Summary

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

Published: April 09, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים עבור חלקיק יחיד מעקב וניתוח תמונות המאפשר הערכה כמותית של דיפוזיה מקדמים, סוגי תנועה וגדלי אשכול של חלקיקים אחד שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פרוטוקול.

Abstract

חלקיק מעקב על רצף וידאו וניתוח האחורי של מסלולים שלהם היא כיום פעולה נפוצה במחקרים ביולוגיים רבים. באמצעות הניתוח של קרום התא קולטן אשכולות כמודל, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור משימה זו ניתוח התמונה באמצעות פיג’י (ImageJ) ו- Matlab שגרות: 1) מגדירים אזורים מעניינים ומעצבים את מסכות המותאמים לאזורים אלה; 2) לאתר את חלקיקי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ וידאו; 3) לנתח את מאפייני דיפוזיה והעוצמה של הרצועות. ניתוח כמותי של מקדמי דיפוזיה, סוגי תנועה וגודל האשכול מתקבל על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, עיבוד תמונה מספק כלי חשוב כדי לקבוע באופן אובייקטיבי dynamics החלקיקים ואת ההשלכות של שינוי תנאים סביבתיים. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורט לניתוח של תכונות אלה. השיטה המתוארת כאן לא רק מאפשר זיהוי מעקב מולקולה בודדת, אבל גם ממכן הערכת פרמטרים דיפוזיה לרוחב-קרום התא, מסווג את סוג המסלול, מאפשר ניתוח מלא ובכך להתגבר קשיים לכימות בגודל נקודה לאורך המסלול כולו שלו-קרום התא.

Introduction

חלבוני ממברנה שמוטבע על שכבה ליפידית הן בתנועה מתמדת עקב פיזור תרמי. הדינמיקה שלהם חיוניים כדי לווסת את התגובות התא, כפי האינטראקציות הבין-מולקולרי לאפשר היווצרות מתחמים להשתנות בגודלו מונומרים כדי oligomers ולהשפיע על יציבותו של איתות תסביכים. שחקרתי את מנגנוני שליטה חלבון דינמיקה היא לפיכך אתגר חדש ב ביולוגיה של התא, הדרושים כדי להבין את האות התמרה חושית מסלולים וכדי לזהות פונקציות תא בלתי צפויות.

פותחו מספר שיטות אופטי ללמוד אינטראקציות אלה החיים תאים1. בין אלה, מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה, שפותחה בשנות ה-80 המוקדמות, מאפשר חקר אינטראקציות מולקולרית ליד או מאוד את קרום התא2. ללמוד פרמטרים דינמיים של מסלולים חלבון ממברנה המתקבל TIRF נתונים בתאים חיים, חלקיק בודד שיטת (SPT) מעקב נדרש. למרות מספר אלגוריתמים זמינים עבור זה, אנו כעת להשתמש לאלה שפורסמו על ידי Jaqaman et al.3 המטפלות הטרוגניות תנועה של חלקיקים בשדה החלקיקים צפופים על-ידי קישור חלקיקים בין מסגרות רצופים כדי להתחבר למסלול וכתוצאה מכך מקטעי לתוך מסלולים מלאה (היעלמות זמנית החלקיקים). התוכנה לוכדת את החלקיקים מיזוג ופיצול הנגרמות כתוצאה צבירת ו דיסוציאציה אירועים3. אחד נתוני הפלט של תוכנה זו היא זיהוי של החלקיקים לאורך המסלול כולו על-ידי הגדרת את עמדותיהם X ו- Y בכל מסגרת.

ברגע זוהו חלקיקים, אנו מיישמים אלגוריתמים שונים כדי לקבוע את timelag קצר דיפוזיה מקדם (ד1-4)4,5. על-ידי החלת הניתוח8 רגע דרוג ספקטרום (MSS)7,6,, או על-ידי התאמת הערך ‘alpha’ על-ידי התאמה של ממוצע הריבועים הזחה (MSD) עקומת9, אנחנו גם לסווג את החלקיקים על פי סוג מסלול.

ניתוח בעוצמה ספוט בתמונות פלורסצנטיות הוא מטרה משותפת עבור מדענים שדה10,11. האלגוריתם הנפוץ ביותר בשימוש הוא מספר כביכול בהירות. שיטה זו בכל זאת אינו מאפשר זיהוי נכון מסגרת עוצמת ב חלקיקי השבר ניידים. לנו יש, לכן, שנוצר אלגוריתם חדש כדי להעריך אלו חלקיקים בעוצמות-המסגרת וכדי לקבוע את מצב צבירת שלהם. ברגע נקודות הציון של כל חלקיק מזוהים באמצעות תוכנת U-Track23, אנו מגדירים בעוצמתה בכל מסגרת מעל המסלול המלא, גם אם ניקח בחשבון את הרקע לתא בכל מסגרת. תוכנה זו מציעה אפשרויות שונות כדי לקבוע את עוצמת המקום והרקע תא לקניה, באמצעות חלבונים monomeric ו- dimeric ידוע גם הפניות, מחשבת את המספר המשוער של חלבונים בהחלקיק זוהה (גודל האשכול).

במאמר זה, אנו מתארים מדריך זהיר כדי לבצע את השלבים 3: 1) זיהוי ומעקב אחר חלקיקים בודדים לאורך וידאו של מיקרוסקופיית פלורסצנטיות באמצעות U-track; 2) מנתח את מקדם דיפוזיה מיידי (ד1-4) של החלקיקים כאלו וסוג התנועה (מוגבל, חינם או מכוונת) של חלקיקים עם מסלולים ארוכים על ידי MSS; 3) מדידת עוצמת ספוט לאורך הווידאו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הרקע מוערך בכל מקום. כך מתאפשר הערכת גודל האשכול וזיהוי של השלבים photobleaching.

השימוש בפרוטוקול זה אינו דורש כישורים מיוחדים ניתן לבצע במעבדה כלשהי עם תרבית תאים, flow cytometry ומתקני מיקרוסקופ. הפרוטוקול משתמש ImageJ או פיג’י (הפצה של ImageJ12), U-track3והשגרה הוק עשה כמה לספירה (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track, אד הוק רוטינות לדרוס Matlab שניתן להתקין בכל מחשב תואם.

Protocol

1. הכנת דגימות ביולוגיות לגדל תאים Jurkat בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% FCS, NaPyr וגלוטמין (RPMI מלאה). Electroporate Jurkat תאים (20 x 106 תאים/400 µL של RPMI 1640 עם 10% FCS) עם וקטור קולטן כימוקין מתויג-GFP monomeric (CXCR4-AcGFP, 20 μg) כדי לאפשר זיהוי שלו באמצעות מיקרוסקופ זריחה.הערה: זה אפשרי להשתמש בחלבונים פלורסנט mon…

Representative Results

השימוש של פרוטוקול זה מאפשר את מעקב אוטומטי של חלקיקים זוהה סרטים מיקרוסקופ פלורסצנטיות, הניתוח של המאפיינים דינמי שלהם. בתחילה, התאים הם transfected עם החלבון מצמידים fluorescently לבצע אחריהם מעקב. הרמה המתאימה של קולטנים מציג על פני התא, המאפשר ש-SPT מתקבל על ידי התא מיון (<strong class="xfi…

Discussion

השיטה המתוארת קל לבצע אפילו מבלי ניסיון עבודה עם Matlab. עם זאת, Matlab רוטינות לדרוש מאוד דיוק עם המינוח של פקודות שונות, הלוקליזציה של התיקיות שונות המועסקים על-ידי התוכנית. ב המעקב אחר ניתוח שגרתי (שלב 3), ניתן לשנות פרמטרים מרובים. חלון “הגדרה Gaussian-תערובת דגם נאוה” (שלב 3.8) קובעת איך U-track יזהה חלקי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו מודים ועד מאנזו קרלו מריה גארסיה Parajo שלהם עזרה וקוד המקור של ניתוח מקדם דיפוזיה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים מן הספרדית משרד המדע, חדשנות אוניברסיטאות (SAF 2017-82940-R), את תוכנית RETICS של אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III (RD12/0009/009, RD16/0012/0006; RIER). LMM JV נתמכים על-ידי התוכנית COMFUTURO של CSIC Fundación הכללי.

Materials

Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

References

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Play Video

Cite This Article
Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

View Video