Analys av mitokondrie respiratoriska kedja komplex i odlade humanceller använder blå infödda polyakrylamid gelelektrofores och Immunoblotting

Blå infödda polyakrylamid gel elektrofores möjliggör analys av in-tact komplex av mitokondriellt oxidativt fosforyleringssystem. Det är en bekväm och billig teknik som kan användas för att överlagra monteringen av hela komplex av mitokondriellt oxidativt fosforyleringssystem. För att förbereda mitokondriella lysates, använd först iskall PBS-lösning för att försiktigt tvätta cellerna en gång.

Skrapa cellerna och pellet dem på fyra grader Celsius vid 800 G i 10 minuter. Sedan tvätta cell pelleten två gånger med iskall PBS och centrifug vid fyra grader Celsius vid 800 G i 10 minuter. Därefter lägger du till 200 mikroliter av 100x proteashämmare till 20 milliliter PBS.

Åter avbryta cellerna i PBS proteashämmare blandningen till en slutlig proteinkoncentration på fem milligram per milliliter. För att förbereda 3,3 millimolar digitonin i PBS med proteashämmare, lös fyra milligram digitonin i en milliliter PBS vid 100 grader Celsius tills ingen fällning syns. Kyl genast på is och tillsätt 10 mikroliter 100x proteashämmare till en milliliter av digitoninlösningen.

Därefter lägger du till den digitonin proteashämmare blandningen till cellerna vid den slutliga koncentrationen av 1,65 millimolar. Blanda väl, och inkubera på is i fem minuter. Tillsätt sedan PBS proteashämmare blandningen till cellerna till den slutliga volymen på 1,5 milliliter.

Centrifugera vid fyra grader Celsius vid 10, 000 G i 10 minuter. Ta bort supernatanten och dra upp den mitokondriella pelleten på rätt sätt i mitokondriell buffert. Förbered en milliliter färsk 10%loreal mountas i PBS-hämmare lösning.

Tillsätt 10%loreal mountased till mitokondrierna vid den slutliga koncentrationen av 1%Inkubera på is i minst 15 minuter. Centrifugera vid fyra grader Celsius vid 20, 000 G i 20 minuter. Samla supernatanten i ett nytt rör och tillsätt provbufferten.

För att förbereda toningsgel för blå native sida, först placera lutning maker på en omrörning platta och anslut den med en flexibel slangar till peristaltiska pumpen. Fäst ett infusionsset med en nål på slangen. Placera en magnetisk omrörare i lutningstillverkarens proximala kammare och tvätta slangen med destillerat vatten vid den maximala pumphastigheten i 10 minuter.

Därefter tömma slangen och toning maker. Använd en pipett för att ta bort överblivna destillerat vatten i kanalen mellan kamrarna i lutningstillverkaren. Stäng kanalen och slangen med ventilen.

Montera två glasplattor i hållaren och placera den på stativet. Med hjälp av hålet på gelhållarens undersida, placera nålen som är ansluten till slangen mellan glasplattorna. För att göra en 8,3 av 7,3 centimeter gel, först förbereda 6%och 15%gel lösningar och hålla dem på is.

Blanda dem försiktigt för att undvika att göra luftbubblor. Därefter, ladda den proximala änden av övertoningsgelblandarslangsslangskammaren med 2,6 milliliter av 6%-gelen och den distala änden med 2,1 milliliter av 15%-gelen. Därefter slår du på magnetomröraren och öppnar slangen och kanalen mellan kamrarna i lutningstillverkaren.

Slå omedelbart på peristaltiska pumpen till fem milliliter per minut. Fyll glasplattorna och ta bort nålen när det inte finns någon gel i slangen. Överlagra försiktigt gelen med destillerat vatten och håll gelen i rumstemperatur i minst en timme.

Tvätta slangen omedelbart genom att fylla lutningskamrarna med destillerat vatten och använda peristaltisk pumpen vid högsta hastighet. Tillsätt sex milliliter av det destillerade vattnet till tre milliliter av 3x gelbufferten för att göra 1x gelbuffert. Med ett filterpapper, försiktigt ta bort destillerat vatten från ytan av gelen.

Tvätta ytan på gelen med 1x gelbufferten, och ta försiktigt bort bufferten med filterpapperet. Förbered 4%stapling gel enligt manuskriptet. Blanda försiktigt för att undvika att göra luftbubblor.

Därefter, placera kammen mellan glasplattorna och häll staplingsgelen under kammen. Sänk ned kammen helt. Låt staplingsgelen polymerisera i minst 30 minuter.

Ta sedan bort kammen och använd en pipett för att tvätta brunnarna med 1x gelbuffert. För att utföra den blå infödda gelelektroforesen, tillsätt först den blå katodbufferten till gelkassetten. Använd en pipett för att tvätta och fylla brunnarna med den blå katodbufferten.

Sedan, ladda fem till 30 mikrogram proteinprover i brunnarna. Fyll försiktigt gelkassetten till toppen med den blå katodbufferten, och tanken med anodbufferten. Kör först gelen med en konstant spänning på 40 volt i 15 minuter.

Därefter, öka spänningen till 80 volt. Kör gelen tills färgämnet når 2/3 av gellängden. Byt ut den blå katodbufferten med katodbufferten och fortsätt med elektroforesen tills färgämnets framsida har runkat av gelen.

Hämta glasplattorna och överför proteinerna till PVDF-membranet genom halvtorr blotting. Använd en konstant spänning på 25 volt och en ström som är begränsad till en ampere i 30 minuter. Montering av luftvägarna kedjan komplex i de mänskliga neuroblastom cellerna var inhiberade vid chloramphenicol behandling i jämförelse med kontroll cellerna utan behandling.

Däremot var komplex kodade av kärngenerna upp-reglerade. Nedbrytning av de oxidativa fosforyleringskomplexen observerades vid flera frys-töcykler. Kvaliteten på gelén skulle kunna påverka detektionen av de oxidativa fosforyleringskomplexen.

Också, strippning av membranet sänkte signal-brus-förhållandet. När du utför förfarandet, Det är viktigt att komma ihåg att utföra enkla förberedelser och gel elektrofores under kalla förhållanden för att bevara in-tact OXPHOS komplex. Efter blå native sida, en andra dimensionen SDS sida kan tillämpas för att studera proteinet sub-enheter av andningskedjan komplex.

Blå native sida gör det möjligt för forskare att studera montering av komplex och även super-komplex av oxidativ fosforyleringssystem.