Summary
Perineural invasie is een agressief fenotype voorhoofd-en nek plaveiselcel cel carcinoom en andere tumoren. Het kuiken chorioallantoic membraan model is gebruikt voor het bestuderen van bloedvat, kanker invasie, en metastase. Hier laten we zien hoe dit model kan worden gebruikt om perineural invasie in vivo te beoordelen.
Abstract
Perineural invasie is een fenotype waarin kanker omringt of de zenuwen binnendringt. Het wordt geassocieerd met een slechte klinische uitkomst voorhoofd-en nek plaveiselcel cel carcinoom en andere kankers. Mechanistische studies hebben aangetoond dat de moleculaire Overspraak tussen zenuwen en tumorcellen optreedt voorafgaand aan de fysieke interactie. Er zijn slechts een paar in vivo modellen om perineural invasie te bestuderen, vooral om vroege progressie te onderzoeken, voordat fysieke zenuw-tumor interacties optreden. De Chick chorioallantoic membraan model is gebruikt om kanker invasie studie, omdat de kelder membraan van de chorion epitheel bootst dat van de menselijke epitheelweefsel. Hier hebben we hergebruikt het kuiken chorioallantoic membraan model te onderzoeken perineural invasie, enten rat dorsale wortel ganglia en menselijke hoofd en nek plaveiselcel cel carcinoom cellen op de chorion epitheel. We hebben aangetoond hoe dit model kan nuttig zijn om het vermogen van kankercellen te evalueren om neurale weefsel binnen te vallen in vivo.
Introduction
Perineural Invasion (PNI) is een onderstudeerde fenotype in kanker, die wordt geassocieerd met een hoge ziekte herhaling en slechte overleving bij patiënten met hoofd en nek plaveiselcel cel carcinoom (HNC)1. PNI wordt microscopisch bepaald als tumorcellen binnen of het omringen van zenuwen2,3. Wanneer PNI wordt gedetecteerd, patiënten zijn waarschijnlijk adjuvante therapieën, zoals electieve nek dissectie en/of bestraling4,5te ontvangen. Echter, deze therapieën zijn agressief, en niet PNI-specifiek. In feite is er geen therapie om PNI te blokkeren, vooral omdat de mechanismen ten grondslag liggen aan zenuw-tumor interacties zijn nog steeds slecht begrepen.
Verschillende moleculaire mechanismen zijn betrokken bij de zenuw-tumor aantrekkingskracht; tumoren en stromale cellen release peptiden en groeifactoren ter bevordering van neuritogenesis6,7. Wanneer gecultiveerd samen in vitro, HNC cellen en dorsale wortel ganglia (DRG) allebei hebben een robuuste reactie; effecten op de tumor cel invasie en neuritogenesis kan worden gezien na een paar dagen in cultuur6,8,9. Er is echter een gebrek aan geschikte in vivo modellen om recapituleren tumor-zenuw interacties voorafgaand aan de invasie. Hier presenteren we een in vivo PNI model om vroege interacties te bestuderen tussen HNC cellen en zenuwen6. We aangepast de Chick chorioallantoic membraan (CAM) model op te nemen een neurale component, enten een DRG in de nok, gevolgd door een Graft van kankercellen om een geïnnerveerd tumor microomgeving na te bootsen.
De CAM model is met succes gebruikt om de invasie van cellen te beoordelen door middel van de kelder membraan, het nabootsen van vroege invasieve stadia van carcinoom en melanoom10,11,12. De nok bestaat uit de bovenste chorion epitheel, tussenliggende mesenchym, en lagere allantoïs epitheel. Het chorion epitheel is structureel vergelijkbaar met menselijk epitheel10,13 in dat de collageen-IV-rijke kelder membraan simuleert de kelder membraan dat het orale epitheel scheidt van de onderliggende bindweefsel. Sinds de eerste tumor enten werden uitgevoerd in de cam in 191314, vele aanpassingen van de methode werden ontwikkeld om voor de beoordeling van bloedvat15,16,17, tumor progressie, en metastase18. Belangrijk is dat de techniek van het enten tumoren op de CAM is zeer weinig veranderd, maar de toepassingen zijn voortdurend in ontwikkeling. Analyses van toenemende complexiteit zijn gepubliceerd, met inbegrip van drug screening19, Bone tissue engineering20, en nanopartikels gebaseerde geneesmiddelen tegen kanker21.
Ons laboratorium maakt gebruik van een CAM-DRG model waarin een zoogdier DRG is geïsoleerd en geënt op het oppervlak van de bovenste NOK. Nadat DRG in de nok wordt opgenomen, worden de HNC cellen geënte dichtbij DRG en toegestaan om met DRG in wisselwerking te staan alvorens het volledige in vivo systeem wordt geoogst en geanalyseerd. Belangrijk, laat het systeem ex-vivo visuele observatie van zowel DRG als de tumor door fluorescentie etikettering van DRG en tumorcellen toe. Dit protocol bestaat uit meerdere stappen met verschillende niveaus van complexiteit uitgevoerd binnen 17 dagen, van broedeieren tot het oogsten van de nok (Figuur 1). De cellen die verschillende proteïnen van belang uiten kunnen in dit model worden getest om de moleculaire wegen te verhelderen verantwoordelijk voor zenuw invasie in kanker, en ook voor het onderzoeken van drugs om neurale invasie direct te richten. Cellen vooraf behandeld met een kandidaat-geneesmiddel kan worden geënt op de nok en het optreden van PNI onderzocht in vergelijking met onbehandelde controles. In feite, is het NOKKEN model gebruikt voor drugonderzoek als tussenstap tussen in vitro studies en pre-klinisch in vivo proeven in knaagdieren19.
Het experimentele ontwerp zal variëren met de hypothese. Bijvoorbeeld, als het testen van de rol van een specifiek eiwit op PNI, zou de experimentele groep DRG geënt met tumorcellen omvatten die de proteïne overdrukken, terwijl de controlegroep DRG met cellen zou moeten omvatten stabiel transfected met lege Vector. Verschillende experimentele ontwerpen kunnen worden gebruikt om specifieke vragen te beantwoorden.
Protocol
Ethiek statement: alle experimenten met behulp van ratten in dit protocol worden gedaan in overeenstemming met DEC (Institutional Animal Care en use Comite) regels van onze instelling. Experimenten met eieren in deze studie zijn vrijgesteld van DEC regelgeving.
1. incubatie van het ei (geschatte timing: 5 min, dag nul)
- Ontvang pathogeen-vrije bevruchte commerciële Lohmann witte Livorno eieren, bij voorkeur op de eerste dag na de bevruchting. Incubeer zes eieren per experimentele groep in een Eier bevochtigen incubator bij 38 °C en 54% vochtigheid voor 8 dagen met rotatie per uur. Gebruik regelmatige rotatie van de eieren om te voorkomen dat het embryo vasthoudt aan de Eier membranen.
Let op: voor de incubatie, houd de eieren in een koelkast van 18 °C te stoppen embryo ontwikkeling voor een maximum van 1 week.
2. oogst en bereiding van DRGs (geschatte timing: 2 h, dag 8)
Opmerking: experimenten met muizen en ratten vereisen goedkeuring van de (DEC). In sommige landen, het gebruik van kippeneieren vereist ook goedkeuring.
- Krijg zes tot zeven week-oude Sprague Delombaerde ratten (~ 200 g in gewicht) om DRGs te halen.
Opmerking: een rat moet opleveren ~ 40 cervicale en thoracale DRGs. muis DRG integreert ook in de nok, nochtans moeten de voorwaarden voor deze soort onafhankelijk worden geoptimaliseerd. - In een laminaire stroom kabinet, oogst DRGs van cervicale en thoracale gebieden na het protocol voor muis DRG extractie elders gepubliceerde22. Volg Figuur 2 voor oriëntatie op hoe te oogsten DRGs.
- Euthanaseren de rat door cardiale punctie na toediening van ketamine/Xylazine geïnjecteerde ze intraperitoneaal. Reinig de rat huid met 70% ethanol en verwijder de rat wervelkolom met behulp van een schaar. Voer geen cervicale dislocatie uit omdat dit de cervicale DRGs zou beschadigen.
- Scheid de cervicale, thoracale en lumbale regio's met dezelfde schaar, naar aanleiding van de schematische anatomische representatie en bruto beelden die in de Figuur 2a-D. Plaats de wervelkolom secties in een 10 cm kweekschaal met 1x PBS om de weefsels nat te houden.
- Met een delicate been schaar, open de wervel botten in de dorsale en buik aspecten, het scheiden van de wervelkolom in twee zijdelingse helften (figuur 2e-F). Plaats de weefselsecties in een schone 10 cm schotel met verse 1x PBS.
- Met behulp van een tang, los het ruggenmerg van de wervel botten om de DRGs te visualiseren (figuur 2g).
- Met fijne pincet die onder elke DRG wordt gehouden, grijp het en trek het uit van de been holte waarin het wordt ingediend. Houd niet de DRG direct omdat dit weefselschade zal veroorzaken. Niet trim de axon bundels uit de DRG (figuur 2H).
Nota: Vermijd gebruikend lumbale DRGs aangezien deze integratie in de nok hebben verminderd. Voor DRG regio locatie, volg de Schematische illustratie en de bruto anatomische beelden op Figuur 2a-D.
- Onmiddellijk na het oogsten, plaats elke DRG in DMEM cultuurmedium aangevuld met 2% penicilline/streptomycine (pen/keelontsteking) en 10% warmte-geïnactiveerd foetale boviene serum (FBS) om te helpen voorkomen dat bacteriële besmetting van de DRGs. groep alle DRGs in dezelfde 6 cm kweekschaal met 4 mL kweekmedium.
- Na het oogsten van alle DRGs, breng ze naar een nieuwe cultuur schotel met DMEM cultuurmedium aangevuld met 2% pen/keelontsteking plus 10% FBS en met 1,25 µ g/mL rode fluorescerende kleurstof. Incubeer voor 1 uur in de cel kweek incubator. Tijdens deze tijd, bereid de eieren voor om de DRG te ontvangen zoals hieronder beschreven (stap 3).
Nota: het interval tussen het oogsten DRGs en voltooiing van fluorescentie het etiketteren zou voldoende moeten zijn om de eieren voor te bereiden; DRGs kan worden gehouden voor een paar uur in de incubator.
3. bereiding van de eieren voor DRG enten (geschatte timing: 1 uur voor een dozijn eieren, dag 8)
- In een laminaire stromings kast, Dim het licht en transilluminate de eieren om te controleren op levensvatbaarheid en embryonale fase. Uitsluiten eieren met een slechte vasculatuur, niet-bevruchte eieren, of eieren niet in overeenstemming met dag 8 post-fertilisatie. Houd het ei voorzichtig met de natuurlijk voorkomende lucht SAC in de richting van de lichtbron (Figuur 3a).
- Markeer met een potlood de eierschaal om de openingen te ontvangen (Figuur 3a-B).
- Eerst, Identificeer de gehechtheid van het ontwikkelende embryo aan de nok als donker bewegend schip dat aan het ei membraan wordt gehecht en merk dit gebied om interventies in deze streek te vermijden.
- In de tweede plaats, kies het besturingsvenster gebied als een goed vasculaire gebied ten minste 2 cm van het embryo gehechtheid en trek een 1,5 cm diameter cirkel. Ongeveer 1 cm van het bedienings venster, teken een 0,5 cm vierkant in een minder vasculaire gebied.
- Ten derde, teken de Air SAC regio om het uit te sluiten van de operatiegebied. Markeer het midden van de Air SAC met een kruis.
- Met een roterend gereedschap en graveer boor, 3 mm in diameter, boor de eierschaal in het gemarkeerde vierkant (figuur 3c). Gebruik botte tang om de eierschaal te verwijderen zonder het verwijderen van de buitenste ei shell membraan (het witte membraan recht onder de schelp) (figuur 3D). Werk zorgvuldig om accidentele perforatie van dit membraan te voorkomen.
- Maak met dezelfde boor als in stap 3,3 een Pinpoint-perforatie in het gemarkeerde kruis in het lucht SAC-gebied om de luchtstroom in het ei te laten (figuur 3e). Wees voorzichtig niet te veel druk op het ei toe te passen, om te voorkomen dat het breken of beschadigen.
- Plaats 30 µ L van Peeters in de vierkante opening, over de intacte buitenste ei shell membraan (figuur 3e). Met een 30-G injectienaald, maak een Pinpoint perforatie in de buitenste membraan in dit vierkante gebied (figuur 3F).
- Plaats het ei in de lichtbron om de lucht SAC te visualiseren. Breng druk op een pipet rubber lamp en plaats deze in de kleine perforatie gemaakt in de lucht SAC gebied (stap 3,4). De druk van de versie in de bol tot u scheiding van de twee membranen in het werkende venster gebied ziet (figuur 3G); Herhaal deze stap zo vaak als je nodig hebt om volledige scheiding van de membranen te bereiken in het besturingsvenster gebied.
- Herhaal stap 3.1-3.6 voor alle eieren.
- Met behulp van dezelfde boor als in stap 3,3, boor de circulaire besturingsvenster wordt voorzichtig niet te scheuren de buitenste ei shell membraan (figuur 3H). Reinig het ei oppervlak door zachtjes steken een plakband om alle losse deeltjes te verwijderen.
- Met stompe Tang, verwijder de eierschaal van het geboorde gebied (figuur 3I-J). Vervolgens, met dezelfde Tang, verwijder de buitenste ei shell membraan (figuur 3k), wordt voorzichtig niet te kleine schelp deeltjes in het ei te voeren om de verontreiniging te minimaliseren.
- Identificeer de nok ongeveer op 1 cm diepte van het ei oppervlak. Bedek elk geopend ei tijdelijk met paraffine membraan om verontreiniging te voorkomen (figuur l').
- Herhaal stap 3.8-3.10 voor alle eieren. Plaats de eieren terug in de Eier incubator zonder rotatie totdat de DRGs zijn klaar voor het enten.
4. enten DRG op de nok (geschatte timing: 40 min, dag 8)
- Bereid een 6 cm kweekschaal met Peeters medium, om de DRGs te wassen voor de implantatie. Breng de voor bereide eieren naar de cel cultuur laminaire stroming kabinet. Verwijder het paraffine membraan uit het ei (figuur 4a).
- Met fijne steriele Tang, grijp voorzichtig één DRG van binnen het cultuurmiddel. Dompel het in de Peeters medium om het overtollige medium dat de fluorescerende kleurstof bevat te verwijderen. Houd de DRG zeer zacht; anders zal het vasthouden aan de Tang.
- Plaats de DRG op de nok, die oppassen niet te punctie het membraan (figuur 4b-C). Indien nodig, gebruik een ander paar tang te helpen ontkoppelen van de DRG van het puntje van de Tang bij het plaatsen van het op de nok.
Opmerking: het houden van de DRG nat met Peeters medium zal ook vergemakkelijken detachement van de Tang. - Bedek het ei met een steriele transparante film dressing. Bedek alle ramen en perforaties gemaakt in de eierschaal om bacteriële besmetting te voorkomen (figuur 4D).
- Na het enten DRGs in alle eieren, Incubeer de eieren in een bevochtigen incubator bij 38 °C en 54% vochtigheid voor 2 dagen, zonder rotatie.
5. enten tumorcellen op de nok (geschatte timing: 1 h 30 min, dag 10)
- Om 48 uur voor het enten van de cellen, plaat de cellen die nodig zijn in de cultuur platen. Bereken 0,5 tot 1 x 106 cellen per ei voor um-SCC-1 cellen om driedimensionale tumoren te genereren in de cam. Wees ervan bewust dat cel nummer kan variëren per cel lijn.
- Aspireren medium en voeg DMEM cultuurmedium aangevuld met 1% pen/keelontsteking plus 10% FBS en 2,5 µ g/mL van groene fluorescerende kleurstof. Incubeer voor 1 h bij 37 °C in de kweek Incubator van de cel. Vervolgens, sortie fluorescentie intensiteit voort naar de Microscoop, aspireren midden, wassen vroeger van 1x PBS, en toevoegen 0,25% trypsine voor tot aan 10 min. neutraliseren trypsine van DMEM aangevuld medium.
- Centrifugeer bij 250 x g voor 4 min om een cel pellet te vormen. Aspireren DMEM medium en opnieuw op te schorten in Peeters om de overtollige fluorescerende kleurstof te wassen. Cellen tellen met een hemocytometer.
- Breng de eieren naar de cel cultuur laminaire stroming kabinet. Open met een schaar en een pincet de transparante film dressing die het ei bedekt (figuur 4e-F).
- Centrifugeer het berekende aantal cellen opnieuw, aspireren het Peeters medium en opnieuw op te schorten bij een eindconcentratie van 0,5 tot 1x106 cellen per 5 µ l van hetzelfde medium (figuur 4G). Bereid het bedrag dat nodig is voor het totale aantal eieren (5 µ L van de cel schorsing per ei).
- Plaats 5 µ L van cel oplossing op de nok, ongeveer 2 mm van DRG (cijfer 4h). Houd uniforme afstanden tussen de DRG en cellen. Wees zeer voorzichtig niet te verstoren het ei te minimaliseren verspreiding van de cellen.
Opmerking: om te beginnen cel implantatie, kies eieren waarop het CAM oppervlak is visueel droog. Als de oppervlakte te nat is, kunnen de cellen zich verspreiden en vormen geen regelmatige tumors. - Bedek het ei met een nieuwe film dressing als in stap 4,4. Enten de cellen in alle eieren. Incubatie de eieren in een bevochtigen incubator bij 38 °C en 54% vochtigheid voor 7 dagen, zonder rotatie.
6. het oogsten van de nok (geschatte timing: 1 h voor dozijn eieren, dag 17)
- Bereid 6-well-platen met 4%-Paraformaldehyde, pH 7.0, één goed per ei, 2 mL per put.
- Breng de eieren naar een laboratorium bankje. Met behulp van een naald aan een spuit om de film dressing perforeren, drop rond 300 µ L van het middel over de nok om iets stijven de nok, waardoor het oogst proces. Herhaal dit voor alle eieren.
- Met een schaar, verwijder de bovenste helft van de eierschaal (waar het bedienings venster zich bevindt) met de nok eraan verbonden (figuur 4i). Verminder de grootte van deze helft tot ongeveer 3 cm in diameter, houdend het gedeelte van de nok waar DRG en de tumorcellen in het centrum werden geënt (figuur 4J). Pak de CAM met fijne Tang en los het uit de eierschaal, terwijl het in het GAASje. Oriënteer de DRG en kankercellen naar boven gericht (figuur 4k-L).
Nota: het 3 cm gebied zou zowel DRG als cellen moeten omvatten. De DRG is gemakkelijk te zien als een kleine Brok gehecht aan de nok, maar tumorcellen zijn soms moeilijk te identificeren op het bruto-examen. - Alternatief, met een schaar, verwijd het werkende venster verwijderend de eierschaal van de bovenkant van het ei terwijl het houden van de nok op zijn plaats; Verwijder ongeveer 1 cm buiten het bedienings venster (figuur 4m) en IDENTIFICEER de DRG en de cellen op de nok (figuur 4n-O). Met delicate fijne Tang, houd de nok aan een van de randen en til het zachtjes. Met scherpe delicate schaar, snijd de nok voorzichtig om een cirkelvormig gebied te verwijderen, ongeveer 3 cm in diameter (figuur 4p), en plaats de nok in de met DRG en kankercellen naar boven gericht.
Opmerking: Vermijd stretching of het vasthouden van de CAM met een tang in meerdere plaatsen om weefselschade die kan genereren microscopische artefacten te minimaliseren. - Plaats elke CAM membraan in een put (figuur l.). Voorzichtig de randen van de nok te begrijpen om het weefsel te openen in de gespreide of schud de plaat zachtjes totdat de nok is uitgevouwen, om te voorkomen dat vouwen artefacten.
- Euthanaseren het embryo (dag 17) door snelle onthoofding. Bevestig de geoogste weefsels in de voor 4 h bij kamertemperatuur. Na fixatie, vervang het middelpunt met 1x PBS en bewaar weefsels in PBS bij 4 °C tot inbedding in paraffine voor het inbouwen. Vermijd over-fixatie die de delicate vasculatuur van de nok zal beschadigen.
- Met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop, foto de membranen binnen 2 dagen na het oogsten om te voorkomen dat het verliezen van TL-signalen.
Representative Results
Wanneer geoptimaliseerd, heeft deze methode dichtbij 100% DRG integratie in de nok. De representatieve resultaten van DRG integratie worden getoond in figuur 5a-B. De integratie van DRG in de nok is belangrijk aangezien het levensvatbaarheid aan het DRG weefsel tijdens het experiment verstrekt. Microscopisch, wordt DRG gezien binnen het verbindingsweefsel van de nok (H & E vlek). Bloedvaten worden vaak gezien in de DRG weefsel, wat suggereert dat de CAM bloedtoevoer is het voeden van de geënte weefsel. Geïmplanteerde tumoren worden ook geïdentificeerd op de nok door H & E; afhankelijk van hoeveel invasie aanwezig is, tumoren kunnen aanwezig zijn met geen enkele tot tal van tumor eilanden invasie van het bindweefsel (figuur 5c-D). De representatieve figuur 5e-F toont de geoogste nok op helderveld Imaging en samengevoegd fluorescentie. UM-SCC-1 de cellen die Goeman receptor 2 overexpressen presenteerden verhoogde invasie van DRG in vergelijking met controlecellen (cijfer 5g-H). Kanker-DRG de interactie wordt waargenomen als kankercellen die richtings invasie naar DRG voorstellen (cijfer 5H).
Data-analyse wordt uitgevoerd op verschillende manieren. De directionele invasie van kankercellen in de richting van de DRG wordt waargenomen als een dichotome variabele en het aantal eieren presenteren dit patroon van de invasie wordt geteld in elke groep. Statistische verschillen tussen groepen worden berekend met behulp van een binomiale test van de verhoudingen. De nabijheid tussen kankercellen en DRG, en tumorgebied worden gemeten gebruikend ImageJ6 en de verschillen tussen groepen worden beoordeeld gebruikend de test van de student t. Om de nauwkeurigheid te verzekeren met ImageJ analyse, moeten alle beelden van hetzelfde experiment worden genomen op gelijke licht en belichting instellingen. Na het aanpassen van de beeld drempel en de helderheid van alle beelden met dezelfde criteria, de Analyseer deeltjes tool wordt gebruikt om tumorgebied te meten en de lineaire meetinstrument maatregelen tumor-DRG afstanden. Het is belangrijk om constante opstelling van grootte van deeltjes te gebruiken die voor alle beelden over verschillende groepen worden geanalyseerd. In sommige gevallen, tumoren groeien dikker en kan handmatig worden gemeten met een digitale remklauw, waardoor een volumemeting.
Met behulp van delen van paraffine-embedded CAM weefsel, H & E vlek of Immunohistochemistry voor epitheelcellen (anti-cytokeratine antilichaam reactief voor menselijke soort) kan worden uitgevoerd, waardoor de beoordeling van de invasie binnen het bindweefsel. Invasie wordt gekwantificeerd als het aantal tumor eilanden in het bindweefsel per ei. Immunofluorescentie voor collageen IV kan worden gebruikt om de kelder membraan te markeren. Ook, als het gebruiken van GFP-geëtiketteerde kankercellen, wordt de identificatie van deze cellen in de weefselsecties vergemakkelijkt zonder een Immunohistochemistry voor cytokeratine. Metastase en bloedvat analyse in cam experimenten worden elders besproken10,17.
Figuur 1: experiment tijdlijn met inbegrip van de belangrijkste stappen op dagen 0, 8, 10 en 17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: DRG extractie op dag 8 . A. rat Schematische illustratie van de anatomische locatie van de wervelkolom. B. diagram van de rat wervels configuratie die verschillende lichaamsgebieden toont; groen voor cervicale, donkerblauw voor thoracale, sinaasappel voor lumbale en licht blauw voor sacrale wervels. C-D. Buik aspect van de rat wervelkolom na chirurgische besnijdenis; scheiding van de regio's zoals geïllustreerd in B. E. dissectie van de wervels om het Ruggenmergkanaal te openen, het scheiden van de wervellichamen in twee laterale secties met de DRGs. sectie moet snijden door de dorsale en buik aspect van elk wervel been op de middellijn. F. bruto aspect van geopende thoracale wervelkolom. G. nadat het ruggenmerg is verplaatst, DRGs zijn gemakkelijk zichtbaar in de wervel kanalen (pijltjes hoofden wijzend 3 DRGs). H. Stereomicroscopic beeld van één DRG (pijl) met de overeenkomstige axon bundels (het hoofd van de pijl). Schaal staven: C, D, F, en G, 1 cm; H, 1 mm. gelieve te klikken hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bereiding van de eieren op dag 8. A-B. Identificatie van ei-vasculatuur en markeringen voorafgaand aan de procedure. Pijlen op een punt om de natuurlijk voorkomende lucht SAC. C-D. Boren en openen van de eierschaal op het vierkante openings merk. Pijl op D wijst naar de intacte buitenste ei shell membraan na het verwijderen van de schelp met de hulp van botte Tang. E. het gemarkeerde kruis op de Air SAC is geperforeerd met de boor om de luchtstroom in het ei (pijl hoofd). 30 µ L van Peeters medium wordt geplaatst op de buitenste ei shell membraan op het plein opening. F. met een fijne spuit naald, is het buitenste ei shell membraan geperforeerd waar de Peeters eerder werd geplaatst. G. de druk wordt toegepast op een rubberen pipet bol terwijl het bevestigen aan de perforatie die op de luchtzak wordt geboord. Wanneer de vingerdruk wordt vrijgegeven, wordt de lucht gestofzuigd, die een kunstmatige lucht zak (witte pijlen) produceert die zich aan het werkende venster zou moeten uitstrekken. H. de randen van het werkende venster worden geboord in een bijna parallelle positie aan de eierschaal, om toevallige perforatie te vermijden. I-J. Verwijdering van de eierschaal met botte Tang. K. Verwijder de buitenste eierschaal membraan met stompe Tang, die voorzichtig zijn om geen deeltjes te introduceren op de nok (waargenomen op ̴1 cm onder het oppervlak). L. eieren zijn tijdelijk bedekt met een paraffine membraan en zet terug in de incubator. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: enten van DRG, cellen, en oogsten van de nok: op dag 8: A. CAM gemakkelijk waargenomen na paraffine membraan verwijderen. B-C. Met fijne Tang, wordt DRG geplaatst op de nok. D. ei is bedekt met film dressing en zet in de incubator; pijlen wijzen op de openingen die worden gedekt. Op dag 10: E-F. Film dressing is verwijderd en DRG is gelegen (pijl hoofd op F). G-H. 5 µ L van cel oplossing is gedaald op de nok op een ~ 2 mm afstand van de DRG. Op dag 17: I-L en M-P demonstreren twee verschillende benaderingen die worden gebruikt om de nok te oogsten. I. Egg shell wordt geopend met een fijne schaar te beginnen op de Air SAC geperforeerde perforatie tot de bovenste helft van het ei wordt verwijderd. J. eierschaal met de nok wordt in grootte verlaagd tot ongeveer 3 cm. K-L. Met fijne Tang, is CAM losgemaakt van de eierschaal en geplaatst in de geplaatste. M-O. Het verwijden van het werkende venster wordt uitgevoerd om de DRG en kankercellen op de nok te visualiseren. Pijlpunt wijst op de tumor en de pijl wijst naar de DRG. P. de nok is gevat met fijne Tang, uitgesneden met een scherpe schaar, en geplaatst in de werkplaats zoals aangegeven in L. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve resultaten. A. H &Amp; E sectie die integratie van DRG in de nok toont. B. hogere vergroting van A; pijlen tonen CAM bloedvaten in de DRG. C. um-SCC-1 cellen geënt op de nok en geoogst vier dagen na het enten (H & E vlek). D. hogere vergroting van C die invasieve tumor eilanden in het nokken verbindingsweefsel (pijlen) toont. E. bruto stereomicroscopic beeld van de cam geënt met um-SCC-1-GALR2 cellen en rat DRG, geoogst op dag 17. F. samengevoegd fluorescentie en helderveld beelden die de DRG benadrukken die in rood en kankercellen wordt geëtiketteerd die in groen worden geëtiketteerd. G-H. Fluorescentie stereomicroscopy van de nok die met DRG wordt geënt en UM-SCC-1-GALR2 versus controlecellen, die richtings invasie van UM-SCC-1-GALR2 cellen aan DRG (H) illustreren. Schaal staven: A-D, 500 µm; E-H, 2 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Stap | Probleem | Reden | Oplossing | ||||||
| 3.2.1 | Kan de embryo bijlage niet identificeren. | Attachment positie is moeilijk te zien, terwijl ei is nog steeds. | Draai het ei snel zijwaarts te kunnen om een lang schip bevestigd aan het ei membraan te zien. | ||||||
| 3,3 & 3,8 | Perforatie van de buitenste eierschaal membraan tijdens het boren. | Verkeerde positionering van de boor. | Plaats de boor bijna parallel aan de eierschaal tijdens het boren. Als membraan is geperforeerd in stap 3,3, is er geen noodzaak om verdere perforatie met naald uit te voeren, zoals vermeld in stap 3,5. Als bloeden gebeurt, gooi het ei. | ||||||
| 4,3 | DRG stokken aan de Tang. | DRG is droog. | Natte DRG opnieuw in Peeters en/of gebruik een fijne naald om DRG van pincet te helpen losmaken. | ||||||
| 5,2 | Cellen zijn niet perfect gelabeld met fluorescerende kleurstof. | Incubatietijd. Sommige cellen vereisen meer tijd om te labelen. | Houd cellen voor een extra uur in de media met fluorescerende kleurstof. | ||||||
| 5,6 | Lucht zeepbel op de cel neerzetten. | Met behulp van alle vloeistof in de pipet tip. | Laad 1 µ L meer dan het gewenste volume en gebruik de laatste µ L van de pipet niet bij het implanteren van cellen. Dit voorkomt luchtbellen in de cellen mix. | ||||||
| 6,3 | Niet in staat om DRG of cellen te identificeren bij het oogsten van de CAM. | Kleine DRG, DRG werd verplaatst, kankercellen uitgespreid. | Als DRG niet wordt gezien, oogst een groter gebied van de nok en plaats in een grotere container voor bevestiging. Controleer DRG en cel positie onder fluorescentie in een stereomicroscoop, en dan trim de nok aan een kleiner formaat voor paraffine inbedding. | ||||||
Tabel 1: problemen met tabel oplossen
Discussion
De CAM-DRG in vivo model hier gepresenteerd adressen van de tekorten van de vorige modellen door te demonstreren zenuw-tumor interactie voor fysieke invasie van de zenuw door tumorcellen. De meeste in vivo studies van PNI focus op tumor verspreiding en remming van de motorische functie, en afhankelijk van directe injectie van tumorcellen in de heup zenuwen23,24,25. De heupzenuw injectie is een in vivo model van PNI waar kankercellen worden geïnjecteerd in een muis of rat heupzenuw waar de tumor vervolgens groeit. Injectie modellen zijn nuttig om destructieve progressie van de tumor en pijn als gevolg van tumorcellen in de zenuwen te tonen. De heupzenuw model is ook geschikt voor de studie van factoren die het mogelijk maken kankercellen te gedijen in de zenuw, maar mist de mogelijkheid om de vroege fase van PNI te evalueren, omdat het introduceert cellen direct in de zenuw, het omzeilen van zenuw scheden. In een andere benadering, chirurgisch geïmplanteerde orthotopic tumor enten werden gebruikt om het belang van adrenerge en cholinerge zenuwvezels te karakteriseren bij het bevorderen van prostaatkanker progressie, dus suggereert een prominente rol van zenuwen in tumor progressie 26. dit model bestond uit chemische ablatie van muizen sympathieke en parasympathische zenuwen. De parasympathische vezels geïnfiltreerd tumor weefsels, een proces met betrekking tot PNI, maar het model werd niet specifiek gebruikt om de fysieke interacties tussen de zenuw en tumor te beoordelen. De CAM-DRG model maakt onderzoek van de interacties tussen de zenuw en kanker tijdens PNI. Bovendien, muizenmodellen zijn duur en tijdrovend in vergelijking met de CAM-model. We raden het gebruik van de CAM-DRG model voor mechanistische studies van PNI.
Sommige voordelen aan de nok-DRG benadering omvatten beoordeling van PNI en andere fenotypes, zoals tumorgroei, metastase, en bloedvat. Identificatie van menselijk DNA op de lagere nok en/of in de lever kan worden gebruikt voor de opsporing van metastase van menselijke kanker cel lijnen10, een meer gevoelige experimentele aanpak ten opzichte van weefsel doorsnede en kleuring, die niet kunnen onthullen kleine uitzaaiingen.
De CAM-DRG methode heeft een aantal beperkingen, met inbegrip van de korte observatietijd frame. Het immuunsysteem van het embryo is fysiologisch actief op dag 1827, wanneer afwijzing en een inflammatoire proces kan plaatsvinden, het beperken van de experimentele tijd. Het is ook belangrijk om de afstand te overwegen wanneer het enten van tumorcellen dicht bij DRG; de grotere DRG-kanker afstanden zouden de moleculaire interactie tussen tumorcellen en zenuw kunnen schaden, of konden het fysieke contact tussen beide componenten van het model vertragen. Ook als de embryo's ouder zijn dan bepaald in dit protocol, kunnen embryo bewegingen de tumorcellen verleggen. Daarom is het belangrijk om eieren te gebruiken in overeenstemming met dag 10 post-fertilisatie voor cel enten.
Aangezien het immuunsysteem is niet volledig ontwikkeld voor dag 1827, de tumor microenvironment in de nok is vergelijkbaar met die van de immuungecompromitteerde muizenmodellen vaak gebruikt voor kanker studies. Daarom is dit model niet nuttig om de rol van immune cellen in tumorvooruitgang te beoordelen. Een andere beperking is de beperkte beschikbaarheid van reagentia voor kippen soorten, zoals antilichamen, cytokines en primers.
Het correct uitvoeren van dit protocol vereist praktijk; Nochtans, kan het door een laboratorium lid zonder behoefte aan een gespecialiseerde kernfaciliteit worden gedaan. Het boren van het ei shell vereist opleiding. Oefenen op kruidenier (niet-bevrucht) eieren wordt aanbevolen voordat u probeert dit model voor de eerste keer. De hoge embryonale overleving en het succes van het model kunnen worden bereikt als sommige kritieke stappen om besmetting te vermijden worden gevolgd: aangewezen antibiotische profylaxe van DRGs in 2% pen/keelontsteking, het werken in een laminaire stroom kabinet, en het vermijden van verspreiding van de deeltjes van de eierschaal op de CAM. Het is ook van cruciaal belang om stabiele vochtigheid te houden tijdens de totale eicel incubatietijd. Wij raden aan om het aantal eieren per groep te verhogen tot de techniek onder de knie is. De meest voorkomende problemen voor onervaren laboratorium personeel zijn eicel contaminatie en onnauwkeurige techniek voor het enten van cellen.
DRG het oogsten vereist ook opleiding; praktijk in het oogsten van DRGs voor in vitro experimenten8 alvorens het in vivo model te proberen wordt aanbevolen. De in vitro DRG cultuur is een kans om voorwaarden te optimaliseren en techniek te verbeteren om de duur van DRG extractie te verkorten. Speciale aandacht voor de oogst techniek is vereist bij het grijpen van de DRG met een tang. DRG zou niet direct moeten worden gehouden; de druk moet eronder worden aangebracht. Wij raden het gebruik van Vergrootglas om beter te visualiseren de DRG tijdens de extractie.
Belangrijk, bij het uitvoeren van dit model voor de eerste keer, moeten alle voorwaarden worden geoptimaliseerd voor de gewenste cel lijn. Dit model is geoptimaliseerd voor rat DRG en de HNC Cell line UM-SCC-1. Het gebruik van muis DRG en andere soorten kankercellen kan vereisen optimalisatie. Met een hogere concentratie van geënte cellen, tumoren hebben de neiging om te groeien dikker en stijver, die tumor metingen vergemakkelijkt. Rekening houdend met meerdere eieren voor elke groep en een passende concentratie van cellen voor elk ei, kan een aantal miljoen cellen nodig zijn voor elk experiment. Om de planning te vergemakkelijken, moet kennis van de verdubbelingstijd van de cellen in aanmerking worden genomen. Voor sommige kritieke stappen in dit protocol wordt een tabel voor probleemoplossing geleverd (tabel 1).
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH/NIDCR Grants DE027551 en DE022567 (NJD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | # 25200-056 | |
| ACE light source | SCHOTT North America, Inc. | Used to transilluminate the eggs | |
| CellTracker Green CMFDA fluorescent dye | Life Technologies | # C7025 | Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium. |
| CellTracker Red CMTPX fluorescent dye | Life Technologies | # C34552 | Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium |
| Cordless rotary tool | DREMEL | # 866 | Used to drill the egg shell |
| DMEM (1x) | Gibco | # 11965-092 | Dulbeecco`s Modified Eagle Medium |
| DMSO | Fisher Bioreagents | # BP231-100 | Dimethyl Sulfoxide |
| Dumont # 5 fine forceps | Fine Science Tools (FST) | # 11254-20 | Used to harvest DRG |
| Egg incubator | GQF Digital Sportsman | # 1502 | Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls |
| Engraving cutter | DREMEL | # 108 | Used to drill the egg shell |
| Extra fine Graefe forceps, curved | Fine Science Tools (FST) | # 11151-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Extra fine Graefe forceps, straight | Fine Science Tools (FST) | # 11150-10 | Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17 |
| Fertilized Lohmann White Leghorn eggs | Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. | ||
| Filter Forceps | EMD Millipore | # XX6200006P | Blunt forceps used to remove the egg shell |
| Fine surgical straight sharp scissor | Fine Science Tools (FST) | #14060-09 | Used to harvest the CAM tissue on day 17 |
| HBSS (1x) | Gibco | # 14025-092 | Hank`s Balanced Salt Solution |
| HI FBS | Gibco | # 10082-147 | Heat-inactivated Fetal Bovine Serum |
| Paraffin wax membrane | Parafilm laboratory film | # PM-996 | Used to temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8 |
| PBS (1x) pH 7.4 | Gibco | # 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| Pen/Strep | Gibco | # 15140-122 | 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin |
| PFA (paraformaldehyde solution) | Sigma-Aldrich | # P6148-1KG | Dilute in water to make a 4% PFA solution |
| Sprague Dawley rats (females) | Charles River laboratories | Strain code: 001 | 6-7 weeks old (190-210g in weight) |
| Tegaderm Transparent Film Dressing | 3M | # 9505W | Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation |
References
- Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of dental research. 97 (7), 742-750 (2018).
- Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer: a review of the literature. Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).
- Schmitd, L. B., et al. Redefining Perineural Invasion: Integration of Biology With Clinical Outcome. Neoplasia (New York, N.Y). 20 (7), 657-667 (2018).
- Chinn, S. B., et al. Impact of perineural invasion in the pathologically N0 neck in oral cavity squamous cell carcinoma. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 149 (6), 893-899 (2013).
- Tai, S. K., Li, W. Y., Yang, M. H., Chu, P. Y., Wang, Y. F. Perineural invasion in T1 oral squamous cell carcinoma indicates the need for aggressive elective neck dissection. The American journal of surgical pathology. 37 (8), 1164-1172 (2013).
- Scanlon, C. S., et al. Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer. Nature communications. 6, 6885 (2015).
- Amit, M., et al. Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma. Oncogene. 36 (23), 3232-3239 (2017).
- Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).
- Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. The Prostate. 49 (3), 213-223 (2001).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Busch, C., Krochmann, J., Drews, U. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion. PloS one. 8 (1), e53970 (2013).
- Li, M., et al. The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (104), (2015).
- Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20318-20323 (2009).
- Murphy, J. B. TRANSPLANTABILITY OF TISSUES TO THE EMBRYO OF FOREIGN SPECIES : ITS BEARING ON QUESTIONS OF TISSUE SPECIFICITY AND TUMOR IMMUNITY. The Journal of experimental medicine. 17 (4), 482-493 (1913).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nature. 1 (1), 85-91 (2006).
- Auerbach, R., Arensman, R., Kubai, L., Folkman, J. Tumor-induced angiogenesis: lack of inhibition by irradiation. International journal of cancer. 15 (2), 241-245 (1975).
- Banerjee, R., et al. The G protein-coupled receptor GALR2 promotes angiogenesis in head and neck cancer. Molecular cancer therapeutics. 13 (5), 1323-1333 (2014).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer research. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Moreno-Jimenez, I., et al. The chorioallantoic membrane (CAM) assay for the study of human bone regeneration: a refinement animal model for tissue engineering. Scientific reports. 6, 32168 (2016).
- Vu, B. T., et al. Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer. Scientific reports. 8 (1), 8524 (2018).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC research notes. 9, 82 (2016).
- Cavel, O., et al. Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor. Cancer research. 72 (22), 5733-5743 (2012).
- Guo, K., et al. Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling. Molecular cancer therapeutics. 12 (3), 264-273 (2013).
- Deborde, S., et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).
- Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. 341 (6142), Science. New York, N.Y. 1236361 (2013).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).
