Bildebehandling protokollen for analyse av spredningen og størrelse membran reseptorer av fluorescens mikroskopi

Summary

Her presenterer vi en protokoll for enkelt partikkel sporing bildeanalyser der kvantitativ vurdering av diffusjon koeffisienter, typer bevegelse og cluster størrelse enkelt partikler oppdaget av fluorescens mikroskopi.

Abstract

Partikkel sporing på en videosekvens og bakre analyse av sine baner er i dag en vanlig operasjon i mange biologiske studier. Analyse for celle membran reseptor klynger som modell, presenterer vi en detaljert protokoll for dette bildet analyse ved Fiji (ImageJ) og Matlab rutiner å: 1) definere områder av interesse og design masker tilpasset disse regioner. 2) spore partikler i fluorescens mikroskopi videoer; 3) analysere diffusjon og intensitet karakteristikkene av utvalgte spor. Kvantitativ analyse av diffusjon koeffisientene, bevegelse og klyngestørrelse oppnås ved fluorescens mikroskopi og bildebehandling gir et verdifullt verktøy for å finne objektivt partikkel dynamikk og konsekvensene av å endre miljøforhold. I denne artikkelen presenterer vi detaljerte protokoller for analyse av disse funksjonene. Metoden beskrevet her ikke bare tillater én-molekylet sporing oppdagelsen, men også automatiserer estimering av lateral diffusjon parametere på cellemembranen, klassifiserer hvilken bane og tillater fullstendig analyse dermed overvinne den vanskeligheter med å kvantifisere størrelsen over sin hele bane på cellemembranen.

Introduction

Membran proteiner i lipid bilayer er i kontinuerlig bevegelse grunnet termiske spredning. Deres dynamics er avgjørende for å regulere celle svar, intermolekylære interaksjoner at komplekser som varierer i størrelse fra monomerer til oligomers og påvirke stabiliteten signalnettverk komplekser. Klargjørende mekanismer som styrer protein dynamics er dermed en ny utfordring i cell biology, å forstå signaltransduksjon trasé og uventede celle funksjonene.

Noen optiske metoder har blitt utviklet til å studere disse interaksjoner i levende celler¹. Blant disse kan totalt interne refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, utviklet i 1980, studiet av molekylære interaksjoner på eller svært nær cellemembranen². For å studere dynamiske parametre av membran protein baner fra TIRF data i levende celler, er en enkelt partikkel oppfølgingsmetode (SPT) nødvendig. Selv om flere algoritmer er tilgjengelig, bruker vi som utgis av Jaqaman et al.³ som partikkel bevegelse heterogene i et tett partikkel ved å koble partikler mellom påfølgende koble den resulterende banen segmenter i fullstendige baner (midlertidig partikkel forsvinningen). Programvaren registrerer partikkel slå sammen og dele resultatet fra aggregering og dissosiasjon hendelser³. En av utdata av denne programvaren er deteksjon av partikler langs hele banen ved å definere sine X og Y posisjoner i hver ramme.

Når partiklene er oppdaget, bruker vi forskjellige algoritmer for å fastslå den korte timelag diffusjon koeffisient (D-_1-4)^4,5. Bruk av øyeblikk skalering spektrum (MSS)^6,7,8 analyse eller montering 'alfa' verdien av justering av Mean Square forskyvning (MSD) til kurven⁹, klassifisere vi også partikler i henhold til typen bane.

Analyse av spot intensiteten i fluorescens bilder er en felles målsetting for forskere i feltet^10,11. Den vanligste algoritmen som brukes er såkalte antall og lysstyrke. Denne metoden likevel tillater ikke riktig frame-by-frame intensitet oppdagelsen i partikler i mobile fraksjonen. Vi har, dermed generert en ny algoritme til å vurdere disse partikkel intensiteter ramme-for-bilde og bestemme deres aggregering tilstand. Når koordinatene for hver partikkel oppdages ved hjelp av U-Track2 programvare³, definerer vi intensiteten i hver ramme over hele banen, også tar hensyn cellebakgrunnen i hver ramme. Denne programvaren tilbyr ulike muligheter for å finne stedet intensiteten og cellebakgrunnen og bruke kjent monomerisk og dimeric proteiner som referanser, beregner antall proteiner i partikkel oppdaget (cluster størrelse).

I denne artikkelen beskriver vi en forsiktig guide for å gjennomføre disse tre trinnene: 1) oppdage og sporing enkelt partikler sammen en video av fluorescens mikroskopi med U-spor; 2) analysere øyeblikkelig diffusjon koeffisient (D-_1-4) av disse partikler og typen bevegelse (begrenset, gratis eller regissert) partikler med lange baner av MSS; 3) måling spot intensiteten langs videoen korrigert av den estimerte bakgrunn fluorescensen for hver spot. Dette gjør at klyngen størrelse estimering og identifisering av photobleaching trinnene.

Bruk av denne protokollen krever ikke spesialisert kompetanse og kan utføres i et laboratorium med cellekultur, flow cytometri og mikroskopi. Protokollen bruker ImageJ eller Fiji (en distribusjon ImageJ¹²), U-spor³og noen ad hoc gjort rutiner (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-spor og adhoc kjøre over Matlab som kan installeres på alle kompatible datamaskiner.

Protocol

1. forberedelse av biologiske prøver

1. Vokse Jurkat celler i RPMI 1640 medium med 10% FCS, NaPyr og L-glutamin (fullstendig RPMI). Electroporate Jurkat celler (20 x 10⁶ celler/400 µL av RPMI 1640 med 10% FCS) med en monomerisk GFP-merket chemokine reseptor vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) å tillate oppdagelsen bruke fluorescens mikroskopi.
   Merk: Det er mulig å bruke andre monomerisk fluorescerende proteiner som mCherry, mScarlet, etc.
2. 24 timer etter transfection analysere celler i en flyt cytometer å finne både celle levedyktighet og CXCR4-AcGFP uttrykk.
3. Velg celler uttrykke lave CXCR4-AcGFP av cellen sortering av GFP^lav positiv celler (figur 1), som lav uttrykk for transfekterte reseptor kreves TIRFM eksperimenter for å sikre enkel partikkel sporing for sporing personlige baner⁹.
4. Kvantifisere nummeret av reseptorer på cellens overflate.
   Merk: Som et eksempel¹³~ 8500-22.000 AcGFP-merket reseptorer/mobiltelefon, tilsvare ~ 2-4.5 partikler/μm².
5. Resuspend sortert celler i komplett RPMI og ruge minst 2 h på 37 ° C, 5% CO₂. Sentrifuge celler (300 x g, 5 min), og resuspended dem i TIRF buffer (HBSS, 25 mM HEPES, 2% FCS, pH 7.3).
   1. Plate på 35 mm glass bunn microwell retter (2-3 x 10⁵ cellen/parabol) belagt med fibronectin (20 μg/mL, 1 time, 37 ° C) i tilstedeværelse eller fravær av aktuelle ligand (dvs. CXCL12, 100 nM, 1 time, 37 ° C). Inkuber celler (20 min på 37 ° C, 5% CO₂) før bildeopptak.
6. Utføre eksperimenter ved hjelp av en TIRF mikroskop, utstyrt med en EM-CCD kamera, en 100 x oljeneddyp mål (HCX PL APO 100 x / 1.46 NA) og en 488 nm diode laser. Mikroskopet kan temperaturkontroll og inkubasjon med CO₂. Finn og fokusere celler med grov og fin fokus knotter, bruker lysende felt for å minimere photobleaching effekter. Finskruen i TIRF-modus bruk en lav laser intensitet, utilstrekkelig for single-partikkel gjenkjenning eller å indusere photobleaching effekter (5% laser makt, 28 μW).
7. Anskaffe filmer (bildesekvenser) av ca 50 s minimere tidsintervallet mellom rammer. Gjennomtrengning av feltet evanescent skal 70-90 nm dybde. Lagre ervervet filmer for hver eksperimentelle tilstand som ".lif" (video.lif).
   Merk: Filmer i eksemplet beskrevet anskaffet på 49% på laser makt (2 mW) med en eksponeringstid på 90 ms, og et tidsintervall på 98 ms, for 49 s (500 bilder). Gjennomtrengning av den valgte flyktige bølgen var 90 nm.

2. valg av bilder og etableringen av masker

1. For hver eksperimentelle tilstand (video.lif), kan du opprette en ny mappe (VideoName) som må inneholde forskjellige mapper for hver serie. Hver mappe inneholder en "videoSeq" mappe for bilder og en "resultater" mappe for resultatene av analysen. Kontroller at filstrukturen i dette øyeblikk er følgende:
   VideoName/video.lif
   VideoName/Series1/videoSeq
   VideoName/Series1/resultater
   Merk: Fra mikroskopet er forskjellige .lif-filer innhentet med flere videoer for hver behandling tilstand (dvs. FN, FN + SDF). "video.lif" svarer til det input.lif video arkiv med alle TIRF filmer oppkjøp (serie) på mikroskopet. "videoSeq" mappe inneholder 500 rammene av filmen som vi analyserer. Mappen "resultater" inneholder alle filer fra til analysen utført. Nøyaktig nomenklatur og lokalisering av de forskjellige mappene er avgjørende for riktig funksjon av algoritmer. Navn i fet skrift i listen ovenfor er løst (dvs. de har å bli kalt på denne måten fordi disse er navnene søkt etter skript). Navn ikke i fet skrift kan endres slik at eksperimentet utføres.
2. Åpne TIRFM videoen (.lif-fil) med Fiji eller ImageJ ved å dra og slippe filen på Fiji menylinjen og klikk på OK å importere lif-filen bruker BioFormats (supplerende figur 1).
3. Velg serien å behandle, og klikk OK (supplerende figur 2A). Hvis du vil utforme en maske for analyse av denne videoen, importere også et multikanalbilde med de forskjellige chromophores (i eksemplet Series 1 er multikanalbilde og Series 2 tilsvarende videoen). Videoen (og multikanalbilde) åpnes som en ImageJ stack. I eksemplet (supplerende figur 2B) bildet er til venstre og videoen er til høyre.
   Merk: Hvis opprettingen av en maske for videoen ikke er nødvendig, gå til trinn 2.5.
4. Opprette en maske. Opprette et enkelt bilde med kanalene nyttig for utformingen av masken. I dette tilfellet er de interessante kanalene de røde, grønne og grå.
   1. Delt kanalene multikanalbilde (supplerende figur 3A): Velg bilde i bar-menyen og velg farge | Deler opp kanaler. De ulike kanalene vises som separate bilder (supplerende figur 3B).
   2. Flette igjen de tre kanalene i ett enkelt bilde (utvidet figur 4A): Velg bilde i baren menyen og velg farge | Slå sammen kanaler. Velg den aktuelle kanaler og trykk OK (supplerende figur 4B). En ny ikke-stablet bildet blir generert (supplerende figur 4C).
   3. Synkronisere de to vinduene ved hjelp av verktøyet Synkronisere Windows (supplerende figur 5A): Velg analyser på baren menyen | Verktøy | Synkronisere Windows. Et nytt vindu med Synkroniser bilde muligheter vises (supplerende figur 5B).
   4. Med to windows synkronisert (bare videoen hvis det er ingen multikanalbilde forbundet), kan den samme regionen i både windows beskjæres. Tegne regionen rundt med rektangulære markeringsverktøyet ImageJ flytende menyen. Velg bilde i bar-menyen og velg Beskjær (supplerende figur 6A). De to beskårne bildene viser individuelt (supplerende figur 6B).
   5. Avslutt synkronisering både windows (supplerende figur 6B) ved å trykke knappen Avslutt synkronisering alle Synkronisere Windows manager.
5. Hvis en maske ikke er opprettet som i trinn 2.4, trekke regionen rundt med rektangulære markeringsverktøyet ImageJ flytende menyen.
6. Lagre videoen som en bildesekvens i katalogen videoSeq under tilsvarende video katalogen (supplerende figur 7A): Velg fil i bar-menyen og velg Lagre som | Bildet sekvens... gi etiketter for videosekvensen som video0000.tif, video0001.tif,... video0499.tif (ekstra figur 7B): i boksen endre navn som video og klikker OK. Rekkefølgen må være alene i katalogen skal brukes med hell av U-spor.
   Merk: Hvis ikke designe en maske for video, gå til trinn 2.8.
7. Utforme en maske. Velg multikanalbilde og åpne segmentering Editor plugin (supplerende figur 8A): velger Plugins i bar-menyen og velg segmentering | Segmentering editor. Legge til og endre etikettene til segmentering nødvendig av rett klikker opp på etikettene til redigeringsprogrammet segmentering (supplerende figur 8B, C).
   1. Velg et egnet markeringsverktøy ImageJ flytende menyen (her bruker Frihåndsform), Velg en etikett (grønn) og utforme først ytterste masken (supplerende figur 9A). Når designet, vises trykk + i alternativet Composite -vinduet, og valgte masken på betrakteren (supplerende figur 9A). Gjenta dette trinnet med neste etiketter (internt, i rødt) (ekstra figur 9B).
      Merk: Etter utformer masken for etikettene Green og interiør, vil eksteriør masken okkupere resten av bildet.
   2. Masker er kodet i bildet som områder 0, 1, 2... i henhold til etikettene i vinduet RGB etiketter. Når alle masker for forskjellige etikettene er utformet, lagrer masken med samme filnavn som video, med navnet mask.tif (ekstra figur 9C): Velg fil i baren menyen og velg Lagre som | TIFF....
      Merk: Valgte maskene vil bli ansatt i beregningen av diffusjon koeffisientene og klassifisering av baner (se trinn 4.2).
8. Kontroller at filstrukturen i dette øyeblikk er følgende:
   VideoName/video.lif
   VideoName/Series1/mask.tif
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
   ...
   VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
   VideoName/Series1/resultater
   Merk: Mask.tif er et bilde med masken som er designet i trinn 2.4 og 2.7. Video*.tiff er videoen som lagret i trinn 2.6. Som ovenfor navnene i fet skrift i listen ovenfor er fast, dvs., de må kalles på denne måten fordi disse er navnene søkt av skriptene. Navn ikke i fet skrift kan endres slik at eksperimentet utføres.

3. sporing partikler

1. Spore alle partikler i de valgte videoene med U-spor.
2. Åpne Matlab og legge U-spor katalogen til banen ved hjelp av angir banen | Legge til med undermapper i menyen. Lagre banen slik at i fremtiden henrettelser av Matlab U-spor er i banen. Denne banen innstillingen må gjøres bare én gang.
3. Endre arbeidsmappen til katalogen som inneholder serien skal analyseres. Påkalle U-spor ved å skrive i konsollen (supplerende Figur10) movieSelectorGUI og trykk enter. Vinduet filmen blir åpnet (supplerende figur 11A).
4. Trykk på knappen ny film og (supplerende figur 11B) vises i vinduet Movie edition .
5. Trykk på Legg til kanal for å velge mappen med video (VideoName/Series1/video) og fylle parameterne film informasjon. Angi utdatamappen resultatene av U-spor resultatene (videoName/Series1/resultater).
   Merk: Parameterne film informasjon kan fås fra mikroskopet og oppkjøp forhold.
6. Trykk på Avanserte kanalinnstillinger og fylle parameterne relatert til oppkjøp. Se verdiene for parameterne i eksemplet (supplerende figur 11C).
7. Trykk på Lagre i vinduet Avanserte kanalinnstillinger og Lagre i vinduet Movie edition . Programmet vil be om bekreftelse skriver filen som heter movieData.mat på mappen resultater . Bekreft.
8. Når du har opprettet filmen, trykk på Fortsett i vinduet film. U-spor vil spørre om objekttypen som skal analyseres. Velg enkelt-partikler (supplerende figur 12). Kontrollpanel-vinduet vises (supplerende figur 13A).
   1. Velg steg trinn 1: gjenkjenning og trykk på innstillingen. Vinduet Innstillingen Gaussian blanding-modellen passer vises (supplerende figur 13B). I eksemplet er "Alpha verdi for sammenligning med lokale bakgrunn" satt til 0,001 og "Rolling-vinduet tid snitt" 3 (supplerende figur 13B).
   2. Trykk på Bruk i vinduet Innstillinger Gaussian blanding-modellen passer og kjøre i Kontrollpanel. Med konfigurasjonen i supplerende figur 13kjører bare gjenkjenning skritt. Dette trinnet tar noen minutter (2-5). Sjekk resultatene ved å trykke knappen resultatet i trinn 1 (deteksjon, supplerende figur 14).
      Merk: Som vist ovenfor, viser filmen røde sirkler på oppdaget partikler. Hvis ingen rød sirkel vises, har dette trinnet ikke arbeidet riktig.
9. Utføre identifikasjon av spor, dvs sammenslåing partikler oppdaget i forrige trinn i spor som spenner over flere rammer. Dette er den trinn 2: sporing av U-spor innstillinger må defineres som vist i Supplerende figur 15A-C. Trinn 2 kostnader funksjonen innstillingene for delbilde til delbilde kobling og Gap lukking, slå sammen og dele i eksemplet vises i supplerende figur 15B og C, henholdsvis.
10. Når parameterne for trinn 2, trykk kjøre i Kontrollpanel og bare trinn 2 kjører (supplerende figur 16).
11. Utføre banen analyse, trinn 3. Define innstillingene som vist i supplerende figur 17 (høyre panel). Deretter trykk Bruk i panelet i innstilling-bevegelse analyse, og kjøre i Control Panel-U-spor. Dette trinnet tar noen sekunder.
12. Kontroller med knappen resultatet i trinn 3 at prosessen har korrekt identifisert alle sporene. For å gjøre det, klikker du på Vis spornummer vinduet filmalternativer , og sjekk bilde for bilde at hvert spor har blitt korrekt identifisert (supplerende figur 18). Manuelt merke dem partikler som ikke er sanne partikler.
    Merk: Hvis denne manuelt valg ikke er gjort, utføres en svakere automatisk valg senere når diffusjon koeffisient beregnes (se trinn 4).

4. beregning av Diffusion koeffisienter og klassifisering av baner

1. Sørg for at alle skript startes fra katalogen på videoen blir analysert (i eksemplet er VideoName/Serie1).
2. Les alle baner for å beregne diffusjon koeffisientene utsteder i Matlab konsollen kommandoen: trajectories=readTrajectories(0.1), der 0,1 er tiden i sekunder mellom to påfølgende rammer (tidsintervallet, vises i panelet film Informasjon, supplerende figur 11B).
3. Utelate baner tilsvarer feilaktig identifisert flekker/baner. Gir en liste over stedene å ekskludere. For eksempel for å utelate flekker 4, 5 og 28, skriv: baner = readTrajectories (0.1, [4, 5, 28]).
4. Beregne øyeblikkelig diffusjon koeffisientene for hver av sporene i denne cellen. I dette tilfellet beregne diffusjon koeffisient for en tidsforsinkelse = 4, kalt D_1-4. For å gjøre det, kjører i Matlab konsollen kommandoen: D = calculateDiffusion (baner, 113.88e-3, 0.0015, 'alfa') der baner er baner fikk i trinn 3, 113.88e-3 er pikselstørrelsen ervervet bildene i mikron, 0.0015 er en øvre grense for diffusion koeffisientene immobile partikler målt i µm²/s og 'alfa' er montert modell som beskrevet nedenfor.
   Merk: Når du bruker en raskere kamera og trenger flere bilder å beregne parameteren diffusjon øke, f.eks til 20, av D = calculateDiffusion (baner, 113.88e-3, 0.0015, 'alfa', '', 20). Strengparameteren før 20, i eksempelet ovenfor, '', er det lagt til utdatafiler. Dette suffiks kan brukes til å skille ulike analyser.
5. Passe MSD med en annen funksjon ved å kalle calculateDiffusion funksjonen igjen med en annen passende modus ('begrenset', 'ledig' eller 'ledet'). I dette eksemplet 'begrenset': D = calculateDiffusion (baner, 113.88e-3, 0.0015, 'begrenset').
6. Få tak i passende resultatene for rettet modellen, som vist i supplerende figur 20.
7. Bryter ned baner i korte og lange baner. Bruke kommandoen: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) der 50 er minimumslengden i rammer på en bane å bli vurdert lenge (i eksempelet).
8. Studere kort baner ved samme passende fremgangsmåten beskrevet trinn 4,3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'ledet', 'Kort'). Analysere kort og unormalt baner med kommandoen: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alfa', 'Kort').
9. Analysere lange baner for å klassifisere typen bevegelse gjennom sine øyeblikk skalering spektrum (MSS)⁷. Kommandoen: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'lang') viser analysen i skjermen og genererer en fil kalt trajectoryClassification < suffiks > .txt i den katalogen results\TrackingPackage\tracks.

5. beregning av klyngen Ssize gjennom partikkel tetthet

Merk: Sørg for at alle skript startes fra katalogen på videoen blir analysert (i eksempelet vist, VideoName/Serie1).

1. Analysere intensiteten i hver partikkel langs deres bane. For å gjøre dette, starte skriptet ved å skrive i konsollen Matlab: analyzeSpotIntensities som tar inn baner beregnet av U-spor i den første delen. I sin mest grunnleggende form, kaller skriptet uten et argument til katalogen for videoen blir analysert (i eksempelet vist, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Konfigurere dette grunnleggende på mange forskjellige måter ved å gi argumenter til skriptet som: analyzeSpotIntensities ("Arg1´, verdi1, ' Arg2´, verdi2,...). Gyldige argumenter med deres tilsvarende variabelverdier ('ArgN´, ValueN) er oppført.
   1. ("spotRadius´, 1)
      Analysere fluorescens intensiteten bruker spotRadius 1 bildepunkt (som standard) som tilsvarer en patch størrelse 3 x 3 sentrert på stedet ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Merk: Velg en spotRadius for en oppdatering av 5 x 5 sentrert på stedet, 2, etc.
   2. ("onlyInitialTrajectories´, 1)
      Hvis dette argumentet angis (sann, verdien 1), analysere bare baner som begynner i det første bildet av videoen. Dette er nyttig for å analysere kontroll bilder (som standard 0, falske).
   3. ('trackTrajectory´, 0)
      Hvis dette argumentet angis til 0 (USANN), deretter holde koordinaten til stedet i første rammen for alle rammer (dette er nyttig for immobile flekker). Hvis argumentet er satt til 1 (standard 1, sann), deretter sporet stedet langs video følgende koordinater beregnes av U-spor.
   4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Inkluder banen antall disse baner utelukket trinn 4,3 (i eksempel 4, 5, 28).
   5. ("extendTrajectory ´, 1)
      Hvis dette argumentet er satt til 1 (sann), deretter analysere intensiteten i patch til slutten av videoen (selv om banen stopper tidligere). Koordinatene stedet er den siste koordinaten i banen (hvis trackTrajectory er sant) eller den første koordinaten i banen (hvis trackTrajectory er false). Dette argumentet er USANN (0) som standard.
   6. ("subtractBackground´, 1)
      Hvis denne parameteren settes, deretter riktig den rå fluorescensen målt på hvert sted ved anslaget av bakgrunnen fluorescens for den plassen (se nedenfor). Dette argumentet er sann (1), som standard.
   7. ('meanLength´, bildenummer)
      Hvis denne parameteren settes, måles mener intensitet stedet på lengden angitt. Angi "meanLength", 20 å måle mener spot intensiteten på de første 20 rammene. Hvis argumentet ikke er angitt, deretter beregnet spot intensiteten på hele banen (som standard, full lengde).
   8. ("showIntensityProfiles´, 1)
      Angi denne parameteren som 1 (som standard 0, falske), tegne intensitet profilen langs de forskjellige rammene som bakgrunnen.
      Merk: Disse flatene er svært nyttig for å identifisere photobleaching som vist i supplerende figur 21. For hver bane analyserer rutinen automatisk hvis det er mulig at det har vært photobleaching. Dette gjøres ved å sammenligne intensitetsverdiene med en Student t i første og siste N rammer langs banen. Standard N er 10, men denne verdien kan endres gjennom argumentet ' Nbleach´.
   9. ('backgroundMethod´, verdi)
      Angi denne parameter for å fastsette bakgrunnen for hver spot. Dette kan gjøres på flere måter kan, og hvilke ettall å bruke valgte skiftende "value":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
         Bruk denne verdien manuelt identifisere bakgrunnen for hele videoen. Kan velge 8 poeng i den første rammen av videoen. En patch rundt disse punktene er analysert langs hele videoen, og 95% quantile av alle intensitetssonene velges som bakgrunn intensiteten for alle steder.
      2. ("backgroundMethod´, 1)
         Bruk denne verdien manuelt identifisere bakgrunnen for hver ramme. Velg 8 poeng for hver spot og hver ramme. Dette er en tidkrevende oppgave, men det gir mye kontroll til brukeren. 95% quantile med intensiteten i disse oppdateringene velges som bakgrunn intensiteten for dette stedet i denne rammen.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
         Bruk denne verdien til å beregne bakgrunnen for hver spot beregnet fra 8 punkt ligger i en sirkel rundt stedet med en radius kontrollert av argumentet ' backgroundRadius´ (standard 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
         Bruk denne verdien til å beregne bakgrunnen for hver ramme ved først å finne cellen i videoen og deretter analysere intensiteten til cellen i hver ramme (supplerende figur 22).
         Merk: Bakgrunnen er valgt som grå verdi på en gitt quantile i denne fordelingen (av standard 0,5 (= 50%), selv om denne parameteren kan styres gjennom argumentet ' backgroundPercentile´, denne verdien kan settes høyere, for eksempel 0,9 (= 90%) Hvis ønsker de fleste av cellen skal anses som bakgrunn. For å hjelpe i identifikasjon av cellen, angi som er verdien for maksimal bakgrunn forventet langs delbildene ved argumentet ' maxBackground´ (for eksempel i alt analysert videoer, bakgrunn verdien normalt aldri går utover 6000)¹³. Som standard er dette alternativet satt til 0, betyr at dette ikke er brukt som standard. Se celle gjenkjenning og markert for bakgrunnen estimering sette argumentet ' showImages´ til 1 (Stopp utførelsen når som helst ved å trykke CTRL + C).
2. Samle diffusjon og intensitet informasjon for alle baner beregnet i trinn 4 og 5.1, henholdsvis bruker gatherDiffusion.AndIntensity (). Samle bare diffusjon og intensitet informasjonen for korte baner. Dermed bruker suffiksene brukes i trinn 4.7 og type: gatherDiffusionAndIntensity ("Short´) der ' Short´ er suffikset brukes i trinn 4.7.
3. Samle øyeblikk spektrum skaleringen og intensitet informationby innskriving: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') der 'Lang' suffikset brukes i trinn 4.7. Et sammendrag av alle filer generert ved hjelp av denne protokollen er vist i figur 2.

Representative Results

Bruk av denne protokollen tillater automatisk sporing av partikler i fluorescens mikroskopi filmer og analyse av deres dynamiske egenskaper. I utgangspunktet celler er transfekterte med fluorescently-kombinert protein spores. Riktig nivå av reseptorer presenterer på cellens overflate som lar SPT oppnås ved celle sortering (figur 1). Celleinnhold analyseres av TIRF mikroskopi som genererer videoer i et format som kan studeres med verktøyene som beskrives i denne protokollen (supplerende Video 1).

Videoene generert kan ikke analyseres direkte uavhengig rammene av hver video er nødvendig. Bruk av ImageJ genererer filer som kan tolkes benytter Matlab programvare som videobilder i TIFF-format eller masker. U-spor spor partikler i valgt video og lagrer informasjonen i Matlab (.mat) filer (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), se figur 2.

Som vist i figur 2, genererer beregning av diffusjon koeffisientene og klassifisering av baner kommandoer, ulike filer (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, etc). Informasjonen i filene behandles best bruker Excel og prisme. Informasjon som kan fås fra denne analysen inkluderer:

1. Prosent av immobile. Du kan bruke som referanse immobile partikler: 95% persentil av D_1-4 verdier Hentet (1) fra enkelt partikler i fast celler og/eller (2) fra renset fluorescerende protein knyttet til coverslips (figur 3A).
2. Prosentandel av lange baner (> 50 rammer) (figur 3B).
3. Type bevegelse av lange baner: regissert, gratis, begrenset (Figur 3 c).
4. Diffusjon koeffisient (D-_1-4) mobile partikler i cellene behandlet med forskjellige stimulans (figur 4A).

Trinn 5 av protokollen analyserer intensiteten i hver partikkel langs banen. Skriptet analyzeSpotIntensities skrives ut skjermen all informasjon analysert. For hver spot og ramme, skriptet viser koordinaten stedet i rammen (x, y) i pixel-enheter, anslaget av bakgrunnen fluorescens (k0), rå øye intensiteten i 3 x 3 patch, korrigert intensiteten (beregnet som rå intensiteten minus sin bakgrunn), maksimumsverdien for intensitet observert i oppdateringen og Sonenummeret i masken hvor dette stedet ligger i denne rammen. Et eksempel på typen produksjonsmengde som produseres er

sted = 43 ramme = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

Denne informasjonen lagres i en loggfil (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) og en tabell som kan leses fra Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). Etter å analysere hver spot, skriver skriptet gjennomsnittlig intensiteten langs banen og majoritarian regionen i masken

sted = 43
meanCorrectedSpotIntensity langs rammer = 4762.303
majoritarian regionen = 3

Denne informasjonen er lagret i loggfilen over og en tabell som kan leses fra et regneark (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). Eksempelvis betyr spot intensiteter (msi) for hver partikkel langs deres bane i celler stimulert med ulike forhold vises i figur 4B. Nå kan vi bruke denne informasjonen til å beregne omtrent på størrelse med fluorescerende klyngen. Som en flekk korrigert intensitet er relatert med antall fluorescerende proteiner i dette stedet, og fluorescens av en monomer kan måles gjennom en lignende, men uavhengige eksperiment, direkte beregne antall reseptorer per partikkel. Frekvensfordeling reseptor antall per partikkel bruke som referanse intensiteten av monomerisk protein i de samme cellene er vist i figur 4C.

Samle spredning og intensitet kommandoen oppretter to filer: én kalt diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtog en annen kalt log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt i mappen / TrackingPackage/spor. Begge filene inneholder 1) spot indeksen, 2) diffusjon koeffisient, 3) intensitet og 4) Sonenummeret i masken. Disse filene kan leses fra et regneark.

Tilsvarende samle bane klassifisering og intensitet kommandoen oppretter to filer en kalt trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt og en annen log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt i den Directory resultater/TrackingPackage/spor. Den første som inneholder 1) spot indeksen, 2) hvilken bevegelse, 3) stedet første øyeblikk, 4) intensiteten, 5) D_1-4 og 6) Sonenummeret i masken. Denne filen kan leses fra Excel.

Et sammendrag av alle filer generert ved hjelp av denne protokollen er vist i figur 2. Andre analysen som utføres med denne protokollen inkluderer sammenligning av dynamiske parameterne for små vs større flekker, dvs monomerer vs oligomers, variasjoner på disse dynamiske parametre av ligander, hemmere, membranen komponering endring av signalnettverk trasé, etc. En fullstendig analyse av CXCR4 svar på sin ligand CXCL12 under ulike eksperimentelle forhold er utført ved hjelp av denne protokollen¹³.

Figur 1 : Cellen sortering. Uttrykk for GFP i Jurkat celler transfekterte med CXCR4-AcGFP før og etter celle sortering. Cellen uttrykke lave nivåer av GFP (GFP^lav) velges og ansatt TIRF eksperimenter.

Figur 2 : Sammendrag av filen genereres. Figuren viser alle filer generert ved hjelp av Matlab rutinen beskrevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Klassifisering av baner. Antall ulike baner tilsvarer cellene behandles med ulike stimuli. (A) prosent immobile flekker, (B) prosentandel av lange baner og (C) type av lange baner.

Figur 4 : Diffusion koeffisienten, mener spot intensitet og antall reseptorer per partikkel. (A) distribusjon av kort diffusjon koeffisientene (D-_1-4) verdier for hver spot i respons på ulike stimuli (I, II, II og IV). Rød linje representerer medianverdien for D_1-4. (B) mener spot intensiteter (msi) verdier for hver spot langs første 20 rammene i respons på ulike stimuli (I, II, II og IV). Rød linje representerer mener intensitetsverdien (SD). (C) prosent av reseptorer/partikkel som utvinnes fra intensitet distribusjon av de enkelte partiklene, tar som bin bredde intensitetsverdien monomerisk protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra figur 1: Åpne en TIRFM fil i Fiji eller ImageJ. Alternativene som vises i vinduet Bio-formater ved å dra og slippe en .lif video. Klikk her for å laste ned figuren. 

Ekstra figur 2: Velg serie. Bilder finnes i .lif video. (A) vindu som tillater valg av serien å bli analysere, inkludert flerkanals bilder. (B) sluttresultat eksempel serien utvalg, inkludert multikanalbilde (venstre) og tilhørende video (høyre). Klikk her for å laste ned figuren. 

Ekstra figur 3: Deler opp kanaler. (A) vinduet fangst av kommandoene ImageJ nødvendig kløyverennens kanaler i et multikanalbilde og (B) resultatet eksempel på kanalen delt. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 4: Slå sammen kanaler. (A) slå sammen ulike kanaler i et enkelt bilde. (B) kanalvalg for sammenslåing. (C) resultatet eksempel på kanalen flettingen. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 5: Synkronisere windows. (A) lokalisering i ImageJ menyen kommandoene kreves for synkronisering av bildet og (B) som vises. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 6: Velg område av interesse. (A) utvalg av vinduet rundt bruker det rektangulære markeringsverktøyet og (B) resultatet av bildebeskjæring. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 7: Lagre videoen. Lagre regionen rundt som en bildesekvens og parametere for Lagre som sekvens bildevinduet. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 8: Segmentering. (A) åpne segmentering editor plugg i den ImageJ plugins-menyen. (B) Legg etiketter/materialer for segmenteringen. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 9: Maske design. (A) valg av riktig etiketter og definisjon av grønne masken. (B) valg av den røde masken. Eksempel på to masker tilsvarer to etiketter. (C) lagre maskene som en TIFF-fil. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 10: MATLAB arbeidsmappen. Valg av riktig katalog som inneholder serien skal analyseres. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 11: U-spor hovedmenyen. (A) film utvalget, (B) film edition og (C) kanal innstillingsmenyer. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 12: Velg hvilken objekttype spore. Velg oppfølging enkelt partikler. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 13: Gjenkjenning av partikler. (A) U-spor, Kontrollpanel. (B) eksempel på innstillinger for gjenkjenning av partikler. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 14: Eksempel på resultater for partikkel gjenkjenning. Forskjellige vinduer som inkluderer en tilskuer menyen, filmen alternativmenyen og filmen. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra Figur 15: Oppfølging-menyen. Eksempel på innstillinger. (A) sporing, (B) Angi - ramme til ramme linking og (C) gap lukking, slå sammen og dele menyer. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 16: Eksempel på resultater for partikkel sporing. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 17: Bane analyse-menyen. Eksempel på innstillinger. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 18: Verifikasjon av spor analyse. Skjermen etter spor analyse, inkludert en videovinduet viser partikler oppdaget og sine tilsvarende spor. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 19: Beregning av diffusjon koeffisienter. Histogrammer av diffusjon koeffisientene beregnes (venstre) og betyr squared forskyvning (MSD, høyre). Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 20: Beregning av diffusjon koeffisienter inkludert forskjellige passende moduser. Histogrammer av diffusjon koeffisientene beregnes (venstre) og betyr squared forskyvning (MSD, høyre) for lukkede modellen. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 21: Intensitet profiler. Eksempel på spot intensitet langs sin bane (blå linjen) og bakgrunn (rød linje). Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra figur 22: Bakgrunn for hver ramme. Venstre: Eksempelbilde for cellen. Midten: Automatisk oppdaget cellen. Høyre: Området velges automatisk som bakgrunn. Klikk her for å laste ned figuren.

Ekstra Video 1: Eksempel på en typisk TIRF video mikroskopi viser tilstedeværelse av partikler med forskjellige intensiteter og typer bevegelser. Klikk her for å laste ned videoen.

Supplerende materiale 1: Filer som inneholder alle protokollen skript i adhoc rutiner ansatt for klassifisering av baner og analyse av klyngestørrelsen. Klikk her for å laste ned materiale.

Discussion

Metoden beskrevet er enkel å utføre selv uten noen tidligere erfaring med Matlab. Matlab rutiner krever imidlertid svært nøyaktighet med nomenklaturen av ulike kommandoer og lokalisering av de forskjellige mappene ansatt av programmet. I sporing analyse rutine (trinn 3), flere parametere kan endres. Vinduet "Innstillingen Gaussian-blanding modell passende" (trinn 3.8) styrer hvordan U-spor vil oppdage enkelt partikler på videoen. Dette gjøres ved å montere en Gaussian blanding modell som beskrevet i³. En av nøkkelparameterne for denne montering definerer et filter for å identifisere lokale maxima. Denne operasjonen avhenger av bildekontrasten og støy i bildene. Den første parameteren (Alpha verdi for sammenligning med lokale bakgrunn) styrer tillit en maxima blir en ekte sted, mens de andre bidrar til å redusere støy under identifisering av flekker. Viktige parametere i "Tracking" trinn (3.9) er antall rammer å lukke hull (dvs. et spor kan omfatte over rammer som partikkelen ikke er faktisk sett, men det er sett før rammene og etter disse rammene, i eksemplet 0) , og antall rammer som et spor må dekke for å bli vurdert som en vellykket spor (i vårt eksempel 20; denne parameteren gjelder kameraet oppkjøpet hastighet og antall rammer i sporet må være slik at beregningen av diffusjon co effektivt). Det er også viktig å avgjøre om å slå sammen og del segmenter (i eksempelet disse to muligheter ble valgt). Deretter må parameterne for trinn 1 i kostnader funksjoner (delbilde til delbilde linking) angis. Denne funksjonen kontrollerer hvordan partikler spores langs rammene. De viktigste parameterne på dette punktet er valg av Brownian søk radius, som styrer hvor langt hver spot forventes å bli i neste delbilde. I vårt eksempel valgte vi 0 og 5 som nedre og øvre grensene, henholdsvis. Merk at disse parameterne er svært spesifikke til natur partikler spores, og at de måtte være innstilt i hver enkelt sak. Spesielt viktig er skalering kraften i Brownsk og lineær søke radier. Disse skalering krefter avhengig av hvilke av partikler (gratis eller begrenset spredning). I eksemplet ble verdiene (0,5, 0,01) valgt gratis spredning. Hvis bestemte dokumentasjon av disse parameterne, kan du se³.

I beregningen av kommandoen diffusjon koeffisientene (trinn 4.4), kan den øvre grensen av diffusjon koeffisient immobile partikler være kjent fra tidligere eksperimenter eller ved å kjøre funksjonen calculateDiffusion på et eget prosjekt med immobile partikler (renset monomerisk fluorescerende protein) og se diffusjon koeffisientene rapportert. Denne funksjonen tar to ekstra parametere: ' outputSuffix´, som er lagt til utdatafiler og standard tar den tomme verdien, og "plotLength´, som standard er 13 og antall tidsforsinkelsen (sekunder) i som diffusion beregningen utføres. Passende modus 'alfa' innebærer en justering av MSD til kurven

dvs lag en offset (MSD₀) og en strøm funksjon av tiden. Eksponenten av denne power-funksjonen, , avgjør om bevegelse er begrenset (0 < α < 0,6), uregelrett (0,6 < α < 0,9), gratis (0,9 < α < 1.1), eller (α > 1.1). For en gjennomgang av denne typen analyser kalles leseren Manzo et al.⁹

Beregningen av diffusjon koeffisienter⁴ produserer to utgang tall (se supplerende figur 19). Den første viser et histogram for de diffusion koeffisienter beregnet (Merk at på dette punktet, det er en uavhengig diffusjon koeffisient for hver bane). Midlere og 95% persentil av disse koeffisienter vises i Matlab konsollen. Den andre tomten viser MSD (rød kurve) og antall trinn anses å beregne den som en funksjon av tidsforsinkelsen for disse baner anses å være mobile (de som diffusion koeffisient er over terskelen i kommandolinjen). Beregnes gjennomsnittet og standardavviket for mobile baner (dette er verdiene for baner i en enkelt celle). I eksemplet er eksponenten 0.59 betyr at bevegelsen er begrenset. For denne kurven montering rapporter programmet usikkerheten forbundet til hver av parametrene (vist som standardavviket for hver) og godhet av fit (perfekt ville rekkevidde null). På dette punktet og etter å sjekke verdien av alpha kan vi bestemme å passe MSD med en annen funksjon:

    Hvis 0 < α < 0,6 (begrenset)

Hvis 0.9 < α < 1.1 (gratis)

Hvis α > 1.1 (regissert)

Uregelrett baner kan ikke utstyres med en annen funksjon. I tilfelle trange partikler kan du beregne confinement størrelsen (i mikron) som Destainville et al.¹⁴

En god indikator på en riktig passende er at godhet av fit skal redusere fra Alfa passer til den endelige monteringen (i eksemplet godhet passer faller fra 0.30474 til 0.15749, supplerende figur 19-20). calculateDiffusioncreates to filer i "results\TrackingPackage\tracks" i mappen serie kalt "diffusionCoefficients.txt" og "diffusionCoefficientsMobile.txt". Disse filene inneholder tre kolonner: 1) indeksen hver skriving bane, 2) deres tilsvarende diffusjon koeffisienten, 3) i majoritarian regionen i masken der dette sporet tilhører (regionene hentes fra filen "mask.tif" som vi generert i trinn 2.7; Hvis denne filen ikke finnes, så finnes denne kolonnen ikke). Du kan bruke denne filen og de tilsvarende filene generert for andre celler for å analysere fordelingen av diffusjon koeffisient for et sett med celler under lignende eksperimentelle forhold.

Beregningen av diffusjon koeffisient for korte baner (trinn 4,7-4,8), er den siste parameteren 'Kort' et suffiks til utdatafilnavnene slik at du kan analysere ulike undergrupper av baner uten å overskrive diffusionCoefficients.txt filer. Selve navnet på utdatafiler er «diffusionCoefficients < suffiks > .txt» og «diffusionCoefficientsMobile < suffiks > .txt». Hvis ingen suffikset er gitt, som i generell analyse utført ovenfor, antas en tom suffiks. Parameterne modell (D, v og MSD₀) kan variere fra de montert på alle baner. Mest bemerkelsesverdig, standardavviket for parameterne samt godhet passer normalt øke. Grunnen er at korte baner er mer ustabile og en pålitelig passende er vanskeligere.

Analyse av lange baner (trinn 4,9) klassifisere dem i trange (1), gratis (2) eller rettet (3) etter deres første øyeblikk og dens plassering i forhold til 2,5% og 97,5% persentil av første øyeblikk av 500 tilfeldig baner med Brownsk bevegelse, den samme diffusjon koeffisient og lengde som banen blir analysert og simulert ved Monte Carlo. Hvis første øyeblikk av banen blir analysert er under 2,5% av de første øyeblikkene i simuleringene, er banen blir studert klassifisert som begrenset. Hvis det er over 97,5% av simulert første øyeblikk, er det klassifisert som anvist; ellers er banen klassifisert som Brownian. I kommandoen ansatt, 113.88e-3 er pikselstørrelsen i µm, 0.0015 er den øvre grensen av diffusjon koeffisient immobile flekker målt i µm2/s, og "Lang" er suffikset for utdatafilnavn. Den første kolonnen i denne filen ("trajectoryClassificationLong.txt") er hvor banen, andre dens klassifisering (1 = begrenset, 2 = gratis, 3 = rettet), og tredje er banen første øyeblikk.

Skriptet for beregning av intensiteten av hver partikkel (trinn 5.1) er svært fleksibel og tillater sporing fluorescens intensiteten på mange forskjellige måter (hver velegnet for forskjellige situasjoner som sporing immobile flekker av en kontroll eksperiment eller sporing svært bevegelige flekker over en celle med variabel fluorescerende bakgrunn). Skriptet vil analysere alle baner langs alle delbilder. For hver spot på hver ramme vil det måle intensiteten av bildepunktene rundt stedet (det analyserer en firkantet patch rundt stedet, som standard en størrelse 3 x 3 piksler), stedet bakgrunn og beregne fluorescens forskjellen på stedet og bakgrunn. Prosentandelen av photobleaching partikler og antall fluorescerende partikler i en enkelt klynge, sett på som ett enkelt sted, kan beregnes på denne måten.

Denne automatiserte metoden (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) gir informasjon om flere parametere (spot intensitet, lateral diffusjon, type bevegelse), som kan hjelpe for å studere forholdet mellom størrelsen og dens dynamiske på basale forhold, og hvordan ulike behandlinger kan endre disse parametrene.

Den viktigste begrensningen av metoden er at det krever celle transfection med fluorescerende protein spores. Hva fører vanligvis til protein overuttrykte, et faktum som hindrer enkelt protein sporing. En celle sortering trinn må inkluderes å velge celler uttrykke en rekke reseptorer at oppdagelsen og sporing av enkelt partikler av SPT-TIRF mikroskopi. Denne metoden kan også brukes til å spore biomolecules merket med kvante prikker eller Fab fragmenter. Beskrevet protokollen krever en rekke kontroller som tidligere må analyseres for å sikre at konklusjonene drevet fra analysen er riktige. Først av alt, er det avgjørende å bestemme riktig uttrykk betingelsene at oppdagelsen og sporing av enkelt partikler. Filmer med tettheter på ~ 4,5 partikler/µm², tilsvarer 8500-22.000 reseptorer/mobiltelefon, ble brukt til å analysere spatio-temporale organiseringen av celle membran reseptor¹³.

Det er viktig å etablere minimum synlig diffusjon koeffisient med renset monomerisk AcGFP proteiner eller fast celler. I begge tilfeller er det antatt at det er ingen spredning og derfor vi anslår at spredning verdiene av partikler analysert i disse forholdene tilsvarer immobilisert partikler og brukes til å skille mellom mobile og immobile baner¹³.

Analysen vi har presentert her er en generell banen analyseverktøyet, som kan brukes til analyse av spredningen av reseptorer av superresolution, analyse av Diffraksjon begrenset bilder og analyse av mobilnettet bevegelse av standard mikroskopi . Den største fordelen med denne metoden med andre beskrevet tidligere, som analyse av tall og lysstyrke¹¹, er at det tillater evaluering av mener intensitetsverdiene for hver enkelt spot langs sin bane, tar hensyn til tidspunktet for overlevelse av AcGFP monomerisk protein før photobleaching. Overlevelse tidspunktet for et molekyl før photobleaching avhenger sterkt eksitasjon betingelsene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Jurkat cells	ATCC	CRL-10915	Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator	BioRad		We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands.
Cytomics FC 500 flow cytometer	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinant human CXCL12	PeproTech	300928A
Inverted Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD camera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism	GraphPad software