Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um candidato de vacina oral contra a diabetes tipo 1 em uma planta comestível.
Abstract
Agricultura molecular de plantas é o uso de plantas para produzir moléculas de interesse. Nesta perspectiva, plantas podem ser utilizadas tanto como biorreatores para produção e purificação subsequente do produto final e para a entrega oral direta de proteínas heterólogos quando utilizar espécies de plantas comestíveis. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de uma vacina oral do candidato contra Diabetes tipo 1 (T1D) em sistemas de planta comestível, usando a tecnologia de baseados em vírus recombinante DNA planta desconstruída, entregada com infiltração de vácuo. Nossos resultados mostram que a beterraba vermelha é um hospedeiro adequado para a expressão transiente de um autoantigen derivada humana associada à T1D, considerado um candidato promissor como vacina T1D. Folhas, produzindo o autoantigen completamente foram caracterizadas por sua resistência à digestão gástrica, a presença de carga bacteriana residual e por seu perfil metabólico secundário, dando uma visão geral sobre a produção de processo para o potencial de uso de plantas para entrega oral directa de uma proteína heteróloga. Nossa análise mostrou quase completa degradação da vacina oral liofilizado candidato seguindo uma simulado digestão gástrica, sugerindo que uma estratégia de encapsulamento na fabricação da vacina de origem vegetal GAD é necessária.
Introduction
Desde a revolução de biologia molecular de plantas na década de 1980, os sistemas à base de plantas para a produção de biofármacos podem ser considerados como uma alternativa aos tradicionais sistemas baseados em células de mamíferos e microbiana1. As plantas exibem várias vantagens sobre plataformas tradicionais, com escalabilidade, custo-efetividade e segurança, sendo os mais relevantes2. O produto recombinante pode ser purificado a partir do tecido de planta transformada e administrado, também por via parentérica ou por via oral e, além disso, planta comestível transformada pode ser usada diretamente para entrega oral. Via oral simultaneamente promove a imunidade da mucosa e sistêmica, e elimina a necessidade de agulhas e pessoal médico especializado. Além disso, entrega oral elimina o complexo processamento a jusante, que normalmente responde por 80% do custo total de fabricação de uma proteína recombinante3. Todas essas vantagens podem ser traduzidas em economia de produção, suprimentos e mão de obra reduzindo os custos de cada dose, tornando a droga acessível à maioria da população mundial.
Várias estratégias, tanto para a transformação estável e expressão transiente, foram desenvolvidas para a produção de proteínas recombinantes em plantas. Entre eles, um sistema de expressão baseada em vírus de planta desconstruída de alto rendimento (por exemplo, magnICON) fornece desempenho superior levando altos rendimentos de proteínas recombinantes em prazos relativamente curtos4. Muitos exemplos de expressão transiente, usando o sistema de expressão baseada em vírus de planta em plantas de Nicotiana benthamiana são relatados, sendo o host de produção padrão-ouro. No entanto, esta planta de modelo não é considerada como uma espécie comestível devido os alcaloides e outros metabolitos tóxicos que são acumulados em suas folhas.
Neste trabalho, descrevemos a comparação entre dois sistemas de plantas comestíveis, beterraba vermelha (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) e espinafre (Spinacea oleracea cv Industria), para a expressão de duas formas de candidato do isoform 65 kDa de ácido glutâmico descarboxilase (GAD65), realizado pela planta baseados em vírus vetores5. GAD65 é um autoantigen importante associada a Diabetes tipo 1 (T1D) e é atualmente sob investigação em ensaios clínicos humanos para impedir ou atrasar T1D através da indução de tolerância6. A produção de GAD65 em plantas tem sido estudada extensivamente em espécies de plantas de modelo como tabacum do Nicotiana benthamiana s.4,5,6,e7. Aqui, descrevemos a utilização de espécies vegetais comestíveis para a produção da molécula em tecidos que pode ser destinada a uma entrega oral direta. Do ponto de vista técnico, estudamos e selecionado o sistema de agroinfiltration da planta e a plataforma de planta comestível para produção de GAD65 avaliando parâmetros diferentes: a expressão da proteína recombinante os níveis, a carga microbiana residual em planta tecido destinado a entrega oral, a resistência de GAD65 para a digestão gástrica e a bioequivalência das plantas transformadas com o tipo selvagem.
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Protocol
1. vermelho cultivo de beterraba e espinafre
- Crescer a beterraba vermelha (b. vulgaris cv Moulin Rouge) e espinafre (S. oleracea cv Industria) plantas em uma câmara de crescimento, usando 150 µE de intensidade da luz, umidade relativa de 65%, ciclo claro/escuro de 12 h 23/21 ° c, respectivamente.
- Após a germinação de sementes, adubar as plantas duas vezes por semana com uma solução de 1 g/L de um fertilizante comercialmente disponível (Tabela de materiais). Para agroinfiltration use espinafre de cinco semanas e plantas de beterraba vermelha de seis semanas de idade.
2. transiente expressão através da tecnologia baseados em vírus de planta desconstruída
- Construção de vetores de expressão de planta
- Introduzir os vetores - o módulo 5' (pICH20111), os 3' módulos (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut e pICH7410.eGFP), preparados como descrito anteriormente,1,2,7e o módulo de integrase (pICH14011)- em Agrobacterium tumefaciens GV3101 tensão usando as técnicas padrão. Crescem em meio de LB contendo 50 μg/mL rifampicina e antibióticos apropriados do vetor-específico (carbenicilina 50 de μg/mL para pICH20111, pICH14011 e pICH7410.eGFP), 50 canamicina μg/mL para pICH31070 por 2 dias a 28 ° C.
- As colônias por colônia do PCR usando os seguintes primers específicos para cada vetor de tela: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' e 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' para 3' módulos pICH31070.GAD65mut e pICH31070.∆87G65mut, com uma temperatura do recozimento de 55 ° C e um tempo de alongamento de 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' e 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' para o terceiro 3' módulo pICH7410.eGFP, com uma temperatura do recozimento de 53 ° C e tempo de alongamento de 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' e 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' para o módulo de 5', com uma temperatura do recozimento de 53 ° C e tempo de alongamento de 20 s e 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' e 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' para o módulo de integrase com uma temperatura do recozimento de 57 ° C e tempo de alongamento de 45 s.
- Realizar a reação de PCR em um volume total de 20 μL usando o seguinte ciclo de reacção específica: 5 min desnaturação inicial a 95 ° C, 35 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s na temperatura de recozimento e a etapa de alongamento a 72 ° C (temperatura e alongamento do tempo de recozimento uma Re específico para cada par de primer) e uma etapa de alongamento final de 7 min a 72 ° C.
- Seringa agroinfiltration
- Inocular as três transformants da . tumefaciens em 50 mL de LB médio contendo 50 μg/mL, rifampicina e os seguintes antibióticos específicos do vetor apropriados: 50 carbenicilina μg/mL para a. tumefaciens transformada com pICH20111, pICH14011 ou pICH7410.eGFP ou 50 canamicina μg/mL para a. tumefaciens transformada com pICH31070. Crescer por agitação durante a noite a 28 ° C.
- Culturas bacterianas durante a noite de pelotas por centrifugação a 4.500 x g por 20 min e Resuspenda-los em 100 mL (ou dois volumes de cultura bacteriana inicial) de solução tampão de infiltração com ácido 4-morpholineethanesulfonic de 10mm (MES; pH 5,5) e 10 mM MgSO4, sem considerar o OD600. Incube as suspensões à temperatura ambiente (RT) para 3h.
- Misturar volumes iguais de suspensões bacterianas que contêm um dos três módulos, GAD65mut, ∆87GAD65mut ou eGFP 3' módulo, com 5' módulo e módulo de integrase. Use a mistura de suspensão para infiltração de seringa de folhas vermelhas de beterraba e espinafre.
- Coloca 5 mL da suspensão em uma seringa sem a agulha. Pressione a ponta da seringa contra a parte inferior da folha para as plantas de beterraba vermelha e espinafre e enquanto isso, aplicar uma contrapressão suave para o outro lado da folha.
- Infiltrar-se as três primeiras folhas completamente expandidas a partir do ápice de cada planta. Rotule as folhas de agroinfiltrated com um tag de papel no caule folha. Retorno as plantas em uma câmara de crescimento sob condições normais.
Nota: Por razões de saúde e segurança, use luvas e óculos de proteção durante o processo de infiltração. - Agroinfiltrated recolher folhas de 4 a 14 dias pós infecção (dpi) e congelá-los em nitrogênio líquido. Tecido de planta loja a-80 ° C.
- Agroinfiltration vácuo
- Crescer separadamente as três transformants da . tumefaciens em 50 mL de meio LB contendo 50 μg/mL rifampicina e vetor-específico apropriado antibiótico por agitação durante a noite a 28 ° C.
- Pellet de culturas bacterianas durante a noite por centrifugação a 4.500 x g por 20 min. resuspenda o pellet em 1 L de tampão de infiltração para uma OD600 de 0.35 e incubam as suspensões no RT para 3h.
- Adicione 0,01% v/v de detergente (polissorbato 20) para cada suspensão. Misturar volumes iguais de suspensões bacterianas que contêm um dos três módulos, GAD65mut, ∆87GAD65mut ou eGFP 3' módulo, com 5' módulo e módulo de integrase.
- Inserir uma planta (beterraba vermelha de seis semanas de idade da planta, consulte a secção 1) no suporte. Inverter o titular e coloque em cima de um copo contendo o banho de infiltração (2L) para submergir as folhas na suspensão de infiltração.
Nota: Certifique-se que todas as folhas estão completamente mergulhadas na suspensão bacteriana. Elevar o nível com a adição de suspensão de infiltração extra se necessário. - O banho de infiltração com a planta submersa de transferência para a câmara de infiltração e fechá-lo. Ligue a bomba de vácuo e abra a válvula de admissão de vácuo na câmara de infiltração.
- Uma vez que a pressão na câmara de infiltração foi reduzido para 90 mbar, manter o vácuo de 3 min. lançamento o vácuo para 45 s. Uma vez que a câmara de infiltração retornou à pressão atmosférica, abrir a câmara e retirar a planta infiltrada do banho bacteriano.
- Retorno as plantas em uma câmara de crescimento sob condições normais.
- Recolher folhas de agroinfiltrated em dpi a expressão máxima, dependendo da proteína recombinante e congelá-los em nitrogênio líquido. Tecido de planta loja a-80 ° C.
3. análise da expressão da proteína recombinante
- Extração de proteínas solúveis totais (TSP)
- Moer a seringa ou vácuo infiltrada vermelhas folhas de beterraba e espinafre, recolhidas nas etapas 2.2.6 e 2.3.8, para pó fino em nitrogênio líquido, usando o almofariz e pilão. Transferir o pó para tubos de plástico de 15 mL e armazenar o material a-80 ° C.
- Adicione 900 µ l de tampão de extração (50 mM de fosfato de sódio pH 8.0, metabissulfito de sódio 20 mM) a 300 mg de pó de folha.
Nota: A relação selecionada entre peso do tecido de planta (mg) para volume de tampão (µ l) é de 1:3. - Homogeneizar a mistura vortexing por 1 min, em seguida, centrifugar a 30.000 x g durante 40 min a 4 ° C.
- Recolher o sobrenadante em um tubo limpo e guarde-a-80 ° C.
- Planta eGFP visualização e quantificação
- Carrega 100 µ l de cada extrato obtido eGFP expressando folhas, em três repetições de técnicas, em uma placa de 96 poços.
- Colocar a placa de 96 poços em um leitor de fluorescência e iniciar a medição. Use o filtro de 485/535 nm conjunto necessário para a deteção de fluorescência eGFP.
- Para a quantificação absoluta, no mesmo prato prepare uma curva de calibração quantidades diferentes de carregamento (62.5, 125, 500, 750 e 1.000 ng) de um eGFP purificado.
- Ácido Bicinchoninic (BCA) de ensaios para quantificação de TSP
- Mix 50 partes de Reagente A (Tabela de materiais) com 1 parte de Reagente B (Tabela de materiais). Prepare um volume suficiente de solução de trabalho de BCA fresco para as amostras para ser analisada e os padrões de calibração.
Nota: O volume de solução de trabalho de BCA exigido para cada amostra é 1,9 mL. Para o procedimento padrão com 9 padrões (incluindo um espaço em branco), 17,1 mL de solução de trabalho de BCA é necessária. - Pipete 0,1 mL de cada padrão (incluindo um espaço em branco) e extratos TSP em um tubo rotulado.
Nota: Como padrões de calibração, preparar um novo conjunto de albumina de soro bovino padrões (BSA) no intervalo 10-1.000 μg/mL, de preferência usando o mesmo diluente de amostras, tais como água. O espaço em branco consiste em 0,1 mL do diluente usado para calibração padrão e preparação da amostra. - Adicione 1,9 mL de solução de trabalho de BCA e misture bem. Cobrir os tubos e incubar a 37 ° C por 30 min.
- Legal os tubos RT. medir a absorvância a 562 nm das amostras dentro de 10 min.
Nota: Mesmo em RT, continua o desenvolvimento de cor. Não será introduzido nenhum erro significativo se as medidas de absorvância de todos os tubos são feitas dentro de 10 min. - Subtrai o valor de absorvância 562 nm do branco das leituras das normas e os extractos TSP.
- Sinopse o 562 em branco-corrigido nm leitura para cada norma na sua concentração. Determine a concentração de proteína de cada extrato.
- Mix 50 partes de Reagente A (Tabela de materiais) com 1 parte de Reagente B (Tabela de materiais). Prepare um volume suficiente de solução de trabalho de BCA fresco para as amostras para ser analisada e os padrões de calibração.
- Execute Coomassie gel mancha como descrito anteriormente no Gecchele et al.8.
- Análise ocidental do borrão
- Efectuar a análise ocidental do borrão, conforme descrita em Gecchele et al.8.
- Após a separação eletroforética de proteínas, transferi-los para uma membrana de nitrocelulose, usando as técnicas padrão. Prepare a solução de bloqueio através da mistura de leite de 4% em tampão fosfato salino (PBS) de pH 7,4. Bloquear a membrana com 10 mL da solução de bloqueio no RT por 1h.
- Prepare o anticorpo primário de coelho em 1:10,000 para o anti-GAD65/67 e anti-LHCB2 e em 1: 20.000 para o anti-eGFP em 5 mL de solução de bloqueio com 0.1% de detergente. Incube a membrana com as soluções de anticorpo primário preparado durante a noite a 4 ° C ou para 4h no RT com agitação constante.
- Descartar o anticorpo primário e lave a membrana 3 vezes durante 5 min cada com bloqueio solução contendo 0,1% de detergente.
- Preparar a peroxidase de rábano (HRP)-conjugado anticorpo anticoelho no 1:10,000 em solução com detergente de 0,1% de bloqueio. Incube a membrana por 1,5 h em RT com agitação constante.
- Descartar o anticorpo secundário e lave a membrana 5 vezes por 5 min cada com PBS-T (PBS suplementado com 0,1% de detergente).
- Incube a membrana com uma solução de luminol comercialmente disponíveis seguindo as instruções do fabricante. Detecta o sinal, usando um sistema de imageamento de quimioluminescência.
4. a unidade de transformação de material
- Colheita da beterraba vermelha ∆87GAD65mut-expressando agroinfiltrated vácuo deixa no auge expressão (11 dpi) e congelá-los em nitrogênio líquido.
- Lyophilize as folhas congeladas por 72 h a-50 ° C e 0,04 mbar. Armazená-los a-80 ° C.
- Triturar as folhas a pó fino e armazená-lo em RT em um recipiente selado com gel de silicone para eliminar a umidade.
5. análise de integridade de simulação e célula gástrica da digestão
- Simulação de digestão gástrica
- Pesar 100 mg de folhas de beterraba vermelha liofilizado moído e ressuspendê-lo em 6 mL de PBS (pH 7,4).
- Ajuste o pH da amostra a 2, com 6 M de HCl.
- Adicione pepsina 4 mg/mL de suínos mucosa gástrica de HCl para obter uma concentração de pepsina final de 1 mg/mL ou um rácio de 01:20 de proteínas solúveis totais de 10 milímetros. Agite a amostra a 37 ° C durante 120 min.
- Ajuste as amostras de pH 8 com 1 M NaOH para inativar a pepsina.
- Centrifugue a 750 alíquotas µ l de cada amostra a 20.000 x g por 20 min a 4 ° C. Recolher separadamente o sobrenadante e ressuspender o precipitado em um volume sobrenadante do tampão de carregamento (1,5 M Tris HCl, pH 6,8, 4% de 2-Mercaptoetanol, 15% de glicerol e 3% SDS).
Nota: Por razões de saúde e segurança, use luvas e trabalhar sob a coifa para a preparação da amostra. - Analise tanto o sobrenadante e ressuspenso pelo borrão ocidental análise8.
- Análise de integridade celular
- Preparar duas amostras de 100 mg de folhas de beterraba vermelha liofilizado moído e ressuspender ambos em 6 mL de PBS (pH 7,4).
- Ajuste o pH de somente uma amostra de 2, com 6 M HCl. Shake ambas as amostras a 37 ° C durante 120 min.
- Centrifugue a 750 alíquotas µ l de cada amostra a 20.000 x g por 20 min a 4 ° C. Recolher separadamente o sobrenadante e ressuspender o precipitado em um volume sobrenadante do tampão de carregamento.
- Analise tanto o sobrenadante e ressuspenso por análise ocidental do borrão.
6. Bioburden ensaio
- Pese 100 mg de folhas de beterraba vermelha liofilizado. Ressuspender o pó em 8 mL de PBS estéril (pH 7,4) e o vórtice por 1 min.
- Prepare o meio LB sem antibióticos ou contendo (i) 50 rifampicina µ g/mL, (ii) 50 µ g/mL cada de rifampicina e carbenicilina, (iii) 50 µ g/mL cada de rifampicina e canamicina ou (iv) 50 µ g/mL cada de rifampicina, carbenicilina e canamicina.
- Placa 1 mL de cada folha liofilizado homogeneizado em um dos 5 LB mídia seletiva.
- Incubar as placas todas por 3 dias a 28 ° C.
- Conte as colônias de Agrobacterium crescidas em cada prato.
- Calcular e definir a carga bacteriana residual, como o número de unidades formadora de Colônia (UFC) por mL de homogeneizado a folha liofilizado (UFC/mL).
7. extração de metabólito
- Extração de metabólito primário
- Pesa 30 mg de-80 ° C armazenados, vácuo agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expressando pó de folha de beterraba vermelha em um tubo de plástico de 2 mL.
- Adicione 750 µ l de frio (v/v) de 70/30 metanol/clorofórmio e vórtice por 30 s. Incubar a-20 º C por 2 h.
Nota: Todos os solventes e aditivos devem ser de grau LC-MS. - Adicione 600 µ l de água fria e centrifugar 17.900 x g a 4 ° C por 10 min. coletar e transferir a fase hidroalcoólica superior para um novo tubo de 2 mL. Descarte a fase inferior clorofórmico e a interfase.
- Colocar as amostras em um vácuo concentrador para 3h para evaporar o solvente.
- Dissolva a pelota Obtida de passo 7.1.4 em 300 µ l de 50/50 (v/v) acetonitrila/água e proceda à sonicação das amostras por 3 min.
- Passar as soluções 0,2 μm filtros de membrana e colocá-los em um transparente fixo 300 µ l inserir tubos de vidro.
- Extração de metabólito secundário
- Pesar de 300 mg de-80 ° C armazenados, vácuo agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expressando pó de folha de beterraba vermelha em um tubo plástico de 15 mL.
- Adicionar 3 mL de metanol, vórtice por 30 s e proceda à sonicação em 40 kHz durante 15 min.
Nota: Todos os solventes e aditivos devem ser de grau LC-MS. - Centrifugar as amostras a 4.500 x g a 4 ° C por 10 min e transferir os sobrenadantes para novos tubos de 15 mL.
- Diluir 100 µ l de extrato 1:3 (v/v) com água e passe a solução através de um filtro de membrana de 0,2 μm.
- Colocar a solução em um tubo transparente em fixo 300 µ l vidro de inserção.
- Extração de lipídios polares
- Pesar 200 mg de-80 ° C armazenados, vácuo agroinfiltrated ∆87GAD65mut-expressando pó de folha de beterraba vermelha em um tubo plástico de 15 mL.
- Adicionar 200 µ l de água e, em seguida, 2 mL de metanol e ficar no gelo por 1h.
Nota: Todos os solventes e aditivos devem ser de grau LC-MS. - Vórtice por 30 s e proceda à sonicação em 40 kHz durante 15 min.
- Centrifugar as amostras a 4.500 x g a 4 ° C por 25 min. coleta e transferência a fase de clorofórmio para tubos de 2 mL. Descarte a fase superior hidroalcoólico e a interfase.
- Colocar as amostras em um vácuo concentrador para 3h para evaporar o solvente.
- Dissolva a pelota Obtida de passo 7.3.5 com 600 µ l de metanol.
- Diluir 100 µ l de extrato 1:5 (v/v) com metanol e transferir a solução através de um filtro de membrana de 0,2 μm.
- Colocar a solução em um tubo transparente em fixo 300 µ l vidro de inserção.
8. análise de espectrometria de massa de cromatografia líquida e processamento de dados
- Configure o sistema de LC-MS, conforme recomendado pelo fornecedor.
Nota: A seção de LC consiste de um mostruário juntamente com HPLC equipada com uma coluna de guarda de C18 (75 x 2.1 mm, partícula tamanho 5 µm) em frente a uma coluna C18 (150 x 2.1 mm, partícula tamanho 3 µm) para a análise de metabólitos secundários e lipídios polares , Considerando que, com uma coluna de guarda HILIC (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) na frente de uma coluna HILIC (150 x 2.1 mm, partícula tamanho 2,7 µm). O MS é um espectrômetro de massa ion trap fornecido com uma ionização electrospray (ESI) ou fontes de ionização química (APCI) uma pressão atmosférica. - Prepare os solventes adequados para os gradientes HPLC. Para análise de metabólito primário, use formiato de amônio 20 mM como A solvente; acetonitrilo de 95%, 5% de água além de formiato de amônio 10 mM como solvente B. Para análise de metabólito secundário, use água + 0,05% de ácido fórmico (A) e acetonitrilo + 0,05% de ácido fórmico (B). Para análise de lipídios polares, use água mais 0,05% de ácido fórmico (A) e 100% acetonitrila (B).
Nota: Os solventes e aditivos devem ser o grau de LC-MS. - Use os gradientes relatados na tabela 1 para a eluição do metabólito. Conjunto o fluxo taxa em 0,2 mL/min. injectar 10 µ l de cada amostra para metabólitos secundários e lipídios polares, Considerando que injetar 5 µ l de metabólitos primários.
- Prepare uma amostra de controle de qualidade (QC) misturando partes iguais de amostras diferentes para ter uma mistura representativa de cada condição experimental. Analise a amostra QC durante o experimento para monitorar a eficiência do instrumento. Especificamente, inserir uma análise de amostra QC depois de cada amostra-lote 10.
- Randomize as amostras para evitar efeitos orientado para o instrumento.
- Após 9 análises, inserir uma coluna limpeza método e uma análise em branco imediatamente após.
Nota: Execute um gradiente lento entre os dois solventes com uma eluição isocrática em alta porcentagem do solvente mais forte. O espaço em branco é composto por uma injeção de um puro metanol: água (50/50, v/v) para melhorar a reprodutibilidade do tempo de retenção na análise seguinte. - Configure o instrumento para adquirir os espectros de massa em modos alternativos de ionização positiva e negativa, usando os parâmetros listados na tabela 2.
Nota: Outros parâmetros dependem da plataforma específica. - Execute o processamento de dados seguinte conforme explicado no Dal Santo et al.9.
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Representative Results
Neste trabalho, é apresentado o fluxo de trabalho para o desenvolvimento de uma vacina oral em tecidos vegetais comestíveis. O foco deste trabalho é a expressão de uma proteína do alvo em uma espécie de planta comestível do anfitrião e a caracterização da vacina oral potencial.
A primeira etapa envolveu a avaliação da adequação da tecnologia de expressão baseada em vírus planta para a produção de proteínas recombinantes em sistemas de plantas comestíveis. Para este objectivo, primeiro usamos o eGFP como uma proteína de modelo e nós expressou-o em dois sistemas de comestíveis vegetais folhosos: vermelha beterraba e espinafre. As plantas foram manualmente agroinfiltrated com suspensões de a. tumefaciens carregando vetores da expressão recombinante eGFP. A expressão da proteína fluorescente foi visualizada pela análise ocidental do borrão (figura 1A, B, D, E) e quantificada sob luz UV. Os resultados mostraram que o sistema de beterraba vermelha é caracterizado por uma maior expressão eGFP, atingindo 544,9 ± 10,9 µ g/g de peso de folha fresca (FLW) em 9 dpi (Figura 1), do que o espinafre, os níveis máximos eGFP (113.4 ± 0,3 µ g/g FLW) foram medidos em 11 dpi ( Figura 1F). Por estas razões, beterraba vermelha foi selecionada como host de expressão para todas as experiências subsequentes.
De acordo com Chen et al.10, a expressão transiente eGFP foi testada por um método a vácuo de infiltração, que é mais adequado para a produção de vacinas em larga escala. Diferentes diluições de pernoite a. tumefaciens cultura, variando de 10-1 a 10-3e diferentes concentrações de detergente (0.005-0.05%) foram testados, comparando o nível de acumulação de eGFP no máxima expressão dpi (dpi-9). Os resultados encontraram que maior concentração bacteriana produzida maior rendimento de eGFP (10-1 ~ 0.35). No entanto, não há diferenças significativas foram encontradas utilizando diferentes concentrações de detergente (dados não mostrados).
Em seguida, as plantas foram vácuo infiltrado com uma suspensão da . tumefaciens 0,35 OD600 e 0,01% de detergente. Uma vez que o sistema de entrega e a plataforma de expressão foram estabelecidas, a expressão de duas formas de GAD65, GAD65mut e um N-terminal truncado formulário (∆87GAD65mut), foi comparado no dia de máxima expressão, dpi 5 e 11, respectivamente, como anteriormente estabelecida11. Após a extração do TSP de agroinfiltrated folhas, todas as amostras foram analisadas por western blot e proteína recombinante relativamente foi quantificada por uma análise de densitometria (Figura 2). Resultados realçado o 20-fold maior desempenho do formulário ∆87GAD65mut sobre o GAD65mut. A forma truncada, portanto, foi selecionada como candidato preferencial vacina oral, acumulando tão alto quanto 201,4 ± 29,3 µ g/g FLW em folhas de beterraba vermelha em 11 dpi.
Finalmente, foram avaliados parâmetros para o desenvolvimento de uma vacina oral potencial. A integridade da proteína recombinante após liofilização de vácuo infiltrou-se folhas de beterraba vermelha, expressando ∆87GAD65mut foi avaliada em comparação com as não tratadas (apenas congelado) tecido, pela análise ocidental do borrão. Como mostrado na Figura 3A, a proteína do alvo demonstrou ser estável após o processo de liofilização.
A simulação da digestão gástrica foi realizada no material liofilizado adicionando pepsina suína enzima gástrica para uma concentração final de 1 mg/mL ou a uma proporção de 01:20 de TSP. Ambas as condições de tratamento digestivo resultaram na degradação da proteína recombinante, como demonstrado pela análise ocidental do borrão (Figura 3, D, E, os dados reportados somente para a concentração de pepsina final de 1 mg/mL). A ausência de um sinal específico nas amostras de sedimento após digestão de pepsina (pepsina lanes, p. 1-3), sugeriu que, após tratamento de liofilização, as células da planta perderam sua integridade, levando a degradação da proteína alvo.
A avaliação da integridade celular mostrou que quando o tecido de planta seca foi resuspended no buffer com pH neutro (pH 7,4), ∆87GAD65mut foi parcialmente solubilizado, sugerindo que pelo menos algumas células foram quebradas durante a folha de moagem e secagem. A ressuspensão do tecido de planta seca em condições ácidas, em vez disso, levou à detecção do ∆87GAD65mut somente na fração insolúvel. Isto era provavelmente devido a precipitação de ∆87GAD65mut causada por baixo o pH, além do conteúdo de proteína de células contínuo11. Estes ensaios indicam que liofilização poderia ser selecionada como tratamento para a preparação de candidatos a vacina.
Além disso, avaliou-se a carga microbiana residual nas folhas vermelho-beterraba agroinfiltrated.
O ensaio de bioburden exibido que os tratamentos explorados para a preparação da vacina candidata eliminada a carga bacteriana11.
A bioequivalência metabólica de plantas de beterraba vermelha de ∆87GAD65mut e controle foi avaliada por impressões digitais de metabólitos primários e secundários e lipídios polares gerados por LC-MS de nove plantas de beterraba vermelha, expressando ∆87GAD65mut, nove controles agroinfiltrated e nove controles do tipo selvagem. Estatística PCA revelou um cluster de planta selvagem-tipo separado de todas as outras amostras. Em vez disso, sem diferenças significativas foram destacadas entre as ∆87GAD65mut e as plantas de controle negativo e infiltradas. Além disso, não há diferença significativa entre os três grupos de plantas em termos de perfis de lipídios polares foi identificado11.
Figura 1: comparação dos níveis de expressão de eGFP em agroinfiltrated vermelho beterraba e espinafre folhas. Western blot análise (A, D) e controles de carga correspondentes (RuBisCO grande subunidade) corados com Coomassie brilhante azul (B, E) de extratos de proteína de eGFP-expressando amostras de folhas coletadas durante a análise do tempo-curso de 4 a 14 dias pós infecção (dpi). O conteúdo de eGFP de cada extracto de folhas de proteína foi quantificado pela medição de fluorescência (C, F). Os resultados das amostras de folhas de beterraba vermelha de agroinfiltrated são exibidos no painel a esquerda, onde as amostras de espinafre agroinfiltrated são mostradas em um direito. Quantidades iguais de extratos de proteína tenha sido carregado, 3,5 µ g para o western blot e 30 µ g para a coloração Coomassie. Um anticorpo anti-eGFP tem sido usado como uma sonda na análise ocidental do borrão. Lado números indicam marcadores moleculares de massa em kDa. p.c., controle positivo, 10 ng de GAD65 humana recombinante comercial; n.c., controle negativo, extrato de folhas infiltrou-se unicamente com a. tumefaciens carregando o 5'- e módulos de integrase. Barras de erro representam o desvio padrão de três experimentos independentes. Esta figura foi modificada de Bertini et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: níveis de expressão GAD65mut e Δ87GAD65mut em folhas de beterraba vermelha. Análise ocidental do borrão (A) e controle de carga correspondente (RuBisCo grande subunidade) corado com Coomassie brilhante azul (B) de proteína de extratos de folhas de beterraba vermelha três expressando Δ87GAD65mut (à esquerda) e GAD65mut (à direita). Um anticorpo anti-GAD tem sido usado como uma sonda na análise ocidental do borrão (as pistas foram carregadas com 20 μL do extrato de GAD65mut e 1 μL do extrato de Δ87GAD65mut). No Coomassie manchado o gel, o mesmo volume de extratos de proteína (10 μL/pista) foi carregado para GAD65mut e Δ87GAD65mut. Lado números indicam marcadores moleculares de massa em kDa. p.c., controle positivo, 10 ng de GAD65 humana recombinante comercial; n.c., controle negativo, o extrato obtido das folhas infiltrou-se apenas com a. tumefaciens carregando o 5'- e módulos de integrase. (C) usando o controle positivo do borrão ocidental como uma referência para uma análise densitométricos, os níveis de expressão relativa das formas duas proteínas são plotadas. Barras de erro representam o desvio padrão de três experimentos independentes. Esta figura foi modificada de Bertini et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação de vacina oral contra o candidato. No lado esquerdo, análises de estabilidade de proteínas após a liofilização tratamento (A, B). Análise ocidental do borrão (A) e gel correspondente corado com Coomassie brilhante azul (B) representando três independentes extratos das folhas, expressando Δ87GAD65mut. Folhas colhidas diretamente foram congeladas (fresco) ou liofilizadas-50 ° c, 0,04 mbar para 72 h (liofilizado). Rácios de reserva: tecido diferentes foram empregados durante a extração de TSP para considerar a perda de água devido à desidratação. Igual volume de extratos foram carregados, 0,25 e 10 µ l, para o borrão ocidental e Coomassie coloração respectivamente. Um anticorpo anti-GAD foi usado por western blot sondagem lado números indicam marcadores moleculares de massa em kDa. n.c., controle negativo, extrato de folhas infiltrated unicamente com a. tumefaciens carregando o 5'- e módulos de integrase. No lado direito, em vitro simulado digestão gástrica de Δ87GAD65mut (C, D, E). Análises borrão ocidental (C, D) e gel correspondente corado com Coomassie brilhante azul (E) representando três independentes extratos das folhas, expressando Δ87GAD65mut após a digestão gástrica simulada. 1 mg/mL de pepsina foi adicionado a 100 mg de liofilizado tecido, enquanto uma amostra de controle sem enzima tem sido usada. µ L 24 e 16 µ l, para sobrenadantes (s) e pelotas (p), respectivamente, obtidas na etapa de centrifugação final, têm sido utilizados para análise de SDS-PAGE. Anti-GAD (C) e anticorpos anti-LHCB2 (D) foram usados como sondas na análise ocidental do borrão. Lado números indicam marcadores moleculares de massa em kDa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Metabólitos primários (100 min) | Tempo (min) | % A | % B | Duração (min) | Tipo |
| Inicial | 0 | 100 | - | Condição inicial | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Isocrática | |
| 10 | 15 | 85 | 15 | Gradiente | |
| 25 | 15 | 85 | 5 | Isocrática | |
| 30 | 50 | 50 | 10 | Gradiente | |
| 40 | 50 | 50 | 30 | Isocrática | |
| 70 | 0 | 100 | 1 | Gradiente | |
| 71 | 0 | 100 | 29 | Isocrática (re-equilíbrio) | |
| Metabólitos secundários (60 min) | Tempo (min) | % A | % B | Duração (min) | Tipo |
| Inicial | 98 | 2 | - | Condição inicial | |
| 0 | 90 | 10 | 2 | Gradiente | |
| 2 | 80 | 20 | 10 | Gradiente | |
| 12 | 75 | 25 | 2 | Gradiente | |
| 14 | 30 | 70 | 7 | Gradiente | |
| 21 | 30 | 70 | 5 | Isocrática | |
| 26 | 10 | 90 | 1 | Gradiente | |
| 27 | 10 | 90 | 14 | Isocrática | |
| 41 | 98 | 2 | 1 | Gradiente | |
| 42 | 98 | 2 | 18 | Isocrática (re-equilíbrio) | |
| Lipídios polares (90 min) | Tempo (min) | % A | % B | Duração (min) | Tipo |
| Inicial | 50 | 50 | - | Condição inicial | |
| 0 | 0 | 100 | 10 | Gradiente | |
| 10 | 0 | 100 | 65 | Isocrática | |
| 75 | 50 | 50 | 1 | Gradiente | |
| 76 | 50 | 50 | 14 | Isocrática (re-equilíbrio) |
Tabela 1: Condições de gradiente de eluição do metabólito na análise de LC-MS.
| Componentes do espectrômetro de massa | Função | Parâmetros | ||||
| Metabólitos primários | Metabólitos secundários | Lipídios polares | ||||
| Fonte de electrospray (ESI) de ionização | Gás de nebulização | 50 libras por polegada quadrada, 350 ° C | 50 libras por polegada quadrada, 350 ° C | - | ||
| Gás de secagem | 10 L. min-1 | 10 L. min-1 | ||||
| Fonte de ionização química (APCI) pressão atmosférica | Gás de nebulização | - | - | 50 libras por polegada quadrada, 350 ° C | ||
| Gás de secagem | 10 L. min-1 | |||||
| Vaporizador | 450 ° C | |||||
| Ion trap e varredura do detector | Modo de varredura completa | 13.000 m/z por segundo | 13.000 m/z por segundo | 13.000 m/z por segundo | ||
| 50-1.500 m/z | 50-1.500 m/z | 50-1.500 m/z | ||||
| Intervalo de varredura | 200 m/z | 400 m/z | 700 m/z | |||
| Massa de destino | ||||||
| Gás de colisão | Hélio | |||||
| Pressão do vácuo | 1.4 x 10-5 mbar | |||||
| Fonte capilar | +4,500 V | +4,500 V | +4,000 V | |||
| Deslocamento de placa final | -500 V | -500 V | -500 V | |||
| Skimmer | 40 V | -40 V | 40 V | |||
| Saída de Cap | 106 V | -121 V | 143.5 V | |||
| 1 de OCT DC | 12 V | -12 V | 12 V | |||
| 2 de OCT DC | 1.7 V | -1.7 V | 2 V | |||
| Lente 1 | -5 V | 5 V | -5 V | |||
| Lente 2 | -60 V | 60 V | -60 V | |||
| ICC para modo de ionização positiva | 20 | |||||
| ICC para modo de ionização negativa | 7 | |||||
Tabela 2: Parâmetros para a aquisição de espectros de massa em modos alternativos de ionização positiva e negativa.
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Discussion
Neste estudo mostramos análise preliminar para a concepção de uma vacina oral contra o candidato para diabetes auto-imune. A proteína do alvo para este experimento foi uma forma mutante do humano 65 kDa glutamato descarboxilase, que produção e funcionalidade são facilmente detectáveis e mensuráveis12. Sua expressão em tecidos diferentes vegetais comestíveis foi mediado por vetores5, que mediar um elevado nível de produção de proteínas recombinantes em um período muito curto de tempo. A seleção da planta melhor candidato anfitrião comestível foi realizado baseado na expressão de eGFP em vermelha beterraba e folhas de espinafre por agroinfiltration manual. Esta etapa pode ser crítica para escala industrial por causa do processo demorado de agroinfiltration manual e a dureza na infiltração de tecido de folhas de espinafre.
A identificação dos dpi específica de colheita que dá o mais alto nível de acumulação de proteínas recombinantes para uma proteína recombinante é uma etapa crítica e precisam ser testados e selecionado em uma base caso-a-caso. A análise da expressão da proteína fluorescente em dpi diferente (de 4 a 12), permitiu identificar o dia da expressão máxima de cada sistema de planta. A comparação entre a concentração de eGFP (µ g/g), FLW nestes dias de máxima expressão, destacou que o vermelho beterraba é o melhor desempenho de plataforma em termos de rendimento de proteína recombinante.
Por esta razão, beterraba vermelha foi testada ainda mais para a entrega de vectores baseados em vírus de planta por um sistema de vácuo, que é considerado mais adequado para a produção industrial em grande escala de vacina13.
Dado que o protocolo padrão de infiltração vácuo é otimizado para espécies de tabaco5, o set-up de uma gama de parâmetros para o ajuste de procedimento para as espécies de plantas considerados é um ponto crítico. Então, o protocolo de vácuo agroinfiltration de beterraba vermelha foi otimizado. Nossa evidência mostrou que a diluição de Agrobacterium é crucial para melhorar os níveis de expressão de proteína, enquanto a concentração de detergente para aumentar a permeabilidade da folha. Os resultados mostraram que o sistema de planta e a tecnologia se encaixa com esta finalidade de trabalho.
Duas formas diferentes de GAD65, GAD65mut e ∆87GAD65mut, que anteriormente eram caracterizadas por sua expressão em s. benthamiana7, exibindo diferente sub celular localização, foram expressos em vermelha beterraba por infiltração de vácuo. Três réplicas biológicas foram preparadas para cada amostra. Cada replicar biológica compreende uma piscina de três folhas infiltradas de diferentes plantas, amostradas de 2 a 14 dpi para ambas as formas de GAD65. Seu nível de expressão foi comparado para selecionar a proteína mais elevada acumula em tecidos vegetais.
A quantificação relativa por densitometria análise demonstrou que o ∆87GAD65mut tem um 20-fold maior nível de expressão do que suas contrapartes intacta. Isto poderia ser devido à sua localização citosólica enquanto GAD65mut, devido a seus resíduos que ancoram esta forma a membrana celular, tem um baixo rendimento7, reflectindo uma menor estabilidade da proteína. Nível de acumulação médio ∆87GAD65mut no tecido de folha de beterraba vermelha era 201,4 ± 29,3 µ g/g FLW, que é suficiente para começar com o desenvolvimento de vacina oral T1D.
Finalmente, após a seleção da forma mais adequada plataforma, tecnologia e proteína, seguimos pela criação de um tratamento pós-colheita das folhas infectadas. Desde que o tecido foliar é composto de 95% de água, um tratamento de desidratação é útil para evitar a contaminação de microorganismo. Nossos resultados demonstraram que um tratamento de liofilização pode ser aplicado à amostra, sem afetar os níveis de proteína recombinante nas folhas. A remoção de água 10 vezes por liofilização elimina a contaminação bacteriana (bioburden), incluindo o recombinante a. tumefaciens usado para o procedimento de agroinfiltration.
Além disso, a análise de encapsulamento de bio proteína mostrou que a ∆87GAD65mut é completamente digerido seguindo uma simulado digestão gástrica. Isto sugere que o tratamento de liofilização danifica a parede de pilha da planta, expondo a proteína recombinante para a composição ácida e enzimática do ambiente gástrico.
A manutenção da integridade da molécula de proteína ou peptídeo sobre a transição do trato gastrointestinal para o local de absorção representa um problema para a entrega de droga oral14. Portanto, após o tratamento da desidratação, a vacina potencial deve ser corretamente formulada para superar o ambiente gástrico sem perder sua integridade. Na fabricação da vacina de origem vegetal GAD, o encapsulamento em um shell relativamente estável pode ser aplicado como um sistema para melhorar sua eficiência, permitindo que seja protegido e estável ao longo da rota de entrega oral15.
Várias tecnologias têm sido exploradas para superar os problemas associados com a oral entrega de macromoléculas tais como alguns estudos recentes sobre a complexação de hidrogel sintético com insulina que mostrou um encapsulamento de alta eficiência e insulina rápida lançamento no intestino em uma maneira dependente do pH16,17.
Ambos a bioequivalência de metabólito primário e secundário de plantas expressando ∆87GAD65mut em comparação com controles infiltrados e não-infiltrada foi investigada utilizando estatísticas de PCA. As diferenças entre as plantas infiltradas expressando ∆87GAD65mut e os controles infiltrados não foram significativas, Considerando que as plantas do selvagem-tipo não-infiltrada formaram um cluster separado. Estes resultados sugerem que as plantas infiltradas distinguem-se das plantas não tratadas pela análise de LC-MS graças a metabólitos bacterianos ou metabolitos produzidos por plantas, por causa da infiltração, como já indicado na literatura13. Em geral esta análise demonstrou que a acumulação de ∆87GAD65mut tem pouco impacto sobre o metabolismo geral.
No total, estes resultados sugerem que a vacina oral potencial, representada por tecido de folha de beterraba vermelha liofilizado expressando ∆87GAD65mut obtidos explorando a tecnologia de expressão baseada em vírus de planta, é adequada para experimental T1D oral imunoterapia ensaios. A tecnologia de vetor de expressão de vírus de planta tornou-se muito atraente no campo expressão transiente, devido à sua capacidade de produzir proteínas estranhas, rapidamente e em níveis elevados. Esta tecnologia é baseada em um vetor desconstruído que carrega somente o RNA polimerase dependente de RNA e de proteína do movimento5 e, portanto, perde sua infecciosidade em plantas; Como consequência, sua transmissão potencial para os seres humanos deve ser excluído.
O protocolo experimental relatado aqui poderia ser estendido a muitos diferentes espécies comestíveis, tais como a alface, Chenopodium capitatum e Tetragonia expansa. Desde as folhas destas espécies, incluindo vermelha beterraba e espinafre, de quem foi detectada como expressão boa planta sistemas5, pode ser usado como alimento cru, a tecnologia proposta aqui pode ser usada para a fabricação de vacinas comestíveis ou para produção de alimentos funcionais minimamente processados ou alimentação.
A combinação de espécies de proteína recombinante/planta, dpi de colheita que dá o mais alto nível de acumulação de proteína recombinante precisa ainda ser determinado empiricamente em uma caso a caso dependendo da proteína recombinante expressa e no host espécie de planta18.
A aplicação desta tecnologia para a produção de vacina oral segura de grande potencial para se tornar uma alternativa às vacinas convencionais em um futuro próximo, além de vírus Oncolíticos combate, vacinas autólogas para linfomas e tumores sólidos, e anticorpos monoclonais para alvo cânceres19,20.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo projeto comum "O uso de plantas para a produção de uma vacina comestível de diabetes auto-imune (eDIVA)" (projeto ID: 891854) financiado pela Universidade de Verona, no âmbito da chamada de 2014.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
| 2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
| 96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
| Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
| Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
| Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
| Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
| Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
| Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
| GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| HILIC Column | Grace | - | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
| HILIC Guard Column | Grace | - | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
| Loading Buffer | |||
| Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
| Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
| Methanol | Sigma | 32213 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| Milk-blocking solution | Ristora | - | 3 % in PBS |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
| Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
| Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
| Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
| Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
| Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
| Syringe | Terumo | - | |
| Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
| Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
| Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
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