Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma resultatet av rött ljus ansökan om tillväxten av Candida albicans biofilm. En icke-koherent rött ljus enhet med våglängd 635 nm och energitäthet av 87,6 J·cm-2 tillämpades under hela tillväxten av Candida albicans biofilmer för 48 h.
Abstract
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma resultaten av traktamente rött ljus behandling på tillväxten av Candida albicans biofilm. För att öka plankton tillväxten av C. albicans SN425, växte inoculums på jäst kväve Base media. För biofilm bildning tillämpades RPMI 1640 media, som har höga halter av aminosyror, för att hjälpa biofilm tillväxt. Biofilmer på 48 h behandlades två gånger dagligen under en period av 1 min med en icke-koherent ljus enhet (rött ljus, våglängd = 635 nm; energitäthet = 87,6 J·cm-2). Som en positiv kontroll (PC), 0,12% klorhexidin (CHX) tillämpades, och som en negativ kontroll (NC), 0,89% NaCl tillämpades på biofilmer. Kolonibildande enheter (CFU), torr vikt, lösliga och olösliga exopolysaccharides kvantifierades efter behandlingar. Kortfattat, det protokoll som presenteras här är enkel, reproducerbar och ger svar om livskraft, torr-vikt och extracellulära polysackarid belopp efter rött ljus behandling.
Introduction
Den ökade incidensen av diabetes, immunsuppressiv terapi program, HIV-infektion, AIDS-epidemin, kliniska ingrepp och brett spektrum antibiotika förbrukning under de senaste åren har ökade incidensen av Candida albicans relaterade sjukdomar1,2. C. albicans infektioner är ofta relaterade till biofilm utveckling och kan orsaka kliniska manifestationer, exempelvis candidiasis eller systemiska manifestationer, såsom candidemi1,2. En av de mest anmärkningsvärda virulensfaktorer biofilm tillväxt är extracellulära polysackarid matrix etableringen. Biofilm bildning samarbetar för att öka motståndet mot befintliga svampdödande läkemedel, miljöbelastning och värd immunologiska mekanismer3.
Biofilm tillväxten av C. albicans börjar med plankton celler tidig anslutning till ett substrat, följt av förökningen av jästceller genom substrat yta och hyphal tillväxt. Den sista fasen av biofilm tillväxt är den mognad fasen, vari jäst-liknande utvecklingen dämpas, hyphal utveckling expanderar och extracellulärmatrix omsluter den biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) i matrisen samverkar för att bilda mannan-glukan komplexa5,6. Växelverkan av exopolysaccharides är avgörande för försvar av biofilmer mot droger7. Minskning av EPS från C. albicans extracellulärmatrix kunde därför stödja utvecklingen av nya antimikrobiella protokoll för oral candidos kontroll.
Ljus reglerar tillväxt, utveckling och uppförande av flera organismer8 och den har använts som en antimikrobiell i fotodynamisk antimikrobiell kemoterapi (PACT). PAKTEN gäller en synligt ljus av en viss våglängd och en ljus-absorberande photosensitizer9. Photosensitizers har dock svårigheter att penetrera biofilmen, orsakar lägre effekt10. Terapeutiska medel underlåtenhet att fullt infiltrera biofilmer är en anledning att biofilmer ibland motstå traditionell antimikrobiell terapi3,5. Om du vill inaktivera bifogade mikrobiella cellerna, behöver antimikrobiella ämnen genomsyra genom den extracellular matrisen; dock karaktäriserar EPS en diffusionsstyrd hinder för sådana molekyler genom att fråga deras nivå av transport in i biofilm eller genom att påverka svaret av det antimikrobiella medlet uteslutande med matrisen själv11.
Med tanke på nackdelarna med pakten, användningen av ljus i sig framstår som en värdefull förbättring. Preliminära data visade att behandling med blått ljus dagligen betydligt hämmade produktionen av EPS-olöslig i Streptococcus mutans biofilm. Av minskningen av EPS-olöslig minskat blått ljus biofilm tillväxt. Dock är resultaten av ljusbehandling med rött ljus i C. albicans biofilmer knappa. Därför var syftet med denna undersökning att utvärdera i vilken sätt ljusbehandling med rött ljus påverkar tillväxt och arrangemang av C. albicans biofilm. För behandling två gånger dagligen, vi anpassat våra laboratoriets föregående protokoll9,12 för att ge en lätt och reproducerbara biofilm modell som ger svar om livskraft, torr-vikt och extracellulära polysackarider belopp efter rött ljus behandling. Samma protokoll som kan användas för att testa andra behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av kultur media
- Förbereda sabouraud dextros agar (SDA). Avbryta 65 g SDA kompletteras med kloramfenikol (50 mg/L) i 1000 mL destillerat vatten. Koka upp att upplösa mediet helt. Sterilisera i autoklav vid 15 PSI (121° C) för 30 min. svalna till 45-50 ° C. Blanda väl och häll 20 mL av SDA i sterila Petri plattor (storlek: 100 x 15 mm).
- Förbereda jäst kväve bas (YNB) medium kompletteras med 100 mM glukos genom att blanda 6,7 g YNB och 18 g dextros till 1 000 mL av ultrarent vatten. Blanda med en omrörare och sterilisera mediet använder ett 0,22 µm vakuum filtersystem.
- Förbered RPMI genom att blanda 10,4 g RPMI 1640 och 34.32 g 3-(N-morpholino) propanesulfonic syra (moppar) 1 000 ml av ultrarent vatten. Blanda i en omrörare utan värme och justera pH till 7 av NaOH 1 N (tillsätt 2 g NaOH till 50 mL ultrarent vatten). Sterilisera mediet använder ett 0,22 µm vakuum filtersystem.
2. före inokulum och inokulum
- Ta bort mikroorganism C. albicans SN425 från −80 ° C frysen och låt den Tina i rumstemperatur. Utsäde 10 µL av den lagerhållna odlingen på petriskålar som innehåller SDA kompletteras med kloramfenikol (50 mg/L). Inkubera i petriskålar aerobt vid 37 ° C för 48 h.
- Efter 48 h för inkubation, lägga till 10 kolonier av C. albicans 10 ml av jäst kväve bas (YNB) medium kompletteras med 100 mM glukos och inkubera aerobt vid 37 ° C i 16 h för det före inokulatet.
- Efter inkubation för 16 h, förbereda inoculums genom att späda ut kulturerna som förrätt till färska YNB medium kompletteras med 100 mM glukos i en 1:10 andel (1 mL av förrätt kultur utspätt i 9 mL YNB). Mät den första optiska densiteten (OD) vid 540 nm.
- Inkubera i inoculums aerobt vid 37 ° C i 8 h tills stammarna når mitten av log tillväxtfasen och mäta den slutliga OD vid 540 nm. Subtrahera den slutliga OD från inledande OD att kontrollera om OD av inoculums är på mitten av stocken tillväxtfasen (8 h, baserat på tillväxtkurvorna i figur 1).
- För att nå ett inokulum med 107 celler mL-1, Centrifugera inokulatet för 5 min vid 5 500 x g, avlägsna supernatanten och koncentrera inokulatet till hälften av volymen av rören.
3. Biofilm bildning och ljusterapi
- Tillsätt 1 mL av inokulatet till brunnarna av en 24-väl polystyren plattan. Inkubera aerobt vid 37 ° C i 90 min tillåta celladhesion till botten av brunnarna.
- Använda ett icke-koherent rött ljus (se Tabell för material) som ljuskälla med våglängd 635 ± 10 nm och en fast uteffekt av 1 460 mW cm−2.
- Använd en kraftmätare som mäter Drivatätheten av ljuset. Den strålningsenergi som tillämpas är 87,6 J cm-2, motsvarande ca 1 min exponering. Använd formel energitäthet (J/cm2) = effekttäthet (W/cm2) x bestrålning tid (s). Applicera ett avstånd av 5 mm mellan ljuskällan och biofilmen att undvika uppvärmningen provet.
- Behandla den positiva kontrollen biofilmer med 0,12% klorhexidin för 1 min och negativ kontroll biofilmer med 0,89% NaCl för 1 min.
- Efter behandlingar, tvätta alla biofilmer två gånger med 0,89% NaCl-lösning.
- Tillsätt 1 mL RPMI 1640 buffras med 3-(N-morpholino) propanesulfonic syra (moppar) vid pH 7 till biofilmer och inkubera plattorna vid 37 ° C under natten.
- På morgonen, tillämpa samma behandlingar som steg 3.2 – 3.6, tvätta biofilmer två gånger med 0,89% NaCl, lägga till nya RPMI buffras med moppar (1 mL, pH 7) till brunnarna och inkubera aerobt vid 37 ° C.
- På samma dag, efter 6 h, exponera biofilmer till rött ljus. Behandla den positiva kontrollen biofilmer med 0,12% klorhexidin för 1 min och negativ kontroll biofilmer med 0,89% NaCl för 1 min. Efter behandlingar, tvätta biofilmer två gånger med 0,89% NaCl-lösning.
- Upprepa steg 3,2-3,8 tills att uppnå 48 h biofilm utveckling.
Obs: I princip, en behandling som kommer att hända på morgonen och den andra en kommer att hända på eftermiddagen samma dag (6 h apart).
4. behandling
- Tillsätt 1 mL steril 0,89% NaCl till brunnen för att ta bort biofilmen genom att skrapa det från väl med en pipettspetsen. Lägga till den borttagna biofilmen i ett sterilt rör.
- Lägg till ytterligare 1 mL steril 0,89% NaCl till brunnen. Skrapa det igen och lägga till suspensionen i en och samma tub för en total volym på 2 mL.
- Kolonibildande enheter (CFU)
- Kraftfullt vortex biofilm suspensionen för 1 min. Från biofilm fjädringen, att använda en alikvot av 0,1 mL för seriell utspädning.
- Späd den biofilm avstängning från 10-1 till 10-4 i 0,89% NaCl-lösning.
- Utsäde 50 μL av varje spädning till SDA plattor och inkubera plattorna vid 37 ° C för 48 h.
- Räkna kolonierna och applicera den formeln CFU/mL = antal kolonier x 10n / q (n = utspädning; q = seedade volym).
- Torr vikt
- Väga och etiketten mikrocentrifugrör.
- Från biofilm fjädringen, använda 0,1 mL för torrvikt (biomassa) beslutsamhet.
- Tillsätt 1 mL absolut etanol till en alikvot av 0,1 mL av biofilmer och förvara den vid-20 ° C i 18 h. Efter 18 h, Centrifugera 10 000 x g i 10 min.
- Tag bort supernatanten, placera rören på exsickator torka proverna i en vecka och väga mikrocentrifugrör igen.
-
Vattenlösliga polysackarider (WSPs) och lösliga i alkali polysackarider (ASP)
- Från biofilm suspensionen kraftigt vortex resten av volymen (1,8 mL) för 1 min och centrifugera vid 5 500 × g under 10 minuter vid 4 ° C. Lagra supernatanten i en ny tub och Tvätta fällningen två gånger med celler, som innehåller olösliga beståndsdelar som ingår i den extracellulära Matrixen med Sterilt ultrarent vatten (5 500 × g, 10 min vid 4 ° C).
- Återsuspendering olösliga innehållet på 1,8 mL Sterilt ultrarent vatten.
- Vattenlösliga polysackarider (WSPs)
Obs: Utföra detta experiment på dragskåp.- Från lagrade supernatanten, reservera 1 mL för kvantifiering av vattenlösliga polysackarider (WSPs).
- Homogenisera lagrade supernatanten för 1 min. Sedan överföra till sterila tuber och lägga till 2,5 volymer av 95% etanol. Förvara rören för 18 h vid-20 ° C för WSPs nederbörd.
- Efter 18 h, Centrifugera rören vid 9500 x g i 20 min vid 4 ° C. Efter centrifugering, kassera supernatanterna.
- Tvätta av prov tre gånger med 75% etanol och lufttorka pellets. Resuspendera pelleten med 1 mL Sterilt ultrarent vatten och kvantifiera de WSP med fenol-sulfuric syra metoden.
- Använda 0,1% glukos (0,01 g glukos 10 ml av ultrarent vatten) för standardkurvan (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 och 25 µL av glukos per rör).
- Tillsätt 200 µL 5% fenol (2,7 mL 90% fenol till 47,3 mL ultrarent vatten) i ett glasrör som bestående av 200 µL av provet eller standardkurvan peka (i tre exemplar per prov) och blanda försiktigt.
- Tillsätt 1 mL svavelsyra till röret och blanda. Vänta 20 min för reaktionen och mäta prover med en spektrofotometer (490 nm).
- Lösliga i alkali polysackarider (ASP)
Obs: Utföra detta experiment i dragskåp.- Från det olösliga åter svävande beloppet, separat 1 mL för bestämning av antisocial personlighetsstörning. Centrifugera i alikvoter i varje biofilm suspension (13 000 x g, för 10 minuter vid 4 ° C).
- Ta försiktigt bort supernatanten i varje rör. Placera sedan proverna på en vakuum koncentrator torka pellets.
- Väga pelletsen och tillsätt 300 µL av 1 N NaOH (2 g NaOH till 50 mL ultrarent vatten) per 1 mg räknat på torr vikt. Inkubera dem i 2 h vid 37 ° C och sedan Centrifugera 13.000 × g i 10 min.
- Försiktigt samla supernatanterna med pipett och överföring till mikrocentrifugrör, upprätthålla pelleten.
- Återigen, tillsätt en motsvarande volym av 1 N NaOH till rören bestående av pellets, och upprepa samma steg som ovan för utvinning av ASP.
- Efter inkubation i 2 h, Centrifugera proverna (13 000 x g i 10 min), noggrant samla supernatanterna och lägga till tidigare insamlade supernatanterna.
- För den tredje utvinningen, upprepa samma steg som ovan, men den här gången, inte Inkubera proverna för 2 h innan centrifugering.
- Efteråt, Lägg till tre volymer av 95% etanol i varje prov. Sedan, lager proverna vid −20 ° C i 18 h för utfällning av ASP.
- Centrifugera rören (9 500 × g i 20 min vid 4 ° C) och kassera supernatanterna.
- Tvätta varje pellet tre gånger med 75% etanol och lufttorka (samma förfaranden gjorde för WSP). Återsuspendering pellets i lika total volym av första extraktionen med 1 N NaOH.
- Läs proverna för kvantifiering av ASP med hjälp av fenol-svavelsyra (samma som för WSP analys).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar resultaten av Log10 CFU/mL av C. albicans efter traktamente behandlingar med rött ljus för 1 min. Red light reducerade signifikant den Log10 CFU/mL jämfört med NC (p = 0,004). Figur 3 presenterar resultaten av biomassa (mg) av C. albicans biofilmer efter dagliga behandlingar. Alla behandlade grupperna visade minskning av biomassa jämfört med NC (p = 0.000) och den röda lampan behandlade grupperna presenterade likartad minskning av biomassa till som observerats i datorn. Figur 4 och figur 5 visar sämre belopp för C. albicans EPS-lösliga och olösliga i EPS i PC jämfört med NC (p = 0.000). Även om inte statistiskt signifikanta, traktamente tillämpningen av rött ljus för 1 min till C. albicans biofilmer numeriskt minskade mängden EPS-lösliga och olösliga i EPS.
Figur 1 . Tillväxtkurvan för C. albicans stam SN 425. Plankton kultur gjordes i YNB medium kompletteras med 100 mM av glukos och inkuberas vid 37 ° C. Den optiska densiteten (OD vid 540 nm) och Log10 CFU/mL bestämdes över tid. Standardavvikelse visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Elak och standard avvikelser av Log10 CFU/mL av C. albicans. Bedömningar gjordes mellan behandling med rött ljus två gånger om dagen och controls-0.12% CHX (PC) och 0,89% NaCl (NC). Lika bokstäver representerar statistiska likhet mellan grupperna (p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Elak och standard avvikelser i torr vikt (mg) av C. albicans. Bedömningar gjordes mellan behandling med rött ljus två gånger om dagen och controls-0.12% CHX (PC) och 0,89% NaCl (NC). Lika bokstäver representerar statistiska likhet mellan grupperna (p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Elak och standard avvikelser av EPS-lösliga uppgå i C. albicans biofilm (µg/mg torr-Weight). Jämförelser gjordes mellan behandling med rött ljus två gånger om dagen och controls-0.12% CHX (PC) och 0,89% NaCl (NC). Lika bokstäver representerar statistiska likhet mellan grupperna (p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Elak och standard avvikelser av EPS-olöslig innehåll i C. albicans biofilm (µg/mg torr-Weight). Bedömningar gjordes mellan behandling med rött ljus två gånger om dagen och controls-0.12% CHX (PC) och 0,89% NaCl (NC). Lika bokstäver representerar statistiska likhet mellan grupperna (p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigaste stegen för framgångsrik odling av C. albicans biofilm är: 1) att göra det före inokulatet och inokulatet i YNB medium kompletteras med 100 mM glukos; (2) att vänta 90 min för fasen vidhäftning och noggrant tvätta två gånger brunnarna med 0,89% NaCl att avlägsna icke-följs celler; och 3) lägga till RPMI medium till klibbade cellerna att starta biofilm bildning, eftersom RPMI kommer att stimulera hyfer tillväxten. Aneuploidies kan uppstå när odling C. albicans. Det är därför viktigt att inte använda kolonier som är mer än sju dagar gamla, inte att lagra plattor vid 4° C och inte åter strimma celler från befintliga plattor. Jämväl, stammar bör användas före 18 timmar över natten tillväxt13.
En studie begränsning är att det utfördes in vitro. Samtidigt in vitro-studier har kraftigt ökat förståelsen av biologin av biofilm, utgör de inte just förhållandena in vivo14. In vitro-tester ger dock hög genomströmning screening förutom att vara en billig och enkel metod14 att besvara frågor om nya antimikrobiella terapier. Att välja rätt kultur media för varje fas av biofilm utveckling är ett viktigt steg för att lyckas med metoden. RPMI 1640 är ett näringsrikt medium som har aminosyror och simulerar sammansättningen av mänskliga vätskor15. RPMI 1640 innehåller L-glutamin, L-arginin, L-asparagin förutom vitaminer och oorganiska salter. YNB media har dock en förhöjd mängd glukos (18 g/L) jämfört med RPMI 1640 medium (2 g/L glukos). Hög glukosinnehållet har beskrivits för att öka plankton tillväxten av Candida arter16. Däremot hjälper förekomsten av högre koncentrationer av aminosyror biofilm tillväxt i RPMI medium jämfört YNB medium16. Kvalitativa data tillämpning SEM micrographs visade att strukturella utformningen av C. albicans biofilmer i RPMI presenterar en komplex organisation med en stadig tillväxt av jäst med ramifying hyfer, spirande element och knopp ärr med en riklig extracellulär matrix16. Sådana resultat är förenliga med en tidigare studie som rapporterade att RPMI 1640 augmented hyphal bildandet i C. albicans biofilmer15. Dessa resultat visar skillnaderna i substratutnyttjande av Candida i hela olika biofilm tillväxtfaser och visar vikten av att förändra media under plankton tillväxt och biofilm bildning.
Valet av rätt temperatur och pH att odla C. albicans biofilmer är också viktigt att utföra metoden med adekvat bildandet av hyfer. C. albicans åtar sig omvandlingen från blastospores till filament reaktion på förhållanden som efterliknar miljön däggdjur värd vävnader17. Dessa villkor innebär växande vid kroppstemperatur (37 ° C) och vid neutralt pH17, och detta är skälet till varför RPMI medium pH justeras till 7.
De metoder som tillämpas i denna studie är betydande eftersom biofilmer av C. albicans SN 425 präglades innan12, visar för att ha stora mängder EPS-lösliga och -olösliga, vilket gör det en tillförlitlig metod för att analysera resultatet av lamporna på de extracellulära polysackarider. Dessutom samma icke-koherent ljus enhet tillämpas i experimenten tillämpades till bakteriell plankton suspensioner18 och biofilmer9, och den största fördelen med denna enhet är minskningen av behandlingstid, vad gör den enheten mer genomförbart för kliniska tillämpningar18. Analysen av dagliga ljusbehandling tillämpas på C. albicans biofilmer är betydande eftersom den metod som tillämpas i den aktuella studien simulerar en behandling som är snabbt och enkelt kan göras av patienten i hemmet.
Rött ljus daglig behandling minskade meaningfully C. albicans mikroorganismer greve och biofilm biomassa. Fler studier kanske prova en kombination av behandlingar, börjar med ljusterapi och senare tillämpa topikal antimykotisk. Denna strategi kan hjälpa disorganizing extracellulärmatrix skärmning C. albicans biofilm, tillåter bättre drog infiltration genom biofilmen att nå och slutligen utrota C. albicans celler. Med tanke på begränsningarna av detta in vitro-experiment, får användningen av rött ljus för 1 min bistå som ett adjuvans för att ämnet antimykotika för behandling av oral candidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Paula da Silveira, Dr Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr Malvin N. Janal och Dr. Iriana Zanin för utvecklingen av denna studie. Vi erkänner också Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) för att donera den stam som analyseras i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
