Summary
Questa carta presenta un metodo chirurgico per la dissezione della drosofila retine pupale insieme a protocolli per il trattamento del tessuto per esame immuno-istochimico, analisi occidentale ed estrazione di RNA.
Abstract
La Drosophila pupal retina fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici durante lo sviluppo. In questa carta, presentiamo un protocollo affidabile per la dissezione della drosofila delicato pupal retina. Il nostro approccio chirurgico utilizza strumenti di microdissection prontamente disponibili per aprire pupe ed estrarre con precisione complessi di occhio-cervello. Possono essere fissi, sottoposto ad esame immuno-istochimico e retine poi montate su vetrini da microscopio e ripreso se l'obiettivo è quello di rilevare strutture cellulari o subcellulari. In alternativa, retine unfixed possono essere isolate dal tessuto di cervello, lisate in buffer appropriato e utilizzate per l'estrazione proteica gel elettroforesi o mRNA (valutare espressione della proteina o del gene, rispettivamente). Pazienza e pratica significativa potrebbe essere necessario padroneggiare il protocollo di microdissection descritto, ma una volta imparato, il protocollo consente relativamente rapido isolamento delle retine principalmente intatta.
Introduction
La retina di Drosophila è composta da circa 750 ommatidi circondati da cellule del pigmento, disposti in un nido d'ape della grata1,2,3,4. Ogni ommatidium contiene otto neuroni del fotoricettore, quattro lente-secrezione delle cellule cono e due cellule del pigmento primarie. Che circonda ogni ommatidium è cellule produttrici di pigmento di grata e gruppi di setole sensoriali. Grazie alla sua natura post-mitotico e stereotipata disposizione esagonale, retina pupal Drosophila fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici compreso cellula adesione5,6, 7,8,9,10 e apoptosi11,12,13,14,15.
Diversi protocolli pubblicati utilizzano aria pressione per estrarre complessi di occhio-cervello da Drosophila pupe16,17,18. Il protocollo descritto qui invece utilizza strumenti di microdissection per attentamente e precisamente isolare complessi di occhio-cervello con l'obiettivo di ottenere tessuto retinico intatto. Questo è fondamentale se le retine sono da utilizzare per morfologica, proteina, o espressione genica analizza quanto stress cellulare o la morte, che potrebbe modificare l'espressione di gene o fenotipo cellulare può provocare danni alla retina. Inoltre, dopo la pratica, da 6 a 10 complessi di occhio-cervello possono essere isolati in 10-15 min, facilitando l'obiettivo di minimizzare la variabilità nell'età e Stadio di sviluppo del tessuto oculare dissecata.
La fissazione, immunostaining e intero-supporto protocollo descritto di seguito è adatto per la preparazione di Drosophila occhi per microscopia fluorescente. Retine possono essere incubate con anticorpi targeting per le proteine di interesse. Ad esempio, gli anticorpi ai componenti di giunzione dei adherens possono essere utilizzati per visualizzare le circonferenze apicale delle cellule, in modo che caratteristiche tra cui il tipo delle cellule, forma e disposizione possono essere valutati19. Prima della fissazione, gli occhi possono essere spaccati invece dal cervello allo scopo di estrarre la proteina per analisi occidentale, o RNA per l'uso in qRT-PCR o RNA-sequenziamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tessuto preparazione
- Messa a punto della drosofila attraversa (come descritto in precedenza20) o cultura ceppi specifici di Drosophila per ottenere pupe del genotipo desiderato. Per garantire che un gran numero di pupe emerga contemporaneamente, stabilire queste culture volare in duplice copia il cibo nutriente media o media di cibo standard generosamente completati con la pasta di lievito.
- Mantenere la drosofila culture a 25 ° C. Per gli incroci che utilizza il sistema di UAS-GAL4, GMR-GAL4 è un driver ideale espresso in cellule di disco larvale occhio posteriore al solco morfogenetico e in tutto lo sviluppo pupale21,22,23, 24. la croce UAS-lacZ X GMR-GAL4 serve come controllo ideale croce come unità di espressione della proteina β-galattosidasi non endogena e inerte.
- Uso la punta di una stecca di bambù 6" che è stata bagnata con acqua distillata per delicatamente sollevare bianchi pre-pupe (Figura 1B) dal lato dei flaconi di coltura sana (Figura 1A) e posizionare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL (Figura 1).
- Posizionare i tubi in una casella di punta della pipetta di plastica insieme a un piccolo pezzo di tessuto imbevuto di acqua distillata per mantenere la camera a umidità sufficiente per proteggere le pupe da dissecazione (Figura 1). Incubare le pupe a 25 ° C fino alla dissezione.
- Utilizzare una stecca di bambù secco 6" per spingere delicatamente le pupe dal tubo del microcentrifuge e su un nero piatto di dissezione. Porre un pezzo di nastro biadesivo fresca sul piatto da portata per dissezione lontano le pupe.
- Utilizzando un paio di pinze, posizionare il lato dorsale pupe alto (cioè, operculums rivolto verso l'alto, Figura 1B) sul nastro (Figura 2A). Garantire che le pupe aderiscano bene il nastro.
Nota: L'umidità sul caso pupal sarà inibiscono l'adesione sicura al nastro, nel qual caso, consentire le pupe asciugare all'aria prima dell'immissione sul nastro biadesivo.
2. dissezione dei complessi di occhio-cervello
- Utilizzare pinze per rimuovere l'opercolo di ogni pupa (Figura 2).
- Usare le forbici microdissection affettare o tagliare aperto il caso pupal di ogni pupa. Falda aprire l'involucro pupa per rivelare la testa, il torace e il segmento addominale anteriore, protezione dei bordi del caso pupal al nastro biadesivo (Figura 2).
Nota: Non è necessario rivelare interamente le pupe. - Perforare l'addome di ogni pupa con pinze taglienti, per afferrare l'animale e rimuoverlo dall'involucro pupa (Figura 2).
- Posizionare le pupe sulla parabola nera dissezione lontano il nastro e coprire con circa 400 µ l di ghiacciata-tamponata-fosfato (PBS, pH 7.4).
- Cogliere ogni pupa di addome con una pinza e con le forbici microdissection, fare un taglio pulito a sezione trasversale attraverso l'intero torace, tagliando la pupa a metà (Figura 2D).
- Rimuovere il residuo posteriore di ciascuna carcassa da PBS e mettere da parte il piatto per dissezione (non scartare, vedere il punto 3.2.1).
- Utilizzando due coppie di una pinzetta, aprire il torace e la testa di ogni pupa per rivelare il complesso di occhio-cervello (Figura 2E). Per effettuare questa operazione, afferrare i bordi di taglio dell'epitelio torace e gradualmente allo strappo per aprire il torace e poi la testa capsula, esponendo il tessuto grasso di occhio-cervello, complessa e circostante.
- Senza afferrare il tessuto, è possibile utilizzare pinze per guidare il complesso di occhio-cervello lontano i resti della testa capsula o scoop il complesso di occhio-cervello dalla capsula testa strappata-Apri.
Nota: Il complesso di occhio-cervello è a forma di manubrio, bianco sporco e più trasparente di color crema grasso circostante (Figura 2B, E). - Con il forcipe, rimuovere con cautela il più grasso connesso con i complessi di occhio-cervello senza toccare il tessuto oculare.
3. elaborazione del tessuto per immunofluorescenza
- Sezionare almeno 6-10 pupe come descritti (passi 2.1-2.9).
Nota: Tre o quattro repliche indipendenti di ogni dissezione tendono a produrre dati sufficienti per testare un'ipotesi. -
Lavaggio e fissazione
- Tagliare la punta di un P20 o la punta della pipetta P100 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura di punta a ~ 1 mm di raggio e lubrificare pipettando un mix di PBS e grasso su e giù. Questo grasso può essere ottenuto dai resti carcassa rimossi al punto 2.6.
- Trasferire i complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBS in un piatto di vetro 9-Beh, sul ghiaccio. Utilizzare la punta lubrificata e una micropipetta di spostamento di aria P20 o P100 per trasferire.
Nota: Complessi di occhio-cervello saranno rispettare non lubrificati suggerimenti durante il pipettaggio e danneggiati o perso. - Rimuovere il grasso residuo connesso con tessuto oculare pipettando il PBS su e giù per ruotare delicatamente i complessi di occhio-cervello. In questo e in tutti i successivi lavaggi, non direttamente Pipettare complessi di occhio-cervello su e giù di danneggiare il tessuto fragile dell'occhio.
- I complessi di occhio-cervello in un volume minimo di trasferimento (< 20 µ l) di PBS in almeno 250 µ l di fissativo. Mescolare pipettando su e giù la soluzione. Incubare per 35 min, sul ghiaccio.
Nota: La stessa punta lubrificata preparata al punto 3.1.1 può essere utilizzata per questo trasferimento. - Con la stessa punta della pipetta, trasferire i complessi di occhio-cervello in un contenente ~ 400 µ l di PBS. Mescolare pipettando su e giù la soluzione e incubare per 5-10 min sul ghiaccio, per lavare. Ripetere la fase di lavaggio almeno due volte.
Nota: Complessi di occhio-cervello possono essere mantenute per diverse ore nel finale Lavaggio PBS, il ghiaccio, o a 4 ° C, prima di procedere al punto 3.3.1.
-
Macchiatura dell'anticorpo
- Per bloccare il tessuto prima di esposizione a soluzioni dell'anticorpo, è possibile trasferire i complessi di occhio-cervello a ~ 400 µ l di PBT. Utilizzare la punta lubrificata e una micropipetta di spostamento di aria P20 o P100 per il trasferimento. Incubare per 10-60 min, sul ghiaccio.
- Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo gli anticorpi adatti in PBT. Poiché complessi di occhio-cervello vengono incubati in 10 aliquote µ l di soluzione di anticorpo, è necessario che il volume preparato sarà una replica di 10.
- Aliquotare 10 µ l di soluzione di anticorpo in un pozzo pulito di un vassoio di 72 pozzetti microtiter (vedi discussione).
- Tagliare la punta di una pipetta P10 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura di punta a ~0.5 mm di raggio e lubrificare di pipettaggio PBT su e giù.
- Trasferire non più di 5 complessi di occhio-cervello, in un volume di < 3 µ l di PBS, in ogni 10 µ l di soluzione di anticorpo usando una micropipetta di spostamento di aria P10 e la punta lubrificata.
- Omogeneizzare la soluzione di anticorpo pipettando su e giù la soluzione. Non pipettare i complessi di occhio-cervello su e giù, onde evitare di danneggiare il tessuto.
- Per minimizzare evaporazione della soluzione dell'anticorpo, posizionare un piccolo pezzo di tessuto imbevuto di acqua distillata nel vassoio microtiter e sigillare il vassoio (ad es., con il coperchio fornito). Incubare per una notte a 4 ° C.
- Trasferire i complessi di occhio-cervello dal vassoio microtiter in ~ 400 µ l di PBT in un piatto di vetro 9-saldata, per lavare. Utilizzare una micropipetta di P10 aria cilindrata e punta lubrificata PBT (preparare come descritto al punto 3.3.4). Mescolare pipettando su e giù la soluzione. Incubare per 5-10 min sul ghiaccio.
- Ripetere la fase di lavaggio almeno due volte. Utilizzare una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e punta lubrificata PBT per trasferire i complessi di occhio-cervello tra soluzioni di lavaggio.
- Preparare la soluzione di anticorpo secondario diluendo appropriati fluoroforo-etichetta anticorpi secondari in PBT come richiesto. 100 µ l di soluzione di anticorpo secondario è sufficiente per ogni batch di pupe di 6-10. Aliquota della soluzione di anticorpo secondario in un piatto di dissezione di vetro 9-saldata.
- Trasferire i complessi di occhio-cervello in soluzione di anticorpo secondario. Utilizzare una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e punta lubrificata PBT per il trasferimento.
- Incubare i complessi di occhio-cervello in soluzione di anticorpo secondario per 1-2 h a temperatura ambiente, o 3-5 h a 4 ° C. Per evitare di candeggio di fluorofori dalla luce, coprire la preparazione con un foglio.
Nota: La durata ottimale di incubazione in soluzione di anticorpo secondario può differire secondo gli anticorpi primari e secondari utilizzati. - Trasferire i complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBT in un piatto di vetro 9-Pozzo, per lavare. Mescolare pipettando su e giù la soluzione. Incubare per 5-10 min sul ghiaccio. Questo passaggio di lavaggio deve essere ripetuto almeno due volte.
-
Ancoraggio secondario
- Per un ancoraggio secondario, trasferire i complessi di occhio-cervello per almeno 200 µ l di fissativo e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente o 35 minuti a 4 ° C.
Nota: Ancoraggio secondario si irrigidisce il tessuto dell'occhio, che agevola il montaggio (punto 3.5). - Utilizzare una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e punta lubrificata PBT per trasferire complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBT in un piatto di vetro 9-Beh, sul ghiaccio, per lavare per 5 min.
- Ripetere la fase di lavaggio almeno una volta.
- Uso un P20 o una micropipetta P100 aria cilindrata e punta lubrificata PBT per trasferire i complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBS in un piatto di vetro 9-Beh, sul ghiaccio, di risciacquare per 1-2 minuti mantenere il tessuto in movimento di pipettaggio PBS, ma non il tessuto , su e giù per evitare che complessi di occhio-cervello da sedimentazione e aderendo al vetro piatto durante il PBS-risciacquo.
- Per un ancoraggio secondario, trasferire i complessi di occhio-cervello per almeno 200 µ l di fissativo e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente o 35 minuti a 4 ° C.
-
Montaggio
- Trasferire i complessi di occhio-cervello in ~ 200 µ l di supporti di montaggio. Utilizzare una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e punta lubrificata PBT per trasferire i complessi di occhio-cervello. Consentire al tessuto di equilibrare in media per 1-2 h di montaggio.
- Mettere una goccia di µ l di 5-8 di mezzi di montaggio fresco su un vetrino pulito.
- Tagliare una punta di P10 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura di punta a ~0.5 mm di raggio e utilizzare questo e una micropipetta di spostamento di aria P10 per trasferire i complessi di occhio-cervello in 5-8 µ l di supporti di montaggio nella goccia di supporti di montaggio sulla diapositiva.
- Utilizzare due aghi di tungsteno per separare gli occhi da lobi ottici. Pin di un complesso di occhio-cervello alla diapositiva con un ago di tungsteno robusto e affettare ogni occhio dal suo lobo ottico associato con un ago di tungsteno (Figura 2F).
- Utilizzare l'ago di tungsteno per manovrare ogni occhio alla superficie del vetrino microscopio con la superficie basale di ogni occhio adiacente alla diapositiva. Delicatamente abbassare un coprivetrino pulito sopra il tessuto e fissarlo con smalto.
Nota: Organizzare gli occhi sulla diapositiva in modo che sono vicino a vicenda o in una linea faciliterà la microscopia successiva. - Immagine le retine usando la microscopia confocale o fluorescente.
Nota: Diapositive devono essere conservati a 4 ° C se non ripreso immediatamente.
4. preparazione del tessuto oculare per macchiarsi occidentale:
- Sezionare 10-16 pupe (passi 2.1-2.9) con le seguenti modifiche: a) raccogliere e sezionare le pupe in due lotti, 10-15 min apart e b) sezionare in PBS completati con inibitori di proteasi e fosfatasi (PBS + pi).
- Trasferire i complessi di occhio-cervello utilizzando un P20 o P100 aria micropipetta di cilindrata e lubrificati punta (preparato come descritto al punto 3.2.1) in ~ 400 µ l di PBS + pi in un piatto di vetro 9-Beh, sul ghiaccio, risciacquare brevemente.
Nota: Questo suggerimento lubrificato può essere utilizzato per passaggi successivi 4.3 e 4.4. - Ripetere il passaggio sciacquare due volte.
- Trasferire tutti i complessi di occhio-cervello in ~ 400 µ l di PBS freddo ghiaccio + pi decantato su un piatto pulito nero per dissezione.
- Rimuovere ogni occhio dai lobi ottica utilizzando un ago di tungsteno robusto (per stabilizzare il complesso di occhio-cervello) e una lama di rasoio fine o microdissection forbici per taglio pulito ogni occhio dal lobo ottico.
Nota: Gli occhi sono 'appiccicosi' in questa fase e possono aderire leggermente il piatto per dissezione. Questo è vantaggioso in quanto può aiutare a facilitare la rimozione degli occhi dai lobi ottica (vedi discussione). - Nel PBS + pi sul piatto per dissezione, usando una lama di un bel paio di pinze ' sweep' tutti gli occhi in una 'pila'.
- Tagliare una punta di P10 con una lama di rasoio pulita per allargare l'apertura punta a ~0.5 mm di raggio e lubrificare il suggerimento-interni di pipettaggio Western tessuto Lysis Buffer (WTLB) su e giù.
- Trasferire i complessi di occhio-cervello a 5 µ l di PBS + pi in una provetta da microcentrifuga 500 µ l. Utilizzare questa punta lubrificata e una micropipetta di spostamento di aria P10 per completare il trasferimento.
- Posizionare il tubo del microcentrifuge sul ghiaccio. Aggiungere 1 volume (5 µ l) di WTLB al campione e 10 µ l di tampone del campione concentrato della proteina x 2 (o 2,5 µ l di tampone del campione concentrato della proteina x 5). Mescolare con un tap.
- Vortice microcentrifuga tubo brevemente e spin giù campione utilizzando una desktop mini-centrifuga.
- Conservare il campione a-20 ° C fino all'analisi. Analizzare mediante protocolli standard.
5. preparazione del tessuto dell'occhio per l'estrazione di RNA:
- Indossare guanti, benchtop pulito, microscopio, strumenti di dissezione e nero piatto di dissezione prima con etanolo al 70% e, quindi, reagente di decontaminazione di RNAsi. Lasciare per asciugare.
- Sezionare il 30-40 pupe come descritti (passi 2.1-2.9) con le seguenti modifiche: a) raccogliere e sezionare pupe di 6-8 in lotti, 15-20 min apart; b) sezionare in PBS e c privo di nucleasi) isolare ciascun lotto di occhi separatamente, ma si accumulano tutti i tessuto retinico nel tubo del microcentrifuge stessa (punto 5.5).
Nota: Avendo due persone contemporaneamente sezionare accelererà efficiente isolamento del tessuto di buon occhio. - Per ogni batch, isolare i complessi di occhio-cervello (passi 2.1-2.9) e trasferimento in ~ 400 µ l di PBS privo di nucleasi in un piatto di vetro 9-Pozzo di sciacquare brevemente, il ghiaccio, utilizzando una micropipetta aria cilindrata P20 o P100 e la punta lubrificata (preparato come descritto al punto 3.1.2).
Nota: Questo suggerimento lubrificato può essere utilizzato per passaggi successivi, 5.4, 5.5 e 5.8. - Ripetere il passaggio sciacquare due volte.
- Trasferire i complessi di occhio-cervello in una goccia di fresco e 400 µ l di PBS privo di nucleasi ghiacciato su un nero pulito piatto di dissezione.
- Rimuovere ogni occhio dai lobi ottica utilizzando un ago di tungsteno robusto (per stabilizzare l'occhio cervello complesso) e una lama di rasoio fine o microdissection forbici per taglio pulito ogni occhio dal lobo ottico.
Nota: Gli occhi sono 'appiccicosi' in questa fase e possono aderire leggermente il piatto per dissezione. Questo è vantaggioso in quanto può aiutare a facilitare la rimozione degli occhi dai lobi ottica (vedi discussione). - Nel PBS nuclease-free sul piatto per dissezione, usando una lama di un bel paio di pinze ' sweep' tutti gli occhi in una 'pila'.
- Trasferire gli occhi in una provetta sterile da microcentrifuga RNAsi-libera e flash-congelamento in azoto liquido.
- Ripetere la dissezione (passaggi 5.3-5.8) di ciascun lotto di pupe. Trasferire ogni batch degli occhi nel tubo del microcentrifuge stesso che è stato mantenuto in azoto liquido (punto 5.5) per accumulare tutti gli occhi in una provetta.
- Conservare i campioni a-80 ° C fino all'estrazione di RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'occhio di pupa è un tessuto facilmente accessibile che serve come un eccellente modello per studiare i processi di sviluppo che morfogenesi in auto. Qui, noi abbiamo dissecato retine e utilizzato l'immunofluorescenza per rilevare le giunzioni dei adherens apicale (Figura 3A, C) o il caspase Dcp-1 (Figura 3D) che si attiva durante l'apoptosi (Figura 3)25. Questi approcci permettono di osservare con chiarezza le cellule durante processi morfogenetici chiave compreso il reclutamento e la morfogenesi di cellule primarie (dalle 18h APF), l'intercalazione di grata di cellule intorno ogni ommatidium (18-24 h APF), l'istituzione della nicchia terziario (21-24 h APF), i cambiamenti nella cella dimensioni e forma (dalle 18h alle 40 h APF) e apoptosi (da 18 a 33 ~ h APF). I tempi di questi eventi morfogenetici sono temperatura-dipendente e pertanto varieranno modestamente in risposta a piccole differenze nelle temperature di incubatore nelle regolazioni del laboratorio diversi. Tuttavia, da circa 40 h APF, viene solitamente ottenuta la disposizione finale delle cellule (Figura 3B, C) e questa è un'età ideale in cui valutare le conseguenze della mutazione genetica o modificazione nell'espressione genica. Ad esempio, seguente l'espressione ectopica di Diap1, un inibitore di nucleo di apoptosi caspasi attivazione (Figura 3)26, il nostro approccio permette di quantificare il conseguente aumento del numero delle cellule del reticolo rispetto a un controllo GMR > lacZ retina. Si possono anche facilmente valutare apoptosi più direttamente utilizzando l'anticorpo anti-Dcp-1 o altri approcci per rilevare le cellule morte (Figura 3D).
Occhio lisato può essere interrogato tramite analisi occidentale per determinare la presenza e/o la relativa espressione di proteine di interesse. Qui, vi mostriamo la rilevazione di DE-caderina, il componente principale di giunzioni intermedie, in wild-type Cantone S retine dissecato alle 21 e 40 h APF occhi (Figura 4A). Quantificazione di questo campione Western blot (a destra, Figura 4A) ha rivelato che l'espressione relativa di DE-Cadherin, non hanno differito sostanzialmente a questi due intervalli di tempo, quando la intensità di banda è normalizzato secondo l'espressione di GAPDH (un nucleo enzima metabolico). Tali analisi solitamente dovrebbe essere eseguite in triplice copia, piuttosto che solo una volta, come illustrato di seguito.
È essenziale per isolare il mRNA di elevata purezza da Drosophila pupale retine se di uno scopo è quello di analizzare l'espressione genica utilizzando avanzate sequenziazione delle applicazioni (ad es., Next-Gen, RNA-seq). Abbiamo trovato che più di 60 occhi al genotipo o condizione sperimentale di dissezione è ottimale se il suo obiettivo è quello di isolare > 1 mg di RNA di alta qualità (Figura 4B). Qui, vi mostriamo un esempio di un spettri di assorbimento di un campione di RNA isolato da 57 occhi di Cantone S wild-type, sezionati a 40 h APF (Figura 4B, pannello superiore). L'assorbanza del picco a 260 nm corrisponde alla lunghezza d'onda di assorbanza di RNA. Presentiamo anche una tabella che riflette il rendimento del RNA e A260/A280 e rapporti di purezza A260/A230 di sei campioni di RNA, che si sono riuniti a 21 h o h 40 APF. Questi dati riflettono differenze sottili nel RNA resa durante l'estrazione di RNA.
Figura 1 : Selezione e cultura di pupe per dissezione. (A) vagando terzo larvale instar (L3) larve e pupe individuare lungo i lati del sano Drosophila culture. (B) pre-pupe possono essere identificati dal loro colore bianco traslucido come pigmento deve ancora essere generato nella custodia protettiva pupal. Asse antero-posteriore e dorso-ventrale della pupa sono mostrati in blu. Una stecca di bambù umido viene utilizzata per sloggiare e scegliere pre-pupe dalle pareti del flaconcino. (C) pupe vengono posizionati all'interno di provette per microcentrifuga da 1,5 mL che sono etichettati in modo appropriato (genotipo, data di raccolta e il momento della raccolta) e (D) coltivate all'interno una camera umidificata assemblata da una casella di punta della pipetta vuoto. Umidità è mantenuta mettendo un pezzo di tessuto umido all'interno della scatola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Dissezione l'occhio pupal. Pupe (A) siano rispettati nastro biadesivo sul nero piatto di dissezione. Anteriore, posteriore e dorsale coordinate sono indicate in blu. (B) per isolare i complessi di occhio-cervello (un singolo uno è mostrato qui), (C) la pupa viene prima rimosso dal relativo caso pupal. Passi importanti in questo processo sono mostrati. Linee rosse indicano dove strappare e aprire l'involucro Pupa dopo l'opercolo è stato rimosso. Le pupe vengono poi rimossi dal caso pupal strappato con il forcipe. (D) un esposto pupa è primo taglio lungo il torace con le forbici microdissection (posizione indicata con linea rossa tratteggiata) e l'epitelio testa quindi attentamente squarciata (frecce rosse), come mostrato nella (E) per rivelare il complesso opaco occhio-cervello. (F) a seguito di incubazione con gli anticorpi adatti, le retine sono affettate da complessi di occhio-cervello. Passi importanti in questo processo sono mostrati. Occhio-cervello è stabilizzato con un ago di tungsteno robusto (a sinistra) e le retine rimosso con un ago di tungsteno (a destra). Per analisi di RNA e proteine, retine unfixed possono essere tagliate in modo pulito da lobi ottica utilizzando una lama di rasoio fine o forbici microdissection, piuttosto che un ago di tungsteno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Immunofluorescenza dell'occhio pupal. (A) gli anticorpi agli svincoli di DE-cadherin etichetta adherens apicale delle cellule dell'occhio pupal. Tutte le immagini nel pannello A sono state raccolte nella regione centrale di una retina usando la microscopia confocal, minimamente modificata con un software di elaborazione di immagine e sono presentate alla stessa scala (scala bar = 5 µm). Nota la crescita e la riorganizzazione delle cellule dalle 18h APF a 27h APF. (B) dei cartoni animati della vista apicale di un singolo ommatidium completamente modellato a 40 h APF (a sinistra) e un ommatidium in sezione trasversale. Tipi di cellule sono colorati come elencato nella chiave. I fotorecettori sono sepolti sotto la superficie della neuroepithlium pseudostratificato e circondati da cono e cellule del pigmento. Tre gruppi di setola circondano ogni ommatidium. (C) piccole regioni di una retina di controllo in cui lacZ è stato espresso (a sinistra) o Diap1 (a destra) inibisce l'apoptosi delle cellule del pigmento secondari e terziari. Etichettatura di giunzioni intermedie con anti-DE-cadherin permette l'analisi di cella numero, disposizione e forma. Immagini sono state catturate utilizzando la microscopia fluorescente standard. (D) un'intera retina incubata con anticorpi anti-attivato Dcp-1, una caspasi attivate durante l'apoptosi, che pota numerose cellule dall'occhio. Immagine è stata catturata usando la microscopia confocal. Linea tratteggiata bianca delinea l'occhio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Analisi di espressione del gene e della proteina dell'occhio pupal. (A) macchia occidentale (a sinistra) di 28 occhi dissecati alle 21h APF o 40h APF, sondato con gli anticorpi a-cad e, come un controllo di carico, GAPDH. Analisi dell'intensità della banda di proteina (a destra) rivela le concentrazioni comparabili di-cad presenti in questi gruppi di retine, relativo GAPDH. Spettro di assorbanza singolo (B) di un campione di RNA estratto dal Cantone S retine sezionate a 40 h APF (in alto). Picco di assorbanza nota a 260 nm. Tabella che documentano i rapporti di quantità e la purezza del RNA estratto dalle retine pupale Cantone S isolate alle 21 e 40 h APF (in basso). Questi dati derivano da tre set di campioni indipendenti. Pupe per ogni set di esempio erano sollevate e incubati nelle stesse condizioni e sezionati nello stesso giorno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo di dissezione di pupal occhio della drosofila qui descritto consente per l'isolamento dei complessi di occhio-cervello di 6 a 10 entro 10-15 min. Tuttavia, pratica e pazienza sono essenziali al fine di padroneggiare la tecnica di dissezione e migliorare la qualità e la velocità delle dissezioni. Questa volta breve dissezione assicura che ogni occhio è circa lo stesso stadio di sviluppo, riducendo la variabilità nell'espressione di gene o fenotipo delle retine in un set di dati. Mentre protocolli alternativi possono richiedere meno pratica al Maestro, nostro protocollo è progettato per isolare metodicamente il delicato tessuto retinico, riducendo al minimo il rischio di lacerazione o taglio, perché danno all'occhio potrebbe indurre l'attivazione della via lo stress o anche morte delle cellule. Consigliamo ai principianti di primo maestro la dissezione delle pupe coltivate a 40 h APF prima di tentare di dissezionare occhi più giovani. Si consiglia di replicare che istituisce attraversa per tutti gli esperimenti (punto 1.1) che farà in modo che ci sono sempre sufficienti pupe disponibili per la raccolta (punto 1.3). Retine possono essere sezionate in una varietà di punti temporali durante lo sviluppo pupa, a seconda gli eventi morfogenetici distinti di interesse al ricercatore. Questi possono includere l'assunzione e la morfogenesi delle cellule primarie (dalle 18h APF), intercalazione delle cellule del reticolo (18-24 h APF), istituzione della nicchia terziario (21-24 h APF), cambiamenti nelle dimensioni delle cellule e forma (dalle 18h alle 40 h APF) e apoptosi (da 18 a 33 ~ h APF) (Figura 3A).
Se durante l'apertura iniziale del caso pupal (punto 2.2, Figura 2), il torace di una pupa è forato, il ricercatore dovrebbe ancora essere in grado di procedere con la dissezione. Tuttavia, se la testa è inizialmente forata, complessi di occhio-cervello intatto di estrazione può essere difficile. Quando si rimuove una pupa da involucro pupa (punto 2.3, Figura 2, pannello di destra), il caso pupal addominale a volte può sloggiare dal nastro biadesivo e rimangono avvolto su addome di pupa. Questo è improbabile un ostacolo, anche se la pupa può galleggiare quando circondato da PBS fino all'addome e collegato caso pupal sono separabili dalla pupa (punto 2.6). Per preservare l'integrità del tessuto retinico, è indispensabile che sia fisso o congelato più rapidamente possibile dopo la puntura iniziale delle pupe. Inoltre, utilizzando soluzioni ghiacciate e mantenere il tessuto sul ghiaccio (o a 4 ° C) ovunque possibile in tutto il protocollo conserverà il tessuto e l'integrità cellulare, portando a meglio immunofluorescenza, analisi della proteina o RNA-analisi. Per le applicazioni di quest'ultime, è importante rimuovere tutto cervello e tessuto grasso dagli occhi come questi tessuti possono contaminare analisi (passo 2.9 e 4.3 o 5.4).
Il complesso di pupal occhio-cervello possa aderire a dissezione, vetro e puntali non lubrificato strumenti quando non fissati o durante PBS lavaggi/risciacqui, che conduce al danno tissutale. Per evitare questo, si consiglia di lubrificazione meticolosa di puntali per pipette e non lavare i piatti di vetro 9-Pozzo con etanolo (sapone per i piatti dovrebbe essere evitati). Invece, semplicemente pulire piatti di vetro con acqua distillata H2O e lubrificare, se necessario, con un risciacquo PBT prima dell'uso. Aghi, forbici e pinze per dissezione dovrebbero anche essere principalmente puliti con distillata H2O, tranne durante la preparazione di questi per le dissezioni di estrazione del RNA (punto 5.1). Tuttavia, luce adesione tra retine e vetrini può aiutare a unfurling occhi e posizionandoli su diapositive quando si separano gli occhi da lobi ottici durante lo scalino (3.5.4 e 3.5.5). Allo stesso modo, luce adesione degli occhi al nero piatti di dissezione può essere utilizzato per appiattire e molto leggermente elasticizzato tessuto che facilita la recisione pulita del connessioni occhio ottica lobo quando isolando le retine per proteina o RNA analizza (passo 4.5 e 5.6). Abbiamo trovato che microdissection forbici o una lama di rasoio fine sono ottimi strumenti rapidamente e in modo pulito fendere occhi slegati da lobi ottici.
Durante macchiatura dell'anticorpo primario, piuttosto che incubando complessi di occhio-cervello in 72-pozzetto micro-altro vassoi (passaggio 3.3.5), un piatto di vetro 9-pozzo può invece essere utilizzato. Per evitare l'evaporazione della soluzione anticorpo durante la notte, essere sicuri di cap i pozzetti di piatto di vetro con un vetrino coprioggetto o diapositiva. Tuttavia, questo approccio richiederà 40-50 µ l di soluzione di anticorpo primario per un lotto di 6-10 complessi di occhio-cervello incubato in un pozzetto di 9-Pozzo vetro piatto, piuttosto che 20 µ l di soluzione di anticorpo primario distribuita tra 2 pozzi di un vassoio di 72-pozzetto micro-altro.
Ancoraggio secondario dei complessi di occhio-cervello (punto 3.4) prima di montare gli occhi su vetrini da microscopio (passo 3.5) sarà marginalmente irrigidire il tessuto così che è più facile a fendere gli occhi da lobi ottici e gli occhi sono meno propensi a piegare o aderire agli aghi di dissezione. Dopo un'incubazione di 1-2 h in mezzo di montaggio (punto 3.5.1), i complessi di occhio-cervello diventano leggermente opaco e quindi più facile da vedere mentre montaggio. Inoltre, dopo 1-2 h in mezzo di montaggio, più anticorpi secondari saranno opportunamente protetto da foto-candeggio durante la formazione immagine di fluorescenza. Incubando le retine pernottamento in mezzi di montaggio prima di montaggio non è raccomandato come questo rende morbide le retine, annullando l'effetto di irrigidimento di ancoraggio secondario.
Per analisi occidentali, il lisato di almeno 20 occhi è necessaria per rilevare in modo affidabile le proteine usando gli anticorpi che riconoscono robustamente Drosophila proteine (ad es., Figura 4A). Tuttavia, un numero maggiore di occhi può essere richiesto se c'è bassa espressione della proteina di interesse. Se la lisi del tessuto per macchiarsi occidentale successiva è incompleta (punto 4.7), il volume di WTLB aggiunto al campione può essere marginalmente aumentato ed il volume di concentrato sample buffer regolato di conseguenza (passo 4.9). Per l'estrazione di RNA, dissezione rapida di un numero significativo degli occhi può essere richiesta se l'obiettivo è quello di isolare una grande quantità di RNA di alta qualità (punto 5.2, Vedi Figura 4B). Questo potenziale svantaggio può essere superato se due scienziati che hanno imparato la dissezione della drosofila pupal occhio collaborano per dissezionare questi grandi numeri delle retine volare contemporaneamente. Tuttavia, la quantità totale di RNA necessaria dipenderà i requisiti dell'istituzione o dell'esecuzione di analisi di RNA, il tipo di analisi di RNA o sequenziamento, la struttura e il kit di estrazione di RNA che viene utilizzato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Zack tamburo e nostri recensori per utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
