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Bioengineering

Expresión transitoria en remolacha roja de una vacuna candidata biofarmacéutica para la Diabetes tipo 1

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59298
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biotechnology, University of Verona
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para producir a un candidato de vacuna oral contra la diabetes tipo 1 en una planta comestible.

Abstract

Planta la agricultura molecular es el uso de plantas para producir moléculas de interés. En esta perspectiva, las plantas pueden utilizarse tanto como biorreactores para la producción y purificación posterior del producto final y para la administración oral directa de proteínas heterólogas al utilizar especies de plantas comestibles. En este trabajo presentamos el desarrollo de la vacuna oral contra la Diabetes de tipo 1 (T1D) candidato en sistemas de plantas comestibles utilizando tecnología del ADN recombinante basado en el virus de la planta deconstruido, entregada con infiltración vacío. Nuestros resultados muestran que una remolacha roja es un huésped adecuado para la expresión transitoria de un autoantígeno derivada humana asociada a T1D, considerado como un candidato prometedor como vacuna T1D. Hojas produciendo el autoantígeno bien se caracterizaron por su resistencia a la digestión gástrica, la presencia de carga bacteriana residual y su perfil metabólico secundario, dando una visión general de la producción de proceso para el uso potencial de las plantas para administración oral directa de una proteína heteróloga. Nuestro análisis demostró la degradación casi completa de la vacuna oral liofilizada candidato tras una digestión gástrica simulada, lo que sugiere que una estrategia de encapsulación en la fabricación de la vacuna de GAD de origen vegetal se requiere.

Introduction

Desde la revolución de biología molecular de plantas en la década de 1980, los sistemas basados en plantas para la producción de biofármacos pueden considerarse como una alternativa a los sistemas tradicionales basados en células microbianas y mamíferos1. Las plantas muestran varias ventajas sobre las plataformas tradicionales, con escalabilidad, eficacia y seguridad, siendo los más relevantes2. El producto recombinante puede ser purificado a partir de tejido vegetal transformado y entonces administrado, ya sea por vía parenteral o por vía oral y, además, transformada de plantas comestibles se pueden utilizar directamente para administración oral. La vía oral al mismo tiempo promueve la inmunidad mucosa y sistémica, y elimina la necesidad de agujas y personal médico especializado. Además, la administración oral elimina el complejo proceso aguas abajo, que normalmente representa el 80% del costo total de fabricación de una proteína recombinante3. Todas esas ventajas se pueden traducir en un ahorro en la producción, insumos y mano de obra reduciendo los costos de cada dosis, lo que el fármaco asequibles a la mayoría de la población mundial.

Varias estrategias, tanto para la transformación estable y expresión transitoria, fueron desarrolladas para la producción de proteínas recombinantes en plantas. Entre ellos, un sistema de expresión basados en virus de planta deconstruido de alto rendimiento (por ejemplo, magnICON) proporciona funcionamiento superior conduce a altos rendimientos de proteínas recombinantes sobre escalas de tiempo relativamente corto4. Se reportan muchos ejemplos de expresión transitoria mediante el sistema de expresión basados en virus vegetales en plantas de Nicotiana benthamiana , siendo el host de producción estándar de oro. Sin embargo, esta planta de modelo no se considera como una especie comestible debido a los alcaloides y otros metabolitos tóxicos que se acumulan en sus hojas.

En este trabajo, describimos la comparación entre dos sistemas de la planta comestible, remolacha roja (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) y espinacas (Spinacea oleracea cv Industria), para la expresión de dos formas de candidato de la isoforma 65 kDa de ácido glutámico decarboxilasa (GAD65), llevado a cabo por la planta basada en virus vectores5. GAD65 es un autoantigen importante asociado a Diabetes de tipo 1 (T1D) y actualmente está bajo investigación en ensayos clínicos en humanos para prevenir o retrasar la T1D induciendo tolerancia6. La producción de GAD65 en plantas se ha estudiado extensivamente en especies modelo como Nicotiana tabacum y N. benthamiana4,5,6,7. Aquí, describimos el uso de especies de plantas comestibles para la producción de la molécula en los tejidos que puede significar para una administración oral directa. Desde un punto de vista técnico, estudia y selecciona el sistema de planta agroinfiltration y la plataforma de plantas comestibles para la producción de GAD65 mediante la evaluación de diferentes parámetros: los niveles de la expresión de proteína recombinante, la carga microbiana residual en la planta tejido para administración oral, la resistencia de GAD65 en la digestión gástrica y la bioequivalencia de las plantas transformadas con el tipo salvaje.

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Protocol

1. rojo cultivo de remolacha y espinacas

  1. Cultivar la remolacha roja (B. vulgaris cv Moulin Rouge) y espinacas (S. oleracea cv Industria) plantas en una cámara de crecimiento, con 150 µE de intensidad de luz, humedad relativa de 65%, ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 23/21 ° C, respectivamente.
  2. Después de la germinación de la semilla, fertilizar las plantas dos veces a la semana con una solución de 1 g/L de fertilizante disponible en el mercado (Tabla de materiales). Para agroinfiltration use espinaca de cinco semanas de edad y plantas de remolacha roja de seis semanas de edad.

2. transitoria expresión a través de la tecnología basada en virus de planta deconstruido

  1. Construcción de vectores de expresión de planta
    1. Introducir los vectores - el módulo de 5' (pICH20111), los 3' módulos (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut y pICH7410.eGFP), preparados como se describió anteriormente1,2,7y el módulo de la integrasa (pICH14011)- en la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 utilizando técnicas estándar. Crecer en medio LB que contienen 50 μg/mL rifampicina y antibióticos apropiados de vectores específicos (50 carbenicilina μg/mL para pICH20111, pICH14011 y pICH7410.eGFP), 50 kanamicina μg/mL para pICH31070 por 2 días a 28 ° C.
    2. Las colonias Colonia PCR utilizando los cebadores específicos siguientes para cada vector de la pantalla: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' y 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' para el 3' módulos pICH31070.GAD65mut y pICH31070.∆87G65mut, con una temperatura de recocido de 55 ° C y un tiempo de elongación de 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' y 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' para el tercer 3' pICH7410.eGFP del módulo, con una temperatura de recocido de 53 ° C y un tiempo de elongación de 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' y 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' para el módulo de 5', con una temperatura de recocido de 53 ° C y un tiempo de elongación de 20 s y 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' y 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' para el módulo de la integrasa con una temperatura de recocido de 57 ° C y un tiempo de elongación de 45 s.
    3. Llevar a cabo la reacción de PCR en un volumen total de 20 μL con el siguiente ciclo de reacción específica: 5 minutos desnaturalización inicial a 95 ° C, 35 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a la temperatura de recocido y el paso de elongación a 72 ° C (temperatura y alargamiento del tiempo de recocido a re específico para cada pareja de imprimación) y a un paso de elongación final de 7 min a 72 ° C.
  2. Jeringa agroinfiltration
    1. Inocular los tres transformantes de a. tumefaciens en 50 mL de-rifampicina de μg/mL LB y 50 medianas que contiene y los siguientes antibióticos apropiados de vectores específicos: 50 carbenicilina μg/mL para a. tumefaciens transformada con pICH20111, pICH14011 o pICH7410.eGFP o 50 kanamicina μg/mL para a. tumefaciens transformada con pICH31070. Crecer por agitación durante la noche a 28 ° C.
    2. Pelotilla de culturas bacterianas durante la noche por centrifugación a 4.500 x g por 20 min y resuspender en 100 mL o dos volúmenes de la cultura bacteriana inicial del búfer de infiltración que contienen ácido 4-morpholineethanesulfonic de 10 mM (MES; pH 5.5) y 10 mM MgSO4, sin tener en cuenta el OD600. Incubar las suspensiones a temperatura ambiente (RT) 3 h.
    3. Mezclar volúmenes iguales de suspensiones bacterianas que contienen uno de los tres módulos, GAD65mut, ∆87GAD65mut o eGFP 3' módulo con 5' módulo y módulo de integrasa. Utilizar la mezcla de suspensión para infiltración de jeringa de hojas de espinacas y remolacha rojos.
    4. Colocar 5 mL de la suspensión en una jeringa sin la aguja. Presione la punta de la jeringa contra la parte inferior de la hoja de espinaca y plantas de remolacha roja y mientras tanto se aplica una contrapresión suave al otro lado de la hoja.
    5. Infiltrarse en las primero tres hojas completamente ampliadas desde el ápice de cada planta. Las hojas de agroinfiltrated con una etiqueta de papel en el tallo de la hoja de la etiqueta. Volver las plantas en una cámara de crecimiento bajo condiciones estándar.
      Nota: Por razones de salud y seguridad, use guantes y protección ocular durante el proceso de infiltración.
    6. Agroinfiltrated recoger las hojas de 4 a 14 días post infección (dpi) y congelar en nitrógeno líquido. Tejido de la planta tienda a-80 ° C.
  3. Agroinfiltration vacío
    1. Crecer por separado las tres a. tumefaciens transformantes en 50 mL de medio LB que contienen 50 μg/mL rifampicina y vector específico apropiado antibiótico por agitación durante la noche a 28 ° C.
    2. Pellets durante la noche las culturas bacterianas por centrifugación a 4.500 x g durante 20 min Resuspender el precipitado en 1 L de tampón de infiltración a un OD600 de 0.35 e incuban las suspensiones a temperatura ambiente durante 3 horas.
    3. Añadir 0.01% v/v del detergente (polisorbato 20) a cada suspensión. Mezclar volúmenes iguales de suspensiones bacterianas que contienen uno de los tres módulos, GAD65mut, ∆87GAD65mut o eGFP 3' módulo con 5' módulo y módulo de integrasa.
    4. Insertar una planta (remolacha roja de seis semanas de edad de la planta, véase la sección 1) en el soporte. Invierta el soporte y coloque encima un vaso de precipitados que contiene el baño de infiltración (2 L) para sumergir las hojas en la suspensión de la infiltración.
      Nota: Asegúrese de que todas las hojas se sumergen completamente en la suspensión bacteriana. Elevar el nivel con la incorporación de la suspensión de infiltración extra si es necesario.
    5. El baño de infiltración con la planta sumergida de transferencia a la cámara de infiltración y ciérrelo. Encienda la bomba de vacío y abrir la válvula de toma de aspiración de la cámara de infiltración.
    6. Una vez que la presión en la cámara de infiltración ha reducido a 90 mbar, mantener el vacío durante 3 minutos lanzamiento el vacío para 45 s. Una vez que la cámara de infiltración ha regresado a la presión atmosférica, abrir la cámara y retirar la planta infiltrada del baño bacteriano.
    7. Volver las plantas en una cámara de crecimiento bajo condiciones estándar.
    8. Recoger hojas de agroinfiltrated en el dpi máxima expresión, dependiendo de la proteína recombinante y congelar en nitrógeno líquido. Tejido de la planta tienda a-80 ° C.

3. Análisis de la expresión de la proteína recombinante

  1. Extracción de proteínas solubles totales (TSP)
    1. Moler la jeringa o vacío se infiltraron en hojas de remolacha y espinacas rojas, recogidos en los pasos 2.2.6 y 2.3.8, a polvo fino en nitrógeno líquido mediante mortero. Transferir el polvo en tubos de plástico de 15 mL y almacenar el material a-80 ° C.
    2. Agregar 900 μl de tampón de extracción (50 mM fosfato de sodio pH 8.0, metabisulfito de sodio 20 mM) a 300 mg de polvo de la hoja.
      Nota: La proporción seleccionada entre peso de tejido de planta (mg) al volumen de buffer (μL) es 1:3.
    3. Homogeneizar la mezcla con un vórtex durante 1 minuto, luego centrifugar a 30.000 x g durante 40 min a 4 ° C.
    4. Recoger el sobrenadante en un tubo limpio y almacenar a-80 ° C.
  2. Planta eGFP visualización y cuantificación
    1. Carga de 100 μl de cada extracto TSP de eGFP expresar hojas, en tres repeticiones de la técnicas, sobre una placa de 96 pocillos.
    2. Poner la placa de 96 pocillos en un lector de fluorescencia y comenzar la medición. Utilice el filtro de 485/535 nm sistema requerido para la detección de la fluorescencia de eGFP.
    3. Para la cuantificación absoluta, en el mismo plato preparar una curva de calibración diferentes cantidades de carga (62.5, 125, 500, 750 y 1.000 ng) de una purificada eGFP.
  3. Ensayo de ácido Bicinchoninic (BCA) para la cuantificación de TSP
    1. Mezcle 50 partes de reactivo A (Tabla de materiales) con 1 parte de reactivo B (Tabla de materiales). Preparar un volumen suficiente de solución de trabajo de BCA fresco para las muestras a ensayar y los estándares de calibración.
      Nota: El volumen de solución de trabajo BCA requerido para cada muestra es de 1,9 mL. El procedimiento estándar con 9 niveles (incluyendo un espacio en blanco), 17,1 mL de solución de trabajo de la BCA se requiere.
    2. Pipetear 0,1 mL de cada estándar (incluyendo un espacio en blanco) y extractos TSP en un tubo etiquetado.
      Nota: Como patrones de calibración, preparar una nueva serie de albúmina de suero bovino (BSA) normas en el rango de 10-1.000 μg/mL, preferentemente con el mismo diluyente como muestras, como el agua. El espacio en blanco consiste en 0.1 mL del diluyente utilizado para la calibración estándar y preparación de la muestra.
    3. Añadir 1,9 mL de solución de trabajo de BCA y mezclar bien. Cubra los tubos e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
    4. Enfriar los tubos a RT. medir la absorbancia a 562 nm de todas las muestras dentro de 10 minutos.
      Nota: Incluso en RT, continúa el desarrollo del color. Se introducirá ningún error significativo si las mediciones de absorbancia de todos los tubos se hacen dentro de 10 minutos.
    5. Restar el valor de absorbancia nm 562 del espacio en blanco de las lecturas de los estándares y los extractos TSP.
    6. Parcela el 562 corregida nm de cada estándar en su concentración. Determinar la concentración de proteína de cada extracto TSP.
  4. Realizar el Coomassie gel de coloración según se describió anteriormente en Gecchele et al8.
  5. Análisis de Western blot
    1. Realizar el análisis de western blot como se describió anteriormente en Gecchele et al8.
    2. Después de la separación electroforética de proteínas, transferencia a una membrana de nitrocelulosa, usando las técnicas estándar. Prepare la solución de bloqueo mediante la mezcla de leche de 4% en tampón fosfato salino pH de (PBS) 7.4. Bloquear la membrana con 10 mL de la solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora.
    3. Preparar el conejo de anticuerpo primario 1: 10,000 para la anti-GAD65/67 y anti-LHCB2 y 1: 20.000 para el anti-eGFP en 5 mL de solución de bloqueo con 0,1% detergente. Incubar la membrana con las soluciones de anticuerpo primario preparado durante la noche a 4 ° C o 4 h a temperatura ambiente con agitación constante.
    4. Deseche el anticuerpo primario y lavar la membrana 3 veces por 5 minutos cada uno con solución de bloqueo con 0,1% detergente.
    5. Preparar la peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado anticuerpos anti-a 1: 10,000 en el bloqueo de solución con 0,1% detergente. Incubar la membrana durante 1,5 h a TA con agitación constante.
    6. Deseche el anticuerpo secundario y lavar la membrana 5 veces por 5 minutos cada uno con PBS-T (PBS suplementado con 0,1% detergente).
    7. Incubar la membrana con una solución de luminol comercialmente disponibles siguiendo las instrucciones del fabricante. Detectar la señal utilizando un sistema de proyección de imagen de quimioluminescencia.

4. procesamiento de material de planta

  1. Cosecha de la remolacha roja expresando ∆87GAD65mut agroinfiltrated vacío deja en la cima de la expresión (11 dpi) y congelar en nitrógeno líquido.
  2. Liofilizar las hojas congeladas durante 72 h a-50 ° C y 0.04 mbar. Almacenar a-80 ° C.
  3. Moler las hojas a polvo fino y guárdelo a temperatura ambiente en un recipiente hermético con gel de sílice para excluir la humedad.

5. Análisis de integridad celular y simulación gástrica de la digestión

  1. Simulación de la digestión gástrica
    1. Pesar 100 mg de hojas de remolacha roja liofilizada grinded y resuspender en 6 mL de PBS (pH 7.4).
    2. Ajustar el pH de la muestra 2 con 6 M de HCl.
    3. Añadir pepsina 4 mg/mL de mucosa gástrica de cerdo en 10 mM HCl para obtener una concentración de pepsina final de 1 mg/mL o un cociente de 1:20 para proteínas solubles totales. Agitar la muestra a 37 ° C durante 120 minutos.
    4. Ajustar las muestras a pH 8 con 1 M NaOH para hacer inactivo de la pepsina.
    5. Centrifugar 750 alícuotas de μl de cada muestra a 20.000 x g durante 20 min a 4 ° C. Recoger por separado el sobrenadante y resuspender el precipitado en un volumen de sobrenadante de buffer de carga (1,5 M Tris HCl, pH 6.8, SDS 3% y glicerol al 15% 4% 2-Mercaptoetanol).
      Nota: Por razones de salud y seguridad, guantes y trabajar bajo campana extractora para preparación de muestras.
    6. Analizar el sobrenadante y el sedimento resuspendido por la mancha blanca /negra occidental análisis8.
  2. Análisis de integridad de la célula
    1. Preparar dos muestras de 100 mg de hojas de remolacha roja liofilizada grinded y resuspender en 6 mL de PBS (pH 7.4).
    2. Ajustar el pH de sólo uno de la muestra 2 con 6 M HCl. agitar ambas muestras a 37 ° C durante 120 minutos.
    3. Centrifugar 750 alícuotas de μl de cada muestra a 20.000 x g durante 20 min a 4 ° C. Recoger por separado el sobrenadante y resuspender el precipitado en un volumen de sobrenadante de buffer de carga.
    4. Analizar el sobrenadante y el sedimento resuspendido por análisis de western blot.

6. carga microbiana ensayo

  1. Pesar 100 mg de hojas de remolacha roja liofilizada. Suspender el polvo en 8 mL de PBS estéril (pH 7.4) y agitar durante 1 minuto.
  2. Preparar el medio LB sin antibióticos o que contienen rifampicina μg/mL (i) 50, (ii) 50 μg/mL de cada una de rifampicina y carbenicilina, (iii) 50 μg/mL de cada de rifampicina y kanamicina o (iv) 50 μg/mL cada de rifampicina, carbenicilina y kanamicina.
  3. Placa 1 mL de cada homogenado liofilizado hoja en uno de los 5 medios selectivos de LB.
  4. Incubar las placas durante 3 días a 28 ° C.
  5. Contar las colonias de Agrobacterium en cada plato.
  6. Calcular y definir la carga bacteriana residual como el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por mL del homogeneizado de liofilizado hoja (UFC/mL).

7. extracción de metabolitos

  1. Extracción de metabolitos primarios
    1. Pesar 30 mg de-80 ° C almacena, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expresión de vacío polvo de hojas de remolacha roja en un tubo de plástico de 2 mL.
    2. Añadir 750 μl de frío 70/30 (v/v) metanol/cloroformo y agitar por 30 s. incubar a-20 ° C por 2 h.
      Nota: Todos los disolventes y aditivos deben ser grado de LC-MS.
    3. Añadir 600 μl de agua fría y centrifugar a 17.900 x g a 4 ° C durante 10 minutos recoja y transferencia de la fase hidroalcohólica superior en un nuevo tubo de 2 mL. Deseche la fase es menor y la interfase.
    4. Coloque las muestras en un concentrador de vacío durante 3 horas para evaporar los solventes.
    5. Disolver los pellets obtenidos de paso 7.1.4 en 300 μL de acetonitrilo/agua 50/50 (v/v) y someter a ultrasonidos las muestras durante 3 minutos.
    6. Pasar las soluciones a través de filtros de membrana de 0,2 μm y ponerlos en un transparente fijo 300 μL insertar tubos de vidrio.
  2. Extracción de metabolitos secundarios
    1. Pesar 300 mg de-80 ° C almacena, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expresión de vacío polvo de hojas de remolacha roja en un tubo de plástico de 15 mL.
    2. Añadir 3 mL de metanol, vortex durante 30 s y someter a ultrasonidos a 40 kHz durante 15 minutos.
      Nota: Todos los disolventes y aditivos deben ser grado de LC-MS.
    3. Centrifugar las muestras a 4.500 x g a 4 ° C por 10 min y transferir el sobrenadante a nuevos tubos de 15 mL.
    4. Diluir 100 μl de extracto de 1:3 (v/v) con agua y pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,2 μm.
    5. Poner la solución en un transparente fijo 300 μL insertar tubo de vidrio.
  3. Extracción de lípidos polares
    1. Pesar 200 mg de-80 ° C almacena, agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expresión de vacío polvo de hojas de remolacha roja en un tubo de plástico de 15 mL.
    2. Añadir 200 μL de agua y luego 2 mL de metanol y luego mantener en hielo durante 1 hora.
      Nota: Todos los disolventes y aditivos deben ser grado de LC-MS.
    3. Vortex durante 30 s y someter a ultrasonidos a 40 kHz durante 15 minutos.
    4. Centrifugar las muestras a 4.500 x g a 4 ° C durante 25 minutos recoge y transferencia de la fase de cloroformo en los tubos de 2 mL. Descartar la fase superior hidroalcohólico y la interfase.
    5. Coloque las muestras en un concentrador de vacío durante 3 h para evaporar el solvente.
    6. Disolver el precipitado obtenido en el paso 7.3.5 con 600 μl de metanol.
    7. Diluir 100 μl de extracto 1:5 (v/v) con metanol y pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0.2 μm.
    8. Poner la solución en un transparente fijo 300 μL insertar tubo de vidrio.

8. líquido cromatografía espectrometría de masas en análisis y procesamiento de datos

  1. Configurar el sistema LC-MS según lo recomendado por el proveedor.
    Nota: La sección de LC consta de un muestreador automático juntada con HPLC equipado con una columna C18 guardia (75 x 2.1 mm, partículas tamaño 5 μm) frente a una columna de C18 (150 x 2.1 mm, partículas tamaño 3 μm) para el análisis de metabolitos secundarios y lípidos polares , mientras que con una columna de guardia HILIC (7.5 x 2.1 mm, 3 μm) frente a una columna de HILIC (150 x 2.1 mm, partículas tamaño 2.7 μm). La MS es un espectrómetro de masas de trampa de iones con una ionización por electrospray (ESI) o una fuentes de ionización química (APCI) de presión atmosférica.
  2. Preparar los disolventes adecuados para los gradientes HPLC. Para el análisis del metabolito primario, utilizar formiato de amonio 20 mM como A solvente; acetonitrilo 95%, 5% de agua además de formiato de amonio de 10 mM como solvente B. Para el análisis de metabolitos secundarios, utilice agua más 0.05% ácido fórmico (A) y acetonitrilo más 0.05% ácido fórmico (B). Para el análisis de lípidos polares, usar agua más 0.05% ácido fórmico (A) y 100% acetonitrilo (B).
    Nota: Los solventes y aditivos deben ser grado de LC-MS.
  3. Utilizar los gradientes registrados en la tabla 1 para la elución del metabolito. Conjunto el flujo en 0,2 mL/min inyectan 10 μl de cada muestra para metabolitos secundarios y lípidos polares, mientras que inyectar 5 μl de metabolitos primarios.
  4. Preparar una muestra de control de calidad (QC) mezclando porciones iguales de diferentes muestras para tener una mezcla representativa de cada condición experimental. Analizar la muestra de control de calidad durante el experimento para controlar la eficiencia del instrumento. En concreto, introduzca un análisis de la muestra de control de calidad después de cada lote de muestra 10.
  5. Aleatorizar las muestras para evitar efectos basados en el instrumento.
  6. Después de 9 análisis, inserte una columna limpieza método y un análisis en blanco inmediatamente después.
    Nota: Realizar un gradiente lento entre los dos disolventes con una elución isocrática en alto porcentaje de los solventes más fuertes. El espacio en blanco consiste en una inyección de un puro metanol: agua (50/50, v/v) para mejorar la reproducibilidad del tiempo de retención en el siguiente análisis.
  7. Configurar el instrumento para la adquisición de espectros de masas en modos alternativos de ionización positivo y negativo utilizando los parámetros enumerados en la tabla 2.
    Nota: Otros parámetros dependen de la plataforma específica.
  8. Realizar el proceso siguiente de datos como se explicó en Dal Santo et al.9.

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Representative Results

En este trabajo se presenta el flujo de trabajo para el desarrollo de una vacuna oral en los tejidos vegetales comestibles. El enfoque de este trabajo es la expresión de una proteína de la blanco en una especie vegetal comestible y la caracterización de la potencial vacuna oral.

El primer paso implicó la evaluación de la idoneidad de la tecnología de expresión basada en el virus de la planta para producir proteínas recombinantes en los sistemas de plantas comestibles. Para ello, primero utilizamos la eGFP como proteína modelo y expresa en dos sistemas de plantas hojas comestibles: rojo de remolacha y espinaca. Las plantas fueron manualmente agroinfiltrated con suspensiones de a. tumefaciens con vectores de expresión recombinante de eGFP. La expresión de la proteína fluorescente fue visualizada por análisis de western blot (figura 1A, B, D, E) y cuantificada bajo luz UV. Los resultados mostraron que el sistema de la remolacha roja se caracteriza por una mayor expresión de eGFP, alcanzando 544.9 ± 10.9 μg/g de peso fresco de hoja (FLW) 9 PPP (figura 1), que las espinacas, que niveles de máxima eGFP (113.4 ± 0,3 μg/g FLW) fueron medidos en 11 dpi ( Figura 1F). Por estas razones remolacha roja fue seleccionado como anfitrión de expresión para todos los experimentos posteriores.

Según Chen et al10, la expresión transitoria de eGFP fue probada por un método de vacío para la infiltración, que es más conveniente para la producción de vacunas a gran escala. Diferentes diluciones de la noche a la mañana cultura de a. tumefaciens , que van desde 10-1 10-3y diferentes concentraciones de detergente (0.005-0.05%) se han probado comparando el nivel de acumulación de eGFP en la máxima expresión dpi (dpi, 9). Los resultados encontraron que títulos bacterianos más altos producen mayores rendimientos de eGFP (10-1 ~ 0.35). Sin embargo, no hay diferencias significativas usando diferentes concentraciones de detergente (datos no mostrados).

Entonces, las plantas fueron infiltrado con una suspensión de a. tumefaciens en 0,35 OD600 y 0,01% de detergente vacío. Una vez que se establecieron la plataforma de expresión y el sistema de entrega, la expresión de dos tipos de GAD65, GAD65mut y N-terminalmente truncado forma (∆87GAD65mut), se comparó en el día de máxima expresión, dpi 5 y 11, respectivamente, como anteriormente estableció11. Después de la extracción de TSP de agroinfiltrated hojas, todas las muestras se analizaron por western blot y la proteína recombinante fue relativamente cuantificada por un análisis de densitometría ósea (figura 2). Resultados destacan el rendimiento más alto 20-fold de la forma de ∆87GAD65mut sobre la GAD65mut. La forma truncada por lo tanto, fue seleccionada como candidato recomendado: vacuna oral, acumulando tan alto como 201.4 ± 29,3 μg/g FLW en hojas de remolacha roja en 11 dpi.

Finalmente, se evaluaron los parámetros para el desarrollo de una potencial vacuna oral. La integridad de la proteína recombinante después de la liofilización del vacío se infiltraron en hojas de la remolacha roja expresando ∆87GAD65mut fue evaluada en comparación con no tratados (sólo congelado) tejido, por análisis de western blot. Como se muestra en la Figura 3A, la proteína diana demostró ser estable después del proceso de liofilización.

Se realizó la simulación de la digestión gástrica en el material liofilizado añadiendo porcinos enzima gástrica pepsina a una concentración final de 1 mg/mL o en una proporción de 1:20 para TSP. Ambas condiciones de tratamiento digestivo resultaron en la degradación de la proteína recombinante, según lo demostrado por análisis de western blot (figura 3, D, E, datos registrados solamente para la concentración final de pepsina de 1 mg/mL). La ausencia de una señal específica en las muestras de sedimento después de digestión de la pepsina (pepsina carriles, p 1-3), sugirió que después de tratamiento de liofilización, las células de la planta pierde su integridad, llevando a la degradación de las proteínas blanco.

La evaluación de la integridad celular demostró que cuando tejido vegetal seco se resuspendió en buffer con pH neutro (pH 7,4), ∆87GAD65mut fue parcialmente solubilizado, sugiriendo que al menos algunas células se rompieron durante la molienda y el secado de la hoja. La resuspensión del tejido de la planta seca en condiciones ácidas, en cambio, llevado a la detección de la ∆87GAD65mut sólo en la fracción insoluble. Esto era probablemente debido a la precipitación de ∆87GAD65mut causada por el pH bajo, además del contenido de proteína de las células intacto11. Estos ensayos indican que liofilización podría ser seleccionado como tratamiento para la preparación del candidato vacunal.

Además, se evaluó la carga microbiana residual en las hojas de remolacha roja agroinfiltrated.

El ensayo de carga microbiana muestra que los tratamientos explotados para la preparación de la vacuna candidata eliminan la carga bacteriana11.

Se evaluó la bioequivalencia metabólica de las plantas de remolacha roja de ∆87GAD65mut y control por huellas digitales de metabolitos primarios y secundarios y lípidos polares generados por LC-MS de nueve plantas de remolacha roja expresando ∆87GAD65mut, nueve agroinfiltrated controles y nueve controles de tipo salvaje. Estadística de la ACP reveló un cluster de tipo salvaje planta separado de las otras muestras. No hubo diferencias significativas en su lugar se destacaron entre las plantas control infiltrada y negativo y ∆87GAD65mut. Además, no hubo diferencias significativas entre los tres grupos de plantas en términos de perfiles de lípidos polares fueron identificado11.

Figure 1
Figura 1: comparación de los niveles de expresión de eGFP en agroinfiltrated rojo de remolacha y espinaca hojas. Mancha blanca /negra occidental análisis (A, D) y los correspondientes controles de carga (subunidad grande de la RuBisCO) teñidos con Coomassie brillante azul (B, E) de extractos proteicos de eGFP expresar muestras foliares recolectaron durante el curso del tiempo análisis de 4 a 14 días post infección (dpi). El contenido de eGFP de cada extracto de proteína de hoja fue cuantificado por la medida de la fluorescencia (C, F). Los resultados de las muestras de hojas de remolacha roja agroinfiltrated se muestran en el panel izquierdo, donde las muestras de espinacas agroinfiltrated aparecen en la derecha. Cantidades iguales de los extractos de proteínas hayan sido cargados, 3,5 μg para el western blot y 30 μg para la tinción de Coomassie. Un anticuerpo anti-eGFP se ha utilizado como una sonda en el análisis de western blot. Números de lado indican marcadores de masa moleculares en kDa. p.c., control positivo, 10 ng de GAD65 humana recombinante comercial; Carolina del norte, control negativo, extracto de hojas infiltradas con a. tumefaciens con 5'- y los módulos de la integrasa. Barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos independientes. Esta figura ha sido modificada desde Bertini et al11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: niveles de expresión de GAD65mut y Δ87GAD65mut en las hojas de la remolacha roja. Mancha blanca /negra occidental análisis (A) y control de carga correspondiente (subunidad grande de la RuBisCo) teñido con Coomassie azul brillante (B) de extractos de proteínas de hojas de remolacha roja tres expresan Δ87GAD65mut (izquierda) y GAD65mut (derecha). Un anticuerpo anti-GAD se ha utilizado como una sonda en el análisis de western blot (los carriles fueron cargados con 20 μL del extracto de GAD65mut y 1 μL del extracto de Δ87GAD65mut). En el Coomassie teñido el gel, el mismo volumen de extractos proteicos (10 μL/carril) fue cargado para GAD65mut y Δ87GAD65mut. Números de lado indican marcadores de masa moleculares en kDa. p.c., control positivo, 10 ng de GAD65 humana recombinante comercial; Carolina del norte, control negativo, el extracto obtenido de hojas infiltrados sólo con a. tumefaciens llevando el 5'- y los módulos de la integrasa. (C) usando el control positivo de inmunoblot como referencia para un análisis densitométrico, los niveles de expresión relativa de las formas de dos proteínas se trazan. Barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos independientes. Esta figura ha sido modificada desde Bertini et al11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación del candidato de vacuna oral. En el lado izquierdo, los análisis de estabilidad de la proteína después de la liofilización de tratamiento (A, B). Mancha blanca /negra occidental análisis (A) y el gel correspondiente tinción con Coomassie azul brillante (B) que representan tres extractos independientes de hojas expresando Δ87GAD65mut. Hojas cosechadas directamente congeladas (fresca) o liofilizadas a-50 ° C, 0.04 mbar durante 72 h (liofilizado). Proporciones de diferentes tejidos: buffer fueron empleados durante la extracción de TSP para considerar la pérdida de agua debido a la deshidratación. Volumen igual de extractos fueron cargados, 0.25 y 10 μl, para western blot y Coomassie manchas respectivamente. Un anticuerpo anti-GAD se ha utilizado para el western blot sondeo lado números indican marcadores de masa moleculares en kDa. Carolina del norte, control negativo, extracto de hojas infiltrated con a. tumefaciens con 5'- y los módulos de la integrasa. En el lado derecho, en vitro simula la digestión gástrica de Δ87GAD65mut (C, D, E). Análisis de Western blot (C, D) y el gel correspondiente tinción con Coomassie brillante azul (E) que representan tres extractos independientes de hojas expresando Δ87GAD65mut después de la digestión gástrica simulada. 1 mg/mL de pepsina se ha agregado a 100 mg de tejido liofilizado, mientras que una muestra control sin enzima se ha utilizado. 24 μl y 16 μl de sobrenadante (s) y pellets (p) respectivamente obtenidos en el paso final de la centrifugación, se han utilizado para el análisis de SDS-PAGE. Anti-GAD (C) y los anticuerpos anti-LHCB2 (D) se utilizaron como sondas en el análisis de western blot. Números de lado indican marcadores de masa moleculares en kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Metabolitos primarios (100 min) Tiempo (min) % A % B Duración (min) Tipo
Inicial 0 100 - Condición inicial
0 0 100 10 Isocrática
10 15 85 15 Gradiente de
25 15 85 5 Isocrática
30 50 50 10 Gradiente de
40 50 50 30 Isocrática
70 0 100 1 Gradiente de
71 0 100 29 Isocrática (re-equilibrio)
Metabolitos secundarios (60 min) Tiempo (min) % A % B Duración (min) Tipo
Inicial 98 2 - Condición inicial
0 90 10 2 Gradiente de
2 80 20 10 Gradiente de
12 75 25 2 Gradiente de
14 30 70 7 Gradiente de
21 30 70 5 Isocrática
26 10 90 1 Gradiente de
27 10 90 14 Isocrática
41 98 2 1 Gradiente de
42 98 2 18 Isocrática (re-equilibrio)
Lípidos polares (90 min) Tiempo (min) % A % B Duración (min) Tipo
Inicial 50 50 - Condición inicial
0 0 100 10 Gradiente de
10 0 100 65 Isocrática
75 50 50 1 Gradiente de
76 50 50 14 Isocrática (re-equilibrio)

Tabla 1: Condiciones de gradiente de elución del metabolito en el análisis por LC-MS.

Componentes del espectrómetro de masas Función Parámetros
Metabolitos primarios Metabolitos secundarios Lípidos polares
Electrospray (ESI) de ionización fuente Gas de nebulización 50 psi, 350 ° C 50 psi, 350 ° C -
Secado de gas 10 L min-1 10 L min-1
Fuente de ionización química (APCI) presión atmosférica Gas de nebulización - - 50 psi, 350 ° C
Secado de gas 10 L min-1
Vaporizador de 450 ° C
Trampa de iones y de exploración de detector Modo de exploración completa 13.000 m/z por segundo 13.000 m/z por segundo 13.000 m/z por segundo
50-1.500 m/z 50-1.500 m/z 50-1.500 m/z
Escanear rango 200 m/z 400 m/z 700 m/z
Masa de destino
Gas de colisión Helio
Presión de vacío 1.4 x 10-5 mbar
Fuente capilar +4,500 V +4,500 V +4,000 V
Desplazamiento de la placa de extremo -500 V -500 V -500 V
Skimmer 40 V -40 V 40 V
Salida de la tapa 106 V -121 V 143.5 V
1 de Oct DC 12 V -12 V 12 V
2 de Oct DC 1.7 V -1.7 V 2 V
Objetivo 1 -5 V 5 V -5 V
Lente 2 -60 V 60 V -60 V
ICC para el modo de ionización positivo 20
ICC para el modo de ionización negativa 7

Tabla 2: Parámetros para la adquisición de espectros de masas en modos alternativos de ionización positivo y negativo.

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Discussion

En este estudio mostramos análisis preliminar para el diseño de una vacuna oral de candidato para la diabetes autoinmune. La proteína diana para este experimento era una forma mutada de la humana 65 kDa glutamato descarboxilasa, que producción y funcionalidad son fácilmente detectables y medibles12. Su expresión en los tejidos de plantas comestibles fue mediada por los vectores5, que mediar un alto nivel de producción de proteínas recombinantes en un marco de tiempo muy corto. La selección de la mejor planta de candidato anfitrión comestible se realizó basado en la expresión de eGFP en remolacha roja y hojas de espinacas por agroinfiltration manual. Este paso podría ser crítico para la escala industrial debido al procedimiento desperdiciador de tiempo de agroinfiltration manual y la dureza en la infiltración de tejido de hojas de espinaca.

La identificación de la PPP específico de recolección que brinda el más alto nivel de acumulación de proteína recombinante de una proteína recombinante es un paso crítico y deben ser probados y seleccionados sobre una base caso por caso. El análisis de la expresión de la proteína fluorescente en diferentes dpi (de 4 a 12), permitió para identificar el día de máxima expresión en cada planta. La comparación entre la concentración de la eGFP (FLW μg/g), en estos días de máxima expresión, puso de relieve ese rojo remolacha es el mejor desempeño de plataforma en términos de rendimientos de proteína recombinante.

Por esta razón, remolacha roja fue probado más para la entrega de vectores basados en virus vegetales por un sistema de vacío, que se considera más conveniente para la producción industrial a gran escala de vacuna contra13.

Dado que el protocolo de infiltración vacío estándar está optimizado para las especies de tabaco5, la instalación de una variedad de parámetros para el ajuste del procedimiento a la especie de planta considerada es un punto crítico. Luego, se optimizó el protocolo de agroinfiltration vacío de remolacha roja. Nuestras pruebas demostraron que la dilución de Agrobacterium es crucial para mejorar los niveles de expresión de la proteína, mientras que la concentración de detergente para mejorar la permeabilidad de la hoja. Los resultados mostraron que el sistema de la planta y la tecnología con el propósito de este trabajo.

Dos tipos de GAD65, GAD65mut y ∆87GAD65mut, que previamente se caracterizaban por su expresión en N. benthamiana7, mostrando diferente localización subcelular, se expresaron en remolacha roja por la infiltración del vacío. Se prepararon tres réplicas biológicas para cada muestra. Cada repetición biológica comprende un grupo de tres infiltrados hojas de diferentes plantas, muestreadas de 2 a 14 PPP para ambas formas la GAD65. Su nivel de expresión se comparó para seleccionar la más alta proteína acumula en los tejidos vegetales.

La relativa cuantificación por densitometría ósea análisis demostró que el ∆87GAD65mut tiene un 20-fold nivel de expresión más alto que su homóloga intacta. Esto podría ser debido a su localización citosólica y GAD65mut, debido a sus residuos que anclan esta forma a la membrana celular, tiene un más bajo rendimiento7, reflejando una menor estabilidad de la proteína. Nivel de acumulación promedio de ∆87GAD65mut en el tejido de hojas de remolacha roja fue 201.4 ± 29,3 μg/g FLW, que es suficiente para comenzar con el desarrollo de la vacuna oral de la T1D.

Finalmente, después de la selección de la forma más adecuada de la plataforma, la tecnología y la proteína, se procedió al establecer un tratamiento después de la cosecha de las hojas infectadas. Puesto que el tejido foliar se compone de 95% de agua, un tratamiento de deshidratación es útil para prevenir la contaminación de microorganismos. Nuestros resultados demostraron que un tratamiento de liofilización podría aplicarse a la muestra, sin afectar los niveles de proteínas recombinantes en las hojas. El retiro de agua 10 veces por liofilización elimina la contaminación bacteriana (bioburden), incluyendo el recombinante a. tumefaciens utilizado para el procedimiento de agroinfiltration.

Además, el análisis de la encapsulación de proteínas bio demostró que el ∆87GAD65mut es digerido completamente después de una digestión gástrica simulada. Esto sugiere que el tratamiento de liofilización daña la pared de célula de la planta, exponiendo la proteína recombinante a la composición enzimática y ácida del medio ambiente gástrico.

El mantenimiento de la integridad de la molécula de proteína o péptido sobre la transición del tracto gastrointestinal en el sitio de absorción representa un problema para la entrega de medicamento oral14. Por lo tanto, después del tratamiento de la deshidratación, la vacuna potencial debe ser correctamente formulada para superar el entorno gástrico sin perder su integridad. En la fabricación de la vacuna de GAD de origen vegetal, la encapsulación en una cáscara relativamente estable podría aplicarse como un sistema para mejorar su eficiencia lo que le permite estar protegido y estable a lo largo de la ruta de administración oral15.

Se han explorado diversas tecnologías para superar los problemas asociados con la administración oral de macromoléculas tales como algunos estudios recientes sobre la complejación de hidrogel sintético con insulina que mostró una eficiencia de encapsulación alta y de la insulina rápida liberan en el intestino en una manera dependiente del pH16,17.

Tanto la bioequivalencia de metabolitos primarios y secundarios de plantas que expresan ∆87GAD65mut en comparación con controles de infiltrados y no infiltrado fue investigada utilizando las estadísticas de PCA. Las diferencias entre las plantas infiltradas expresan ∆87GAD65mut y los controles del infiltrado no fueron significativas, mientras que las plantas de tipo silvestre no infiltrado formaron un grupo separado. Estos resultados sugieren que las plantas infiltradas se distinguen de las plantas no tratadas por el análisis de LC-MS gracias a metabolitos bacterianos o metabolitos producidos por las plantas debido a la infiltración, como ya se indica en la literatura13. En general este análisis demostró que la acumulación de ∆87GAD65mut tiene poco impacto en el metabolismo general.

En conjunto, estos resultados sugieren que la vacuna oral potencial, representada por el tejido de la hoja de remolacha roja liofilizada expresando ∆87GAD65mut obtenido explotando la tecnología de expresión basados en virus vegetales, es conveniente experimental T1D inmunoterapia oral ensayos. La tecnología del vector de expresión planta virus se ha convertido en muy atractiva en el campo de expresión transitoria, debido a su capacidad para producir las proteínas extranjeras rápidamente tanto en niveles altos. Esta tecnología se basa en un vector deconstruido que lleva sólo la ARN polimerasa dependiente de RNA y proteínas de movimiento5 y por lo tanto pierde su infectividad en plantas; como consecuencia, se debe excluir su posible transmisión a los seres humanos.

El protocolo experimental divulgado aquí podría extenderse a muchas diversas especies comestibles, como la lechuga, Chenopodium capitatum y Tetragonia expansa. Desde las hojas de estas especies, incluyendo el rojo de remolacha y espinacas, que previamente fue detectado como buena expresión de sistemas de planta5, puede utilizarse como alimento crudo, la tecnología aquí propuesta podría utilizarse para la fabricación de vacunas comestibles o para producción de alimentos mínimamente procesados funcionales o alimentación.

La combinación de especies de la planta de proteína recombinante, dpi de recolección que brinda el más alto nivel de acumulación de proteína recombinante necesita a determinar empíricamente basándose en caso por caso dependiendo de la proteína recombinante expresada y en el host especie de planta18.

La aplicación de esta tecnología para la producción de vacuna oral mantener gran potencial para convertirse en una alternativa a las vacunas convencionales en un futuro próximo, además de virus oncolíticos combate, vacunas autólogas para linfomas y tumores sólidos, y anticuerpos monoclonales objetivo cánceres19,20.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el proyecto "El uso de plantas para la producción de una vacuna comestible de diabetes autoinmune (eDIVA)" (proyecto ID: 891854) financiado por la Universidad de Verona, en el marco de la convocatoria 2014.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters Sartorius-Stedim 17764
2–mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma M8250 pH 5.5
96-well plate Sarstedt 833924
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade Sigma 34967
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate Sigma 70221
Anti-eGFP antibody ABCam ab290
Anti-GAD 65/67 antibody Sigma G5163
Anti-LHCB2 antibody Agrisera AS01 003
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
C18 Column Grace    - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column Grace    - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower Peter Excel 15-5-15 Fertilizer
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Chemiluminescence imaging system BioRad 1708370 ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform Sigma C2432
Detergent Sigma P5927 Polysorbate 20
Fluorescence reader Perkin-Elmer  1420-011 VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade Sigma 94318
Glycerol Sigma G5516 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase Promega M7841
HCl Sigma H1758 Corrosive
HILIC Column Grace    - Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column Grace    - Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler Beckman Coulter    - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter    - System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol Sigma 24137 Flamable
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
KCl Sigma P9541 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4 Sigma P9791 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution Ge Healthcare RPN2232 Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator 5Pascal LIO5P0000DGT
Mass Spectometer Bruker Daltonics   - Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol Sigma 32213
MgSO4 Sigma M7506
Milk-blocking solution Ristora    - 3 % in PBS
Na2HPO4 Sigma S7907 Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl Sigma S3014 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4 Sigma S8282  Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH Sigma S8045
Nitrocellulase membrane Ge Healthcare 10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7000
Peroxidase substrate ECL GE Healthcare RPN2235 Light sensitive material
Pump Vacuum Press VWR 111400000098
Reagent A Sigma B9643 Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B Sigma B9643 Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite Sigma 7681-57-4
Sonicator system Soltec 090.003.0003 Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe Terumo    -
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes Thermo Scientific 11573680
Trizma Base Sigma T1503 Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone Formedium TRP03 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator Heto 3878 F1-3 Speed-vac System
Water LC-MS grade Sigma 39253
Yeast extract Sigma Y1333 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

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References

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Santoni, M., Bertini, E., Zampieri, R., Cuccurullo, A., Commisso, M., Gecchele, E., Avesani, L. Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes. J. Vis. Exp. (145), e59298, doi:10.3791/59298 (2019).

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