Summary
여기, 선물이 식용 식물에 타입 1 당뇨병에 대 한 경구 백신 후보자를 생산 하는 프로토콜.
Abstract
식물 분자 농업 관심사의 분자를 생산 하는 식물의 사용 이다. 이 관점에서 식물 사용할 수 있습니다 모두 생물 반응 기 생산 및 최종 제품의 후속 정화 및 분리 단백질의 직접 구두 전달에 대 한 식용 식물을 사용 하는 경우. 이 작품에서는, 우리는 진공 침투 전달 deconstructed 식물 바이러스-기반 재조합 DNA 기술을 사용 하 여 식용 식물 시스템에 타입-1 당뇨병 (T1D)에 대 한 후보 구강 백신의 개발 제시. 우리의 결과 빨간 사탕 T1D T1D 백신으로 유망한 후보 간주에 관련 된 인간의 파생된 autoantigen 과도 표현 위한 적합 한 호스트 보여줍니다. 위 소화에에 그들의 저항, 잔류 세균의 존재 및 사용 가능성에 대 한 프로세스 생산의 개요를 제공의 2 차 대사 프로필 있는 autoantigen 생산 잎 특징 철저 하 게 했다 분리 단백질의 직접 구두 전달 식물. 우리의 분석 시뮬레이션된 위 소화, 식물 유래 갓 백신의 제조에서 캡슐화 전략 필요 하다는 것을 제안에 따라 동결된 후보 구강 백신의 거의 완전 한 저하를 보였다.
Introduction
식물 분자 생물학 혁명 1980 년대에서 이후 바이오의 생산을 위한 공장 기반 시스템 미생물 및 포유류 세포1에 따라 기존 시스템의 대 안으로 여겨질 수 있다. 식물은 확장성, 비용 효율성 및 안전2가장 관련성이 높은 되 고 여러 장점이 전통적인 플랫폼을 표시 합니다. 재조합 제품 변형 된 식물 조직에서 정화를 다음 관리, 중 parenterally 또는 구두와, 또한, 변형 된 식용 식물 직접 구두 전달에 대 한 사용할 수 있습니다. 구강 경로 동시에 점 막 및 조직 면역을 촉진 하 고 그것은 바늘과 전문된 의료 인력에 대 한 필요성을 제거. 또한, 구두 전달 일반적으로 재조합 단백질3의 총 제조 비용의 80%를 차지 하는 복잡 한 다운스트림 처리를 제거 합니다. 그 모든 장점은 생산, 공급 및 노동 세계 인구의 대부분을 저렴 한 약을 만드는 각 복용량의 비용 절감으로 번역 될 수 있다.
여러 가지 전략, 모두 안정적인 변환 및 과도 식, 식물에서 재조합 단백질의 생산을 위해 개발 되었다. 그들 가운데, 높은 수율 deconstructed 식물 바이러스-기반 식 시스템 (예: magnICON) 상대적으로 짧은 날짜 표시줄4이상의 재조합 단백질의 높은 수익률을 선도 하는 우수한 성능을 제공 합니다. 과도 식 Nicotiana benthamiana 식물에서 식물 바이러스-기반 식 시스템을 사용 하 여의 많은 예제, 표준 생산 호스트 되 고 보고 됩니다. 그러나,이 모델 식물은 알 카 로이드 및 그것의 잎에 축적 된 다른 독성 대사 산물 식용 종으로 간주 되지.
이 작품에서는, 우리는 두 식용 식물 시스템, 레드 비트 간의 비교 설명 (베타 vulgaris 이력서 물 랑 루즈), 시금치 (Spinacea 올레라케아 이력서 산업), 글루탐산의 65 kDa isoform의 두 후보 형태의 표현에 대 한 decarboxylase (GAD65), 바이러스-기반 식물에 의해 실시5벡터 스 GAD65 타입-1 당뇨병 (T1D)에 관련 된 주요 autoantigen 이며 그것은 현재를 방지 하거나 허용 오차6유도 T1D 지연 인간 임상 시험에서 조사를 받고 있다. GAD65의 생산 공장에서 광범위 하 게 모델 식물 종에서 Nicotiana tabacum 고 명 benthamiana4,5,,67로 공부 했다. 여기, 우리가 직접 구두 납품을 위해 의미 될 수 있다 조직에 분자의 생산을 위한 식용 식물의 사용을 설명 합니다. 기술적인 관점에서 우리는 공부 하 고 다른 매개 변수를 평가 하 여 공장 agroinfiltration에 대 한 시스템 및 GAD65 생산을 위한 식용 식물 플랫폼 선택: 재조합 형 단백질 표정 수준, 식물에서 잔여 미생물 충전 조직 구두 전달, 위 소화를 GAD65의 저항 및 야생 유형으로 변형 된 식물의 bioequivalence에 대 한 의미.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 붉은 사탕 무 우와 시금치 재배
- 붉은 사탕 무 우 성장 (B. vulgaris 이력서 물 랑 루즈), 시금치 (S. 올레라케아 이력서 산업) 식물 성장 챔버에 각각 23/21 ° C에서의 빛의 강도, 65% 상대 습도, 명암 주기 12 h 150 µE를 사용 하 여.
- 씨앗 발 아 후 거 름 식물 상용 비료 (자료 테이블)의 1 g/L 해결책으로 일주일에 두 번. Agroinfiltration에 대 한 5 주 된 시금치 및 6 주 오래 된 빨간 무 우 식물을 사용 합니다.
2. 과도 식 deconstructed 식물 바이러스 기반 기술을 통해
- 공장 식 벡터의 건설
- 벡터-5' 모듈 (pICH20111), 3' 모듈 (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut 및 pICH7410.eGFP), 앞에서 설명한1,,27, 준비 및 integrase 모듈 (pICH14011)-소개 Agrobacterium tumefaciens GV3101 변형 표준 기술을 사용 하 여. 28 ° c.에 2 일 동안 50 μ g/mL 리 팜 피신과 적절 한 벡터 특정 항생제 (50 μ g/mL carbenicillin pICH20111, pICH14011 및 pICH7410.eGFP), pICH31070에 대 한 50 μ g/mL 대를 포함 하는 파운드 매체에 성장
- 식민지 각 벡터에 대 한 다음과 같은 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 식민지 화면: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3', 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 3' 모듈 pICH31070.GAD65mut 및 pICH31070.∆87G65mut, 55 ° C의 어 닐 링 온도 110의 신장 시간 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3', 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' 세 번째 3' 모듈 pICH7410.eGFP, 53 ° C의 어 닐 링 온도와 30의 신장 시간에 대 한 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3', 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' 53 ° C의 어 닐 링 온도와 20 s와 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3의 신장 시간 5' 모듈 ' 및 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' 57 ° C의 어 닐 링 온도와 45의 신장 시간 integrase 모듈에 대 한 s.
- 다음 특정 반응 주기를 사용 하 여 20 μ의 전체 볼륨에 PCR 반응을 수행: 5 분 초기 변성 95 ° C에서 30의 35 주기 s 95 ° C, 30에서 어 닐 링 온도 72 ° C에서 신장 단계에서 s (어 닐 링 온도 신장 시간을 다시 각 뇌관 커플에 대 한 특정) 및 72 ° c.에 7 분의 최종 신장 단계
- 주사기 agroinfiltration
- 3 A. tumefaciens transformants 파운드 중간 포함 50 μ g/mL 리 팜 피신 및 다음 적절 한 벡터 특정 항생제의 50 mL에 접종: A. tumefaciens pICH20111와 변형에 대 한 50 μ g/mL carbenicillin pICH14011 또는 pICH7410.eGFP, 또는 50 μ g/mL 대 A. tumefaciens pICH31070와 변형에 대 한. 28 ° c.에 하룻밤 떨고에 의해 성장
- 20 분 동안 4500 x g 에서 원심 분리 하 여 하룻밤 세균성 문화를 작은 고 10 m m 4-morpholineethanesulfonic 산 (MES, pH 5.5)을 포함 하는 침투 버퍼의 100 mL (또는 초기 세균성 문화의 두 개의 볼륨)에 그들을 resuspend 및 10 m m MgSO4, 마약을 고려 하지 않고600. 실 온 (RT) 3 h에서 정지를 품 어.
- 모듈 중 하나는 3, GAD65mut, ∆87GAD65mut 또는 eGFP 3', 5' 모듈 모듈과 integrase 모듈을 포함 하는 세균성 정지의 동등한 볼륨 믹스. 서 스 펜 션 믹스를 사용 하 여 붉은 사탕 무 우와 시금치 잎의 주사기 침투에 대 한.
- 바늘 없는 주사기에는 서 스 펜 션의 5 mL을 배치 합니다. 시금치와 붉은 사탕 무 우 식물, 나뭇잎의 밑면에 대 한 주사기의 끝을 누르고 한편 잎의 다른 쪽에 부드러운 counterpressure을 적용.
- 각 식물에 대 한 정점에서 시작 처음 세 완전히 확장 된 잎을 침투 하 고 잎 줄기에 종이 태그와 agroinfiltrated 잎 레이블을 지정 합니다. 표준 조건 하에서 성장 챔버에 식물을 반환 합니다.
참고: 건강과 안전 이유를 위한 착용 장갑과 눈 보호 침투 과정. - 수집 agroinfiltrated 14 일 게시 감염 (dpi) 액체 질소에서 그들을 고정 하는 4에서 출발 한다. -80 ° c.에 게 식물 조직
- 진공 agroinfiltration
- 28 ° c.에서 밤새 흔들어 파운드 매체 50 μ g/mL 리 팜 피신 및 적절 한 벡터-특정의 50 mL에 별도로 3 A. tumefaciens transformants 항생제 성장
- 20 분에 4500 x g 에서 원심 분리 하 여 펠 릿 하룻밤 세균성 문화 침투 버퍼 0.35의 OD600 의 1 L에 펠 릿을 Resuspend 고 3 h에 대 한 실시간에 정지를 품 어.
- 각 정지에 (폴 20) 세제의 0.01 %v / v를 추가 합니다. 모듈 중 하나는 3, GAD65mut, ∆87GAD65mut 또는 eGFP 3', 5' 모듈 모듈과 integrase 모듈을 포함 하는 세균성 정지의 동등한 볼륨 믹스.
- 삽입 한 공장 (6 주 오래 된 빨간 사탕 무 공장, 섹션 1을 참조) 소유자에서. 홀더를 반전 하 고 침투 목욕 잠수함 침투 정지에서 잎 (2 패)를 포함 하는 비 커 위에 배치 합니다.
주: 모든 나뭇잎 세균 현 탁 액에 담근 완전히는 확인 하십시오. 필요한 경우 추가 침투 정지의 추가 레벨을 올립니다. - 침수 식물 침투 목욕 침투 실로 전송 하 고 그것을 닫습니다. 진공 펌프를 켜고 침투 챔버에 진공 흡입구 밸브를 엽니다.
- 일단 90 mbar 침투 약 실에 있는 압력 감소 했다, 계속 3 분 출시에 대 한 진공 진공 45에 대 한 s. 침투 챔버는 대기압에 반환에, 일단 챔버를 열고 욕조에서는 세균 침투 식물을 제거 합니다.
- 표준 조건 하에서 성장 챔버에 식물을 반환 합니다.
- 재조합 단백질에 따라 최대 식 dpi에서 agroinfiltrated 잎을 수집 하 고 액체 질소에 그들을 동결. -80 ° c.에 게 식물 조직
3. 재조합 형 단백질 표정 분석
- 총 수용 성 단백질 (TSP) 추출
- 주사기를 갈기 또는 진공 침투 붉은 사탕 무 우와 시금치 잎, 2.2.6 단계와 단계에서 2.3.8, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 액체 질소에 정밀한 분말을 수집 합니다. 15 mL 플라스틱 튜브로 분말을 전송 하 고-80 ° c.에 있는 자료를 저장
- 잎 가루 300 밀리 그램을 추출 버퍼 (50 m m 인산 나트륨 pH 8.0, 20mm 나트륨 metabisulphite)의 900 µ L를 추가 합니다.
참고: 버퍼 볼륨 (µ L)으로 식물 조직 무게 (mg) 사이의 선택한 비율 1:3입니다. - 1 분에 대 한 vortexing에 의해 혼합 균질 다음 4 ° c.에 40 분 30000 x g 에서 원심
- 깨끗 한 튜브에 상쾌한 수집 하 고-80 ° c.에 그것을 저장합니다
- 식물 eGFP 시각화 및 정량화
- EGFP 96 잘 접시에 잎, 3 개의 기술 복제, 표현에서 얻은 각 TSP 추출의 100 µ L를 로드 합니다.
- 96 잘 접시를 형광 판독기에 넣고 측정 시작. 485/535 nm 필터 eGFP 형광 검출에 필요한 설정 사용.
- 절대 정량화에 대 한 같은 접시에 준비 보정 곡선 로드 다른 수량 (62.5, 125, 500, 750, 1000 ng) 순화 eGFP의.
- TSP 정량화에 대 한 Bicinchoninic 산 (BCA) 분석 결과
- (자료 테이블) 50 부분의 시 약 A 1 부분 시 약 B (자료 테이블)의 혼합. 샘플 분석 되 고 교정 표준에 대 한 충분 한 양의 신선한 BCA 작업 솔루션을 준비 합니다.
참고: 각 샘플에 필요한 BCA 작업 솔루션의 볼륨은 1.9 mL. 9 표준 (를 포함 하 여 빈) 표준 절차, BCA 작업 솔루션의 17.1 mL이 필요 합니다. - 각 표준 (를 포함 하 여 빈), 그리고 TSP 추출 물 이라는 관으로의 0.1 mL 플라스틱
참고: 교정 표준으로 준비 신선한 집합이 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 샘플, 물 등으로 가급적 같은 희석제를 사용 하 여 10-1000 μ g/mL 범위에서. 교정 표준 및 샘플 준비에 사용 되는 희석제의 0.1 mL 빈에 의하여 이루어져 있다. - 1.9 mL BCA 작업 솔루션을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 튜브를 커버 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 실시간 측정 562에서 흡 광도를 튜브 쿨 10 분 이내 모든 샘플의 nm.
참고: RT, 에서도 색상 개발 계속 됩니다. 10 분 이내 모든 튜브의 흡 광도 측정 한다면 상당한 오류를 소개 합니다. - 표준과 TSP 추출의 판독에서 빈의 562 nm 흡 광도 값을 뺍니다.
- 플롯 빈 수정 562 nm의 농도에 각 표준에 대 한 읽기. 각 TSP 추출의 단백질 농도 결정 합니다.
- (자료 테이블) 50 부분의 시 약 A 1 부분 시 약 B (자료 테이블)의 혼합. 샘플 분석 되 고 교정 표준에 대 한 충분 한 양의 신선한 BCA 작업 솔루션을 준비 합니다.
- Gecchele 외8앞에서 설명한 대로 얼룩 Coomassie 젤을 수행 합니다.
- 서쪽 오 점 분석
- Gecchele 외8앞에서 설명한 서쪽 오 점 분석을 수행 합니다.
- 단백질 전기 이동 별거 후에 니트로 막 표준 기술을 사용 하 여 전송. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) pH 7.4에에서 4% 우유를 혼합 하 여 차단 솔루션을 준비 합니다. 1 시간에 대 한 실시간에 차단 솔루션의 10 mL와 함께 막을 차단 합니다.
- 안티-GAD65/67 및 안티-LHCB2, 1:10,000 및 1:20,000 안티 eGFP 0.1% 세제로 차단 솔루션의 5 mL에 대 한 토끼 항 기본 체를 준비 합니다. 준비 된 1 차적인 항 체 솔루션 4 ° C에서 하룻밤 또는 일정 한 동요와 RT에 4 h 막 품 어.
- 1 차적인 항 체를 삭제 하 고 차단 솔루션 0.1% 세제를 포함 하 5 분에 대 한 3 번 막 씻어.
- 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 준비-0.1% 세제 솔루션을 차단에 1:10,000에서 어원이 안티 토끼 항 체. 일정 한 동요와 RT에 1.5 h 막 품 어.
- 이차 항 체를 삭제 하 고 각 PBS-t (PBS 0.1% 세제로 보완) 5 분에 대 한 5 번 막 씻어.
- 제조업체의 지침에 따라 상용 luminol 솔루션 멤브레인을 품 어. 화학 이미징 시스템을 사용 하 여 신호를 감지 합니다.
4. 식물 소재 처리
- 수확 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 빨간 무 우 식 피크 (11 dpi)에서 나뭇잎과 액체 질소에 그들을 동결.
- 0.04 mbar-50 ° C에서 72 h에 대 한 냉동된 잎 lyophilize -80 ° c.에서 그들을 저장합니다
- 정밀한 분말을 잎을 갈기 고 수 분을 제외 하 실리 카 겔 컨테이너를 밀봉된에 RT에 저장 합니다.
5. 위 소화 시뮬레이션 및 셀 무결성 분석
- 위 소화 시뮬레이션
- 6 mL PBS (pH 7.4)에 resuspend 및 grinded 동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램 무게.
- 6 M HCl와 2 샘플 pH를 조정 합니다.
- 10 m m HCl 1 mg/mL의 펩 신 최종 농도 또는 1:20 총 수용 성 단백질의 비율을 돼지 위 점 막에서 4 mg/mL의 펩 신을 추가 합니다. 120 분 동안 37 ° C에서 샘플을 흔들어.
- 비활성화는 펩 신을 1 M NaOH로 pH 8에 샘플을 조정 합니다.
- 20000 x g 4 ° c.에 20 분에 각 샘플의 750 µ L aliquots 원심 상쾌한 별도로 수집 하 고 버퍼를 로드의 표면에 뜨는 볼륨 하나에 펠 릿을 resuspend (1.5 M Tris HCl, pH 6.8, 3 %SDS, 15% 글리세롤, 및 4 %2-mercaptoethanol).
참고: 건강과 안전 이유를 위해 장갑을 착용 하 고 샘플 준비에 대 한 증기 두건에서 작동. - 서쪽 오 점 분석8여는 상쾌한와 resuspended 펠 릿을 분석.
- 셀 무결성 분석
- Grinded 동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램의 두 샘플을 준비 하 고 6 mL PBS (pH 7.4)에 둘 다 resuspend.
- 하나는 6 M HCl. 흔들어 2 120 분 동안 37 ° C에서 두 샘플 샘플만의 pH를 조정 합니다.
- 20000 x g 4 ° c.에 20 분에 각 샘플의 750 µ L aliquots 원심 상쾌한 별도로 수집 하 고 버퍼를 로드의 표면에 뜨는 볼륨 하나에 펠 릿을 resuspend.
- 서쪽 오 점 분석은 상쾌한 및 resuspended 펠 릿을 분석 합니다.
6. Bioburden 분석 결과
- 동결된 붉은 사탕 무 우 잎의 100 밀리 그램 무게. 8 mL의 멸 균 PBS (pH 7.4)에 1 분 동안 소용돌이 분말 resuspend
- 항생제 또는 (i) 50 µ g/mL 리 팜 피신, 리 팜 피신과 carbenicillin의 각 (ii) 50 µ g/m l, (iii) 50 µ g/mL 각 리 팜 피신과 대, 또는 (iv) 50 µ g/mL 각 리 팜 피신, carbenicillin, 고 대를 포함 하지 않고 파운드 매체를 준비 합니다.
- 플레이트 5 선택적 파운드 미디어 중에서 각 동결된 잎 homogenate의 1 mL.
- 28 ° c.에 3 일 동안 모든 접시를 품 어
- 각 접시에 성장 Agrobacterium 식민지를 계산 합니다.
- 계산 하 고 동결된 잎 homogenate (CFU/mL)의 mL 당 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 수로 잔여 세균 전을 정의 합니다.
7. 대사 산물 추출
- 1 차 대사 산물 추출
- 저장-80 ° C의 30 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 2 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.
- 2 시간 동안-20 ° C에서 30 미 품에 대 한 차가운 70/30 (v/v) 메탄올/클로 프롬 및 소용돌이의 750 µ L를 추가 합니다.
참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다. - 새로운 2 mL 튜브에 냉 수와 10 분 수집에 대 한 17,900 x g 4 ° c에서 원심 분리기 및 전송의 600 µ L 위 hydroalcoholic 단계를 추가 합니다. 더 낮은 chloroformic 위상과 interphase를 삭제 합니다.
- 용 제 증발에 3 h에 대 한 진공 집중 장치에 샘플을 넣어.
- 50/50 (v/v) 이기/물 단계 7.1.4에서 300 µ L에서 얻은 펠 릿을 녹이 고 3 분에 대 한 샘플을 sonicate.
- 0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 하 고는 투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브에 넣어.
- 2 차 대사 산물 추출
- -80 ° C 저장의 300 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 15 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.
- 메탄올와 동 30의 3 개 mL를 추가 s, 그리고 15 분 동안 40 kHz에서 sonicate.
참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다. - 10 분 동안 4 ° C에서 4500 x g 에서 샘플 원심 고 새로운 15 mL 튜브는 supernatants 전송.
- 희석 100 µ L의 추출 물으로 1:3 (v/v) 하 고 0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다.
- 투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브로 솔루션을 넣어.
- 극 지 지질 추출
- 저장-80 ° C의 200 밀리 그램의 무게, 진공 agroinfiltrated ∆87GAD65mut 표현 15 mL 플라스틱 튜브에 붉은 사탕 무 우 잎 가루.
- 물 200 µ L 그리고 메탄올의 2 개 mL를 추가 하 고 1 시간을 위한 얼음에 계속.
참고: 모든 용 매와 첨가제 LC MS 학년 이어야 합니다. - 30 대 한 소용돌이 s와 15 분 동안 40 kHz에서 sonicate.
- 원심 25 분 수집 4 ° C에서 4500 x g 에서 샘플 및 전송 클로 프롬 단계 2 mL 튜브로. 위 hydroalcoholic 위상과 interphase를 삭제 합니다.
- 용 매 증발에 3 h에 대 한 진공 집중 장치에 샘플을 넣어.
- 단계 7.3.5 오디오 메탄올의 600 µ L에서에서 얻은 펠 릿을 디졸브.
- 희석 100 µ L 1:5 (v/v) 메탄올 추출 하 고 0.2 μ m 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다.
- 투명 고정된 300 µ L 삽입 유리 튜브로 솔루션을 넣어.
8. 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 분석 및 데이터 처리
- 공급 업체에서 권장 하는 대로 LC-MS 시스템을 설정 합니다.
참고: C18 열 (150 x 2.1 m m, 입자 크기 3 µ m) 앞 C18 가드 열 (75 x 2.1 m m, 입자 크기 5 µ m)의 2 차 대사 산물 및 극 지 지질 분석에 대 한 장착 HPLC 결합 한 autosampler LC 섹션 구성 반면 (150 x 2.1 m m, 입자 크기 2.7 µ m) HILIC 열 앞 HILIC 가드 열 (7.5 x 2.1 m m, 3 µ m). MS는 분무 이온화 (ESI) 또는 대기압 화학 이온화 (APCI) 소스와 함께 제공 되는 이온 트랩 질량 분석기 이다. - HPLC 그라디언트에 대 한 적절 한 용 매를 준비 합니다. 주 대사 산물 분석에 대 한 사용 하 여 20 m m 염화 편대 용 매 a; 95% 이기, 5% 수 플러스 10 m m 염화 편대 용 매 b.로 2 차 대사 산물 분석 물 플러스 0.05% 개미 산 (A)와 이기 플러스 0.05% 개미 산 (B)를 사용 하 여. 극 지 지질 분석 물 플러스 0.05% 개미 산 (A) 및 100% 이기 (B)를 사용 하 여.
참고: 용 제, 첨가제, LC-MS 학년 이어야 합니다. - 대사 산물 차입에 대 한 표 1 에 보고 된 그라디언트를 사용 합니다. 반면 0.2 mL/분 주사 10 µ L의 2 차 대사 산물 및 극 지 지질, 각 샘플에는 흐름 속도 설정 기본 대사 산물에 대 한 5 µ L를 주사.
- 각 실험 조건의 대표적인 혼합 다른 샘플의 동등한 부분을 혼합 하 여 품질 관리 (QC) 샘플을 준비 합니다. 악기 효율성을 모니터링 하는 실험 중 QC 샘플을 분석. 특히, 각 10 샘플 배치 후 QC 샘플 분석을 삽입 합니다.
- 악기 기반 효과 피하기 위해 샘플을 무작위.
- 9 분석 후 청소 방법 및 빈 분석 열 삽입 후 즉시.
참고: 강한 용 매의 높은 비율에 isocratic 차입과 두 용 매 사이 느린 그라데이션을 수행 합니다. 빈 순수한 메탄올의 주입으로 구성 됩니다: 다음 분석에 보존 시간 재현성을 향상 시키기 위해 물 (50/50, v/v). - 표 2에 나열 된 매개 변수를 사용 하 여 다른 긍정적이 고 부정적인 이온화 모드에서 질량 스펙트럼을 취득 하는 악기를 설정 합니다.
참고: 다른 매개 변수는 특정 플랫폼에 따라 달라 집니다. - 달 산 외.9에 설명 된 대로 다음 데이터 처리를 수행 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 작품에서 식용 식물 조직에서 구강 백신의 개발에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 이 작품의 초점은 식용 호스트 식물 종에 대상 단백질의 표현과 잠재적인 구강 백신의 특성 이다.
첫 번째 단계는 식용 식물 시스템에서 재조합 단백질을 생산 하는 식물 바이러스-기반 식 기술의 적합성의 평가 참여. 이 목표를 위해 우리가 먼저 사용는 eGFP 모델 단백질으로 하 고 우리 두 식용 잎이 많은 식물 시스템으로 표현: 붉은 사탕 무 우와 시금치. 식물은 수동으로 A. tumefaciens eGFP 재조합 식 벡터 운반의 정지 된 agroinfiltrated 이었다. 형광 단백질 표정 서쪽 오 점 분석 (그림 1A, B, D, E)에 의해 구상 되었고 자외선에서 계량. 결과 최대 eGFP 수준 (113.4 ± 0.3 µ g/g FLW) 11 dpi ( 에서 측정 되었다 시금치 보다 붉은 사탕 무 우 시스템 544.9 ± 10.9 µ g/g의 신선한 잎 무게 (FLW) 9 dpi (그림 1C)에 도달 높은 eGFP 식으로 특징은 나타났다 1 층 그림). 이러한 이유로 붉은 사탕 무 우 식 호스트 모든 후속 실험으로 선정 됐다.
첸 외10에 따르면 eGFP 과도 식 대규모 백신 생산을 위한 더 적당 한 침투에 대 한 진공 방법에 의해 시험 되었다. A. tumefaciens 문화, 10-1 에서 10-3및 세제의 다른 농도 이르기까지 하룻밤의 다른 희석 (0.005-0.05%) 최대 식 dpi (9 dpi)에서 eGFP 축적 수준을 비교 하 여 테스트 되었습니다. 결과 더 높은 세균성 titers 큰 eGFP 수확량을 생산 발견 (10-1 ~ 0.35). 그러나, 중요 한 차이가 다른 세제 농도 (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여 발견 했다.
다음, 식물 진공 0.35 OD600 및 세제의 0.01%에는 A. tumefaciens 현 탁 액으로 침투 했다. 두 형태의 GAD65, GAD65mut는 N-말기의 표현 양식 (∆87GAD65mut), 잘린 식 플랫폼 및 배달 시스템 설치 되었다, 일단 최대 식의 날에 비교 했다 5와 11 dpi, 각각,로 이전 설립된11. Agroinfiltrated에서 TSP 추출 잎, 모든 샘플 서쪽 오 점 분석 했다 고 재조합 단백질은 비교적 densitometry 분석 (그림 2)에 의해 정량 합니다. 결과 GAD65mut 통해 ∆87GAD65mut 폼의 20-fold 고성능을 강조 했다. 잘린된 양식은 따라서 높은 201.4 29.3 ± µ g/g FLW 11 dpi에서 붉은 사탕 무 우 잎에 축적 선호 구강 백신 후보자로 선정 되었다.
마지막으로, 잠재적인 경구 백신의 개발에 대 한 매개 변수를 평가 했다. 재조합 형 단백질 무결성 동결 진공의 ∆87GAD65mut을 표현 하는 붉은 사탕 무 우 잎에 침투 후 치료 (만 언)와 비교에서 평가 되었다 서쪽 오 점 분석에 의해 조직. 그림 3A에서 같이, 대상 단백질 동결은 과정 후 안정적인 것으로 설명 했다.
위 소화의 시뮬레이션 또는 TSP 1시 20분의 비율로 1 mg/mL의 최종 농도에 돼지 위 효소 펩 신을 추가 하 여 동결된 자료에 실행 되었다. 서쪽 오 점 분석에 의해 입증으로 모두 소화 치료 조건 재조합 단백질 저하에서 결과 (그림 3C, D, E, 1 mg/mL의 펩 신 최종 농도 대해서만 데이터 보고). 펩 신 소화 (레인 펩 신, p 1-3), 동결 치료, 후 식물 세포 대상 단백질 저하로 이어지는 그들의 무결성 손실 제안 후 펠 렛 샘플에서 특정 신호의 부재.
셀 무결성의 평가 그 때 말린된 식물 조직 중립 ph (pH 7.4), ∆87GAD65mut 버퍼에 resuspended는 되었다 부분적으로 solubilized, 적어도 일부 셀 잎을 분쇄 하 고 건조 하는 동안 부서 졌다 하는 것을 건의 했다. 산 성 조건에서 말린된 식물 조직의 물의 resuspension 대신, 불용 성 부분에서 서만 ∆87GAD65mut의 검출 이끌어 냈다. 이것은 아마 손상 되지 않은 세포11의 단백질 콘텐츠 이외에 낮은 pH에 기인한 ∆87GAD65mut 강수량 때문 이었다. 이러한 분석을 동결 건조 백신 후보자의 준비에 대 한 치료로 서 선택할 수 있는 것을 나타냅니다.
또한, agroinfiltrated 붉은 사탕 무 우 잎에 잔류 미생물 충전 평가 했다.
Bioburden 분석 결과 후보 백신 준비에 대 한 악용 치료 세균성 부하11제거 표시 됩니다.
∆87GAD65mut 및 제어 붉은 사탕 무 우 식물의 대사 bioequivalence의 차 및 2 차 대사 산물 및 극 지 지질 9 붉은 사탕 무 우 식물 ∆87GAD65mut, 9 agroinfiltrated 컨트롤을 표현에서 LC-MS에 의해 생성 된 지문에 의해 평가 되었다 고 9 야생-타입 컨트롤입니다. PCA 통계 야생-타입 식물 클러스터를 다른 모든 샘플에서 분리 밝혔다. 상당한 차이가 대신 ∆87GAD65mut 및 침투 및 부정적인 제어 식물 사이 강조 했다. 또한, 극 지 지질 프로 파일의 관점에서 식물의 3 개 그룹 중 상당한 차이가 확인된11했다.
그림 1: 비교의 eGFP 식 수준 agroinfiltrated 붉은 사탕 무 우와 시금치 잎. 서쪽 오 점 분석 (A, D) 및 해당 로드 컨트롤 (RuBisCO 큰 소 단위) Coomassie 화려한 블루 (B, E)의 eGFP 표현에서 단백질 추출 물 묻은 잎 샘플 14 4에서 시간 코스 분석 중 수집 일 게시 감염 (dpi). 각 리프 단백질 추출의 eGFP 콘텐츠 형광 측정 (C, F)에 의해 정량 했다. Agroinfiltrated 붉은 사탕 무 우 잎 샘플에서 결과 agroinfiltrated 시금치 샘플 오른쪽에 표시 되어 있는 왼쪽된 패널에 표시 됩니다. 같은 양의 단백질 추출 되었습니다 로드, 서쪽 오 점을 위해 3.5 µ g과 30 µ g Coomassie 얼룩에 대 한 합니다. 안티 eGFP 항 체는 서쪽 오 점 분석에 프로브로 사용 되었습니다. 쪽 번호 kDa에 분자 질량 마커를 나타냅니다. 시공, 긍정적인 통제, 10 상업 재조합 인간 GAD65;의 ng 노스캐롤라이나, 부정적인 컨트롤 A. tumefaciens 들고 5'와 전적으로 침투 하는 잎에서 추출-integrase 모듈. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험에서 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림은 Bertini 외.11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 붉은 사탕 무 우 잎에 GAD65mut 및 Δ87GAD65mut 식 수준. 서쪽 오 점 분석 (A) 및 해당 로드 제어 (RuBisCo 큰 소 단위) Coomassie 화려한 블루 (B) Δ87GAD65mut (왼쪽)와 GAD65mut (오른쪽) 3 개의 붉은 사탕 무 우 잎에서 추출 물 단백질의 스테인드. 항 GAD 항 체는 서쪽 오 점 분석 (레인 GAD65mut에 대 한 추출의 20 μ와 Δ87GAD65mut에 대 한 추출의 1 μ 로드)에 프로브로 사용 되었습니다. 젤을 얼룩이 Coomassie 동일한 양의 단백질 추출 물 (10 μ/레인) GAD65mut 및 Δ87GAD65mut에 대 한 로드 되었습니다. 쪽 번호 kDa에 분자 질량 마커를 나타냅니다. 시공, 긍정적인 통제, 10 상업 재조합 인간 GAD65;의 ng 노스캐롤라이나, 부정적인 컨트롤, A. tumefaciens 들고 5' 만으로 침투 잎에서 얻은 추출 물-integrase 모듈. (C) 사용 하 여 서쪽 오 점 긍정적인 통제 densitometric 분석, 두 단백질 형태의 상대 식 수준에 대 한 참조로 구성 됩니다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험에서 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림은 Bertini 외.11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 구강 백신 후보 평가. 왼쪽된 측에, 치료 (A, B) 동결 후 단백질 안정성의 분석. 서쪽 오 점 분석 (A) 및 해당 젤 Coomassie 화려한 블루 (B) 대표 하는 Δ87GAD65mut을 표현 하는 잎에서 3 개의 독립적인 추출 스테인드. 수확된 잎 직접 (신선한) 냉동 또는-50 ° C, 72 h (동결 건조) 0.04 mbar에서 동결 건조 된. 다른 조직: 버퍼 비율 TSP 추출 하는 동안 탈수로 인해 물 손실을 고려 하기 위하여 채택 되었다. 동일한 양의 추출 물 0.25와 서쪽 오 점 및 각각 얼룩 Coomassie 10 µ L 로드 되었습니다. 항 GAD 항 체는 사용 측면을 조사 하는 서쪽 오 점을 위해 숫자 kDa에 분자 질량 마커를 나타냅니다. 노스캐롤라이나, 부정적인 컨트롤 A. tumefaciens 들고 5'와 전적으로 잎 infiltrated에서 추출-integrase 모듈. 생체 외에서 오른쪽에 Δ87GAD65mut의 위 소화를 시뮬레이션 (C, D, E). 서쪽 오 점 분석 (C, D)와 해당 젤 Coomassie 화려한 블루 (전자) 대표 하는 시뮬레이션된 위 소화 후 Δ87GAD65mut을 표현 하는 나뭇잎의 3 개의 독립적인 추출 스테인드. 1 mg/mL의 펩 신 효소를 사용 하지 않고 동결 건조 된 조직, 컨트롤 샘플 동안 100 밀리 그램에 추가 되었습니다. 24 µ L과 supernatants (s) 및 펠 릿 (p) 각각 최종 원심 분리 단계에서 얻은 16 µ L SDS 페이지 분석을 위해 사용 되었습니다. 안티 갓 (C)와 안티-LHCB2 (D) 항 체는 서쪽 오 점 분석에 있는 조사로 사용 되었다. 쪽 번호 kDa에 분자 질량 마커를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 주 대사 (100 분) | 시간 (분) | % A | % B | 기간 (분) | 유형 |
| 초기 | 0 | 100 | - | 초기 조건 | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Isocratic | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | 그라데이션 | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | Isocratic | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | 그라데이션 | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | Isocratic | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | 그라데이션 | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | Isocratic (재 평형) | |
| 2 차 대사 산물 (60 분) | 시간 (분) | % A | % B | 기간 (분) | 유형 |
| 초기 | 98 | 2 | - | 초기 조건 | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | 그라데이션 | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | 그라데이션 | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | 그라데이션 | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | 그라데이션 | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | Isocratic | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | 그라데이션 | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | Isocratic | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | 그라데이션 | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | Isocratic (재 평형) | |
| 극 지 지질 (90 분) | 시간 (분) | % A | % B | 기간 (분) | 유형 |
| 초기 | 50 | 50 | - | 초기 조건 | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | 그라데이션 | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | Isocratic | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | 그라데이션 | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | Isocratic (재 평형) |
표 1: LC MS 분석에서 대사 산물 차입에 대 한 그라데이션 조건.
| 질량 분석기 구성 요소 | 함수 | 매개 변수 | ||||
| 1 차 대사 산물 | 2 차 대사 산물 | 극 지 지질 | ||||
| 분무 이온화 (ESI) 소스 | Nebulizing 가스 | 50 psi, 350 ° C | 50 psi, 350 ° C | - | ||
| 가스 건조 | 10 L 분-1 | 10 L 분-1 | ||||
| 대기압 화학 이온화 (APCI) 소스 | Nebulizing 가스 | - | - | 50 psi, 350 ° C | ||
| 가스 건조 | 10 L 분-1 | |||||
| 기화 기 | 450 ° C | |||||
| 이온 트랩 및 검출기 스캔 | 완전 한 스캔 모드 | 초당 13000 m/z | 초당 13000 m/z | 초당 13000 m/z | ||
| 50-1500 m/z | 50-1500 m/z | 50-1500 m/z | ||||
| 스캔 범위 | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| 질량을 대상 | ||||||
| 충돌 가스 | 헬륨 | |||||
| 진공 압력 | 1.4 x 10-5 mbar | |||||
| 모 세관 소스 | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| 엔드 플레이트 오프셋 | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| 제비 갈매기 | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| 모자 출구 | 106 V | -121 V | 143.5 V | |||
| 10 월 1 일 DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| 10 월 2 일 DC | 1.7 V | -1.7 V | 2 V | |||
| 렌즈 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| 렌즈 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| 긍정적인 이온화 모드에 대 한 ICC | 20 | |||||
| 부정적인 이온화 모드에 대 한 ICC | 7 | |||||
표 2: 다른 긍정적이 고 부정적인 이온화 모드에서 질량 스펙트럼 수집에 대 한 매개 변수입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 연구에서 우리는 자기 면역 당뇨병에 대 한 후보 구강 백신의 설계에 대 한 예비 분석을 보였다. 이 실험에 대 한 대상 단백질 돌연변이 형태의 인간의 65 kDa 조미료 Decarboxylase, 어떤 생산 및 기능은 쉽게 감지 하 고 측정 가능한12했다. 다른 식용 식물 조직에 그것의 식5벡터는 아주 짧은 시간 프레임에서 재조합 단백질 생산의 높은 수준에서 중재 중재 했다. 붉은 사탕 무 우에 eGFP 식에 따라 식용 호스트 수행한 최고의 후보 식물의 선택 하 고 수동 agroinfiltration에 의해 시금치 잎. 이 단계 수동 agroinfiltration의 시간이 걸리는 절차 및 시금치 잎 조직 침투에 경도 산업을 위한 중요 한 수 있습니다.
재조합 단백질에 대 한 최상위 재조합 단백질 축적을 주는 수확의 특정 dpi의 식별 중요 한 단계 이며 테스트 하 여 사건에-의해-사건을 기준으로 선택 해야 합니다. (4 ~ 12)에서 다른 dpi에 형광 단백질 표정 분석 각 공장 시스템에 최대 식의 하루를 식별 수 있습니다. 최대 식 요즘에서 eGFP 농도 (µ g/g FLW), 사이 비교 강조 그 빨간 사탕은 재조합 단백질 생산량 측면에서 플랫폼을 수행 하는 최고.
이러한 이유로, 붉은 사탕 무 우 더 백신 산업 대규모 생산13에 대 한 더 적합 한 것으로 간주 됩니다 진공 시스템에서 식물 바이러스-기반 벡터의 배달에 대 한 테스트 되었습니다.
그 담배 종5표준 진공 침투 프로토콜 최적화, 다양 한 식물 종으로 간주 절차 조정에 대 한 매개 변수 설정 중요 한 포인트입니다. 그런 다음, 빨간 무 우 진공 agroinfiltration 프로토콜 최적화 되었다. 우리의 증거 Agrobacterium 희석 리프 침투성 강화에 세제 농도 동안 단백질 식 수준 향상에 중요 한 보여주었다. 이 작업 목적에 맞는 기술과 공장 시스템 결과 보였다.
두 가지 형태의 GAD65, GAD65mut, ∆87GAD65mut, 이전 명. benthamiana7, 다른 하위 셀룰러 지역화를 표시에 그들의 표현에 대 한 특징은 붉은 사탕 무 우에 진공 침투에 의해 표현 되었다. 3 생물 복제는 모든 샘플에 대 한 준비가 되어 있었다. 각 생물 복제 GAD65 형태에 대 한 14 dpi로 2에서 샘플링 하는 다른 식물에서 3 침투 잎의 풀 구성. 그들의 식 수준 높은 축적 단백질 식물 조직에서 선택와 비교 되었다.
Densitometry 분석에 의해 상대 정량화는 ∆87GAD65mut 20-fold 높은 식 수준 그대로 보다는 설명 했다. 이 수 수 그것의 cytosolic 지역화로 인해 GAD65mut, 세포 막에이 양식을 앵커의 잔류물 때문에7, 수익률 낮은 하는 동안 반영 낮은 단백질 안정성. 붉은 사탕 무 우 잎 조직에서 ∆87GAD65mut 평균 축적 수준은 T1D 경구 백신 개발 시작 하기에 충분 한 201.4 29.3 ± µ g/g FLW, 이었다.
마지막으로, 가장 적합 한 플랫폼, 기술, 단백질 형태의 선택 후 우리는 감염 된 잎의 수확 후 처리를 설정 하 여 진행. 잎 조직이 95% 물로 구성 되어, 이후 탈수 처리는 미생물 오염을 방지 하기 위해 유용 합니다. 우리의 결과 동결 처리에 적용할 수 샘플, 잎에 있는 재조합 형 단백질 수준의 영향을 주지 않고 설명 했다. 동결은 여 10 물 제거 세균 오염 (bioburden), agroinfiltration 절차에 대 한 사용 재조합 A. tumefaciens 를 포함 하 여 제거 합니다.
또한, 단백질 바이오 캡슐의 분석은 ∆87GAD65mut 시뮬레이션된 위 소화 다음 소화 완전히는 보여주었다. 이 동결 처리 식물 세포 벽, 재조합 단백질의 위 환경 산 및 효소에 노출 피해 나왔다.
흡수의 사이트로 위장 전환을 통해 단백질 또는 펩 티 드 분자 무결성의 유지 관리 구강 약물 전달14에 대 한 문제를 나타냅니다. 따라서, 탈수 처리 후 잠재적인 백신 해야 제대로 책정의 무결성의 손실 없이 위 환경 극복 하. 식물 파생 된 갓 백신의 제조에서 상대적으로 안정적인 셸에서 캡슐화 그것을 보호 하 고 구강 배달 경로15에 따라 안정적인 수 있도록 효율성을 개선 하는 시스템으로 적용할 수 있습니다.
높은 캡슐화 효율을 보여준 인슐린과 신속한 인슐린 합성 하이드로 겔의 complexation에 최근 연구 등 고분자의 구두 납품과 관련 된 문제를 극복 하기 위해 다양 한 기술은 탐험 되어 pH 의존 방식으로16,17창에 놓습니다.
모두는 차 및 2 차 대사 산물 bioequivalence 침투 및 비 침투 컨트롤에 비해 ∆87GAD65mut을 표현 하는 식물의 PCA 통계를 사용 하 여 조사 했다. 비 침투 야생-타입 식물 별도 클러스터를 형성 하는 반면 ∆87GAD65mut와 침투 컨트롤 침투 식물의 차이점, 중요 한 되지 않았습니다. 이러한 결과 침투 식물 세균 대사 산물 또는 대사 산물과 같이 이미 문학13침투 때문에 식물에 의해 생산 덕분에 LC MS 분석 치료 식물에서 구별 됩니다 것이 좋습니다. 전반적으로이 분석 ∆87GAD65mut의 축적 전반적인 신진 대사에 거의 영향을 주지는 설명 했다.
이 결과 동결된 붉은 사탕 무 우 잎 조직 ∆87GAD65mut 식물 바이러스-기반 식 기술 이용 얻은 표현으로 표현 하는 잠재적인 구강 백신은 실험 T1D 구두 immunotherapy 적합 제안 하는 모두 재판입니다. 식물 바이러스 식 벡터 기술 과도 식 필드의 신속 하 고 높은 수준에서 외래 단백질을 생산 하는 능력 때문에 매우 매력적인 되고있다. 이 기술은 RNA 중 합 효소 RNA 의존 및 운동 단백질5 deconstructed 벡터 기반 되 고 따라서 그것은 그것의 infectivity 식물; 결과적으로, 인 간에 게 그것의 잠재적인 전송 제외 해야 합니다.
여기 보고 실험 프로토콜 많은 식용 종, 상 추, 등 명 capitatum 및 번 expansa를 연장 될 수 있습니다. 붉은 사탕 무 우, 시금치를 포함 하 여,이 종의 잎부터 그 이전 좋은 식 공장 시스템5, 발견 되었다 요리 하지 않은 음식으로 사용할 수 있습니다., 그리고 여기에 제안 된 기술 제조 식용 백신 또는 사용 될 수 있습니다. 최소 가공된 기능성 식품 또는 사료의 생산입니다.
재조합 형 단백질/식물의 조합, 재조합 단백질 축적 최상위 주는 수확의 dpi 필요가 여전히 표현 재조합 단백질에 따라 케이스에 의해-사건을 기준 및 호스트에서 경험적으로 확인할 수 식물 종18.
구강 백신의 생산에 대 한이 기술의 응용 프로그램이 기존의 백신 가까운 장래에, 전투 oncolytic 바이러스, 림프 종 및 단단한 종양에 대 한 헌 백신 이외에 대안이 될 큰 잠재력이 고 대상 암19,20단일 클론 항 체.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 공동 프로젝트 "자가 면역 당뇨병 식용 백신 (eDIVA)의 생산을 위한 식물의 사용"에 의해 지원 되었다 (프로젝트 ID: 891854) 베로나 대학 전화 2014의 프레임 워크에 의해 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
References
- Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
- Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
- Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957 (2010).
- Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
- Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
- Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
- Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
- Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
- Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
- Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
- Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
- Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
- Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
- Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
- Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
- Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
- Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).
