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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Transiente Expression in rote Beete einen biopharmazeutischen Kandidat Impfstoff für Typ-1-Diabetes

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59298
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biotechnology, University of Verona
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine mündliche Impfstoffkandidaten gegen Diabetes Typ1 in eine essbare Pflanze produzieren.

Abstract

Pflanze molekulare Landwirtschaft ist der Einsatz von Anlagen zur Erzeugung von Molekülen von Interesse. Unter diesem Gesichtspunkt können Pflanzen sowohl als Bioreaktoren für die Produktion und die anschliessende Reinigung des Endprodukts und für die direkte mündliche Übergabe heterologen Proteine verwendet werden, wenn essbare Pflanzenarten zu verwenden. In dieser Arbeit präsentieren wir die Entwicklung von einem Kandidaten Schluckimpfung gegen Typ-1-Diabetes (T1D) in essbare Anlagensysteme mit dekonstruierten Pflanze Virus-basierte rekombinanter DNA-Technologie, geliefert mit Vakuum Infiltration. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine rote Beete geeignet Host für die transiente Expression von einem menschlichen abgeleiteten Autoantigen T1D, als ein viel versprechender Kandidat als T1D Impfstoff zugeordnet ist. Blätter produzieren die Autoantigen zeichneten sich gründlich auf ihre Resistenz gegen Magen Verdauung und für das Vorhandensein der bakteriellen Restladung ihre sekundäre metabolischen Profils, geben einen Überblick über die Prozess-Produktion für den möglichen Einsatz von Anlagen zur mündlichen Direktlieferung von einer heterologen Proteinen. Unsere Analyse ergab fast vollständigen Abbau der gefriergetrockneten Kandidat Schluckimpfung nach einer simulierten Magen Verdauung, was darauf hindeutet, dass eine Kapselung-Strategie bei der Herstellung von pflanzlichen GAD Impfstoff erforderlich ist.

Introduction

Seit der Pflanze Molekularbiologie Revolution in den 1980er Jahren können als Alternative zu herkömmlichen Systemen basierend auf mikrobielle und Säugetier-Zellen1pflanzliche Systeme für die Produktion von Biopharmazeutika betrachtet werden. Pflanzen zeigen mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Plattformen mit Skalierbarkeit, Wirtschaftlichkeit und Sicherheit werden die relevantesten2. Das rekombinante Produkt kann von transformierte Pflanzengewebe gereinigt und dann verabreicht, entweder parenteral oder oral und darüber hinaus kann transformierten essbare Pflanze direkt zur mündlichen Lieferung verwendet werden. Die orale Verabreichung fördert gleichzeitig Schleimhaut und systemische Immunität, und es entfällt die Notwendigkeit für Nadeln und medizinisches Fachpersonal. Darüber hinaus entfällt mündlichen Lieferung die komplexe Weiterverarbeitung, die normalerweise 80 % der gesamten Herstellungskosten eines rekombinanten Proteins3ausmacht. Diese Vorteile können übersetzt werden Einsparungen in der Produktion, Versorgung und Arbeit, die Reduzierung der Kosten für jede Dosis, das Medikament zu einem Großteil der Weltbevölkerung erschwinglich zu machen.

Für die Produktion rekombinanter Proteine in Pflanzen wurden mehrere Strategien, sowohl für stabile Transformation und transiente Expression entwickelt. Unter anderem bietet eine hochverzinsliche dekonstruiert Virus-basierte Ausdruck der Anlage (z. B. MagnICON) überlegenen Leistung, hohe Erträge von rekombinanten Proteinen über relativ kurze Fristen4führt. Viele Beispiele für transiente Expression mit der Virus-basierte Ausdruck der Anlage in Nicotiana Benthamiana Pflanzen werden gemeldet und den Gold-Standard-Produktions-Server. Allerdings gilt diese Modellpflanze nicht als essbaren Arten aufgrund der Alkaloide und andere toxischen Metaboliten, die in den Blättern angesammelt werden.

In dieser Arbeit beschreiben wir den Vergleich zwischen zwei essbare Anlagensysteme, rote Beete (Beta Vulgaris cv Moulin Rouge) und Spinat (Spinacea Oleracea cv Industria), für den Ausdruck von zwei Kandidaten der 65 kDa Isoform von Glutaminsäure Decarboxylase (GAD65), durchgeführt von der Pflanze, die Virus-basierte Vektoren5. GAD65 ist eine große Autoantigen, Typ 1 Diabetes (T1D) zugeordnet und es wird derzeit in klinischen Studien am Menschen zu verhindern oder zu verzögern T1D durch Induktion Toleranz6untersucht. Die Produktion von GAD65 in Pflanzen wurde ausgiebig im Modell Pflanzenarten wie Nicotiana Tabacum und N. Benthamiana4,5,6,7untersucht. Hier beschreiben wir die Verwendung von essbaren Pflanzen für die Herstellung des Moleküls in Geweben, die für eine mündliche Direktfahrt gemeint sein kann. Aus technischer Sicht wir studierten und das System für die Pflanze Agroinfiltration und essbare Pflanze Plattform für GAD65 Produktion durch die Auswertung verschiedener Parameter ausgewählt: die rekombinante Proteinexpression Ebenen, die mikrobielle Restladung im Werk Gewebe für die mündlichen Lieferung, den Widerstand der GAD65, der Magen Verdauung und die Bioäquivalenz der transformierten Pflanzen mit dem Wildtyp.

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Protocol

1. rote Rüben und Spinat Anbau

  1. Rote Beete wachsen (B. Vulgaris cv Moulin Rouge) und Spinat (S. Oleracea cv Industria) Pflanzen in einer Kammer Wachstum mit 150 µE Lichtintensität, 65 % Relative Luftfeuchtigkeit, 12 h hell/dunkel-Zyklus am 23/21 ° C, beziehungsweise.
  2. Nach der Keimung der Samen Düngen der Pflanzen zweimal wöchentlich mit einer Lösung von 1 g/L von einem handelsüblichen Dünger (Table of Materials). Verwenden Sie für Agroinfiltration fünf Wochen altes Baby Spinat und rote Beete sechs Wochen alten Pflanzen.

(2) transiente Expression durch die dekonstruierten Virus-basierte Anlagentechnik

  1. Bau der Pflanze Expressionsvektoren
    1. Einführung der Vektoren - das 5'-Modul (pICH20111), die 3' Module (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut und pICH7410.eGFP), als zuvor beschriebenen1,2,7vorbereitet und der Integrase-Modul (pICH14011)- in Agrobacterium Tumefaciens GV3101 Belastung verwenden standard-Techniken. Wachsen Sie auf LB-Medium mit 50 μg/mL Rifampicin und entsprechenden Vektor-spezifische Antibiotika (50 μg/mL Carbenicillin für pICH20111, pICH14011 und pICH7410.eGFP), 50 μg/mL Kanamycin für pICH31070 für 2 Tage bei 28 ° C.
    2. Bildschirm der Kolonien von Colony PCR unter Verwendung der folgenden spezifischen Zündkapseln für jeden Vektor: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' und 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3 "für die 3'-Module pICH31070.GAD65mut und pICH31070.∆87G65mut, mit einer annealing-Temperatur von 55 ° C und eine Dehnung mal 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' und 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3 "für die dritte 3' Modul pICH7410.eGFP, mit einer Anlasstemperatur von 53 ° C und einer Dehnung-Zeit von 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' und 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3" für das 5'-Modul mit einer Anlasstemperatur von 53 ° C und eine Dehnung von 20 s und 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' und 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3 "für die Integrase-Modul mit einer Anlasstemperatur von 57 ° C und einer Dehnung Zeit von 45 s.
    3. Durchführung der PCR-Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 μl mit Hilfe der folgenden spezifischen Reaktionszyklus: erste Denaturierung 5 min bei 95 ° C, 35 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei der Anlasstemperatur und der Dehnung Schritt bei 72 ° C (Temperatur und Dehnung Glühen eine Re spezifisch für jedes Paar Grundierung) und eine endgültige Dehnung Schritt 7 min bei 72 ° C.
  2. Spritze agroinfiltration
    1. Die drei A. Tumefaciens Transformanten in 50 mL LB Medium mit 50 μg/mL Rifampicin und die folgenden entsprechenden Vektor-spezifische Antibiotika zu impfen: 50 μg/mL Carbenicillin für A. Tumefaciens verwandelt mit pICH20111, pICH14011 oder pICH7410.eGFP oder 50 μg/mL Kanamycin für A. Tumefaciens mit pICH31070 verwandelt. Wachsen Sie durch Schütteln über Nacht bei 28 ° C.
    2. Pellet-Übernachtung Bakterienkulturen durch Zentrifugation bei 4.500 X g für 20 min und Aufschwemmen sie in 100 mL (oder zwei Bände der ersten bakterielle Kultur) der Infiltration Puffer mit 10 mM 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES; pH 5,5) und 10 mM MgSO4, ohne Rücksicht auf die OD600. Inkubieren Sie die Suspensionen bei Raumtemperatur (RT) für 3 h.
    3. Mischen Sie gleiche Volumina von bakteriellen Suspensionen, eines der drei Module, GAD65mut, ∆87GAD65mut oder eGFP 3', 5' Modul und Integrase Modul enthalten. Verwenden Sie die Federung-Mischung für Spritze Infiltration von roten Rüben und Spinat Blätter.
    4. Platz 5 mL der Suspension in einer Spritze ohne Nadel. Drücken Sie die Spitze der Spritze gegen die Unterseite des Blattes für Spinat und rote Beete Pflanzen, und inzwischen wenden Sie einen sanften Gegendruck auf die andere Seite des Blattes.
    5. Die ersten drei komplett erweiterte Blätter ab der Spitze für jede Pflanze zu infiltrieren. Beschriften Sie die Agroinfiltrated Blätter mit einem Papier-Tag auf dem Blattstiel. Die Pflanzen in einer Kammer Wachstum unter Standardbedingungen zurück.
      Hinweis: Aus Gesundheits- und Sicherheitsgründen, tragen Sie Schutzbrille und Handschuhe während Infiltrationsprozess.
    6. Sammle Agroinfiltrated Blätter von 4 bis 14 Tage nach Infektion (dpi) und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Store Pflanzengewebe bei-80 ° C.
  3. Vakuum agroinfiltration
    1. Wachsen Sie einzeln die drei A. Tumefaciens Transformanten in 50 mL LB-Medium mit 50 μg/mL Rifampicin und entsprechenden Vektor-spezifische Antibiotika durch Schütteln über Nacht bei 28 ° C.
    2. Pellet über Nacht Bakterienkulturen durch Zentrifugation bei 4.500 X g für 20 min. Aufschwemmen das Pellet in 1 L des Infiltration-Puffer auf eine OD600 von 0,35 und inkubieren Sie die Aufhängungen bei RT für 3 h.
    3. Jede Aussetzung 0,01 % V/V des Waschmittels (Polysorbat 20) hinzufügen. Mischen Sie gleiche Volumina von bakteriellen Suspensionen, eines der drei Module, GAD65mut, ∆87GAD65mut oder eGFP 3', 5' Modul und Integrase Modul enthalten.
    4. Legen Sie eine Pflanze (sechs Wochen alte rote Beete zu Pflanzen, siehe Abschnitt 1) in der Halterung. Invertieren des Inhabers und legen auf einen Becher mit der Infiltration Bad (2 L), die Blätter in der Infiltration Suspension eintauchen.
      Hinweis: Sicherstellen Sie, dass alle Blätter in der Bakteriensuspension vollständig eingetaucht sind. Das Niveau mit dem Zusatz von zusätzlichen Infiltration Federung, bei Bedarf.
    5. Übertragen der Infiltration Bad mit dem untergetauchten Werk zur Infiltration Kammer und schließen Sie es. Schalten Sie die Vakuumpumpe und öffnen Sie das Vakuum Einlassventil auf die Infiltration Kammer zu.
    6. Sobald der Druck in der Kammer Infiltration bis 90 Mbar reduziert hat, halten dem Vakuum für 3 min. Release das Vakuum für 45 s. Sobald die Infiltration Kammer auf den atmosphärischen Druck zurückgekehrt ist, öffnen Sie die Kammer und entfernen Sie die infiltrierte Pflanze aus dem bakteriellen Bad.
    7. Die Pflanzen in einer Kammer Wachstum unter Standardbedingungen zurück.
    8. Agroinfiltrated Blätter mit der maximalen Ausdruck dpi, je nach das rekombinante Protein zu sammeln und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Store Pflanzengewebe bei-80 ° C.

(3) rekombinante Protein Expressionsanalyse

  1. Insgesamt lösliche Protein (TSP) Extraktion
    1. Schleifen Sie die Spritze oder Vakuum infiltriert rote Rüben und Spinat Blätter, gesammelt in den Schritten 2.2.6 und 2.3.8, zu feinen Pulver in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stößel. Übertragen Sie das Pulver in 15 mL-Kunststoff-Rohre und speichern Sie das Material bei-80 ° C.
    2. 300 mg Blattpulver 900 µL Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat pH 8.0, 20 mM Natrium Metabisulphite) hinzufügen.
      Hinweis: Die gewählte Verhältnis zwischen pflanzlichen Gewebe Gewicht (mg), Puffervolumen (µL) ist 1:3.
    3. Die Mischung durch Vortexen für 1 min zu homogenisieren, dann Zentrifugieren bei 30.000 X g für 40 min bei 4 ° C.
    4. Sammeln Sie den Überstand in ein sauberes Röhrchen und speichern Sie es bei-80 ° C.
  2. EGFP Anlagenvisualisierung und Quantifizierung
    1. Laden Sie 100 µL der einzelnen TSP-Extrakt aus eGFP Blätter in drei technischen Wiederholungen auf einer 96-Well-Platte zum Ausdruck zu bringen.
    2. Die 96-Well-Platte in ein Fluoreszenz-Leser und starten Sie die Messung. Verwenden Sie die 485/535 nm Filtersatz für eGFP Fluoreszenz-Detektion erforderlich.
    3. Für die absolute Quantifizierung in der gleichen Platte vorbereiten einer Kalibrationskurve laden verschiedene Mengen (62,5, 125, 500, 750 und 1000 ng) der gereinigten eGFP.
  3. Bicinchoninic Säure (BCA) Assay für TSP Quantifizierung
    1. 50 Teile des Reagenz A (Table of Materials) mit 1 Teil des Reagenz B (Table of Materials) mischen. Die Proben untersucht werden und die Kalibrierstandards bereiten Sie ausreichendes Volumen an frischer BCA Tanklösung vor.
      Hinweis: Die Lautstärke des BCA funktionierende Lösung für jede Probe erforderlich ist 1,9 mL. Für das Standardverfahren mit 9 Normen (einschließlich Leerzeichen) ist 17,1 mL BCA Arbeitslösung erforderlich.
    2. Pipette 0,1 mL jedes Standard (einschließlich Leerzeichen) und TSP-Extrakte in eine beschriftete Röhrchen.
      Hinweis: Als Kalibrierstandards, bereiten eine neue Reihe von Rinderserumalbumin (BSA) Normen im 10-1.000 μg/mL-Bereich, vorzugsweise mit dem gleichen Verdünnungsmittel als Proben, wie Wasser. Der Blank besteht aus 0,1 mL das Verdünnungsmittel für Kalibrierstandard und Probenvorbereitung verwendet.
    3. 1,9 mL BCA Arbeitslösung und mischen Sie gründlich. Die Röhren zu decken und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
    4. Cool die Rohre nach RT. Maß der Extinktion bei 562 nm aller Proben innerhalb von 10 Minuten.
      Hinweis: Auch bei RT weiter die Farbentwicklung. Keine signifikanten Fehler soll eingeführt werden, wenn die Extinktion Messungen alle Rohre innerhalb von 10 min fertig sind.
    5. Subtrahieren Sie den 562 nm Absorption Wert des Rohlings aus den Lesungen des Standards und der TSP-Extrakte.
    6. Handlung der Blank-korrigierte 562 nm Lektüre für jeden Standard auf seine Konzentration. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jede TSP-Extrakt.
  4. Führen Sie wie zuvor beschrieben in Gecchele Et Al.8Färbung Coomassie-Gel.
  5. Western-Blot Analyse
    1. Führen Sie die western-Blot Analyse in Gecchele Et Al.8wie oben beschrieben.
    2. Übertragen Sie nach der elektrophoretischen Trennung von Proteinen sie auf eine Nitrocellulose-Membran mit standard-Techniken. Bereiten Sie die blockierende Lösung durch Mischen von 4 % Milch Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7.4. Blockieren Sie die Membran mit 10 mL der blockierenden Lösung bei RT für 1 h.
    3. Bereiten Sie die Kaninchen Primärantikörper bei 1: 10.000 für die Anti-GAD65/67 und Anti-LHCB2, und bei 1: 20.000 für die Anti-eGFP in 5 mL blockierende Lösung mit 0,1 % Waschmittel. Inkubieren Sie die Membran mit den vorbereiteten Primärantikörper Lösungen über Nacht bei 4 ° C oder 4 h bei RT mit ständiger Bewegung.
    4. Entsorgen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Membran 3 Mal für 5 min mit blockierenden Lösung mit 0,1 % Waschmittel.
    5. Bereiten Sie den Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierte Anti-Kaninchen-Antikörper bei 1: 10.000 in blocking-Lösung mit 0,1 % Waschmittel. Inkubieren Sie die Membran für 1,5 h bei RT mit ständiger Bewegung.
    6. Verwerfen Sie der Sekundärantikörper und waschen Sie die Membran 5 Mal für 5 min mit PBS-T (PBS ergänzt mit 0,1 % Waschmittel).
    7. Inkubieren Sie die Membran mit einer handelsüblichen Luminol-Lösung nach den Anweisungen des Herstellers. Erkennen Sie das Signal mit Hilfe eines Chemilumineszenz imaging Systems.

4. Anlage Materialbearbeitung

  1. Ernte die Vakuum Agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimierenden rote Rübe Blätter an der Spitze der Ausdruck (11 dpi) und Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
  2. Lyophilize die gefrorenen Blätter für 72 h bei-50 ° C und 0,04 Mbar. Speichern sie bei-80 ° C.
  3. Mahlen Sie die Blätter zu feinen Pulver und bewahren sie bei RT in einem verschlossenen Behälter mit Kieselgel, die Feuchtigkeit auszuschließen.

5. Magen Verdauung Simulation und Zelle Integritätsanalyse

  1. Magen Verdauung simulation
    1. 100 mg geschliffen Gefriergetrocknete Rote Rübe Blätter wiegen und in 6 mL PBS (pH 7,4) aufzuwirbeln.
    2. Stellen Sie den pH-Wert der Probe 2 mit 6 M HCl.
    3. Fügen Sie 4 mg/mL Pepsin aus Schweinen Magenschleimhaut in 10 mM HCl, eine endgültige Pepsin-Konzentration von 1 mg/mL oder ein Verhältnis von 01:20, insgesamt lösliche Proteine zu erhalten. Schütteln Sie die Probe bei 37 ° C für 120 min.
    4. Passen Sie die Proben bis pH 8 mit 1 M NaOH, das Pepsin zu inaktivieren.
    5. Zentrifugieren Sie 750 µL-Aliquots jeder Probe bei 20.000 X g für 20 min bei 4 ° C. Überstand getrennt zu sammeln und das Pellet in einem Überstand Band der Ladepuffer Aufschwemmen (1,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 3 % SDS, 15 % Glycerin und 4 % 2-Mercaptoethanol).
      Hinweis: Aus Gesundheits- und Sicherheitsgründen, Handschuhe tragen und arbeiten unter Abzug für die Probenvorbereitung.
    6. Der Überstand und die resuspendierte Pellet durch western-Blot Analyse8zu analysieren.
  2. Zellanalyse Integrität
    1. Bereiten Sie zwei Proben von 100 mg geschliffen Gefriergetrocknete Rote-Bete-Blätter und Aufschwemmen Sie sowohl in 6 mL PBS (pH 7,4).
    2. Stellen Sie den pH-Wert des nur eine Probe bis 2 mit 6 M HCl. Schütteln beide Proben bei 37 ° C für 120 min.
    3. Zentrifugieren Sie 750 µL-Aliquots jeder Probe bei 20.000 X g für 20 min bei 4 ° C. Überstand getrennt zu sammeln und das Pellet in einem Überstand Band der Ladepuffer Aufschwemmen.
    4. Der Überstand und die resuspendierte Pellet durch western-Blot Analyse analysieren.

6. die Keimbelastung assay

  1. Wiegen Sie 100 mg Gefriergetrocknete Rote Rübe Blätter. Das Pulver in 8 mL sterilem PBS (pH 7,4) und Vortex für 1 min aufzuwirbeln.
  2. Bereiten Sie die LB-Medium ohne Antibiotika oder (i) 50 µg/mL Rifampicin, (Ii) 50 µg/mL von Rifampicin und Carbenicillin, (Iii) 50 µg/mL von Rifampicin und Kanamycin oder (iv) 50 µg/mL von Rifampicin, Carbenicillin und Kanamycin enthält.
  3. Platte 1 mL jedes gefriergetrocknete Blatt Homogenat in eines der 5 Selektivmedien LB.
  4. Inkubieren Sie alle Teller für 3 Tage bei 28 ° c
  5. Zählen Sie die Agrobacterium Kolonien gewachsen auf jeder Platte.
  6. Berechnen Sie und definieren Sie die bakterielle Restladung als die Anzahl der Kolonie bildende Einheiten (KBE) pro mL gefriergetrocknete Blatt Homogenat (KBE/mL).

(7) Metabolit Extraktion

  1. Primäre Metabolit Extraktion
    1. Wiegen Sie 30 mg von-80 ° C gelagert, Vakuum-Agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimierenden rote-Bete-Blattpulver in 2 mL Kunststoffhülse.
    2. Fügen Sie 750 µL kalter 70/30 (V/V) Methanol/Chloroform und Vortex für 30 S. Inkubation bei-20 ° C für 2 h.
      Hinweis: Alle Lösungsmittel und Zusatzstoffe müssen LC-MS-Klasse sein.
    3. Fügen Sie 600 µL von kaltem Wasser und Zentrifuge bei 17.900 X g bei 4 ° C für 10 min. sammeln und Transfer der oberen wässrige Phase in eine neue 2-mL-Tube. Entsorgen Sie die untere chloroformic Phase und der Interphase.
    4. Setzen Sie die Proben in einem Vakuum Konzentrator für 3 h die Lösungsmittel verdunsten.
    5. Das Pellet gewonnenen Schritt 7.1.4 in 300 µL 50/50 (V/V) Acetonitril/Wasser auflösen und die Proben 3 min beschallen.
    6. Die Lösungen durch 0,2 μm-Membranfilter und steckte sie in eine transparente feste 300 µL einfügen Glasröhren.
  2. Sekundären Metaboliten Extraktion
    1. Wiegen Sie 300 mg von-80 ° C gelagert, Vakuum-Agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimierenden rote-Bete-Blattpulver in 15 mL Kunststoffhülse.
    2. Geben Sie 3 mL Methanol, Wirbel für 30 s, und bei 40 kHz für 15 min beschallen.
      Hinweis: Alle Lösungsmittel und Zusatzstoffe müssen LC-MS-Klasse sein.
    3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.500 X g bei 4 ° C für 10 min und übertragen Sie die Überstände in neue 15 mL-Tuben.
    4. Verdünnte 100 µL 1:3 (V/V) mit Wasser zu extrahieren und die Lösung durch ein 0,2 μm-Membranfilter.
    5. Setzen Sie die Lösung in eine transparente feste Glasrohr 300 µL einfügen.
  3. Polare Lipid-Extraktion
    1. Wiegen Sie 200 mg von-80 ° C gelagert, Vakuum-Agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimierenden rote-Bete-Blattpulver in 15 mL Kunststoffhülse.
    2. Fügen Sie 200 µL Wasser und dann 2 mL Methanol, und dann auf Eis für 1 h halten.
      Hinweis: Alle Lösungsmittel und Zusatzstoffe müssen LC-MS-Klasse sein.
    3. Wirbel für 30 s und bei 40 kHz für 15 min beschallen.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4.500 X g bei 4 ° C für 25 min. sammeln und Transfer der Chloroform-Phase in 2 mL Röhrchen. Entsorgen Sie die obere wässrige Phase und der Interphase.
    5. Setzen Sie die Proben in einem Vakuum Konzentrator für 3 h das Lösungsmittel verdunstet.
    6. Lösen Sie die Pellets aus Schritt 7.3.5 mit 600 µL Methanol gewonnen.
    7. Verdünnte 100 µL 1:5 (V/V) mit Methanol extrahiert und ein 0,2-μm-Membranfilter die Lösung durchlaufen.
    8. Setzen Sie die Lösung in eine transparente feste Glasrohr 300 µL einfügen.

8. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie Analyse und Datenverarbeitung

  1. Das LC-MS-System richten Sie ein, wie durch den Lieferanten empfohlen.
    Hinweis: Die LC-Abschnitt besteht aus einem Autosampler mit HPLC, ausgestattet mit einer C18 Vorsäule (75 x 2,1 mm, Partikel Größe 5 µm) vor eine C18-Säule (150 x 2,1 mm, Partikel Größe 3 µm) für die Analyse von Sekundärmetaboliten und polaren Lipide gekoppelt , während mit einem HILIC Vorsäule (7,5 x 2,1 mm, 3 µm) vor einer HILIC-Spalte (150 x 2,1 mm, Partikel Größe 2,7 µm). Die MS ist eine Ionenfallen-Massenspektrometer mit einer Elektrospray-Ionisation (ESI) oder ein Atmosphärendruck-chemische Ionisation (APCI)-Quellen zur Verfügung gestellt.
  2. Bereiten Sie die geeignete Lösungsmittel für die HPLC-Gradienten. Verwenden Sie für die primäre Metabolit Analyse 20 mM Ammonium-Formiat als Lösungsmittel A; 95 % Acetonitril, 5 % Wasser plus 10 mM Ammonium-Formiat als Lösungsmittel B. Verwenden Sie für die sekundären Metaboliten Analyse Wasser plus 0,05 % Ameisensäure (A) und Acetonitril plus 0,05 % Ameisensäure (B). Verwenden Sie für polare Lipid-Analyse Wasser plus 0,05 % Ameisensäure (A) und 100 % Acetonitril (B).
    Hinweis: Die Lösungsmittel und Zusatzstoffe müssen LC-MS-Klasse sein.
  3. Verwenden Sie die Steigungen, die in Tabelle 1 für Metabolit Elution gemeldet. Satz der Durchflussmenge bei 0,2 mL/min injizieren 10 µL jeder Probe für sekundäre Pflanzenstoffe und polaren Lipide, während Spritzen 5 µL für Hauptmetaboliten.
  4. Bereiten Sie eine Qualitätskontrolle (QC) Probe durch das Mischen von gleicher Teilen der verschiedenen Proben eine repräsentative Mischung aus einzelnen experimentellen Bedingungen haben. Analysieren Sie die QC-Probe während des Experiments Instrument Effizienz überwachen. Speziell, fügen Sie ein QC-Probenanalyse nach jeder 10 Probe-Charge.
  5. Zufällig die Proben um Instrument-gesteuerte Effekte zu vermeiden.
  6. Nach 9 Analysen, fügen Sie eine Spalte Reinigung Methode und eine leere Analyse sofort nach.
    Hinweis: Führen Sie einen langsamen Verlauf zwischen den beiden Lösungsmittel mit einer isokratischen Elution bei hohen Anteil an das stärkste Lösungsmittel. Der Blank besteht aus einer Injektion von reinem Methanol: Wasser (50/50, V/V) Retention Time Reproduzierbarkeit in der folgenden Analyse zu verbessern.
  7. Richten Sie das Instrument Massenspektren in Alternative positive und negative Ionisierung Modi verwenden die in Tabelle 2aufgeführten Parameter zu erwerben.
    Hinweis: Andere Parameter hängen von der spezifischen Plattform.
  8. Führen Sie die nächsten Datenverarbeitung wie Dal Santo Et Al.9erläutert.

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Representative Results

In dieser Arbeit wird der Workflow für die Entwicklung einer Schluckimpfung in essbare Pflanzengeweben vorgestellt. Der Schwerpunkt dieser Arbeit ist der Ausdruck ein Zielprotein in einer essbaren Host Pflanzenarten und die Charakterisierung der potenziellen Schluckimpfung.

Der erste Schritt bestand die Bewertung der Eignung von Virus-basierte Ausdruck Anlagentechnik, rekombinante Proteine in essbare Anlagen zu produzieren. Zu diesem Zweck verwenden wir zuerst die eGFP als Modell Protein und wir es in zwei essbare Blattwerk Systeme ausgedrückt: Rote Beete und Spinat. Pflanzen wurden manuell Agroinfiltrated mit Suspensionen von A. Tumefaciens eGFP rekombinante Expressionsvektoren tragen. Die fluoreszierende Protein-Expression wurde visualisiert durch western-Blot Analyse (Abb. 1A, B, D, E) und unter UV-Licht quantifiziert. Ergebnisse zeigten, dass das rote-Bete-System zeichnet sich durch einen höheren eGFP Ausdruck, erreichen 544.9 ± 10,9 µg/g frische Flügelgewicht (FLW) bei 9 dpi (Abbildung 1), als Spinat, welche maximale eGFP (113,4 ± 0,3 µg/g FLW) bei 11 dpi ( gemessen wurden Abbildung 1F). Aus diesen Gründen wurde die rote Beete als Ausdruck Host für alle nachfolgenden Experimente ausgewählt.

Laut Chen Et Al.10war die eGFP transiente Expression durch ein Vakuum Verfahren zur Infiltration, getestet, die für die Impfstoff-Produktion in großem Maßstab besser geeignet ist. Verschiedenen Verdünnungen der Übernachtungen A. Tumefaciens Kultur, von 10-1 bis 10-3und unterschiedlicher Konzentration des Reinigungsmittels (0,005-0,05 %) sind durch den Vergleich der eGFP Ansammlung Ebene bei den maximalen Ausdruck dpi (9 dpi) getestet worden. Ergab, dass höhere bakterielle Titer größere eGFP Erträge produziert (10-1 ~ 0,35). Allerdings wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden mit verschiedenen Waschmittel Konzentrationen (Daten nicht gezeigt).

Damals waren die Pflanzen Vakuum mit einer A. Tumefaciens Aufhängung bei 0,35 OD600 und 0,01 % des Waschmittels infiltriert. Sobald der Ausdruck-Plattform und Liefersystem hergestellt wurden, die Expression von zwei Formen von GAD65, GAD65mut und ein N-Terminal abgeschnitten Form (∆87GAD65mut), wurde im Vergleich zum Zeitpunkt des maximalen Ausdruck 5 und 11 dpi bzw. als zuvor 11gegründet. Nachdem die TSP-Extraktion aus Agroinfiltrated verlässt, alle Proben wurden durch western-Blot analysiert und das rekombinante Protein war relativ durch eine Densitometrie Analyse (Abbildung 2) quantifiziert. Ergebnisse hervorgehoben die 20-fold höhere Leistung der ∆87GAD65mut Form über die GAD65mut. Verkürzte Form wählte daher als bevorzugte Schluckimpfung Kandidat, so hoch wie 201.4 ± 29,3 µg/g FLW in rote-Bete-Blätter mit 11 dpi ansammeln.

Schließlich wurden die Parameter für die Entwicklung von einem potenziellen Schluckimpfung ausgewertet. Die Integrität der rekombinanten Proteins nach Gefriertrocknung von Vakuum rote-Bete-Blätter mit dem Ausdruck ∆87GAD65mut infiltriert wurden im Vergleich mit unbehandelten (nur gefroren) Gewebe, durch western-Blot Analyse. Wie in Abbildung 3A, demonstriert das Zielprotein nach dem Lyophilisierung Prozess stabil zu sein.

Die Simulation der Magen Verdauung erfolgte auf das gefriergetrocknete Material durch Zugabe von porcinen Magen Enzym Pepsin, eine Endkonzentration von 1 mg/mL oder in einem Verhältnis von 01:20, TSP. Beide Verdauungs Behandlungsbedingungen führte der rekombinanten Proteinabbau, wie western-Blot Analyse zeigt (Abbildung 3, D, E, Daten nur für die Pepsin Endkonzentration von 1 mg/mL berichtet). Das Fehlen eines bestimmten Signals in den Pellet-Proben nach Pepsin Verdauung (Bahnen Pepsin, s. 1-3), schlug vor, dass nach der Behandlung die Gefriertrocknung, die Pflanzenzellen ihre Integrität, führt zu dem Ziel Proteinabbau verloren.

Die Auswertung der Zelle Integrität zeigten, dass bei getrockneten Pflanzengewebe in Puffer mit pH-neutralen (pH 7,4), ∆87GAD65mut Nukleinsäuretablette war teilweise darauf hindeutet solubilisiert war, dass zumindest einige Zellen im Blatt Schleif- und Trocknung gebrochen waren. Die Wiederfreisetzung des getrockneten Pflanzengewebe in sauren Bedingungen führte stattdessen auf die Aufdeckung von ∆87GAD65mut nur in der unlösliche Fraktion. Dies war wahrscheinlich wegen der ∆87GAD65mut Niederschlag durch den niedrigen pH-Wert, neben der Eiweißgehalt der ungebrochenen Zellen11verursacht. Diese Tests zeigen, dass Gefriertrocknung als Behandlung für die Vorbereitung der Impfstoffkandidat ausgewählt werden konnte.

Darüber hinaus wurde die mikrobielle Restladung in Agroinfiltrated rot-Rübenblätter bewertet.

Die Keimbelastung Assay angezeigt, dass die Behandlungen genutzt für die Kandidaten Impfstoff Vorbereitung der bakteriellen Belastung11beseitigt.

Die metabolische Bioäquivalenz von ∆87GAD65mut und Kontrolle rote Beete Pflanzen wurde durch Fingerabdrücke von primären und sekundären Metaboliten und polaren Lipide aus neun rote Beete Pflanzen, ∆87GAD65mut, neun Agroinfiltrated Kontrollen von LC-MS erzeugt beurteilt und neun Wildtyp Steuerelemente. PCA-Statistik ergab einen Wildtyp Pflanze-Cluster getrennt von den anderen Proben. Keine signifikanten Unterschiede wurden stattdessen zwischen der ∆87GAD65mut und infiltriert und negative Kontrollpflanzen hervorgehoben. Darüber hinaus wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den drei Gruppen von Pflanzen in Bezug auf die polare Lipid-Profile identifizierten11.

Figure 1
Abbildung 1: Vergleich der eGFP Ausdruck in Agroinfiltrated rote Rüben und Spinat Blätter. Western-blot Analyse (A, D) und entsprechenden laden Kontrollen (große Untereinheit der RuBisCO) gebeizt mit Coomassie Brilliant Blue (B, E) Protein Auszüge aus eGFP exprimierenden Blattproben gesammelt während der Analyse zeitlicher Verlauf von 4 bis 14 Tagen post Infektion (dpi). Die eGFP Inhalt jedes Proteinextrakt wurde durch Fluoreszenzmessung (C, F) quantifiziert. Die Ergebnisse aus Agroinfiltrated rot-Rübenblätter Proben werden im linken Bereich, wo die Agroinfiltrated-Spinat-Proben in richtig angezeigt werden. Gleiche Mengen von Protein-Extrakten geladen wurden, 3,5 µg für den western-Blot und 30 µg für die Coomassie-Färbung. Ein Anti-eGFP-Antikörper wurde als Sonde in der western-Blot-Analyse verwendet. Seite Zahlen molekulare Masse Marker im kDa. p.c., Positivkontrolle, 10 ng von kommerziellen rekombinanten menschlichen GAD65; n.c., Negativkontrolle, Extrakt aus Blättern, die ausschließlich mit A. Tumefaciens tragen 5' infiltriert- und Integrase-Module. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Diese Zahl wurde von Bertini Et Al.11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: GAD65mut und Δ87GAD65mut Ausdruck Niveaus in rote-Bete-Blättern. Western-Blot Analyse (A) und entsprechende Verladung Kontrolle (große Untereinheit der RuBisCo) gebeizt mit Coomassie Brilliant Blue (B) des Proteins Auszüge aus drei rote-Bete-Blätter mit dem Ausdruck Δ87GAD65mut (links) und GAD65mut (rechts). Ein Anti-GAD-Antikörper wurde als Sonde in der western-Blot Analyse verwendet (die Bahnen wurden mit 20 μl-Extrakt für GAD65mut und 1 μL der Extrakt für Δ87GAD65mut geladen). In der Coomassie gefärbt Gel wurde die gleiche Menge an Protein-Extrakte (10 μL/Bahn) für GAD65mut und Δ87GAD65mut geladen. Seite Zahlen molekulare Masse Marker im kDa. p.c., Positivkontrolle, 10 ng von kommerziellen rekombinanten menschlichen GAD65; n.c., Negativkontrolle, Extrakt aus den Blättern infiltriert nur mit A. Tumefaciens tragen die 5'- und Integrase-Module. (C) mit die western-Blot positiv-Kontrolle als Referenz für eine densitometrische Analyse der relativen Ausdruck Niveaus der beiden Protein Formen gezeichnet. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von drei unabhängigen Experimenten. Diese Zahl wurde von Bertini Et Al.11geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Schluckimpfung Kandidat Bewertung. Auf der linken Seite, Analysen der Proteinstabilität nach Gefriertrocknung Behandlung (A, B). Western-Blot Analyse (A) und entsprechenden Gel befleckt mit Coomassie Brilliant blau (B), drei unabhängige Extrakte aus den Blättern, die mit dem Ausdruck Δ87GAD65mut darstellt. Geernteten Blätter wurden direkt eingefroren (frisch) oder lyophilisiert bei-50 ° C, 0,04 Mbar für 72 h (gefriergetrockneten). Verschiedene Gewebe: Puffer-Verhältnisse wurden während der TSP-Extraktion eingesetzt, um den Wasserverlust durch Austrocknung zu betrachten. Gleiches Volumen an Extrakte wurden geladen, 0,25 und 10 µL, für western-Blot und Coomassie-Färbung bzw.. Ein Anti-GAD-Antikörper verwendet wurde für die western-Blot sondieren Seite Zahlen molekulare Masse Marker im kDa. n.c., Negativkontrolle, Auszug aus Blätter gelangt ausschließlich mit A. Tumefaciens tragen die 5'- und Integrase-Module. Auf der rechten Seite, in-Vitro simuliert Magen Verdauung von Δ87GAD65mut (C, D, E). Western-Blot Analysen (C, D) und entsprechenden Gel befleckt mit Coomassie Brilliant Blue (E), drei unabhängige Extrakte der Blätter mit dem Ausdruck Δ87GAD65mut nach simulierten Magen Verdauung darstellt. 1 mg/mL Pepsin wurde auf 100 mg von gefriergetrockneten Gewebe während einer Kontrollprobe hinzugefügt, ohne Enzym verwendet worden ist. 24 µL und 16 µL für Überstände (s) und Pellets (p) bzw. in der abschließenden Zentrifugationsschritt gewonnen wurden für die SDS-PAGE-Analyse verwendet. Anti-GAD (C) und Anti-LHCB2 (D) Antikörper wurden als Sonden in der western-Blot-Analyse verwendet. Seite Zahlen molekulare Masse Marker im kDa. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Hauptmetaboliten (100 min.) Zeit (min) % A % B Dauer (min.) Typ
Anfängliche 0 100 - Ausgangszustand
0 0 100 10 Isokratische
10 15 85 15 Farbverlauf
25 15 85 5 Isokratische
30 50 50 10 Farbverlauf
40 50 50 30 Isokratische
70 0 100 1 Farbverlauf
71 0 100 29 Isokratische (Re-Gleichgewicht)
Sekundäre Pflanzenstoffe (60 min) Zeit (min) % A % B Dauer (min.) Typ
Anfängliche 98 2 - Ausgangszustand
0 90 10 2 Farbverlauf
2 80 20 10 Farbverlauf
12 75 25 2 Farbverlauf
14 30 70 7 Farbverlauf
21 30 70 5 Isokratische
26 10 90 1 Farbverlauf
27 10 90 14 Isokratische
41 98 2 1 Farbverlauf
42 98 2 18 Isokratische (Re-Gleichgewicht)
Polaren Lipide (90 min) Zeit (min) % A % B Dauer (min.) Typ
Anfängliche 50 50 - Ausgangszustand
0 0 100 10 Farbverlauf
10 0 100 65 Isokratische
75 50 50 1 Farbverlauf
76 50 50 14 Isokratische (Re-Gleichgewicht)

Tabelle 1: Farbverlauf Bedingungen für Metabolit Elution in LC-MS-Analyse.

Massenspektrometer-Komponenten Funktion Parameter
Hauptmetaboliten Sekundäre Pflanzenstoffe Polaren Lipide
Electrospray Ionisierung (ESI) Quelle Vernebelung gas 50 Psi, 350 ° C 50 Psi, 350 ° C -
Trocknungsgas 10 L min-1 10 L min-1
Atmosphärendruck chemische Ionisation (APCI) Quelle Vernebelung gas - - 50 Psi, 350 ° C
Trocknungsgas 10 L min-1
Vaporizer 450 ° C
Ionenfallen und Detektor scan Full-Scan-Modus 13.000 m/Z pro Sekunde 13.000 m/Z pro Sekunde 13.000 m/Z pro Sekunde
50-1.500 m/Z 50-1.500 m/Z 50-1.500 m/Z
Scan-Bereich 200 m/z 400 m/z 700 m/z
Ziel der Masse
Kollision gas Helium
Vakuum-Druck 1.4 x 10-5 mbar
Kapillare Quelle +4,500 V +4,500 V +4,000 V
Endplatte Versatz -500 V -500 V -500 V
Skimmer 40 V -40 V 40 V
GAP-Ausfahrt 106 V -121 V 143,5 V
Okt 1 DC 12 V -12 V 12 V
Oct 2 DC 1.7 V -1,7 V 2 V
Objektiv 1 -5 V 5 V -5 V
Linse 2 -60 V 60 V -60 V
ICC für positive Ionisation Modus 20
ICC für negative Ionisation Modus 7

Tabelle 2: Parameter für Massenspektren Übernahme in andere positive und negative Ionisierung Modi.

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Discussion

In dieser Studie haben wir vorläufige Analyse für die Gestaltung der ein Kandidat Schluckimpfung für autoimmune Diabetes gezeigt. Das Zielprotein für dieses Experiment war eine mutierte Form des menschlichen 65 kDa Glutamat-Decarboxylase, welche Produktion und Funktionalität sind leicht nachweisbar und messbar12. Ihren Ausdruck in verschiedenen essbaren Pflanzengeweben wurde durch die Vektoren5, vermittelt die vermitteln eines hohen Maß an rekombinanten Proteinproduktion in sehr kurzer Zeit. Die Auswahl der besten Kandidaten Pflanze, essbare Host durchgeführt wurde, anhand des eGFP Ausdrucks in rote Beete und Blattspinat durch manuelle Agroinfiltration. Dieser Schritt könnte durch das aufwändige Verfahren der manuelle Agroinfiltration und die Härte in Spinat Blatt Gewebe eindringen kritische industrielle Scale-up sein.

Die Identifizierung von spezifischen dpi der Ernte, die rekombinante Protein Akkumulation höchste für ein rekombinantes Protein gibt ist ein entscheidender Schritt und getestet und auf einer Schachtel-durchschachtel Grundlage ausgewählt werden müssen. Die Analyse der fluoreszierenden Proteinexpression bei verschiedenen dpi (von 4 bis 12 Jahren), erlaubt, um Tag der maximalen Ausdruck in jeder Anlage zu identifizieren. Der Vergleich zwischen eGFP Konzentration (µg/g FLW), heutzutage maximalen Ausdruck hervorgehoben, dass rote Rüben ist der leistungsfähigste Plattform in Bezug auf die Erträge des rekombinanten Proteins.

Aus diesem Grund wurde rote-Bete weiter für die Lieferung der Anlage Virus-basierte Vektoren durch ein Vakuumsystem getestet, die besser geeignet für Impfstoff industrielle Großproduktion13gilt.

Angesichts der Tatsache, dass das standard Vakuum Infiltration Protokoll für Tabak Arten5optimiert ist, ist die Einrichtung einer Reihe von Parametern für die Prozedur Anpassung an die Pflanzenarten, die als ein kritischer Punkt. Dann wurde das rote Beete Vakuum Agroinfiltration Protokoll optimiert. Unsere Beweise zeigten, dass die Agrobacterium Verdünnung entscheidend ist für die Proteingehalte Ausdruck, während die Waschmittel Konzentration die Blatt-Durchlässigkeit verbessern zu verbessern. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anlage und die Technologie, die mit dieser Arbeit Zweck passen.

Zwei verschiedene Formen der GAD65, GAD65mut und ∆87GAD65mut, die zuvor für ihren Ausdruck in N. Benthamiana7anzeigen verschiedenen subzellulären Lokalisierung gekennzeichnet waren äußerte in rote Beete Vakuum eindringen. Drei biologische repliziert wurden für jede Probe vorbereitet. Jedes biologische replizieren umfasst einen Pool von drei infiltrierten Blätter aus unterschiedlichen Werken, von 2 bis 14 dpi für beide GAD65 Formen abgetastet. Ihren Ausdruck im Vergleich wurde um das höchste anfallende Protein in Pflanzengewebe auszuwählen.

Die relative Quantifizierung von Densitometrie Analyse gezeigt, dass die ∆87GAD65mut 20-fold Ausdruck höher ist als das intakte Gegenstück. Dies könnte aufgrund seiner cytosolischen Lokalisation während GAD65mut, aufgrund seiner Rückstände, die dieses Formular an der Zellmembran verankern eine niedrigeren Ertrag7, hat eine niedrigere Proteinstabilität reflektiert werden. ∆87GAD65mut war durchschnittliche Ansammlung in rote Beete Blattgewebe 201.4 ± 29,3 µg/g FLW, das ist ausreichend, um mit der T1D Schluckimpfung Entwicklung starten.

Schließlich, nach der Auswahl der am besten geeignete Plattform, Technologie und Protein bilden gingen wir durch die Einrichtung einer Behandlung nach der Ernte von den infizierten Blättern. Da Blattgewebe 95 % aus Wasser besteht, ist eine Austrocknung Behandlung nützliche Mikroorganismen Kontamination zu verhindern. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine Gefriertrocknung Behandlung an der Probe angewendet werden könnte, ohne die rekombinante Protein-Ebene in den Blättern. Die 10-divisibel Wasserentzug durch Gefriertrocknung beseitigt die bakterielle Kontamination (Keimbelastung), einschließlich der rekombinanten A. Tumefaciens für das Agroinfiltration-Verfahren verwendet.

Darüber hinaus ergab die Analyse der Protein Bio Kapselung, dass die ∆87GAD65mut nach einer simulierten Magen Verdauung vollständig verdaut wird. Dies deutet darauf hin, dass die Gefriertrocknung Behandlung der pflanzlichen Zellwand, Freilegung der rekombinanten Proteins zu sauer und enzymatische Zusammensetzung der Magen Umwelt schädigt.

Die Aufrechterhaltung der Integrität Protein oder Peptid-Molekül über den Magen-Darm-Trakt-Übergang auf der Website der Absorption stellt ein Problem für orales Medikament Lieferung14. Daher sollte nach der Austrocknung Behandlung der potentiellen Impfstoff korrekt formuliert werden um die gastrische Umwelt zu überwinden, ohne seine Integrität zu verlieren. Bei der Herstellung von pflanzlichen GAD Impfstoff könnte die Verkapselung in einer relativ stabilen Schale als ein System zur Verbesserung der Effizienz ermöglicht es, entlang der mündlichen Lieferung Route15stabil und geschützt werden angewendet werden.

Verschiedene Technologien wurden untersucht, zur Überwindung der Probleme im Zusammenhang mit der mündlichen Lieferung von Makromolekülen wie einige neuen Studien über Komplexierung von synthetischen Hydrogel mit Insulin, welches eine hohe Kapselung Effizienz zeigte und schnelles insulin lassen Sie im Darm in einem pH-abhängigen Weise16,17.

Sowohl die primären und sekundären Metaboliten Bioäquivalenz von Pflanzen, die mit dem Ausdruck ∆87GAD65mut im Vergleich zu infiltriert und nicht infiltriert Kontrollen wurde mittels PCA Statistik untersucht. Die Unterschiede zwischen der infiltrierten Pflanzen, ∆87GAD65mut und die eingedrungenen Kontrollen waren nicht signifikant, während die nicht infiltriert Wildtyp Pflanzen einen separate Cluster gebildet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die eingedrungenen Pflanzen durch die LC-MS-Analyse durch bakterielle Stoffwechselprodukte oder Metaboliten von Pflanzen aufgrund der Infiltration, wie bereits in der Literatur13produziert aus unbehandelten Pflanzen unterschieden werden. Insgesamt zeigte diese Analyse, dass die Anhäufung von ∆87GAD65mut wenig Einfluss auf den gesamten Stoffwechsel hat.

Insgesamt diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die potenziellen Schluckimpfung, vertreten durch Gefriergetrocknete Rote Beete Blattgewebe mit dem Ausdruck ∆87GAD65mut erhalten die Virus-basierte Ausdruck Anlagentechnik, Nutzung für experimentelle T1D orale Immuntherapie eignet Studien. Die Anlagentechnik Virus Ausdruck Vektor ist im Feld transiente Expression, wegen seiner Fähigkeit, Fremdeiweiße schnell und auf hohem Niveau produzieren sehr attraktiv geworden. Diese Technologie basiert auf einem dekonstruiert Vektor, der nur die RNA-Polymerase RNA abhängige und Bewegung Protein5 trägt und daher verliert es seine Infektiosität in Pflanzen; Folglich sollte die mögliche Übertragung auf den Menschen ausgeschlossen werden.

Das experimentelle Protokoll berichtet hier ließe sich um viele verschiedene essbare Arten, wie z. B. Kopfsalat, Chenopodium Capitatum und Tetragonia Expansa. Da die Blätter dieser Arten, einschließlich rote Beete und Spinat dessen bisher erkannt wurde als guter Ausdruck Werk Systeme5, kann als Rohkost verwendet werden, die hier vorgeschlagene Technologie könnte verwendet werden, für die Herstellung essbare Impfstoffe oder für Herstellung von funktionalen gering verarbeitete Lebensmittel oder Futtermittel.

Die Kombination von rekombinanten Proteinen/Pflanzenarten, dpi der Ernte, das rekombinante Protein Akkumulation höchste gibt müssen noch empirisch auf einen Fall von Fall zu Fall je nach das rekombinante Protein zum Ausdruck gebracht und auf dem Host bestimmt werden Pflanzen Sie Arten18.

Die Anwendung dieser Technologie für die Produktion von oralen Impfstoff halten großes Potenzial zu einer Alternative zu herkömmlichen Impfstoffen in naher Zukunft, neben der Bekämpfung onkolytische Viren, autologe Impfstoffe für Lymphomen und soliden Tumoren werden und monoklonale Antikörper gegen Ziel Krebserkrankungen19,20.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das gemeinsame Projekt "Die Verwendung von Pflanzen zur Herstellung von essbaren Impfstoff eine autoimmune Diabetes (eDIVA)" (Projekt-ID: 891854) von der Universität von Verona im Rahmen des Aufrufs 2014 finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters Sartorius-Stedim 17764
2–mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) Sigma M8250 pH 5.5
96-well plate Sarstedt 833924
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade Sigma 34967
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate Sigma 70221
Anti-eGFP antibody ABCam ab290
Anti-GAD 65/67 antibody Sigma G5163
Anti-LHCB2 antibody Agrisera AS01 003
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
C18 Column Grace    - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column Grace    - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower Peter Excel 15-5-15 Fertilizer
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Chemiluminescence imaging system BioRad 1708370 ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform Sigma C2432
Detergent Sigma P5927 Polysorbate 20
Fluorescence reader Perkin-Elmer  1420-011 VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade Sigma 94318
Glycerol Sigma G5516 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase Promega M7841
HCl Sigma H1758 Corrosive
HILIC Column Grace    - Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column Grace    - Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler Beckman Coulter    - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter    - System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol Sigma 24137 Flamable
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
KCl Sigma P9541 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4 Sigma P9791 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution Ge Healthcare RPN2232 Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator 5Pascal LIO5P0000DGT
Mass Spectometer Bruker Daltonics   - Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol Sigma 32213
MgSO4 Sigma M7506
Milk-blocking solution Ristora    - 3 % in PBS
Na2HPO4 Sigma S7907 Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl Sigma S3014 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4 Sigma S8282  Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH Sigma S8045
Nitrocellulase membrane Ge Healthcare 10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa Sigma P7000
Peroxidase substrate ECL GE Healthcare RPN2235 Light sensitive material
Pump Vacuum Press VWR 111400000098
Reagent A Sigma B9643 Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B Sigma B9643 Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite Sigma 7681-57-4
Sonicator system Soltec 090.003.0003 Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe Terumo    -
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes Thermo Scientific 11573680
Trizma Base Sigma T1503 Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone Formedium TRP03 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator Heto 3878 F1-3 Speed-vac System
Water LC-MS grade Sigma 39253
Yeast extract Sigma Y1333 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade

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Santoni, M., Bertini, E., Zampieri, R., Cuccurullo, A., Commisso, M., Gecchele, E., Avesani, L. Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes. J. Vis. Exp. (145), e59298, doi:10.3791/59298 (2019).

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