تحليل Mitochondrial مجمعات سلسلة التنفس في "الخلايا البشرية المزروعة" استخدام التفريد جل Polyacrylamide الأصلي الأزرق وإيمونوبلوتينج

الأزرق الأصلي polyacrylamide هلام الكهرباء يسمح بتحليل مجمعات في اللباقة من نظام الفوسفور الاكسدة الميتوكوندريا. بل هو تقنية مريحة وغير مكلفة التي يمكن استخدامها لتراكب تجميع مجمعات كاملة من نظام الفوسفور التأاكسى الميتوكوندريا. لإعداد السيتات الميتوكوندريا، استخدم أولاً محلول PBS البارد الجليدي لغسل الخلايا بلطف مرة واحدة.

كشط الخلايا و بيليها لهم في أربع درجات مئوية في 800 G لمدة 10 دقائق. ثم، غسل بيليه الخلية مرتين مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة والطرد المركزي في أربع درجات مئوية في 800 G لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف 200 ميكرولترات من مثبطات البروتياز 100x إلى 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.

إعادة تعليق الخلايا في خليط مثبطات البروتياز برنامج تلفزيوني لتركيز البروتين النهائي من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر. لإعداد 3.3 مللر digitonin في برنامج تلفزيوني مع مثبطات البروتياز، حل أربعة ملليغرام من digitonin في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في 100 درجة مئوية حتى لا يعجل مرئية. يبرد على الجليد على الفور وإضافة 10 ميكرولترات من مثبطات البروتياز 100x إلى ملليلتر واحد من حل digitonin.

بعد ذلك، أضف خليط مثبطات البروتيزين الاتين إلى الخلايا عند التركيز النهائي لـ 1.65 ملليمولار. اخلطي جيداً، و احتضني الثلج لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة خليط مثبطات البروتياز برنامج تلفزيوني إلى الخلايا إلى الحجم النهائي من 1.5 ملليلتر.

جهاز طرد مركزي عند أربع درجات مئوية عند 10,000 غ لمدة 10 دقائق. إزالة عظمى وإعادة تعليق بيليه الميتوكوندريا في العازلة الميتوكوندريا. إعداد ملليلتر واحد من 10٪ لوريال الطازجة في محلول مثبطات برنامج تلفزيوني.

إضافة 10٪ لوري mountased إلى الميتوكوندريا في التركيز النهائي من 1٪ احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة على الأقل. جهاز طرد مركزي عند أربع درجات مئوية عند 20000 جي لمدة 20 دقيقة. جمع افرا في أنبوب جديد وإضافة المخزن المؤقت عينة.

لإعداد هلام التدرج للصفحة الأصلية الزرقاء، ضع أولا صانع التدرج على لوحة تحريك وتوصيله مع أنابيب مرنة إلى مضخة ال peristaltic. إرفاق ضخ مجموعة مع إبرة إلى الأنابيب. ضع مُحرك مغناطيسي في الغرفة القريبة من صانع التدرج واغسل الأنابيب بالماء المقطر عند الحد الأقصى لسرعة المضخة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، إفراغ الأنابيب وصانع التدرج. استخدام ماصة لإزالة أي بقايا الماء المقطر في القناة بين غرف صانع التدرج. أغلق القناة والأنابيب بالصمام.

تجميع اثنين من لوحات زجاجية في حامل ووضعها على المنصة. باستخدام ثقب على الجزء السفلي من حامل هلام، ووضع إبرة متصلة الأنابيب بين لوحات الزجاج. لجعل 8.3 في 7.3 سم هلام، أولا إعداد 6٪ و 15٪ هلام الحلول والاحتفاظ بها على الجليد.

امزجها بلطف لتجنب صنع فقاعات الهواء. ثم، تحميل نهاية قريبة من حجرة أنابيب خلاط هلام التدرج مع 2.6 ملليلتر من هلام 6٪ ونهاية هات مع 2.1 ملليلتر من هلام 15٪. بعد ذلك، قم بالتبديل على المُحرك المغناطيسي وفتح الأنابيب والقناة بين غرف صانع التدرج.

قم بتشغيل المضخة ال peristaltic على الفور إلى خمسة ملليلترات في الدقيقة. املأ الألواح الزجاجية وأزل الإبرة عندما لا يكون هناك هلام في الأنابيب. تراكب بلطف هلام مع الماء المقطر والحفاظ على هلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل.

اغسل الأنابيب على الفور عن طريق ملء غرف التدرج بالماء المقطر واستخدام المضخة المترفة في السرعة القصوى. إضافة ستة ملليلتر من الماء المقطر إلى ثلاثة ملليلترات من العازلة هلام 3x لجعل 1x العازلة هلام. مع ورقة مرشح، وإزالة بلطف الماء المقطر من سطح الجل.

اغسل سطح الجل بمخزن الجل 1x، وازيل المخزن المؤقت بلطف بورق الفلتر. إعداد 4٪ التراص هلام وفقا للمخطوطة. مزيج بلطف لتجنب صنع فقاعات الهواء.

ثم، ضع المشط بين اللوحات الزجاجية وصب هلام التراص تحت المشط. غمر المشط بالكامل. اسمحوا هلام التراص البلمرة لمدة 30 دقيقة على الأقل.

ثم، إزالة المشط واستخدام ماصة لغسل الآبار مع 1x هلام العازلة. لتنفيذ electrophoresis هلام الأصلي الأزرق، أولا، إضافة العازلة الكاثود الأزرق إلى كاسيت هلام. استخدام ماصة لغسل وملء الآبار مع العازلة الكاثود الأزرق.

ثم، تحميل خمسة إلى 30 ميكروغرام من عينات البروتين في الآبار. املأ بلطف الكاسيت الهلامي إلى الأعلى مع المخزن المؤقت الكاثود الأزرق، والتانك مع المخزن المؤقت الأنود. أولاً، قم بتشغيل الجل بفولت ثابت يبلغ 40 فولت لمدة 15 دقيقة.

ثم، زيادة الجهد إلى 80 فولت. تشغيل هلام حتى تصل الصبغة 2/3 من طول هلام. استبدل العازلة الكاثود الأزرق مع العازلة الكاثود ومواصلة electrophoresis حتى جبهة الصبغة قد تشغيل قبالة هلام.

استرداد لوحات الزجاج ونقل البروتينات إلى غشاء PVDF عن طريق النشاف شبه الجافة. استخدام الجهد المستمر من 25 فولت والحالية محدودة إلى أمبير واحد لمدة 30 دقيقة. تم تثبيط تجميع مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي في خلايا الورم الأرومي العصبي البشري عند علاج الكلوراففينيكول بالمقارنة مع خلايا التحكم دون علاج.

وعلى النقيض من ذلك، فإن المجمعات التي تُشفرها الجينات النووية كانت منظمة. وقد لوحظ تدهور مجمعات الفوسفور التأسد على عدة دورات تجميد ذوبان. يمكن أن تؤثر جودة الجل على اكتشاف مجمعات الفوسفور التأسد.

أيضا، تجريد من الغشاء خفض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. عند إجراء العملية، من المهم أن تتذكر القيام بإعداد بسيط وكهرباء هلام في ظل ظروف باردة للحفاظ على مجمعات أوكسفوس في اللباقة. بعد الصفحة الأصلية الزرقاء، يمكن تطبيق صفحة SDS البعد الثاني لدراسة وحدات البروتين الفرعية لمجمعات سلسلة الجهاز التنفسي.

صفحة الأزرق الأصلي يسمح للباحثين دراسة تجميع المجمعات وحتى فائقة مجمعات نظام الفوسفور التأسد.