Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以产生一个口服疫苗候选1型糖尿病在食用植物。
Abstract
植物分子耕作是利用植物生产感兴趣的分子。从这个角度来看, 植物既可以作为生物反应器, 用于生产和随后纯化最终产品, 也可以用于使用可食用植物物种时直接口服异源蛋白质。在这项工作中, 我们提出了一个候选口服疫苗1型糖尿病 (T1D) 在食用植物系统中使用解构植物病毒重组 DNA 技术, 以真空渗透交付。我们的研究结果表明, 红甜菜是一个合适的宿主, 用于与 T1D 相关的人类衍生自身抗原的瞬态表达, 被认为是 T1D 疫苗的一个有希望的候选疫苗。对产生自体抗原的叶片进行了彻底的检测, 以了解其对胃消化的抵抗力、残留细菌电荷的存在以及对其的次生代谢状况, 并概述了该过程中的生产, 以便对其潜在的用途进行概述用于直接口服异源蛋白的植物。我们的分析显示, 在模拟胃消化后, 冻干候选口服疫苗几乎完全降解, 这表明在制造植物衍生的 GAD 疫苗时需要一种封装策略。
Introduction
自20世纪80年代植物分子生物学革命以来, 以植物为基础的生物制药生产系统可以被认为是基于微生物和哺乳动物细胞1 的传统系统的替代品。与传统平台相比, 工厂具有多种优势, 可扩展性、成本效益和安全性是最相关的 2。重组产物可以从转化后的植物组织中纯化, 然后在肠外或口服, 此外, 转化后的食用植物可以直接用于口服。口腔途径同时促进黏膜和全身免疫, 消除了对针头和专业医务人员的需求。此外, 口服可消除复杂的下游加工, 而下游加工通常占重组蛋白3制造总成本的80%。所有这些优势都可以转化为在生产、供应和劳动力方面的节约, 降低每剂的成本, 使全球大多数人口都能负担得起这种药物。
为植物重组蛋白的生产, 提出了几种稳定转化和瞬态表达的策略。其中, 一种高产量解构的植物病毒表达系统 (如 Mamonicon) 提供了卓越的性能, 在相对较短的时间范围内提高了重组蛋白的高产量4。报道了在作为金标准生产宿主的烟碱植物中使用植物病毒表达系统的许多瞬态表达的例子。然而, 这种示范植物并不被认为是一种可食用的物种, 因为它的叶子中积累了生物碱和其他有毒代谢物。
在这项工作中, 我们描述了两个可食用的植物系统的比较, 红色甜菜 (贝塔寻常的 Cv红磨坊) 和菠菜 (菠菜就是cv 工业), 表达了两种候选形式的 65 kda 谷氨酸异形脱羧酶 (GAD65), 由基于植物病毒的载体5进行。GAD65 是一种与1型糖尿病 (T1D) 相关的主要自身抗原, 目前正在人体临床试验中进行研究, 以通过诱导耐受性6来预防或延缓 T1D。在植物中生产 gad65 的过程中, 以烟叶和5%、6、7为典型植物种类进行了广泛的研究。在这里, 我们描述了使用食用植物物种生产的分子组织, 可用于直接口服。从技术角度出发, 通过对重组蛋白表达水平、植物残留微生物电荷等不同参数的评价, 研究并选择了 GAD65 生产的植物农业渗透系统和食用植物平台。用于口服的组织, GAD65 对胃消化的抵抗力, 以及转化后的植物与野生类型的生物等效性。
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Protocol
1. 红甜菜和菠菜栽培
- 生长红甜菜(b. vulgaris cv红磨坊) 和菠菜 (s.深恶痛绝 cv industria) 植物在生长室中, 分别使用150μe 的光强, 65% 相对湿度, 在231°c 下12小时光/暗周期。
- 种子萌发后, 每周用市售肥料的 1 gl 溶液 (材料表) 给植物施肥两次。对于农业渗透使用5周龄菠菜和6周龄的红甜菜植物。
2. 解构植物病毒技术的瞬态表达
- 植物表达载体的构建
- 介绍载体----5 ' 模块 (pich20111)、3 ' 模块 (pICH20111. gad65mut、pICH31070.∆87G65mut 和 pich7410. egfp), 如前面所述的1、2、7和集成酶模块 (pICH20111)----采用标准技术对农杆菌 gv3101 菌株进行研究。生长在含有50μgml 利福平和适当的 vector 特异性抗生素的 LB 培养基上 (50μgml 卡比西林用于 pICH20111, PICH20111 和 pich争取 7410. Egfp, 50μgml 卡那霉素治疗 PICH20111), 在28°C 下为期2天。
- 使用每个载体的特定引物, 用菌落 PCR 筛选菌落: 5 '-ATTAAGGGTACCTCG-3 ' 和 5 '-ACACCCTTCTCTTTTC-3 ' 的 3 ' 模块 pich31070. gadd65mut 和 pICH31070.∆87G65mut, 退火温度为55°c 和第三个 3 ' 模块 pich74. 10. egfp 的伸长时间为110、5 '-TGAGTCATCACCACC-3 ', 退火温度为 53°c, 伸长时间为 30秒, 5 '-AATGTCTCTCTCG-3 ' 和 5 '-TCCCTTAAGGTGTG-3 '对于 5 ' 模块, 退火温度为 53°c, 伸长时间为20秒和 5 '-GGACCCTGATGGATCC-3 ' 和 5 '-GATGGGCCGCAACGACGA-3 ' 的整合酶模块的退火温度为 57°c, 伸长时间为45秒。
- 使用以下特定反应周期在20μl 的总体积内进行 PCR 反应: 95°c 时初始变性 5分钟, 95°c 时 350个月, 退火温度下 30秒, 72°c 时伸长率步长 (退火温度和伸长率为对于每对底漆夫妇, 请选择特定的), 在72°c 下, 最后的伸长率为7分钟。
- 注射器农业浸润
- 在含有50μgml 利福平的 LB 介质和以下适当的 Vector-specific 特异性抗生素中接种三种 a.肿瘤转化剂: 50μml 卡比西林 (pich20111, pICH14011 或 pich7410. egfp, 或50μgml 卡那霉素, 用 pICH31070 转化为a. tumefaciens 。在28°c 下连夜晃动而生长。
- 在 4, 500 x克离心 20分钟, 并在含有 10 mL 4-吗啡-乙磺酸 (mes; ph 5.5) 和 10 mm 的渗透缓冲液的100毫升 (或初始细菌培养的两卷) 中重新悬浮细菌培养, 并将其重新悬浮在渗透缓冲液中。MgSO4, 不考虑 od600.在室温下 (RT) 下对悬浮液进行3年的孵化。
- 将含有 GAD65mut、"87Gad65mut" 或 eGFP 3 ' 模块的三个模块之一的等量细菌悬浮液与 5 ' 模块和集成酶模块混合。使用悬浮液混合注射器渗透红甜菜和菠菜叶。
- 将悬浮液的5毫升放置在没有针头的注射器中。将注射器的尖端按在菠菜和红甜菜植物的叶子下部, 同时对叶片的另一侧施加温和的反压。
- 渗透前三个完全膨胀的叶子从顶点开始为每个植物。在农业浸润的叶子上贴上纸标签。在标准条件下将生长室内的植物送回。
注: 出于健康和安全原因, 在渗透过程中佩戴护目镜和手套。 - 收集感染后4至14天的农业浸润叶片 (dpi), 并将其冷冻在液氮中。将植物组织存放在-80°c。
- 真空农业渗透
- 在含有50μgml 利福平和适当的 VECTOR 特异性抗生素的 lb 培养基50毫升中分别生长, 在28°c 下夜间晃动.
- 在 4, 500 x克离心下进行隔夜细菌培养, 20分钟. 将渗透缓冲液 1 l 中的颗粒重新悬浮到0.35 的 od 600,并在 rt 孵育3小时。
- 在每个悬浮液中加入0.01% 的洗涤剂 (聚山梨酸酯 20)。将含有 GAD65mut、"87Gad65mut" 或 eGFP 3 ' 模块的三个模块之一的等量细菌悬浮液与 5 ' 模块和集成酶模块混合。
- 在支架中插入一个工厂 (6周前的红甜菜厂, 见第1节)。将含有渗透浴 (2 L) 的烧杯上的支架和地方倒置, 将叶片浸入渗透悬浮液中。
注: 确保所有的叶子完全浸入细菌悬浮液。提高水平, 如有需要, 增加额外的渗透暂停。 - 将浸入式浴池与浸没的植物转移到渗透室并将其关闭。打开真空泵, 打开渗透腔上的真空进气阀。
- 一旦渗透室内的压力降低到90毫巴, 将真空保持 3分钟, 释放真空45秒。一旦渗透室恢复到大气压力, 打开腔内, 将浸润的植物从细菌浴中取出。
- 在标准条件下将生长室内的植物送回。
- 根据重组蛋白的不同, 以最大表达 dpi 收集农业浸润的叶片, 并将其冷冻在液氮中。将植物组织存放在-80°c。
3. 重组蛋白表达分析
- 总可溶性蛋白质 (TSP) 提取
- 将注射器或真空浸润的红甜菜和菠菜叶磨碎, 按步骤收集2.2.6 和 2.3.8, 用砂浆和茎在液氮中细粉。将粉末转移到15毫升塑料管中, 并将材料存放在-80°c。
- 加入900Μl 的萃取缓冲液 (50 mM 磷酸钠 pH 值 8.0, 20 mM 亚亚硫酸钠) 到300毫克的叶粉中。
注: 植物组织重量 (mg) 与缓冲液体积 (μL) 之间的选定比率为1:3。 - 通过旋涡 1分钟, 然后在4°C 下离心 40分钟, 使混合物均匀.
- 将上清液收集在干净的管中, 并将其存放在-80°c。
- 植物 eGFP 可视化和定量
- 在96孔板上, 以三个技术复制的形式加载从 eGFP 表达叶子的每个 TSP 提取物的100Μl。
- 将96孔板放入荧光读取器中, 开始测量。使用 eGFP 荧光检测所需的 485535 nm 滤光片集。
- 为了绝对定量, 在同一板块中准备校准曲线, 加载不同数量的纯化 eGFP (62.5、125、500、750和 1, 000 纳克)。
- 双氯苯酸 (BCA) 测定 TSP 的定量
- 将试剂 A (材料表) 的50个部分与试剂 b (材料表) 的1份混合。准备足够数量的新鲜 BCA 工作解决方案, 以便对样品进行检测和校准标准。
注: 每个样品所需的 BCA 工作解决方案的体积为 1.9 mL。对于具有9个标准 (包括空白) 的标准程序, 需要 17.1 mL 的 BCA 工作解决方案。 - 每个标准的移液器 0.1 mL (包括一个空白) 和 TSP 提取成一个标记的管。
注: 作为校准标准, 在10-1000 微米范围内制定一套新的牛血清白蛋白 (BSA) 标准, 最好使用与样品相同的稀释剂, 如水。该空白由 0.1 mL 的稀释剂组成, 用于校准标准和样品制备。 - 加入1.9 毫升的 BCA 工作溶液, 彻底混合。盖上管子, 在37°c 孵育30分钟。
- 将管材冷却到 RT, 在10分钟内测量所有样品的562纳米吸收率。
注: 即使在 RT, 颜色的发展仍在继续。如果在10分钟内完成所有管的吸收率测量, 不会出现重大误差。 - 从标准和 TSP 提取物的读数中减去空白的 562 nm 吸收值。
- 绘制每个标准的空白校正 562 nm 读数的浓度。确定每个 TSP 提取物的蛋白质浓度。
- 将试剂 A (材料表) 的50个部分与试剂 b (材料表) 的1份混合。准备足够数量的新鲜 BCA 工作解决方案, 以便对样品进行检测和校准标准。
- 进行 Coomassie 凝胶染色, 如前面在 Gecchele 等人。
- 西方印迹分析
- 按照 Gecchele 等人的前面描述的, 进行西方印迹分析.
- 蛋白质电泳分离后, 使用标准技术将其转移到硝化纤维素膜上。将4% 的牛奶混合在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) pH 值7.4 中, 制备阻止溶液。用10毫升的阻塞溶液在 RT 封堵膜1小时。
- 用0.1% 洗涤剂在1:10000 处制备抗 Gad65/67 和抗 LHCB2 的兔原代抗体, 在1:20000 时制备抗 egfp 的抗 egfp。在4°C 下用准备好的原代抗体溶液在4°c 下或在 RT 中连续搅拌4小时对膜进行培养。
- 丢弃原代抗体, 用含有0.1% 洗涤剂的阻滞液清洗膜 3次, 每次5分钟。
- 用0.1% 洗涤剂在阻止溶液中制备辣根过氧化物酶 (HRP)-共轭抗家兔抗体。在 RT 处不断搅拌, 将膜培养1.5 小时。
- 丢弃二级抗体, 用 PBS-T (PBS 补充0.1% 洗涤剂) 清洗膜 5次, 每次5分钟。
- 按照制造商的说明, 用市售的发光醇溶液对膜进行培养。使用化学发光成像系统检测信号。
4. 植物材料加工
- 在表达峰 (11 dpi) 采集真空农业浸润的87GAD65mut 表示红甜菜叶, 并将其冷冻在液氮中。
- 在-50°c 和0.04 毫巴的情况下, 将冷冻叶冷冻干燥72小时。将它们存放在-80°c。
- 将叶子磨成细粉, 并将其存放在用硅胶密封的容器中, 以排除水分。
5. 胃消化模拟和细胞完整性分析
- 胃消化模拟
- 称量100毫克的磨碎冻干红甜菜叶, 并在6毫升的 PBS (pH 7.4) 中重新悬浮。
- 使用 6m HCl 将样品 ph 值调整为2。
- 在 10mm Porcine 中加入猪胃黏膜中的 4 Mg\ ml 胃蛋白酶, 最终得到 1 mg/mL 或1:20 与总可溶性蛋白的比例。在37°c 下摇晃样品120分钟。
- 用 1 M NaOH 将样品调整到 pH 值 8, 以灭活胃蛋白酶。
- 在4°C 条件下, 以 20, 000 x g 的速度离心每个样品的 750μl aliquots, 时间为20分钟。分别收集上清液并将颗粒重新悬浮在一个加载缓冲液的上清液体积中 (1.5 M Tris HCl, pH 值 6.8, 3% SDS, 15% 甘油和 4% 2-甲基)。
注: 出于健康和安全原因, 请戴手套, 在通风罩下工作, 以便制备样品。 - 用西方印迹分析8对上清液和再悬浮颗粒进行了分析.
- 细胞完整性分析
- 准备两个样品的100毫克磨冻干燥红甜菜叶, 并重新悬浮在6毫升的 PBS (pH 7.4)。
- 将只有一个样品的 pH 值调整到 2, HCl 为 6 m HCl. 在37°c 下将两个样品摇一摇120分钟。
- 在4°C 条件下, 以 20, 000 x g 的速度离心每个样品的 750μl aliquots, 时间为20分钟。分别收集上清液, 并将颗粒重新悬浮在一个加载缓冲液的上清液体积中。
- 采用西方印迹分析的方法对上清液和再悬浮颗粒进行了分析。
6. 生物检测
- 重量100毫克冻干红甜菜叶。将粉末在无菌 PBS (pH 7.4) 和涡旋的8毫升中重新采样1分钟。
- 在不使用抗生素或含有 (i) 50μgml 利福平的情况下制备 LB 培养基, (ii) 利福平和卡苯青霉素各 50μgml, (三) 利福平和卡那霉素各 50μgl, 或 (四) 利福平、卡贝西林和卡那霉素各50μgml。
- 在5个选择性 LB 介质中的一种中, 每种冻干叶均质板1毫升。
- 在28°c 下将所有板材取出3天。
- 数一数每个盘子上生长的农杆菌菌落。
- 计算并定义残留细菌电荷为冻干叶均质 (cfu) 每毫升的菌落形成单元 (CFU) 的数量。
7. 代谢物提取
- 主要代谢物提取
- 重量30毫克-80°c 储存, 真空农业浸润 "87GAD65mut-表达红甜菜叶粉在一个2毫升塑料管。
- 加入750Μl 的冷 70/30 (v/v), 为 30s. 在-20°c 时培养2小时。
注: 所有溶剂和添加剂必须是 LC-MS 级。 - 在17900Xg 的4°c 下加入600μl 冷水和离心机, 在4°c 下收集并转移到新的2毫升管中。丢弃较低的氯仿相和间期。
- 将样品放入真空集中器 3小时, 使溶剂蒸发。
- 将从步骤7.1.4 中获得的颗粒溶解在300Μl 中, 每 50 (v/v) 乙腈/水, 并将样品与样品进行3分钟的超声处理。
- 通过0.2μm 膜过滤器将溶液通过, 并将其放入透明的固定300μl 插入玻璃管中。
- 次生代谢物提取
- 重量300毫克-80°c 储存, 真空农业浸润 "87GAD65mut-表达红甜菜叶粉在一个15毫升塑料管。
- 加入3毫升甲醇, 涡流 30秒, 在 40 kHz 的情况下超声15分钟。
注: 所有溶剂和添加剂必须是 LC-MS 级。 - 在4°c 条件下以 4, 500 x克的温度离心样品 10分钟, 并将上清液转移到新的 15 ml 管中。
- 用水稀释 1: 3 (vv) 的 100μl, 并通过0.2μm 的滤膜将溶液通过。
- 将溶液放入透明的固定300μl 插入玻璃管中。
- 极脂萃取
- 重量200毫克-80°c 储存, 真空农业浸润 "87GAD65mut-表达红甜菜叶粉在一个15毫升塑料管。
- 加入200Μl 的水, 然后加入2毫升的甲醇, 然后在冰上保持1小时。
注: 所有溶剂和添加剂必须是 LC-MS 级。 - 30 s 的涡流和声音在 40 kHz 15分钟。
- 在4°c 下以 4, 500 x 克的速度离心样品 25分钟, 收集氯仿相并将其转移到2毫升管中。放弃上氢酒精期和间期。
- 将样品放入真空集中器 3小时, 使溶剂蒸发。
- 用600μl 甲醇溶解从步骤7.3.5 中获得的颗粒。
- 用甲醇稀释 1: 5 (vv) 的100μl 萃取物, 并通过0.2μm 的滤膜将溶液通过。
- 将溶液放入透明的固定300μl 插入玻璃管中。
8. 液相色谱质谱分析和数据处理
- 按照供应商的建议建立 LC-MS 系统。
注: LC 部分由自动取样器和 HPLC 组成, 在 C18 柱 (150 x 2.1 毫米, 粒径3微米) 前装有 C18 防护柱 (75 x 2.1 毫米, 粒径 5μm), 用于分析次生代谢物和极性脂质, 而在 HILIC 柱前面使用 HILIC 防护柱 (7.5 x 2.1 mm, 3μm) (150 x 2.1 mm, 粒径 2.7μm)。MS 是一种离子陷阱质谱仪, 具有电喷雾电离 (ESI) 或大气压力化学电离 (APCI) 源。 - 为高效液相色谱梯度准备适当的溶剂。在初级代谢物分析中, 使用 20 mM 甲酸铵作为溶剂 A;95% 乙腈, 5% 水加 10 mm 甲酸铵为溶剂 B。对于次生代谢物分析, 请用水加0.05% 甲酸 (A) 和乙腈加0.05% 甲酸 (B)。对于极性脂质分析, 用水加0.05% 甲酸 (A) 和100% 乙腈 (B)。
注: 溶剂和添加剂必须是 LC-MS 级。 - 使用表 1中报告的梯度进行代谢物洗脱。将流量定为 0.2 Ml/min, 为次生代谢物和极性脂质注入每个样本 10μl, 而为初级代谢物注入5μl。
- 通过混合不同样品的相等部分来制备质量控制 (QC) 样品, 以使每个实验条件具有代表性的混合物。在实验过程中分析 QC 样品, 以监测仪器效率。具体而言, 在每个采样批次之后插入 QC 样品分析。
- 随机的样品, 以避免仪器驱动的影响。
- 9分析后, 立即插入列清洗方法和空白分析。
注: 在最强溶剂的高百分比下, 用等温洗脱法在两种溶剂之间执行慢速梯度。空白包括注射纯甲醇: 水 (50/50, v2), 以提高保留时间的重现性在以下分析。 - 使用表 2中列出的参数设置仪器, 以交替的正负电离模式获取质谱。
注: 其他参数取决于特定平台。 - 按照 Dal Santo 等人的解释, 执行下一个数据处理.
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Representative Results
本文介绍了在食用植物组织中开发口服疫苗的工作流程。这项工作的重点是在可食用寄主植物物种中表达目标蛋白和对潜在口服疫苗的定性。
第一步是评估基于植物病毒的表达技术是否适合在食用植物系统中产生重组蛋白。为此, 我们首先使用 eGFP 作为模型蛋白, 并将其表达为两个可食用的叶植物系统: 红甜菜和菠菜。植物通过携带 eGFP 重组表达载体的 a .肿瘤悬浮液进行人工农业浸润。用西方印迹分析 (图 1A b e)观察荧光蛋白的表达, 并在紫外光下进行量化。结果表明, 红甜菜系统的 eGFP 表达较高, 在 9 dpi (图 1C) 下, 新鲜叶重量 (flw) 达到 544.9±10.9μg, 比菠菜高, 在 11 dpi下测量最大 egfp 水平 (1113.4±0.3 μgw) (11 dpi ((11 dpi) (图 1 f)。由于这些原因, 红色甜菜被选定为所有后续实验的表达式宿主。
据陈家等人10 人介绍, 采用真空入渗法检测了 eGFP 瞬态表达, 更适合大规模疫苗生产。不同浓度的隔夜 a. 肿瘤培养, 从10-1到 10-3不等, 洗涤剂浓度不同 (0.005-0.05%)通过比较最大表达 dpi (9 dpi) 下的 eGFP 积累水平进行了测试。结果发现, 较高的细菌滴度产生较高的 eGFP 产量 (10-1 ~ 0.35)。然而, 使用不同的洗涤剂浓度没有发现显著差异 (数据未显示)。
然后, 在 0.35 OD 600 和0.01% 的洗涤剂下, 用a. tumefaciens悬浮液真空浸润植物。一旦表达平台和传递系统建立, Gad65、GAD65mut 和 n-终止截断形式 ("87 Gad65mut") 的表达形式将分别与以前一样在最高表达日5和 11 dpi 进行了比较。建立11。从农业浸润叶片中提取 TSP 后, 用西方印迹法对所有样品进行分析, 并通过密度分析对重组蛋白进行相对定量 (图 2)。结果表明, 在 GAD65mut 上, 87GAD65mut 形态的性能提高了20倍。因此, 截断形式被选定为首选口服疫苗候选, 积累高达2014±29.3 微克波尔瓦在红色甜菜叶在 11 dpi。
最后, 对开发潜在口服疫苗的参数进行了评估。通过西方印迹分析, 与未经处理 (仅冷冻) 的组织进行了比较, 并对真空浸润红甜菜冻干后的重组蛋白完整性进行了评价, 表达了 "87GAD65mut"。如图 3 a所示, 在冻干过程后, 目标蛋白被证明是稳定的。
在冻干材料上, 以1:20 与 tsp 的比例, 将猪胃酶蛋白酶加入 1 mgml 的最终浓度或达到1:20 的比例, 对冻干材料进行了胃消化模拟。这两种消化道处理条件都导致重组蛋白降解, 如西方印迹分析所示 (图 3C·D· e,仅报告的胃蛋白酶最终浓度为 1 mg/mL 的数据)。在胃蛋白酶消化后的颗粒样品中没有特定的信号 (通道胃蛋白酶, 第1-3 页), 这表明在冷冻干燥处理后, 植物细胞失去了完整性, 导致目标蛋白降解。
细胞完整性评价表明, 当干燥的植物组织在具有中性 pH 值 (pH 7.4) 的缓冲液中重新悬浮时, 有 "87GAD65mut" 部分溶解, 表明至少有一些细胞在叶片研磨和干燥过程中被破坏。干燥的植物组织在酸性条件下的再悬浮, 反而导致只在不溶性部分检测到 "87GAD65mut"。这可能是由于低 pH 值引起的 "87GAD65mut 沉淀", 此外还有未破细胞的蛋白质含量11。这些检测表明, 冷冻干燥可以选择作为疫苗候选制剂的治疗方法。
此外, 还对草根浸润红甜菜叶片中残留微生物的电荷进行了评价。
生物测定表明, 为候选疫苗制剂开发的治疗方法消除了细菌负荷11。
通过 lc-ms 产生的初级和二级代谢物以及极性脂质的指纹, 对87GAD65mut 和对照红甜菜植物的代谢生物等效性进行了评估, 这些生物代谢与生物等效性的关系表现为 "87GAD65mut", 9 种农业浸润对照和对照株。9个野生类型的控件。PCA 统计显示了一个野生类型的植物集群分离到所有其他样本。相反, 87GAD65mut 与浸润和负对照植物之间没有显著差异。此外, 三组植物在极性脂质分布方面无显著差异 11.
图 1: 农业浸润红甜菜和菠菜叶片 eGFP 表达水平的比较。西方印迹分析 (a, d) 和相应的加载控制 (RuBisCO 大亚基) 染色的蛋白质提取物 egfp 表达叶样本中收集的时间过程分析从4到14感染后的天数 (dpi)。用荧光法测定了每种叶蛋白提取物的 eGFP 含量 (c, f)。农业浸润红甜菜叶样本的结果显示在左侧面板中, 在右侧面板中显示了农业浸润的菠菜样本。加载了等量的蛋白质提取物, 西部印迹为3.5 微克, 库马西染色为30微克。在西方印迹分析中, 一种抗 egfp 抗体被用作探针。侧数表示 kDa 中的分子质量标记。p. c., 阳性对照, 10 纳克的商业重组人 GAD65;n. c., 负对照, 从叶子中提取的提取物仅与携带 5 ' 和积分酶模块的 a . tumefacens渗透。误差条表示三个独立实验的标准偏差。这一数字已从 Bertini 等人11 人处修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2 : Gad65mut 和 87Gad65ut 在红甜菜叶片中的表达水平 .西方印迹分析 (a) 和相应的加载控制 ( rubisco 大亚基 ) 染色的蛋白质提取物的蛋白质提取物的三个红甜菜叶的颜色 , 表达了 87gad65mut ( 左 ) 和 gad65mut ( 右 ) 。在西方印迹分析中 , 一种抗 gad 抗体被用作探针 ( 车道上装载了20μl的 GAD65mut 提取物和 1 微米的萃取物 , 用于 Gad65mut ) 。在 Coomassie 染色凝胶中 , 为 GAD65mut 和 87gad65mut 加载相同体积的蛋白质提取物 ( 10μl / lane ) 。侧数表示 kDa 中的分子质量标记。p. c., 阳性对照, 10 纳克的商业重组人 GAD65;n. c., 负对照, 从叶子中提取的提取物只与携带 5 ' 和积分酶模块的 a . tumefacens渗透。(c) 利用西方印迹阳性对照作为密度分析的参考, 绘制了两种蛋白质形态的相对表达水平。误差条表示三个独立实验的标准偏差。这一数字已从 Bertini 等人11 人处修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:口服疫苗候选评价。左侧分析了冷冻干燥处理后的蛋白质稳定性 (a, b)。西方印迹分析 (a) 和相应的凝胶染色与库马西明亮的蓝色 (b) 代表三个独立提取物的叶子表达了 87GAD65mut 。收获的叶子在-50°c 下直接冷冻 (新鲜) 或冻干, 0.04 毫巴 72小时 (冻干)。不同的组织: 缓冲比在 TSP 提取过程中使用, 以考虑脱水造成的水分损失。提取物的等体积分别为西方印迹和库马西染色, 分别为0.25 和10Μl。一种抗 gad 抗体已被用于西部印迹探测侧数表明分子质量标记在 kDa。n. c., 负对照, 从叶子中提取的提取物仅与携带 5 ' 和积分酶模块的 a. tumefacens 渗透。右侧为 "胃消化效果" 87GAD65mut (c, d, e)的体外模拟。西方印迹分析 (c, d) 和相应的凝胶染色与库马西明亮蓝 (e) 代表三个独立提取物的叶子表达了约87GAD65mut 后模拟胃消化。在100毫克的冻干组织中加入了 1 mgml 的胃蛋白酶, 同时使用了不含酶的对照样品。对于在最后离心步骤中分别获得的上清液和颗粒 (p), 24Μl 和16μl 已用于 SDS-PAGE 分析。在西方印迹分析中, 以抗 gad (c) 和抗 Lhcb2 (d) 抗体为探针。侧数表示 kDa 中的分子质量标记。请点击这里查看此图的较大版本.
| 主要代谢物 (100分钟) | 时间 (分钟) | % A | % B | 持续时间 (分钟) | 类型 |
| 初始 | 0 | 100元 | - | 初始条件 | |
| 0 | 0 | 100元 | 10 | 伊萨克拉克拉克拉特 | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | 梯度 | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | 伊萨克拉克拉克拉特 | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | 梯度 | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | 伊萨克拉克拉克拉特 | |
| 70 | 0 | 100元 | 1 | 梯度 | |
| 71 | 0 | 100元 | 29 | 等价性 (再平衡) | |
| 次生代谢物 (60分钟) | 时间 (分钟) | % A | % B | 持续时间 (分钟) | 类型 |
| 初始 | 98 | 2 | - | 初始条件 | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | 梯度 | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | 梯度 | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | 梯度 | |
| 14 | 30 | 70 | 7。 | 梯度 | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | 伊萨克拉克拉克拉特 | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | 梯度 | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | 伊萨克拉克拉克拉特 | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | 梯度 | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | 等价性 (再平衡) | |
| 极地脂质 (90分钟) | 时间 (分钟) | % A | % B | 持续时间 (分钟) | 类型 |
| 初始 | 50 | 50 | - | 初始条件 | |
| 0 | 0 | 100元 | 10 | 梯度 | |
| 10 | 0 | 100元 | 65 | 伊萨克拉克拉克拉特 | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | 梯度 | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | 等价性 (再平衡) |
表 1: LC-MS 分析中代谢物洗脱的梯度条件。
| 质谱仪组件 | 功能 | 参数 | ||||
| 主要代谢物 | 次生代谢物 | 极地脂质 | ||||
| 电喷电离 (ESI) 源 | 雾化气体 | 50 psi, 350°c | 50 psi, 350°c | - | ||
| 干燥气体 | 10 L 分钟-1 | 10 L 分钟-1 | ||||
| 大气压力化学电离 (APCI) 源 | 雾化气体 | - | - | 50 psi, 350°c | ||
| 干燥气体 | 10 L 分钟-1 | |||||
| 蒸发器 | 450°c | |||||
| 离子陷阱和探测器扫描 | 完全扫描模式 | 13, 000 m//秒 | 13, 000 m//秒 | 13, 000 m//秒 | ||
| 50-1500 m/z | 50-1500 m/z | 50-1500 m/z | ||||
| 扫描范围 | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| 目标质量 | ||||||
| 碰撞气体 | 氦 | |||||
| 真空压力 | 1.4 x 10-5 毫巴 | |||||
| 毛细管来源 | + 4, 500 V | + 4, 500 V | + 4, 000 V | |||
| 端板偏移 | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| 斯基默 | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| 盖帽出口 | 106 V | -121 V | 143.5 V | |||
| 10月1日 | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| 10月 2 DC | 1.7 V | -1.7 V | 2 V | |||
| 镜头1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| 镜头2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| 用于正电离模式的 ICC | 20 | |||||
| 用于负电离模式的 ICC | 7。 | |||||
表 2: 在交替的正负电离模式下获取质谱的参数。
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Discussion
在这项研究中, 我们对自身免疫性糖尿病候选口服疫苗的设计进行了初步分析。本实验的目标蛋白是人类 65 kDa 谷氨酸脱羧酶的突变形式, 其生产和功能易于检测和测量 12.它在不同食用植物组织中的表达是由载体5介导的, 在很短的时间内介导高水平的重组蛋白产生。根据红甜菜和菠菜叶片中 eGFP 表达的方法, 通过人工农业浸润, 选择了最佳候选植物食用寄主。由于人工农业浸润的耗时过程和菠菜叶片组织浸润的硬度, 这一步骤对工业扩张可能至关重要。
确定收获的特定 dpi, 使重组蛋白的最高重组蛋白积累水平是一个关键的步骤, 需要在个案的基础上进行测试和选择。对不同 dpi (从4到 12) 的荧光蛋白表达进行分析, 可以确定每个植物系统中最大表达的日期。在这些最长表达日, eGFP 浓度 (μgw FLW) 之间的比较突出表明, 就重组蛋白产量而言, 红甜菜是表现最好的平台。
为此, 对红甜菜进行了进一步测试, 通过真空系统提供植物病毒载体, 该系统被认为更适合疫苗工业大规模生产13。
鉴于标准的真空渗透协议针对烟草物种5进行了优化, 为所考虑的植物物种的程序调整设置一系列参数是一个临界点。然后, 对红甜菜真空农业渗透方案进行了优化。我们的证据表明, 农杆菌稀释是提高蛋白质表达水平的关键, 而洗涤剂浓度, 以提高叶片的渗透性。结果表明, 该装置系统和技术符合这一工作目的。
在红甜菜中, 以不同的亚细胞定位为特征, 以其在n.benthamiana7中的表达表现为 gad65 和, 表现出不同的亚细胞定位。为每个样品准备了三个生物复制。每个生物复制包括来自不同植物的三片浸润的叶子池, 对两种 GAD65 型的采样从2到 14 dpi 不等。将其表达水平与植物组织中积累的最高蛋白质进行比较。
密度测量分析的相对定量表明, "87GAD65mut 的表达水平比完整的对应表达水平高出 20倍"。这可能是由于其细胞质定位, 而 GAD65mut, 由于其残留物锚定这种形式的细胞膜, 具有较低的产量 7, 反映了较低的蛋白质稳定性.·红甜菜叶片组织平均积累水平为2014±29.3 微克 FLW, 足以从 T1D 口服疫苗的研制开始。
最后, 在选择了最适合的平台、技术和蛋白质形式后, 我们着手对受感染的叶子进行收获后的处理。由于叶片组织由95% 的水组成, 脱水处理有助于防止微生物污染。我们的研究结果表明, 冷冻干燥处理可以应用于样品, 而不会影响叶片中的重组蛋白水平。通过冻干去除10倍水消除了细菌污染 (bioburden), 包括用于农业渗透过程的重组a. 肿瘤.
此外, 蛋白质生物包封分析表明, 在模拟胃消化后, 对 "87GAD65mut" 进行了完全消化。这表明冷冻干燥处理会破坏植物细胞壁, 使重组蛋白暴露在胃环境的酸性和酶组成中。
维持蛋白质或肽分子的完整性在胃肠道过渡到吸收部位是一个问题口服药物给药 14.因此, 脱水治疗后, 应正确配制潜在的疫苗, 以克服胃环境, 而不会失去其完整性。在植物衍生的 GAD 疫苗的制造中, 可以将包封在相对稳定的外壳中作为一个系统, 以提高其效率, 使其能够在口服第15条路线上得到保护和稳定。
探索了各种技术来克服与大分子口服相关的问题, 例如最近关于合成水凝胶与胰岛素络合的一些研究表明, 该技术具有较高的包封效率和快速胰岛素在肠道中释放以 ph 依赖的方式16,17。
利用 PCA 统计方法研究了与浸润对照和非浸润对照相比, 植物的原生和次生代谢物生物等效性均为87GAD65mut。渗透植物与浸润对照之间的差异不显著, 而非浸润的野生植物形成了一个独立的集群。这些结果表明, 正如文献13所示, 由于植物因渗透而产生的细菌代谢物或代谢物, LC-MS 分析将浸润的植物与未经处理的植物区分开来.总体而言, 这一分析表明, "87GAD65mut 的积累对整体代谢影响不大。
总之, 以冻干红甜菜叶组织为代表的潜在口服疫苗, 利用植物病毒表达技术获得的具有 "87GAD65mut" 的实验性口服疫苗, 适用于实验性的 T1D 口服免疫治疗。试验。植物病毒表达载体技术由于能够快速和高水平地产生外来蛋白质, 在瞬态表达领域变得非常有吸引力。这项技术是基于解构载体, 只携带 RNA 聚合酶 RNA 依赖和运动蛋白5 , 因此它失去了其在植物中的传染性;因此, 它对人类的潜在传播应该被排除在外。
本文报道的实验方案可以推广到许多不同的食用物种 , 如生菜、 和西白茶 .由于这些物种的叶子, 包括红甜菜和菠菜, 以前被检测为良好的表达植物系统5, 可以作为未煮熟的食物, 这里提出的技术可以用来制造食用疫苗或生产经过最低限度加工的功能性食品或饲料。
重组蛋白植物种类的组合, 收获的 dpi, 给出最高的重组蛋白积累水平, 仍需根据所表达的重组蛋白和宿主根据具体情况进行经验确定植物种类18。
除了对抗结肠病毒、淋巴瘤和实体肿瘤的自体疫苗外, 这种技术在口服疫苗生产中的应用还具有很大的潜力, 可以在不久的将来成为常规疫苗的替代品,单克隆抗体, 以针对癌症19,20。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了维罗纳大学在2014年呼吁框架内资助的 "利用植物生产自身免疫性糖尿病食用疫苗" (项目 ID:891854) 联合项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
References
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