Summary

Disseksjon av Drosophila Pupal netthinnen for Immunohistochemistry, Western analyse og RNA isolasjon

Published: March 15, 2019
doi:

Summary

Dette dokumentet presenterer en kirurgisk metode for dissekere Drosophila pupal Netthinne sammen med protokoller for behandling av vev for immunohistochemistry, western analyse og RNA-utvinning.

Abstract

Drosophila pupal netthinnen gir en utmerket modellsystem for studiet av Morfogenetiske prosesser under utvikling. I dette papiret presenterer vi en protokoll som er pålitelig for Disseksjon av delikate Drosophila pupal netthinnen. Våre kirurgisk tilnærming benytter lett-tilgjengelig microdissection verktøy å åpen pupae og nøyaktig ekstra øye-hjerne komplekser. Disse kan fast, utsatt for immunohistochemistry og Netthinne så montert på objektglass og fotografert hvis målet er å oppdage mobilnettet eller subcellular strukturer. Alternativt kan unfixed Netthinne isolert fra hjernevev, lysed i riktige buffere og benyttes for protein gel geleelektroforese eller mRNA utvinning (å vurdere protein eller genet uttrykk, henholdsvis). Betydelig praksis og tålmodighet kan være nødvendig å mestre microdissection protokollen beskrevet, men når mestret, protokollen gjør at relativt rask isolering av hovedsakelig uskadet netthinne.

Introduction

Drosophila netthinnen består av ca 750 ommatidia omgitt av pigment cellene ordnet i honeycomb gitter1,2,3,4. Hver ommatidium inneholder åtte photoreceptor nerveceller, fire linse-sekresjon koniske celler og to primære pigment cellene. Hver ommatidium er pigment-produserende gitter celler og sensoriske bust grupper. På grunn av sin post mitotisk natur og stereotype Sekskantet arrangement gir Drosophila pupal netthinnen en utmerket modellsystem for studier av Morfogenetiske prosesser inkludert celle vedheft5,6, 7,8,9,10 og apoptose11,12,13,14,15.

Flere publiserte protokoller benytte lufttrykket å trekke øyet-hjerne komplekser Drosophila pupae16,17,18. Protokollen beskrevet i stedet benytter her microdissection verktøy å forsiktig og isolere nøyaktig øye-hjerne komplekser med mål om å få uskadet retinal vev. Dette er avgjørende hvis Netthinne skal utnyttes for morfologiske, protein eller genuttrykk analyserer siden skade Netthinne kan resultere i mobilnettet stress eller død, som kan endre mobilnettet fenotype eller genet uttrykket. I tillegg etter trening, kan 6 til 10 øye-hjerne komplekser bli isolert i 10 til 15 min, tilrettelegge mål å minimere variasjon i alder og utviklingen scene av dissekert øye vev.

Den fiksering, immunostai- og hele-mount protokollen beskrevet nedenfor er egnet for utarbeidelse av Drosophila øyne for fluorescerende mikroskopi. Netthinne kan være inkubert med antistoffer målretting proteiner av interesse. Antistoffer mot adherens junction komponenter kan for eksempel brukes til å visualisere de apikale omkretsene av cellene slik at egenskaper, inkludert celle type, form og arrangement blir vurdert19. Før fiksering, kan øynene i stedet bli kløyvde fra hjernen for å trekke ut protein for vestlige analyse eller RNA for bruk i qRT PCR eller RNA-sekvensering.

Protocol

1. vev forberedelse Definer Drosophila krysser (som beskrevet tidligere20) eller kultur spesifikke Drosophila stammer for å få pupae av ønsket genotype. Å sikre at et stort antall pupae dukke sammentreffet, etablere disse fly kulturer i duplikat på næringsrik mat media eller standard mat medier sjenerøst supplert med gjær-lim. Opprettholde Drosophila kulturer på 25 ° C. Kors utnytte UAS-GAL4 systemet, er GMR-GAL4 en ideell driver ut…

Representative Results

Pupal øyet er en drøy vev som fungerer som en utmerket modell å undersøke utviklingsprosesser som stasjonen morphogenesis. Her har vi dissekert Netthinne og brukte immunofluorescence til å oppdage de apikale adherens veikryssene (figur 3A, C) eller Dcp-1 caspase (figur 3D) som aktiveres under apoptose (Figur 3)25. Disse metodene tillater en tydelig observere celler under viktige Morfogen…

Discussion

Den Drosophila pupal øye disseksjon beskrevet her tillater for isolering av 6-10 øye-hjerne komplekser innen 10 til 15 min. Men er tålmodighet og praksis avgjørende for å mestre teknikken disseksjon og forbedre kvaliteten og hastigheten på disseksjoner. Denne korte disseksjon tiden sikrer at hvert øye er omtrent den samme utviklingsstadiet, reduserer variasjon i fenotype eller genet uttrykk for Netthinne i et datasett. Mens alternativ protokoller kan kreve mindre øvelse å mestre, er våre protokollen ut…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Zack trommelen og våre korrekturlesere nyttig på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av R15GM114729.

Materials

Adobe Photoshop Adobe Image processing software
Bamboo splints, 6"  Ted Pella Inc 116
Beta mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Beta-glycerol phosphate Sigma-Aldrich 50020
Black dissecting dish Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder Fine Science Tools 10053
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693132001
Confocal microscope (Zeiss LSM 501) Carl Zeiss or similar microscope
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 40718
Double-sided tape 3M 665
Drosophila food media, nutrient-rich  7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila food media, standard Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758
Fixative solution 4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) Leica Microsystems or similar microscope
Forceps  Fine Science Tools 91150-20 Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde Thermo Scientific 28908
Glass 9-well dishes  Corning 7220-85 Also known as 9-well dishes 
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) Fisher Scientific 12-550-413
Glass petri dish Corning 3160-100BO
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Image Studio software version 5.2.5 LI-COR Biosciences Image processing software for quantitation of Western blots.
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions.
Lane marker reducing sample buffer  ThermoFisher Scientific 39000 5X concentrated protein sample buffer.
Microcentrigure tubes  Axygen MCT-175-C
Microdissection scissors  Fine Science Tools 15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells) Nunc 438733
Mounting media 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate Sigma-Aldrich P3130
Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) Sigma-Aldrich P5368 Prepare according to manufacturer's instructions
PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.  
PBT 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder Fine Science Tools 26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH Imgenex IMG-3073 For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 Cell signaling 9578S For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad Developmental Studies Hybridoma Bank DCAD2 For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 DCAD1  Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit  Promega Z6110
Rnase decontamination reagent (RNase Away) Molecular BioProducts 7002
Scalpel blades Fine Science Tools 10050 Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated  donkey anti-rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 712-545-153 For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-165-144 For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Cell Signaling Technology 7077 For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 305-035-003 For Western blotting. Used at 1:3000
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich 215309
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 50860
Spectrophotometer (NanoDrop) ThermoFisher Scientific 2000c 
Stereo dissecting microscope (M60 or M80) Leica Microsystems or similar microscope
Sylgard (black) Dow Corning SYLG170
Sylgard (transparent) Dow Corning SYLG184 Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes KIMTECH 34120
TritonX Sigma-Aldrich T8787
Trizma hydrochloride pH7.5 Sigma-Aldrich T5941
Tungsten needle, fine Fine Science Tools 10130-10 Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy Fine Science Tools 10130-20 Insert into pin holder
WTLB (western tissue lysis buffer) 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.
Yeast paste (local supermarket) Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O

References

  1. Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
  2. Wolff, T., Ready, D. . The development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
  5. Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
  6. Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
  7. Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
  8. Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
  9. Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
  10. Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
  11. Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
  12. Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
  13. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
  14. Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
  15. Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
  16. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  17. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
  18. Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
  19. Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
  20. Greenspan, R. J. . Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Ellis, M. C., O’Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
  23. Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
  25. Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
  26. Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).

Play Video

Cite This Article
DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation. J. Vis. Exp. (145), e59299, doi:10.3791/59299 (2019).

View Video