Detta dokument presenterar en kirurgisk metod för dissekera Drosophila Pupp näthinnor tillsammans med protokollen för bearbetning av vävnad för immunohistokemi, västra analys och RNA-extraktion.
Drosophila Pupp näthinnan ger en utmärkt modellsystem för att studera morphogenetic processer under utveckling. I detta papper presentera vi ett pålitligt protokoll för dissektion av delikat Drosophila Pupp näthinnan. Våra kirurgisk metod använder lätt-tillgängligt lokalt verktyg för att öppna puppor och just extrahera öga-hjärna komplex. Dessa kan fastställas, utsätts för immunohistokemi och näthinnor sedan monterade på objektglas och avbildas om målet är att upptäcka cellular eller subcellulära strukturer. Alternativt, ofixerade näthinnor kan isoleras från hjärnvävnaden, lyserat i lämpliga buffertar och utnyttjas för protein gel elektrofores eller mRNA utvinning (att bedöma protein eller gen uttryck, respektive). Betydande övning och tålamod kan behöva behärska lokalt protokollet beskrivs, men när behärskar, protokollet kan relativt snabbt isolering av främst oskadade näthinnor.
Drosophila näthinnan består av cirka 750 ommatidia omgiven av pigmentceller ordnade i en bikakestruktur galler1,2,3,4. Varje ommatidium innehåller åtta ljusmätare nervceller, fyra objektiv utsöndrar kon celler och två primära pigmentceller. Kring varje ommatidium är pigment-celler galler och sensoriska borst grupper. På grund av dess efter mitotiska natur och stereotypa sexkantiga arrangemang ger Drosophila Pupp näthinnan en utmärkt modell för att studera morphogenetic processer inklusive cell adhesion5,6, 7,8,9,10 och apoptos11,12,13,14,15.
Flera publicerade protokoll utnyttja lufttrycket att extrahera öga-hjärna komplex från Drosophila puppor16,17,18. Protokollet beskrivs istället använder här lokalt verktyg att noggrant och isolera exakt öga-hjärna komplex med målet att erhålla oskadade retinala vävnaden. Detta är avgörande om näthinnor är för att utnyttjas för morfologiska, protein eller genuttrycket analyseras eftersom skador på näthinnor kan resultera i cellulär stress eller döden, som kunde ändra det cellulära fenotyp eller gen uttrycket. Dessutom, efter träningen, kan 6 till 10 öga-hjärna komplex isoleras i 10 till 15 min, underlätta målet att minimera variabiliteten i ålder och utvecklingsfas dissekerade ögat vävnad.
Den fixering, immunfärgning och hela-mount-protokollet som beskrivs nedan är lämplig för utarbetandet av Drosophila ögon för fluorescerande mikroskopi. Näthinnor kan inkuberas med antikroppar riktade proteiner av intresse. Antikroppar mot adherens junction komponenter kan exempelvis utnyttjas för att visualisera de apikala omkretsar celler så att egenskaper inklusive celltyp, form och arrangemang kan vara bedömda19. Före fixering, kan ögon istället vara klyvs från hjärnan i syfte att utvinna protein för västra analys eller RNA för användning i qRT-PCR eller RNA-sekvensering.
Den Drosophila Pupp ögat dissektion beskrivs här tillåter för isolering av 6 till 10 öga-hjärna komplex inom 10-15 min. Men är tålamod och praxis avgörande för att behärska tekniken dissektion och förbättra kvalitet och hastighet dissektioner. Denna korta dissektion tid säkerställer att varje öga är ungefär samma utvecklingsstadiet, minska variationen i fenotyp eller gen uttrycket av näthinnor i en datauppsättning. Samtidigt som alternativa protokoll kan kräva mindre praxis att bemästra, ä…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Zack trumma och våra granskare för hjälpsamma kommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöds av R15GM114729.
Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
Double-sided tape | 3M | 665 | |
Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |