Bildebehandling protokollen for analyse av spredningen og størrelse membran reseptorer av fluorescens mikroskopi
Summary
Her presenterer vi en protokoll for enkelt partikkel sporing bildeanalyser der kvantitativ vurdering av diffusjon koeffisienter, typer bevegelse og cluster størrelse enkelt partikler oppdaget av fluorescens mikroskopi.
Abstract
Partikkel sporing på en videosekvens og bakre analyse av sine baner er i dag en vanlig operasjon i mange biologiske studier. Analyse for celle membran reseptor klynger som modell, presenterer vi en detaljert protokoll for dette bildet analyse ved Fiji (ImageJ) og Matlab rutiner å: 1) definere områder av interesse og design masker tilpasset disse regioner. 2) spore partikler i fluorescens mikroskopi videoer; 3) analysere diffusjon og intensitet karakteristikkene av utvalgte spor. Kvantitativ analyse av diffusjon koeffisientene, bevegelse og klyngestørrelse oppnås ved fluorescens mikroskopi og bildebehandling gir et verdifullt verktøy for å finne objektivt partikkel dynamikk og konsekvensene av å endre miljøforhold. I denne artikkelen presenterer vi detaljerte protokoller for analyse av disse funksjonene. Metoden beskrevet her ikke bare tillater én-molekylet sporing oppdagelsen, men også automatiserer estimering av lateral diffusjon parametere på cellemembranen, klassifiserer hvilken bane og tillater fullstendig analyse dermed overvinne den vanskeligheter med å kvantifisere størrelsen over sin hele bane på cellemembranen.
Introduction
Membran proteiner i lipid bilayer er i kontinuerlig bevegelse grunnet termiske spredning. Deres dynamics er avgjørende for å regulere celle svar, intermolekylære interaksjoner at komplekser som varierer i størrelse fra monomerer til oligomers og påvirke stabiliteten signalnettverk komplekser. Klargjørende mekanismer som styrer protein dynamics er dermed en ny utfordring i cell biology, å forstå signaltransduksjon trasé og uventede celle funksjonene.
Noen optiske metoder har blitt utviklet til å studere disse interaksjoner i levende celler1. Blant disse kan totalt interne refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, utviklet i 1980, studiet av molekylære interaksjoner på eller svært nær cellemembranen2. For å studere dynamiske parametre av membran protein baner fra TIRF data i levende celler, er en enkelt partikkel oppfølgingsmetode (SPT) nødvendig. Selv om flere algoritmer er tilgjengelig, bruker vi som utgis av Jaqaman et al.3 som partikkel bevegelse heterogene i et tett partikkel ved å koble partikler mellom påfølgende koble den resulterende banen segmenter i fullstendige baner (midlertidig partikkel forsvinningen). Programvaren registrerer partikkel slå sammen og dele resultatet fra aggregering og dissosiasjon hendelser3. En av utdata av denne programvaren er deteksjon av partikler langs hele banen ved å definere sine X og Y posisjoner i hver ramme.
Når partiklene er oppdaget, bruker vi forskjellige algoritmer for å fastslå den korte timelag diffusjon koeffisient (D-1-4)4,5. Bruk av øyeblikk skalering spektrum (MSS)6,7,8 analyse eller montering ‘alfa’ verdien av justering av Mean Square forskyvning (MSD) til kurven9, klassifisere vi også partikler i henhold til typen bane.
Analyse av spot intensiteten i fluorescens bilder er en felles målsetting for forskere i feltet10,11. Den vanligste algoritmen som brukes er såkalte antall og lysstyrke. Denne metoden likevel tillater ikke riktig frame-by-frame intensitet oppdagelsen i partikler i mobile fraksjonen. Vi har, dermed generert en ny algoritme til å vurdere disse partikkel intensiteter ramme-for-bilde og bestemme deres aggregering tilstand. Når koordinatene for hver partikkel oppdages ved hjelp av U-Track2 programvare3, definerer vi intensiteten i hver ramme over hele banen, også tar hensyn cellebakgrunnen i hver ramme. Denne programvaren tilbyr ulike muligheter for å finne stedet intensiteten og cellebakgrunnen og bruke kjent monomerisk og dimeric proteiner som referanser, beregner antall proteiner i partikkel oppdaget (cluster størrelse).
I denne artikkelen beskriver vi en forsiktig guide for å gjennomføre disse tre trinnene: 1) oppdage og sporing enkelt partikler sammen en video av fluorescens mikroskopi med U-spor; 2) analysere øyeblikkelig diffusjon koeffisient (D-1-4) av disse partikler og typen bevegelse (begrenset, gratis eller regissert) partikler med lange baner av MSS; 3) måling spot intensiteten langs videoen korrigert av den estimerte bakgrunn fluorescensen for hver spot. Dette gjør at klyngen størrelse estimering og identifisering av photobleaching trinnene.
Bruk av denne protokollen krever ikke spesialisert kompetanse og kan utføres i et laboratorium med cellekultur, flow cytometri og mikroskopi. Protokollen bruker ImageJ eller Fiji (en distribusjon ImageJ12), U-spor3og noen ad hoc gjort rutiner (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-spor og adhoc kjøre over Matlab som kan installeres på alle kompatible datamaskiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet er enkel å utføre selv uten noen tidligere erfaring med Matlab. Matlab rutiner krever imidlertid svært nøyaktighet med nomenklaturen av ulike kommandoer og lokalisering av de forskjellige mappene ansatt av programmet. I sporing analyse rutine (trinn 3), flere parametere kan endres. Vinduet “Innstillingen Gaussian-blanding modell passende” (trinn 3.8) styrer hvordan U-spor vil oppdage enkelt partikler på videoen. Dette gjøres ved å montere en Gaussian blanding modell som beskrevet i<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Carlo Manzo og Maria García Parajo for deres hjelp og kilde koden av diffusjon koeffisienten analyse. Dette arbeidet var støttes delvis av stipend fra det spanske departementet for vitenskap og innovasjon universiteter (SAF 2017-82940-R) og RETICS programmet i Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 og RD16/0012/0006; RIER). LMM og JV støttes av programmet COMFUTURO av Fundación generelt CSIC.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
