I denne metoden er embryonale hjerte vev kirurgisk microdissected, dissosiert fluorescently merket og implantert i vert embryonale vev. Dette gir en plattform for å studere den person eller vev nivå utviklingsmessige organisasjonen under ektopisk hemodynamic forhold og/eller endrede paracrine/juxtacrine miljøer.
Tolke relative effekten av cellen autonome mønstre mot ytre microenvironmental innflytelse på celle avstamning besluttsomhet representerer en generell utfordring i utviklingspsykologi biologi forskning. I embryonale hjertet, dette kan være spesielt vanskelig som regionale forskjeller i uttrykket av transcriptional regulatorer, paracrine/juxtacrine signalnettverk signaler, og hemodynamic kraft er kjent for å påvirke cardiomyocyte modning. En forenklet metode for å endre en utvikle cardiomyocyte molekylære og biomekaniske microenvironment vil derfor være en kraftfull teknikk for å undersøke hvordan lokale forhold innflytelse celle skjebne og funksjon. For å løse dette, har vi optimalisert en metode for å fysisk transplantasjon juvenile cardiomyocytes i ektopisk steder i hjertet eller de omkringliggende embryonale vev. Dette tillater oss å undersøke hvordan microenvironmental forhold innflytelse cardiomyocyte skjebne overganger enkeltcelle oppløsning i intakt fosteret. Her beskriver vi en protokoll som embryonale myocytter kan være isolert fra en rekke cardiac underdomener atskilt, fluorescently merket og microinjected til verten embryo med høy presisjon. Cellene kan bli direkte analysert i situ bruker en rekke bildebehandling og histologiske teknikker. Denne protokollen er et kraftig alternativ til tradisjonelle pode eksperimenter som kan være prohibitively vanskelig i et bevegelig vev som hjertet. Oversikt over denne metoden også kan tilpasses en rekke donor vev og vertsmiljøer, og dens lette av bruk, lave kostnader, og hastighet gjør det et potensielt nyttig program for en rekke utviklingsmessige studier.
CARDIAC utviklingsmessige forskning har nytt godt enormt fra ankomsten av germline transgene modellsystemer som har identifisert mange av genet regulatoriske nettverkene som mønster ulike celle overleveringslinjer og funksjonelle domener i hjertet. Imidlertid kan identifisere hvordan disse genet nettverk samhandle med og svare microenvironmental forhold, inkludert paracrine/juxtacrine signaler og Biofysiske innganger (strekk, belastning, hemodynamic flyt), være utfordrende. Som sådan, er det ikke alltid lett å avgjøre om en mobilnettet fenotypen oppstår som en direkte konsekvens av en genetisk forstyrrelsene eller som en sekundær resultatet av en tilpasning til endringer i cardiac biomekanikk eller høyere orden vev komposisjon1,2 .
Pode eksperimenter, som klassisk blitt brukt til adressen konsepter av skjebnen-spesifikasjonen, vil engasjement, induksjon og kompetanse3,4, representere en ideell tilnærming til å omgå noen av utfordringene som er iboende i definere celle autonome mot miljømessige påvirkning i hjertet. Dessverre gjør hjertet sammentrekninger standard pode tilnærmingsmåter vanskelig. Rask bevegelse av vev forhindrer ofte podet celler fra å hjertet og store vev punkteringer (normalt kreves for pode) ofte føre til hjertesvikt og embryonale dødelighet5,6,7. Derfor har vi utviklet en trykk-basert, microinjection systemet for presisjon mobilnettet implantasjon i utviklingsland chick hjertet, omgå den tekniske hekk av vev pode beskrevet tidligere8,9. Bruker denne teknikken, kan individuelle eller små grupper av cardiac celler isolert fra en donor fosteret bli microinjected til en rekke områder av en vert embryonale hjerte eliminerer behovet for omfattende vert forberedelse og store vev fornærmelser som oppstår ved hjelp av standard pode teknikker. Microinjection nålene brukes for disse implantasjon studier har en ytre diameter på ~ 30−40 µm, som betyr at nålen kan plasseres direkte i vevet (dvs. kan trenge embryonale hjerteinfarkt veggen) og celler focally leveres med minimal skade de omkringliggende vev. Protokollen kan brukes til å utføre en rekke isotopanrikning, heterotopic, Isokor og heterochronic manipulasjoner, gir en rask, fleksibel og rimelig tilnærming for å direkte undersøke klassisk eksperimentelle embryologiske paradigmer i utviklingsland 4-chambered hjerte.
I protokollen skissert nedenfor, vi merke giver celler med en celle permeant fluorescerende farge, som gjør at suksessen til en microinjection eksperiment overvåkes i sanntid og plasseringen av engrafted celler dokumenteres uten behov for noen ekstra flekker. Det bør imidlertid bemerkes at denne tilnærmingen er best egnet for kortsiktige eksperimenter (ca 48 h) som fluorescerende fargestoff kan gå tapt gjennom celledeling. Alternative tilnærminger kan brukes for lengre sikt eksperimenter.
Mens vi presenterer denne teknikken i sammenheng med hjerte utvikling, har vi brukt den med stor virkning for cellen implantasjon eksperimenter i mesoderm, hodet, lemmer og somites. Slik den grunnleggende fremgangsmåten beskrevet nedenfor er svært tett og kan brukes i en rekke organsystemer.
Muligheten til å definere hvordan microenvironmental forhold innvirkning cardiac celle skjebne spesifikasjonen og slekten stabilisering er grunnleggende for å skape en kompresjons forståelse av medfødt hjertesykdom også å utvikle effektive protokoller for riktig modning av stilk cellen eller somatisk cell reprograming-baserte cardiomyocytes. Protokollen skissert ovenfor gir etterforskerne muligheten til å direkte analysen cardiac celle utvikling under endret i vivo forhold, slik at cellen autonome modning prosesser skal skilles fra paracrine/juxtacrine og/eller hemodynamic signaler. Kombinert med høy oppløsning bilder, genetisk analyse og fysiologiske analyser, kan denne teknikken fungere som et kraftig supplement til eksisterende transgene modeller.
Form et teknisk stand punkt, protokollen presenteres her er avhengig av effektiv isolasjon, merking og presis implantering av donor hjerte cellene i vert embryonale vev. Bruk av en microinjection system sterkt hjelpemidler i målretting av donor cellene og tillater vellykkede implantasjon uten behov for oppretting av store engraftment områder i vert vev. Noen operative ferdigheter er nødvendig for å utføre denne teknikken men som redusert levedyktighet kan resultere hvis injeksjon nålen ikke er nøye plassert i vevet (forårsaker brudd i hjertet eller lokale blodkar). Stell og tenkte bør også gis til isolasjon og merking trinnene. Over fordøyelsen av donor vev kan føre til dårlig implantasjon effektivitet, og forbigående merking teknikker kan begrense tidsvinduet som giver celler kan spores (som celledeling kan fortynnes etiketten).
Denne teknikken er svært modifiserbare og kan tilpasses til en rekke formål. Eksempelvis sprøytes donor cellene fra et stort utvalg av vev og stadier kan isoleres (selv om optimalisering av enzymatisk fordøyelsen er nødvendig) og kan tilsvarende inn en rekke vert vev over ulike stadier av utvikling. Tilsvarende kan etikettmetoden endres for å spore celler på tvers av ulike timelige windows, inkludert bruk av fluorescerende uorganiske semiconductor nanokrystaller for lenger forbigående merking og implantering av vaktel celler eller celler fra green fluorescerende protein transgene (GFP +) donor embryo11 for permeant merking.
Mens vi bruker denne teknikken for avian implantasjon studier, føler vi at det kunne bli brukt for et stort utvalg av chimeric studier i fremtiden. Genetisk forandret hjerte celler fra transgene organismer kunne for eksempel isolert og microinjected inn i avian hjertet bruker en veldig lignende protokoll. Videre celler i cardiomyocytes fra stammer cellene eller via somatisk cell reprograming tilnærminger kan være microinjected inn i embryonale hjertet å vurdere deres integrering i vev og/eller modning under i vivo biomekaniske forhold.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av grant R00HL122360 fra National Institutes of Health, nasjonale hjerte, lunge og blod Institute (NHLBI).
1 mL Insulin Syringe | BD | 329654 | |
1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 24-282 | |
10 ml Syringe | BD | 305482 | |
1000ul Reach Barrier Tip Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-430 | |
15 mL Centriguge Tubes, Racked | Genesee Scientific | 28-101 | |
1588 Genesis Hova-Bator Incubator | GQF | 813927021221 | |
18G x 1 1/2 Needle | BD | 305196 | |
200ul Barrier Tip Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 24-412 | |
32G x 1/2" Needle | TSK Steriject Air-Tite | TSK3213 | |
Alchohol Wipes 70% | Thermo Fisher Scientific | 19015744 | |
Angled Forceps | Fine Scientific Tools | 11260-20 | |
Backloading Tips | Eppendorf | 930001007 | |
Black India Ink | KOH-I-NOOR | 3084-F | |
CellTracker Green CMF | Thermo Fisher Scientific | C7025 | 1 mM in DMSO |
CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 1 mM in DMSO |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Commercial Grade Packing Tape | Staples | 2619001 | |
Curved Tenotomy Scissors | Fine Scientific Tools | 14067-11 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
DMSO, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | D12345 | |
DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | 5252000021 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | |
Hatching Eggs | Pilgrim's Hatchery | — | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
Injectman 4 | Eppendorf | 5192000027D | |
Micromanipulator | Leica Microsystems | — | |
Parafilm | SIGMA | P6543-1EA | |
Paraformaldehyde 32% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 100496-496 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-022 | |
Petri Dish | Genesee Scientific | 32-107 | |
Pipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
Pipette Puller | HEKA | PIP 6 | |
Scotch Transparent Tape | Staples | 487909 | |
Sigmacote | SIGMA | SL2-25ML | |
Stereo Microscope | Leica | — | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
Transfer Pipette | Thermo Fisher Scientific | 273 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 |