Summary

Dissezione della drosofila Pupal Retina per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento del RNA

Published: March 15, 2019
doi:

Summary

Questa carta presenta un metodo chirurgico per la dissezione della drosofila retine pupale insieme a protocolli per il trattamento del tessuto per esame immuno-istochimico, analisi occidentale ed estrazione di RNA.

Abstract

La Drosophila pupal retina fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici durante lo sviluppo. In questa carta, presentiamo un protocollo affidabile per la dissezione della drosofila delicato pupal retina. Il nostro approccio chirurgico utilizza strumenti di microdissection prontamente disponibili per aprire pupe ed estrarre con precisione complessi di occhio-cervello. Possono essere fissi, sottoposto ad esame immuno-istochimico e retine poi montate su vetrini da microscopio e ripreso se l’obiettivo è quello di rilevare strutture cellulari o subcellulari. In alternativa, retine unfixed possono essere isolate dal tessuto di cervello, lisate in buffer appropriato e utilizzate per l’estrazione proteica gel elettroforesi o mRNA (valutare espressione della proteina o del gene, rispettivamente). Pazienza e pratica significativa potrebbe essere necessario padroneggiare il protocollo di microdissection descritto, ma una volta imparato, il protocollo consente relativamente rapido isolamento delle retine principalmente intatta.

Introduction

La retina di Drosophila è composta da circa 750 ommatidi circondati da cellule del pigmento, disposti in un nido d’ape della grata1,2,3,4. Ogni ommatidium contiene otto neuroni del fotoricettore, quattro lente-secrezione delle cellule cono e due cellule del pigmento primarie. Che circonda ogni ommatidium è cellule produttrici di pigmento di grata e gruppi di setole sensoriali. Grazie alla sua natura post-mitotico e stereotipata disposizione esagonale, retina pupal Drosophila fornisce un sistema di modello eccellente per lo studio dei processi morfogenetici compreso cellula adesione5,6, 7,8,9,10 e apoptosi11,12,13,14,15.

Diversi protocolli pubblicati utilizzano aria pressione per estrarre complessi di occhio-cervello da Drosophila pupe16,17,18. Il protocollo descritto qui invece utilizza strumenti di microdissection per attentamente e precisamente isolare complessi di occhio-cervello con l’obiettivo di ottenere tessuto retinico intatto. Questo è fondamentale se le retine sono da utilizzare per morfologica, proteina, o espressione genica analizza quanto stress cellulare o la morte, che potrebbe modificare l’espressione di gene o fenotipo cellulare può provocare danni alla retina. Inoltre, dopo la pratica, da 6 a 10 complessi di occhio-cervello possono essere isolati in 10-15 min, facilitando l’obiettivo di minimizzare la variabilità nell’età e Stadio di sviluppo del tessuto oculare dissecata.

La fissazione, immunostaining e intero-supporto protocollo descritto di seguito è adatto per la preparazione di Drosophila occhi per microscopia fluorescente. Retine possono essere incubate con anticorpi targeting per le proteine di interesse. Ad esempio, gli anticorpi ai componenti di giunzione dei adherens possono essere utilizzati per visualizzare le circonferenze apicale delle cellule, in modo che caratteristiche tra cui il tipo delle cellule, forma e disposizione possono essere valutati19. Prima della fissazione, gli occhi possono essere spaccati invece dal cervello allo scopo di estrarre la proteina per analisi occidentale, o RNA per l’uso in qRT-PCR o RNA-sequenziamento.

Protocol

1. tessuto preparazione Messa a punto della drosofila attraversa (come descritto in precedenza20) o cultura ceppi specifici di Drosophila per ottenere pupe del genotipo desiderato. Per garantire che un gran numero di pupe emerga contemporaneamente, stabilire queste culture volare in duplice copia il cibo nutriente media o media di cibo standard generosamente completati con la pasta di lievito. Mantenere la drosofila culture a 25 ° C. Per gli incroci …

Representative Results

L’occhio di pupa è un tessuto facilmente accessibile che serve come un eccellente modello per studiare i processi di sviluppo che morfogenesi in auto. Qui, noi abbiamo dissecato retine e utilizzato l’immunofluorescenza per rilevare le giunzioni dei adherens apicale (Figura 3A, C) o il caspase Dcp-1 (Figura 3D) che si attiva durante l’apoptosi (Figura 3)25. Questi approcci permettono di osser…

Discussion

Il metodo di dissezione di pupal occhio della drosofila qui descritto consente per l’isolamento dei complessi di occhio-cervello di 6 a 10 entro 10-15 min. Tuttavia, pratica e pazienza sono essenziali al fine di padroneggiare la tecnica di dissezione e migliorare la qualità e la velocità delle dissezioni. Questa volta breve dissezione assicura che ogni occhio è circa lo stesso stadio di sviluppo, riducendo la variabilità nell’espressione di gene o fenotipo delle retine in un set di dati. Mentre protocolli al…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Zack tamburo e nostri recensori per utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da R15GM114729.

Materials

Adobe Photoshop Adobe Image processing software
Bamboo splints, 6"  Ted Pella Inc 116
Beta mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Beta-glycerol phosphate Sigma-Aldrich 50020
Black dissecting dish Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder Fine Science Tools 10053
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693132001
Confocal microscope (Zeiss LSM 501) Carl Zeiss or similar microscope
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 40718
Double-sided tape 3M 665
Drosophila food media, nutrient-rich  7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila food media, standard Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758
Fixative solution 4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) Leica Microsystems or similar microscope
Forceps  Fine Science Tools 91150-20 Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde Thermo Scientific 28908
Glass 9-well dishes  Corning 7220-85 Also known as 9-well dishes 
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) Fisher Scientific 12-550-413
Glass petri dish Corning 3160-100BO
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Image Studio software version 5.2.5 LI-COR Biosciences Image processing software for quantitation of Western blots.
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions.
Lane marker reducing sample buffer  ThermoFisher Scientific 39000 5X concentrated protein sample buffer.
Microcentrigure tubes  Axygen MCT-175-C
Microdissection scissors  Fine Science Tools 15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells) Nunc 438733
Mounting media 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate Sigma-Aldrich P3130
Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) Sigma-Aldrich P5368 Prepare according to manufacturer's instructions
PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.  
PBT 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder Fine Science Tools 26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH Imgenex IMG-3073 For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 Cell signaling 9578S For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad Developmental Studies Hybridoma Bank DCAD2 For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 DCAD1  Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit  Promega Z6110
Rnase decontamination reagent (RNase Away) Molecular BioProducts 7002
Scalpel blades Fine Science Tools 10050 Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated  donkey anti-rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 712-545-153 For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-165-144 For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Cell Signaling Technology 7077 For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 305-035-003 For Western blotting. Used at 1:3000
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich 215309
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 50860
Spectrophotometer (NanoDrop) ThermoFisher Scientific 2000c 
Stereo dissecting microscope (M60 or M80) Leica Microsystems or similar microscope
Sylgard (black) Dow Corning SYLG170
Sylgard (transparent) Dow Corning SYLG184 Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes KIMTECH 34120
TritonX Sigma-Aldrich T8787
Trizma hydrochloride pH7.5 Sigma-Aldrich T5941
Tungsten needle, fine Fine Science Tools 10130-10 Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy Fine Science Tools 10130-20 Insert into pin holder
WTLB (western tissue lysis buffer) 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.
Yeast paste (local supermarket) Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O

References

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Cite This Article
DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation. J. Vis. Exp. (145), e59299, doi:10.3791/59299 (2019).

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