Summary
यह अक्सर सुसंस्कृत कोशिकाओं पर यौगिकों का एक सेट की क्षमता cytotoxicity का आकलन करने के लिए आवश्यक है. यहाँ, हम मज़बूती से एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप में विषाक्त यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक रणनीति का वर्णन.
Abstract
Cytotoxicity एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि जब दवाओं है कि चिकित्सीय लाभ हो सकता है का अध्ययन करने की मात्रा निर्धारित करने की जरूरत है. इस वजह से, कई दवा स्क्रीनिंग assays महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक के रूप में cytotoxicity का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत यौगिकों के लिए profiled. संस्कृति में कोशिकाओं को और अधिक महंगा और श्रम गहन पशु मॉडल में आशाजनक नेतृत्व यौगिकों पर अनुवर्ती कार्यवाही से पहले cytotoxicity का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल हैं. हम यौगिकों कि मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) लाइन व्यक्त tdTomato में सेल विकास को प्रभावित की पहचान करने के लिए एक रणनीति का वर्णन. रणनीति सेल संख्या का आकलन करने के लिए दो पूरक assays का उपयोग करता है. एक परख 3 की कमी के माध्यम से काम करता है-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी) सेल नंबर के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में formazan और अन्य सीधे tdTomato NSCs व्यक्त मायने रखता है. दो परख एक ही प्रयोग में एक साथ प्रदर्शन किया जा सकता है और श्रम गहन नहीं कर रहे हैं, तेजी से, और सस्ती. इस प्रदर्शन में वर्णित रणनीति एक 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में विषाक्तता के लिए एक अन्वेषणात्मक प्राथमिक स्क्रीन में 57 यौगिकों का परीक्षण किया. हिट के तीन प्राथमिक स्क्रीन के रूप में एक ही परख सेट अप का उपयोग कर एक छह सूत्री खुराक प्रतिक्रिया में आगे विशेषता थी. विषाक्तता के लिए उत्कृष्ट पुष्टि प्रदान करने के अलावा, दो assays से परिणामों की तुलना सेल विकास के अन्य पहलुओं को प्रभावित यौगिकों की पहचान करने में प्रभावी हो सकता है.
Introduction
सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक है कि एक रासायनिक यौगिक है कि चिकित्सकीय क्षमता है के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए पशु कोशिकाओं के लिए अपनी विषाक्तता है. यह विशेषता निर्धारित करेगा कि क्या एक दवा अधिक व्यापक अध्ययन के लिए एक अच्छा उम्मीदवार है. ज्यादातर मामलों में, कम से कम विषाक्तता के साथ यौगिकों की मांग कर रहे हैं, लेकिन वहाँ स्थितियों में विशिष्ट सेल प्रकार को मारने की क्षमता के साथ एक यौगिक ब्याज की है, जैसे, विरोधी tumorigenic दवाओं. हालांकि पूरे जानवरों प्रणालीगत विषाक्तता निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल प्रणाली रहे हैं, लागत और श्रम शामिल निषिद्ध है जब कुछ यौगिकों से अधिक का परीक्षण करने की आवश्यकता है. इस प्रकार स्तनधारी कोशिका संवर्धन का प्रयोग सामान्यतः सबसे कुशल विकल्प1,2के रूप में किया जाता है . छोटे से मध्यम थ्रूपुट दवा स्क्रीन एक महत्वपूर्ण मोडलिटी है जिसके माध्यम से सेल संस्कृति में विषाक्तता का मूल्यांकन किया जा सकता है। इन स्क्रीन व्यक्तिगत संकेतन रास्ते को लक्षित एनोटेट पुस्तकालयों पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तरह के एक स्क्रीन के सामान्य प्रारूप शुरू में एक ही खुराक पर पुस्तकालय में सभी यौगिकों का परीक्षण करने के लिए है (आम तौर पर 10 $M) एक खोजात्मक प्राथमिक विषाक्तता स्क्रीन में, और फिर एक में गहराई से माध्यमिक खुराक प्रतिक्रिया स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए पूरी तरह से विषाक्तता की विशेषता प्राथमिक स्क्रीन से हिट की प्रोफ़ाइल. तरीकों को इस रणनीति को लागू करने के लिए यहाँ वर्णित किया जाएगा और एक त्वरित प्रदान, कुशल, और सस्ती तरीका की पहचान करने और विषाक्त यौगिकों की विशेषता.
स्तनधारी कोशिकाओं3,4 में छोटे यौगिकों और नैनो सामग्री की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए अनेक विधियां विकसित की गईहैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ सामग्री भ्रामक परिणाम प्रदान करने परख के साथ बातचीत कर सकते हैं, और इस तरह के बातचीत का परीक्षण किया जाना चाहिए जब विषाक्तता स्क्रीन से हिट विशेषता4. Cytotoxicity परख में शामिल हैं trypan नीले बहिष्करण5, लैक्टेट dehydrogenase (LDH) रिलीज परख6, Alamar नीले परख7, calcien acetoxyethyl एस्टर (AM)8, और एटीपी परख9. इन सभी assays सेल चयापचय जो सेल संख्या के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते हैं के विभिन्न पहलुओं को मापने. जबकि सभी प्रदान लाभ, टेट्राज़ोलियम नमक-आधारित परख जैसे 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (एमटीटी), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H--ly-olium-5-carboxide-4, आयोडोफेनिल[-2-[4-निट्रोफेनिल]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonet (WST-1)10,11 अच्छी सटीकता प्रदान करते हैं और कम लागत पर उपयोग में आसानी। एमटीटी, जो इस प्रदर्शन में इस्तेमाल किया जाएगा, एक mitochondrial रिडक्टस द्वारा एक अघुलनशील formazan के लिए कम है और इस रूपांतरण की दर सेल संख्या के साथ दृढ़ता से संबंधित है. इस परख का उपयोग छोटे पैमाने पर और 2,000 यौगिकों12तक की जांच पुस्तकालयों के लिए नियमित रूप से किया जाता है . एक लेबल मार्कर द्वारा कोशिकाओं की प्रत्यक्ष गिनती सेलुलर संख्या का आकलन करने के लिए एक और विधि प्रदान करता है, और MTT परख के विपरीत यह सेलुलर विकास की गतिशीलता के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं. कई सार्वजनिक रूप से उपलब्ध एल्गोरिदम स्वचालित सेल गिनती विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध हैं और वहाँ भी स्वामित्व एल्गोरिदम कि इमेजिंग पाठकों के लिए सॉफ्टवेयर संकुल का हिस्सा हैं13,14. इस विधि विवरण में, एक मानव तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) लाइन है कि आनुवंशिक रूप से संविधान के लिए संपादित किया गया है tdTomato15 एक परीक्षण लाइन के रूप में काम करने के लिए एक MTT परख और एक स्वचालित सेल गिनती के बीच सेलुलर व्यवहार्यता परिणामों की तुलना करेंगे 57 परीक्षण यौगिकों की विषाक्तता का आकलन एक स्क्रीन में परख. हालांकि इस रणनीति का प्राथमिक लक्ष्य की पहचान करने और विषाक्त यौगिकों की विशेषता थी, यह संभावित विकास निरोधात्मक और विकास बढ़ाने यौगिकों की पहचान करने के अतिरिक्त लाभ है और इस प्रकार दवाओं की पहचान करने के लिए एक प्रभावी विधि प्रदान करता है कि सेलुलर विकास modulate कर सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. एनएससी संस्कृति
नोट: एक मानव एनएससी लाइन के हेरफेर नीचे वर्णित किया जाएगा, लेकिन किसी भी सेल लाइन इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सभी सेल संस्कृति काम एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है.
- तहखाने झिल्ली के साथ एक 96 अच्छी तरह से प्लेट कोट /
- ईसीएम(सामग्री की तालिका)का थाव अलीकोट , जो बर्फ पर एनएससी के लगाव की सुविधा प्रदान करेगा। 10 एमएल आधार माध्यम (सामग्री की सारणी)में उपयुक्त सांद्रता (सामान्यत: 1:100) को निरूपित करें तथा 96-कूप प्लेट के 60 आंतरिक कुओं में से प्रत्येक के लिए 50 डिग्री सेल्सियल प्रति अच्छी तरह से जोड़ें (चित्र 1)। केवल आंतरिक 60 कुओं का उपयोग कलाकृतियों कि किनारे प्रभाव16से परिणाम हो सकता है से बचने के लिए .
- प्लेट को कमरे के तापमान पर या सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2) में कम से कम 30 मिनट के लिए बैठने दें।
- अलग और प्लेट तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं.
नोट: इस विधि में उपयोग के लिए कोशिकाओं को एक T75 फ्लास्क में कम से कम 80% संगम के लिए विकसित किया जाना चाहिए.- आधार माध्यम, B27, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 2 m M glutamine, और 10 ng/mL बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (FGFb या FGF2) से बना है कि एनएससी माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 में एक टी 75 फ्लास्क में एक T75 फ्लास्क में संस्कृति कोशिकाओं।
- इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को निकालें एक बार वे 80% संगम तक पहुंच जाते हैं और एनएससी माध्यम से प्रेरित होते हैं। सेल वियोजन अभिकर्मक की एक उचित राशि जोड़ें (3 एक T75 फ्लास्क के लिए एमएल; सामग्री की तालिका) और इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, सभी कोशिकाओं को अलग हो जाना सुनिश्चित करने के लिए T75 फ्लास्क और पिपेट में एनएससी माध्यम के 7 एमएल जोड़ें जोरदार। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर 15 एमएल ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए अलग किए गए सेल समाधान को स्थानांतरित करें।
- अपकेंद्रण के बाद, ट्यूब से सुपरनेट को हटा दें और एनएससी माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से भर दें और कोशिकाओं की गणना करें।
- एनएससी माध्यम के साथ 200,000 कोशिकाओं/एमएल के लिए कोशिकाओं की एकाग्रता को फिर से समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को पूरी तरह से कुओं में सजातीय चढ़ाना के लिए फिर से निलंबित कर रहे हैं।
- तीन 96-वेल प्लेटों के 60 आंतरिक कुओं में सेल मिश्रण (20,000 कोशिकाओं) की प्लेट 100 डिग्री सेल्सियस जिसे अनुभाग 1.1 में वर्णित के रूप में लेपित किया गया है। प्लेट सेल कॉलम-दर-स्तंभ के लिए एक 8-चैनल मल्टीचैनल पाइपेटर के आठ स्लॉट में से छह का उपयोग करें।
- बाह्यतम कुओं से संभावित वाष्पीकरण को कम करने के लिए कोशिकाओं के बिना सभी कुओं में 100 डिग्री सेल्सियस आधार माध्यम या एनएससी माध्यम जोड़ें।
- एक सेल संस्कृति माइक्रोस्कोप के तहत, नेत्रहीन तीन 96 अच्छी प्लेटों में से प्रत्येक पर कम से कम 10 कुओं का निरीक्षण करने के लिए पुष्टि करें कि कोशिकाओं की उम्मीद घनत्व पर बीज रहे हैं. परख के साथ आगे बढ़ना नहीं है अगर कोशिकाओं को एक घनत्व भी विरल या घने पर चढ़ाया जाता है.
2. यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज
नोट: इस प्रदर्शन में परीक्षण घर का बना पुस्तकालय यौगिकों कि wingless/integrated (Wnt), रेटिनोइक एसिड, विकास कारक-बीटा (TGF-जेड) को बदलने, और ध्वनि हाथी संकेतन रास्ते के साथ ही tyrosine kinases की एक किस्म शामिल हैं।
-
विषाक्तता के लिए अन्वेषणात्मक प्राथमिक स्क्रीन /
- अलीकोट 50 डिग्री 100 एमएल अप करने के लिए 57 परीक्षण यौगिकों (पूरक तालिका 1) में 10 लाख की एकाग्रता पर 10% dimethyl suloxide (DMSO) एक यू-नीचे के आंतरिक 60 कुओं में, वी नीचे या गोल नीचे 96-अच्छी प्लेट के साथ तीन DMSO कुओं के साथ एक नियंत्रण के रूप में (देखें चित्र 1 प्लेट मानचित्र के लिए). यह मास्टर यौगिक प्लेट के रूप में काम करेगा जिसमें 25 डिग्री सेल्सियस यौगिक है जिसे जमे हुए और कई बार थके हुए किया जा सकता है।
नोट: फ्लैट तली प्लेटों का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि बेंच टॉप पाइपेटर के साथ उनके पास से यौगिकों की छोटी मात्रा को उत्तेजित करना अधिक कठिन होगा। - धारा 1 में वर्णित के रूप में विभाजित करने के बाद इनक्यूबेटर 16-24 एच से सेल कल्चर प्लेट्स निकालें और आठ मल्टी-वेल स्लॉट के केवल छह का उपयोग करके 8 चैनल मल्टी-वेल पाइपेटर के साथ एनएससी माध्यम कॉलम-बाय-कॉलम बंद करें। तीन प्रतिकृति प्लेटों में से प्रत्येक में कोशिकाओं के लिए ताजा एनएससी माध्यम के 95 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और प्लेटों को वापस इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि नीचे चरण 2.1.4 पूरा नहीं हो जाता है।
- एक खाली यू-बॉटम, वी-बॉटम या गोल-नीचे 96-वेल प्लेट के प्रत्येक आंतरिक 60 कुओं में से प्रत्येक के लिए एनएससी माध्यम के 49 डिग्री सेल्सियस जोड़ें एक 8 चैनल मल्टी-वेल पाइपेटर के साथ। मास्टर कंपाउंड प्लेट को खोल दें और प्रत्येक आंतरिक 60 कुओं में एनएससी माध्यम के 49 डिग्री एल में मास्टर प्लेट से पिपेट 1 डिग्री सेल्सियस यौगिक के लिए एक बेंच टॉप पाइपेटर या समकक्ष उपकरण का उपयोग करें।
- बेंच शीर्ष pipettor के साथ पतला यौगिक 3x मिक्स.
- इनक्यूबेटर से एनएससी की तीन 96-वेल प्लेटों को निकालें, बेंच टॉप पाइपेटर के साथ प्रत्येक पतला यौगिक के पिपेट 15 डिग्री एल और तीन प्लेटों में से प्रत्येक में यौगिक के 5 डिग्री एल एलिकोट वितरित करें।
नोट: यह 1:20 प्रारंभिक के साथ संयोजन में कोशिकाओं में यौगिक के कमजोर पड़ने 2.1.3 कदम में कमजोर पड़ने एक 1:1000 कमजोर पड़ने ऐसी है कि एनएससी पर यौगिकों की अंतिम एकाग्रता हो जाएगा 10 डिग्री एक DMSO एकाग्रता के साथ 0.1% और अंतिम DMSO नियंत्रण के लिए एकाग्रता 0.1% हो जाएगा. - 72 ज के लिए यौगिक के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं और cytotoxicity परख के साथ आगे बढ़ना. कम अंतराल का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक 72 घंटे ऊष्मायन अवधि परीक्षण यौगिकों के संभावित cytotoxic प्रभाव को अधिकतम करना चाहिए.
- अलीकोट 50 डिग्री 100 एमएल अप करने के लिए 57 परीक्षण यौगिकों (पूरक तालिका 1) में 10 लाख की एकाग्रता पर 10% dimethyl suloxide (DMSO) एक यू-नीचे के आंतरिक 60 कुओं में, वी नीचे या गोल नीचे 96-अच्छी प्लेट के साथ तीन DMSO कुओं के साथ एक नियंत्रण के रूप में (देखें चित्र 1 प्लेट मानचित्र के लिए). यह मास्टर यौगिक प्लेट के रूप में काम करेगा जिसमें 25 डिग्री सेल्सियस यौगिक है जिसे जमे हुए और कई बार थके हुए किया जा सकता है।
-
खुराक प्रतिक्रिया परख
नोट: खुराक-प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले 96-वेल के लिए सेट-अप चित्र 2 में प्रदर्शित होता है।- छह DMSO नियंत्रण प्रतिकृति और दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने पर तीन अलग अलग यौगिकों के परीक्षण triplicates के लिए कॉलम 2 का उपयोग करें छह खुराक पर 10 डिग्री सेल्सियस की एक उच्च खुराक के साथ शुरू.
- एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में एनएससी माध्यम के 196 डिग्री सेल्सियस में DMSO या परीक्षण परिसर के 4 डिग्री एल को विलेय। B2-G2 से कुओं के कॉलम में DMSO के 25 डिग्री एल और परीक्षण यौगिकों के 50 डिग्री सेल्सियस B3-B11 से पंक्ति के लिए तीन परीक्षण यौगिकों के साथ जोड़ें 10 m triplicates में पंक्तियों में B3-B5, B6-B8, और B9-B11.
- 96-वेल प्लेट के आंतरिक भाग में शेष खाली स्तंभों के लिए एनएससी माध्यम के पिपेट 25 डिग्री सेल्सियस। एक मल्टीचैनल पाइप्टोर के साथ कुओं B3-B11 से यौगिक के 25 डिग्री एल निकालें, कुओं C3-C11 में जोड़ें, और कम से कम पांच बार मिश्रण. यौगिकों में से प्रत्येक के लिए छह खुराक की कुल के लिए दो गुना कमजोर पड़ने पर triplicates उत्पन्न करने के लिए शेष पंक्तियों के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ.
- अनुभाग 2.1 में प्राथमिक स्क्रीन के लिए वर्णित बिल्कुल के रूप में खुराक प्रतिक्रिया के लिए एनएससी उत्पन्न. खुराक प्रतिक्रिया के लिए यौगिकों को जोड़ा जाता है और कोशिकाओं पर बिल्कुल के रूप में चरण 2.1.5 और 2.1.6 में वर्णित पर incubated.
नोट: खुराक प्रतिक्रिया परख के तीन जैविक प्रतिकृतियां अलग-अलग दिनों में अलग-अलग मार्गों पर एनएससी पर परख दोहराकर की जाती हैं।
3. एक प्लेट रीडर पर कोशिकाओं इमेजिंग
- कोशिकाओं को आवंटित समय के लिए यौगिकों के साथ इनक्यूबेट किए जाने के बाद, प्रति अच्छी तरह से पूर्व उपचार सेल संख्या निर्धारित करने के लिए प्लेट रीडर पर छवि कोशिकाओं।
नोट: इमेजिंग कोशिकाओं के लिए निर्देश पाठक-विशिष्ट हैं, लेकिन आम तौर पर एक समान रणनीति का पालन करें. नीचे दिए गए निर्देश इस प्रदर्शन में प्रयुक्त पाठक पर लागू होते हैं (सामग्री की तालिका)। - इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और इसे प्लेट रीडर के अंदर रखें। अध्ययन के लिए प्रोटोकॉल और प्रयोग फ़ाइलें सेट करने के लिए इमेजर सॉफ़्टवेयर खोलें. कार्य प्रबंधक पर Imager मैनुअल मोड पर जाएँ और अब कैप्चर करें क्लिक करें...|
- पोत प्रकार के रूप में 96 अच्छी तरह से प्लेट चुनें, आवर्धन के लिए 10x का चयन करें, और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) 531 और इमेजिंग tdTomato के लिए 593. एक अच्छी तरह से उठाओ, तो छवि ध्यान केंद्रित करने के लिए Autofocus क्लिक करें, और ऑटो प्रदर्शन उचित जोखिम समय के लिए. मैन्युअल रूप से ध्यान और जोखिम को समायोजित अगर जरूरत है.
- एक बार उचित ध्यान और जोखिम प्राप्त किया गया है, तस्वीर पर कब्जा करने के लिए कैमरा आइकन पर क्लिक करें. फिर प्रोटोकॉल का निर्माण जारी रखने के लिए छवि के ऊपर PROCESS/ANALZYE क्लिक करें और ANALYSIS टैब का चयन करें।
- छवि के दाईं ओर विश्लेषण जोड़ें चरण में सेलुलर विश्लेषण क्लिक करें और प्रारंभ करें क्लिक करें. छवि प्रत्येक व्यक्तिगत कक्ष को इंगित करने के लिए हाइलाइट किए गए कक्ष दिखाएगा. विकल्प चयन को फ्लोरोसेंट थ्रेशोल्ड या कक्ष आकार के आधार पर बेहतर चयन कक्षों के लिए पैरामीटर ्स्वइन करने के लिए क्लिक किया जा सकता है. यदि इमेजर कक्षों की ठीक से गणना कर रहा है, तो स्क्रीन के निचले भाग पर चरण जोड़ें क्लिक करें.
- चित्र सेट से प्रयोग बनानेके लिए स्क्रीन के शीर्ष पर स्थित आइकन पर क्लिक करें, जो प्रयोग के साथ एक विंडो खोलेगा. एक बार खुलने के बाद, प्रोटोकॉल टैब के अंतर्गत प्रक्रिया क्लिक करें और नई विंडो में जो खुलती है वह पठनका चयन करती है, फिर नई विंडो में केवल 60 कुओं का चयन करने के लिए पूर्ण प्लेट क्लिक करें जिसमें कक्ष (B2... G11). परिवर्तनों को सहेजने के लिए ठीक क्लिक करें, फिर प्रक्रिया विंडो में ठीक क्लिक करें.
- प्लेट अब इस प्रोटोकॉल द्वारा छवि की जा सकती है और प्रयोगात्मक फ़ाइल बचाया जा सकता है. प्लेट को चलाने के लिए Play आइकन पर क्लिक करें. एक बार पहली प्लेट की छवि है, अन्य दो प्लेटें छवि. इमेजिंग के पूरा होने पर, विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए सेल गिनती डेटा डाउनलोड करें। 10x आवर्धन पर सभी छवियों को ले लो.
4. टर्मिनल एमटीटी साइटोटॉक्सिसिटी परख
नोट: tdTomato इमेजिंग पूरा करने के दो घंटे के भीतर एमटीटी परख शुरू करें।
- 25 मिलीग्राम एमटीटी का वजन करके 5 mg/mL MTT स्टॉक समाधान करें और इसे एनएससी माध्यम के 5 एमएल में पुन: जमा करें। समाधान भंवर जब तक वहाँ MTT, जो कई मिनट लग सकते हैं की कोई दिखाई precipitates हैं.
- इनक्यूबेटर से सेल कल्चर प्लेट्स निकालें और सेल कल्चर मीडियम को बंद करें। सेल संस्कृति माध्यम में MTT 1:10 को पतला करें और कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
- 2 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं। कुएं में कोशिकाओं की संख्या के अनुपात में एक बैंगनी वेग मोटे तौर पर दिखाई देना चाहिए। या तो प्लेट से एमटीटी समाधान को प्रेरित करें या प्लेट से समाधान को जल्दी से फ़्लवर्ट करें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100% DMSO के 50 डिग्री एल जोड़ें और 400 आरपीएम पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों हिला। एक प्लेट रीडर में 595 एनएम पर प्रत्येक अच्छी तरह से अवशोषण पढ़ें और विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा निर्यात.
5. डेटा विश्लेषण
- उपयुक्त सॉफ्टवेयर (वाणिज्यिक स्प्रेडशीट, आर) के साथ tdTomato सेल मायने रखता है और अवशोषण का एक विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं। अवशोषण या तीन DMSO के सेल गिनती के लिए औसत की गणना सामान्यीकरण प्रयोजनों के लिए प्रत्येक प्लेट पर प्रतिकृति करता है, तो सेल मायने रखता है या इस औसत से थाली पर प्रत्येक के लिए अवशोषण के लिए मूल्य विभाजित और एक प्रतिशत में परिवर्तित. यह प्रत्येक प्लेट के लिए DMSO नियंत्रण के सापेक्ष सामान्यीकृत सेल गिनती या अवशोषण पैदावार.
- तीन प्लेटों पर कुओं को दोहराने के लिए माध्य सामान्यीकृत गणना या अवशोषण तथा मानक विचलन की गणना कीजिए।
नोट: इस बिंदु पर सामान्यीकृत मूल्यों के चार अलग अलग सेट होना चाहिए: प्लेटों में से प्रत्येक के लिए एक और एक तीन प्रतिकृति प्लेटों के लिए मतलब है. - रूढ़िवादी हो सकता है और पर या नीचे एक सामान्यीकृत मूल्य का उपयोग करें 25% तीन प्रतिकृति प्लेटों भर में औसत के लिए विषाक्त के रूप में एक यौगिक वर्गीकृत करने के लिए. इसके अलावा, क्योंकि प्रत्येक प्लेट पर केवल एक ही उपचार प्रति उपचार किया जाता है, केवल लेबल यौगिकों कि विषाक्त के रूप में सभी तीन दोहराने प्लेटों पर इस सीमा से नीचे गिर जाते हैं. सभी यौगिकों कि इस विश्लेषण नेत्रहीन विषाक्तता की पुष्टि करने के लिए विषाक्त के रूप में फिल्टर के फ्लोरोसेंट छवियों की जांच.
नोट: एक विकास निरोधात्मक या वृद्धि को बढ़ाने के प्रभाव के साथ यौगिकों की पहचान प्रत्येक प्लेट पर प्रतिकृति की कमी के कारण इस प्रकार की एक खोजपूर्ण परख में आकलन करने के लिए और अधिक कठिन है। हालांकि, निम्नलिखित यौगिकों कि या तो धीमा या सेलुलर विकास में वृद्धि हो सकती है की पहचान करने के लिए एक त्वरित तरीका है. - प्रत्येक प्लेट पर तीन प्रतिकृति DMSO नियंत्रण के लिए मानक विचलन की गणना करें और फिर DMSO नियंत्रण के ऊपर या नीचे औसत मान वाले किसी भी यौगिक के लिए फ़िल्टर करें। यौगिकों कि तीन प्लेटों में से प्रत्येक पर इस फिल्टर से बाहर गिर आगे की जांच वारंट हो सकता है.
- प्राथमिक विषाक्तता स्क्रीन के रूप में खुराक प्रतिक्रिया के लिए एक ही विश्लेषण रणनीति का प्रयोग करें. प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए DMSO नियंत्रण के लिए औसत की गणना और प्रतिशत लाइव कोशिकाओं या प्रतिशत अवशोषण प्रत्येक यौगिक के लिए सामान्यीकृत करने के लिए इन मूल्यों का उपयोग / तीन जैविक प्रतिकृति के लिए सभी यौगिक/डोज संयोजनों के लिए साधनों की साधन और मानक त्रुटि की गणना करें।
- अपने लॉग मान के लिए एकाग्रता रूपांतरण, एकाग्रता बनाम सामान्यीकृत व्यवहार्यता के लॉग के लिए एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करते हैं, और एक गैर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण के साथ वक्र फिट (विश्लेषण आर या विभिन्न वाणिज्यिक सांख्यिकीय में किया जा सकता है संकुल)। घातक खुराक की गणना 50 (या तकनीकी रूप से इस मामले में व्यवहार्य खुराक 50) या यौगिक की एकाग्रता है कि इस वक्र के समीकरण से 50% विषाक्तता में परिणाम. कई सॉफ्टवेयर संकुल स्वचालित रूप से इस आंकड़े की गणना करेगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
स्वचालित सेल गणना डेटा ने 25% से कम व्यवहार्यता वाले ग्यारह यौगिकों की पहचान की जब कि एम टी टी डेटा ने इन समान यौगिकों के साथ-साथ दो अतिरिक्त यौगिकों की पहचान की (सारणी 1 और तालिका 2,छायांकित लाल)। दो यौगिकों केवल MTT परख में विषाक्त हो पाया (वेल्स F3 और G10) था 31% और 39%, क्रमशः, नियंत्रण के रूप में tdTomato सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या और रैंक क्रम द्वारा इस पुस्तकालय में अगले दो सबसे विषाक्त यौगिकों थे उन विषाक्त समझा के बाद. इन दो कुओं के लिए मानक विचलन मूल्यों का सुझाव नहीं था कि तीन प्लेटों के बीच एक बाहरी था जो औसत विषम था, और जब तीन प्रतिकृति प्लेटों में से प्रत्येक के लिए संख्या की जांच न तो यौगिक किसी पर 25% सीमा से नीचे गिर गया प्लेटें (डेटा नहीं दिखाया गया है). चित्र 3में कई कुओं से टीडीटमाटर फ्लोरोसेंट के प्रतिनिधि चित्र दिखाए गए हैं। एमटीटी और सेल काउंट परख के बीच विषाक्तता के लिए असंगत दो कुओं के चित्रों की जांच से पता चला कि थ्3 (चित्र 3ठ) और जी 10 ( चित्र3ब्) के यौगिक दोनों विषाक्त थे , हालांकि तीन प्रतिकृति प्लेटों में से एक में वहाँ अच्छी तरह से G10 में कुछ अवशिष्ट रहते कोशिकाओं थे (डेटा नहीं दिखाया). ऐसा लगता है कि इस उदाहरण में MTT परख बेहतर cytotoxicity के लिए स्कोर करने में सक्षम था के रूप में कभी कभी imager सेल गिनती एल्गोरिथ्म गलती से मृत /
MTT परख विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए बनाया गया है, लेकिन क्योंकि एक पुस्तकालय यौगिकों कि बढ़ाने और सेल विकास को बाधित हो सकता है यह कितनी अच्छी तरह परख दोनों संभावित विकास निरोधात्मक और proliferative प्रभाव ों की मात्रा का आकलन करने के लिए जानकारीपूर्ण होगा परीक्षण यौगिकों. ऐसा करने के लिए एक फिल्टर जिससे यौगिकों विकास निरोधात्मक के रूप में वर्गीकृत किया गया था अगर उनके सामान्यीकृत मतलब अवशोषण या सेल गिनती से अधिक थे 25% और नियंत्रण के नीचे कम से कम दो मानक विचलन तीन प्रतिकृति प्लेटों में से प्रत्येक पर मतलब है (शेड सारणी 1 तथा सारणी 2में पीला । ग्यारह यौगिकों सेल गिनती परख के लिए इस कसौटी से मुलाकात की और केवल दो MTT परख के साथ केवल एक (E10) दो परख के बीच ओवरलैपिंग हालांकि सेल गिनती परख के लिए ग्यारह में से दो थे पहले MTT परख से विषाक्त होने का उल्लेख किया (F3 , G10).
यौगिक जिनके सामान्यीकृत साधन नियंत्रण के ऊपर दो मानक विचलन थे, प्रत्येक तीन प्रतिकृति प्लेटों पर विकास को बढ़ाने के रूप में वर्गीकृत किया गया था (तालिका 1 और तालिका 2में शेडेड हरे रंग)। केवल एक यौगिक प्रत्येक परख के लिए इस कसौटी फिट और यौगिक परख के बीच ओवरलैप नहीं किया. एमटीटी और सेल काउंट परख के बीच विसंगतियों वाले कुओं की छवियों की आगे की जांच से संकेत मिलता है कि कुछ उदाहरणों में जिन कुओं में एमटीटी ने टीडीटमाटर परख के सापेक्ष सेल काउंट का अनुमान लगाया था , कोशिकाओं को बड़ा दिखाई दिया (चित्र 3ब्) , जबकि वे कुएँ जहां एमटीटी ने टी डीटमाटर के सापेक्ष कोशिकाओं की संख्या कम आंकी थी, कोशिकाएं छोटी प्रतीत होती थीं (चित्र 3ड) । संक्षेप में, tdTomato परख विषाक्त के रूप में ग्यारह यौगिकों वर्गीकृत, विकास निरोधात्मक के रूप में ग्यारह, और एक के रूप में वृद्धि बढ़ाने के साथ छत्तीस सेल विकास पर कोई स्पष्ट प्रभाव नहीं होने (तालिका 1). एमटीटी परख विषाक्त के रूप में तेरह यौगिकों वर्गीकृत, दो विकास निरोधात्मक के रूप में, और एक के रूप में वृद्धि बढ़ाने के साथ चालीस एक सेल विकास पर कोई स्पष्ट प्रभाव नहीं है (तालिका 2).
विषाक्त होने के रूप में पहचान े गए तीन यौगिकों पर छह सूत्री खुराक प्रतिक्रिया परख की गई थी। इन तीन यौगिकों STAT3 inhibitors WP1066 (B5) और stattic (E4) और epidermal विकास कारक रिसेप्टर अवरोधक tyrphostin 9 (E11) थे. खुराक लगातार दो गुना कमजोर पड़ने की एक अधिकतम एकाग्रता पर शुरू कर रहे थे 10 डिग्री एम और 312.5 एनएम की एक न्यूनतम एकाग्रता के लिए जा रहा. इन यौगिकों में से एक के लिए कक्ष संख्या तथा एमटीटी परख दोनों के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं के सामान्यीकृत प्रतिशत की सांद्रता बनाम संकेन्द्रण के लॉग का ग्राफ (WP1066) चित्र 4में दर्शाया गया है। वक्र चार सबसे कम सांद्रता के लिए कोई विषाक्तता के साथ अपेक्षाकृत फ्लैट है, पर तेजी से गिर जाता है 5 डिग्री सेल्सियस खुराक, और लगभग पूर्ण विषाक्तता के लिए चला जाता है पर 10 डिग्री एम. घातक खुराक 50 (एलडी50) tdTomato परख के लिए 4.4 $M और एमटीटी परख के लिए 6.0 डिग्री के रूप में गणना की गई थी। अन्य दो यौगिकों के लिए tdTomato और MTT LD50 मान थे 3.4 $M और 4.7 $M, क्रमशः, स्थिर के लिए, और 0.8 $M और 1.6 $M, tryphostin 9 के लिए.
चित्र 1 : प्राथमिक विषाक्तता स्क्रीन में इस्तेमाल मास्टर यौगिक प्लेट के लिए प्लेट नक्शा. सभी बाहरी कुओं ग्रे में छायांकित हैं यह दर्शाता है कि वे कोशिकाओं के बिना मीडिया निहित. DMSO नियंत्रण (100%) कुओं B2, D6, और G11 में बोल्ड में लेबल कर रहे हैं. सभी कुओं लेबल Cmpd 10 00% DMSO में 10 एम एम एकाग्रता पर अद्वितीय परीक्षण यौगिकों निहित. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : खुराक प्रतिक्रिया परख में इस्तेमाल यौगिक प्लेट के लिए प्लेट नक्शा. सभी बाहरी कुओं ग्रे में छायांकित हैं यह दर्शाता है कि वे कोशिकाओं के बिना केवल मीडिया निहित. DMSO नियंत्रण स्तंभ 2 में रखे गए थे. सभी यौगिक/डोज संयोजनों के ट्रिपीकेट इंगित किए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : चयनित कुओं के tdTomato फ्लोरोसेंट छवियों 72 घंटे के बाद उपचार. (ए) ठीक है B2: DMSO नियंत्रण, (बी) अच्छी तरह से F3: सेल गिनती डेटा कोई विषाक्तता का सुझाव दिया लेकिन MTT डेटा किया था, (सी) अच्छी तरह से E6: tdTomato गिनती के सापेक्ष MTT द्वारा overestimated सेल गिनती , (डी) अच्छी तरह से G6 MTT के सापेक्ष सेल गिनती को कम करके आंका tdTomato. सभी छवियों को 10x आवर्धन पर एक RFP फिल्टर के साथ 531/593 एनएम तरंगदैर्ध्य उत्तेजना के लिए / कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : अच्छी तरह से B5 में यौगिक के लिए लॉग एकाग्रता बनाम व्यवहार्यता प्रतिशत DMSO के लिए वक्र. वक्र पर अंक छह खुराक पर औसत सामान्यीकृत व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं - तीन जैविक प्रतिकृति के लिए मतलब की मानक त्रुटि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: tdTomato सेल के साधन तीन प्रतिकृति प्लेटों के लिए प्रतिशत DMSO नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत मायने रखता है ± मानक विचलन. अच्छी तरह से छायांकन निम्नलिखित इंगित करता है: लाल, विषाक्त यौगिकों; पीला, संभावित विकास निरोधात्मक; हरे, संभावित विकास को बढ़ाने. कोई छायांकन इंगित करता है कि यौगिकों सेल वृद्धि को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं हुआ।
तालिका 2: MTT अवशोषण के साधन तीन प्रतिकृति प्लेटों के लिए प्रतिशत DMSO नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत ± मानक विचलन. अच्छी तरह से छायांकन निम्नलिखित इंगित करता है: लाल, विषाक्त यौगिकों; पीला, संभावित विकास निरोधात्मक; हरे, संभावित विकास को बढ़ाने. कोई छायांकन इंगित करता है कि यौगिकों सेल वृद्धि को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं हुआ।
| अच्छा | यौगिक | नोट्स |
| B2 | डीएमएसओ | नकारात्मक नियंत्रण |
| सी 2 | शिविर | प्रोटीन kinase एक उत्प्रेरक |
| डी 2 | FRACTALKINE | चेमोकीन |
| ई 2 | LDN212854 | अस्थि रूपजनिक प्रोटीन (बीएमपी) रिसेप्टर अवरोधक |
| एफ 2 | एजी 370 | प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर (PDGFR) kinase अवरोध कनेर |
| जी 2 | डीएपीटी | गामा-सेक्रेटस अवरोधक; तंत्रिका विभेदन धनात्मक नियंत्रण |
| बी 3 | AY9944 | 7-dehydrocholestrol रिडक्टेज अवरोधक; हेजहॉग पथ संदमक |
| सी 3 | एसटीए-21 | प्रतिलेखन के सिग्नल ट्रांसड्यूसर और उत्प्रेरक 3 (STAT3) अवरोधक |
| डी 3 | जीएम-सीएसएफ | ग्रैनुल्कोसाइट-मैक्रोफेज उपनिवेश-उत्तेजक कारक; साइटोकाइन |
| ई3 | टीएनपी470 | मेथियोनिन ऐमिनिप्टिडेस-2 अवरोधक |
| एफ 3 | जैव | ग्लाइकोजन सिन्थेज काइनेज-3 अवरोधक; WNT पथ उत्प्रेरक |
| जी 3 | सीएनटीएफ | सिलिरी न्यूरोट्रॉफिक कारक; न्यूरोपेप्टाइड |
| बी 4 | संत | चिकना रिसेप्टर विरोधी; हेजहॉग पथ संदमक |
| सी 4 | एजी 825 | ERBB2 अवरोधक |
| D4 | एम-सीएसएफ | मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक; साइटोकाइन |
| ई 4 | स्टेटिक | प्रतिलेखन के सिग्नल ट्रांसड्यूसर और उत्प्रेरक 3 (STAT3) अवरोधक |
| एफ 4 | एससी79 | AKT (प्रोटीन kinase बी) उत्प्रेरक |
| जी 4 | डीएमएच 1 | अस्थि रूपजनिक प्रोटीन (बीएमपी) रिसेप्टर अवरोधक |
| बी 5 | WP1066 | प्रतिलेखन के सिग्नल ट्रांसड्यूसर और उत्प्रेरक 3 (STAT3) अवरोधक |
| C5 | इंसुलिन | |
| D5 | आईएल-3 | इंटरलेकिन-3; साइटोकाइन |
| E5 | एजी 494 | एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (ईजीएफआर) अवरोधक |
| एफ 5 | LY294002 | फॉस्फोइनोसोटाइड 3-किनेस अवरोधक |
| जी 5 | IGF2 | इंसुलिन वृद्धि कारक-2 |
| बी 6 | शिथिलता | चिकना एगोनिस्ट; हेजहॉग पथ सक्रियक |
| C6 | एजी 370 | प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर kinase अवरोधक |
| D6 | डीएमएसओ | नकारात्मक नियंत्रण |
| ई 6 | EC23 | रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर एगोनिस्ट |
| एफ 6 | TORIN2 | रैपैमाइसिन (एमटीओआर) अवरोधक का मशीनी लक्ष्य |
| जी 6 | Y27362 | रो-संबद्ध, कुंडल-कुंडली जिसमें प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोधक होता है |
| बी 7 | CELECOXCIB | साइक्लोऑक्सीजन-2 (COX-2) अवरोधक |
| C7 | एसबी525334 | विकास कारक बीटा-रिसेप्टर (TGBFR) अवरोध करनेवाला बदलने |
| डी 7 | डीएपीटी | गामा-सेक्रेटस अवरोधक; तंत्रिका विभेदन धनात्मक नियंत्रण |
| ई7 | CHIR99021 | ग्लाइकोजन सिन्थेज काइनेज-3 अवरोधक; WNT पथ उत्प्रेरक |
| एफ 7 | LDN 193189 | अस्थि रूपजनिक प्रोटीन (बीएमपी) रिसेप्टर अवरोधक |
| जी 7 | ताराजोटिन | रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर एगोनिस्ट |
| बी 8 | AM580 | रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर एगोनिस्ट |
| सी 8 | डीएचबीपी | कैल्शियम रिलीज अवरोध करनेवाला |
| डी 8 | जेएसके | नाइट्रिक ऑक्साइड दाता |
| ई8 | DORSOMORPHIN | अस्थि रूपजनिक प्रोटीन (बीएमपी) रिसेप्टर अवरोधक; 5' एडेनोसाइन मोनोफोस्टेज-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एएमपीके) अवरोधक |
| एफ 8 | IMATINIB | टायरोसिन काइनेज अवरोधक |
| जी 8 | बीएमएस 493 | प्रतिलोम रेटिनोइक अम्ल ग्राही एगोनिस्ट |
| बी 9 | CYCLOPAMINE | चिकना रिसेप्टर विरोधी; हेजहॉग पथ संदमक |
| सी 9 | SEMAGACESTAT | गामा-सेक्रेटस अवरोधक |
| डी 9 | BOSUTINIB | टायरोसिन काइनेज अवरोधक |
| ई9 | PURMORPHAMINE | चिकना एगोनिस्ट; हेजहॉग पथ सक्रियक |
| एफ 9 | जग | जगगया; पायदान रिसेप्टर एगोनिस्ट |
| G9 | एसबी431542 | विकास कारक बीटा-रिसेप्टर (TGBFR) अवरोध करनेवाला बदलने |
| बी 10 | एससी79 | AKT (प्रोटीन kinase बी) उत्प्रेरक |
| सी 10 | DANTROLENE | रायनडीन ग्राही विरोधी |
| डी 10 | TYRPHOSTIN46 | एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (ईजीएफआर) अवरोधक |
| ई10 | AM80 | रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर एगोनिस्ट |
| एफ 10 | आईएफएन-वाई | इंटरफेरॉन-गामा; साइटोकाइन |
| जी 10 | PQ401 | इंसुलिन जैसे विकास कारक रिसेप्टर (IGF1R) अवरोध करनेवाला |
| बी 11 | डीएपीटी | गामा-सेक्रेटस अवरोधक; तंत्रिका विभेदन धनात्मक नियंत्रण |
| C11 | ए 2 एम | एक्स्ट्रासेलुलर ग्लाइकोप्रोटीन; प्रोटीज़ संदमक |
| D11 | एजी 490 | एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (ईजीएफआर) अवरोधक |
| ई11 | TYRPHOSTIN9 | प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर (PDGFR) kinase अवरोध कनेर |
| एफ 11 | बीएमपी-2 | अस्थि रूपजनिक प्रोटीन-2 |
| जी11 | डीएमएसओ | नकारात्मक नियंत्रण |
अनुपूरक तालिका 1: प्राथमिक स्क्रीन यौगिकों की सूची. अच्छी तरह से स्थान, नाम, और प्राथमिक स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया था कि यौगिकों में से प्रत्येक पर नोट्स प्रदान की जाती हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस लेख का प्राथमिक लक्ष्य एक रणनीति है कि कुशलतापूर्वक और सस्ते में एक कम मध्यम-throughput स्क्रीनिंग में सेल विकास को प्रभावित यौगिकों की पहचान सकता है का वर्णन करने के लिए किया गया था. दो लंबकोणीय तकनीकों का उपयोग निष्कर्ष में विश्वास बढ़ाने के लिए सेल नंबर का आकलन करने के लिए किया गया था और अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं जो उपलब्ध नहीं होंगे यदि केवल एक परख का उपयोग किया गया था। परख में से एक एक फ्लोरोसेंट सेल इमेजर का इस्तेमाल सीधे tdTomato-सकारात्मक कोशिकाओं की गिनती करने के लिए और दूसरा mitochondria की अच्छी तरह से विशेषता क्षमता पर निर्भर था MTT formazans इस प्रकार सेल संख्या10के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा करने के लिए छोड़ दें. इस प्रदर्शन में कुल 57 परीक्षण यौगिकों का मूल्यांकन किया गया था , हालांकि परख के एमटीटी विंग का उपयोग 2,000 यौगिक14के साथ एक पुस्तकालय के परीक्षण के लिए किया गया है . स्क्रीन के परिणामों ने बताया कि कैसे दो परख अधिक विश्वास के साथ कुछ निष्कर्ष तक पहुँचने में एक दूसरे को सुदृढ़ कर सकता है, और परिदृश्यों पर प्रकाश डाला जहां दो assays अतिरिक्त जानकारी है कि आम तौर पर होगा प्रदान पूरक थे कम से कम दो अलग-अलग प्रयोगों को करने की आवश्यकता है.
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम सिर्फ कोशिकाओं चढ़ाना से पहले होता है। सेल संस्कृति में चयापचय की स्थिति बहुत अस्थिर हो सकता है, विशेष रूप से glutamine और ग्लूकोज की खपत के मामले में, अगर कोशिकाओं को बहुत अधिक घनत्व पर बीज रहे हैं17,18. इन शर्तों के तहत सेल मौत सेल संस्कृति की स्थिति और परीक्षण यौगिकों की विषाक्तता के लिए असंबंधित करने के लिए निहित कारकों के कारण होगा. परिणाम साइटोटॉक्सिक यौगिकों के लिए झूठी सकारात्मकता में वृद्धि के साथ - साथ पुनरुत्पादन में कठिनाई18होगा . इस कदम पर सफलता का इस्तेमाल किया जा रहा सेल लाइन के उचित सेल घनत्व जानने की आवश्यकता है, चढ़ाना से पहले सेल संख्या का सही निर्धारण, और कोशिकाओं के पूर्ण resuspension के भीतर और 96 के कुओं के पार सजातीय चढ़ाना वितरण सुनिश्चित करने के लिए -अच्छी तरह से प्लेट। यह भी नेत्रहीन पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को लगभग सही घनत्व पर मौजूद हैं 2-3 एच एक माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें देख कर चढ़ाना के बाद.
जहां तक स्वयं परख का संबंध है, एमटीटी परख के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि एमटीटी पूरी तरह से सेल संस्कृति माध्यम में भंग हो गया है। एमटीटी के अवशिष्ट वेग तीव्र सेलुलर विषाक्तता में परिणाम स्वयं से हो सकता है तो यह पूरी तरह से जोरदार भंवर के साथ एमटीटी भंग करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल गिनती परख के लिए सबसे महत्वपूर्ण बिंदु इमेजिंग tdTomato के लिए सही जोखिम समय स्थापित करने के लिए है. एक्सपोजर बार है कि बहुत कम कर रहे हैं वास्तव में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं सॉफ्टवेयर द्वारा uncounted जा रहा में परिणाम कर सकते हैं, और जोखिम बार है कि बहुत लंबे समय से संकेत इतना मजबूत है कि यह पड़ोसी कोशिकाओं मिश्रणों एक साथ इस तरह है कि सॉफ्टवेयर एक सेल के रूप में कई कोशिकाओं की गिनती कर सकते हैं क्योंकि यह उन्हें हल करने में असमर्थ है14. अधिकांश सॉफ़्टवेयर पैकेज जो इमेजिंग रीडर्स के साथ आते हैं, एक पूर्वावलोकन चरण के लिए अनुमति देते हैं जो कि कोशिकाओं की गणना की जा रही है. यह कई जोखिम समय पर इस पूर्वावलोकन कदम चलाने के लिए और एक है कि फ्लोरोसेंट कोशिकाओं सबसे सही पहचान करता है लेने के लिए महत्वपूर्ण है.
किसी भी विधि के साथ के रूप में इन assays के लिए कुछ सीमाएं हैं. उच्च थ्रूपुट हासिल करने के लिए, प्राथमिक विषाक्तता परख केवल एक ही उपचार / एकल खुराक प्रतिमान का उपयोग करता है जो अधिक झूठी सकारात्मक और झूठी नकारात्मक की कीमत पर आ सकता है। इसके अतिरिक्त, हालांकि कई पहले के अध्ययनों से पता चला है कि MTT सेल संख्या के साथ बहुत अच्छी तरह से संबंधित है जब या तो एक कॉलोनी बनाने परख19 या एक थाइमिडीन निगमन असालीकाउपयोग कर, कुछ यौगिकों के साथ उपचार या तो बढ़ा सकते हैं या माइटोकोंड्रियाल क्रियाकलाप को इस प्रकार बाधित करें कि एमटीटी परख के परिणाम अब कोशिका संख्या21के साथ सहसंबंधित न हों . इस प्रदर्शन से परिणाम से संकेत मिलता है कि जबकि MTT विषाक्त यौगिकों की पहचान करने में उत्कृष्ट है, इसकी क्षमता यौगिकों की पहचान करने के लिए है कि या तो रोकते हैं या प्रसार को बढ़ाने शायद सीमित है क्योंकि इस तरह के यौगिकों एक में mitochondrial गतिविधि बदल जिस तरह से यह सेल नंबर के साथ कम अच्छी तरह से संबंधित है. वहाँ भी tdTomato गिनती परख के लिए कुछ सीमाएं हैं. एक स्पष्ट सीमा के लिए एक सेल लाइन stably एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने की आवश्यकता है. जीनोम हेरफेर में हाल ही में प्रगति यह बहुत आसान ऐसी लाइनों को विकसित करने के लिए बना दिया है, लेकिन उन्हें उत्पन्न करने के लिए आवश्यक काम कुछ प्रयोगशालाओं की क्षमताओं से परे हो सकता है. एक तकनीकी दृष्टिकोण से, किसी भी सेल गिनती परख है कि छवि विश्लेषण का उपयोग करता है के साथ सबसे बड़ा मुद्दों इन assays की अक्षमता कोशिकाओं है कि एक साथ संकुल रहे हैं एक undercount में जिसके परिणामस्वरूप के बीच अंतरहै 14, इसलिए, उचित चढ़ाना है सटीक परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है. एक अन्य संभावित समस्या मृत या मर कोशिकाओं है कि fluoresce चमकीले की गिनती है. इस समस्या से बचने के लिए एक तरीका इन पृष्ठभूमि कोशिकाओं को निकालने के लिए गिनती से पहले PBS के साथ कोशिकाओं को धोने के लिए है। यह कुछ कम अच्छी तरह से कोशिकाओं लाइनों का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक नहीं हो सकता है क्योंकि लाइव सेल धोने पर अलग हो सकते हैं। इस समस्या का एक वैकल्पिक समाधान के लिए कई विश्लेषण कार्यक्रमों में निहित लचीलापन का उपयोग करने के लिए एक संकीर्ण सीमा के भीतर सेल पहचान के लिए पैरामीटर अनुकूलित इतना है कि केवल रहते हैं, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की गिनती कर रहे हैं.
इस आलेख में वर्णित रणनीति कुशलतापूर्वक कई सौ यौगिकों तक स्क्रीन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है. एमटीटी परख रीडआउट माइटोकोंड्रिल गतिविधि का शारीरिक परिणाम है और सेल लाइन या यौगिक-विशिष्ट प्रभाव हो सकता है जो गलत परिणाम4,21का उत्पादन कर सकता है। यह एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग कर एक सेल गिनती परख के साथ संयोजन करके, इन सीमाओं को बहुत कम किया जा सकता है. के रूप में दिखाया गया है, दोनों assays के परिणामों की तुलना विषाक्त यौगिकों की पहचान करने में करीब 100% सटीकता में परिणाम कर सकते हैं. एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि एक HEK293T लाइन में stably tdTomato व्यक्त, वहाँ विषाक्त यौगिकों22के एक पुस्तकालय के लिए MTT और tdTomato के बीच उच्च आईसी50 संबंध है. हालांकि इस अध्ययन के लिए पर्याप्त हिट यौगिकों पर माध्यमिक पुष्टि नहीं चला एक समान सामंजस्य विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, परीक्षण किया गया था कि तीन यौगिकों के लिए गणना LD50 मान समान थे.
विषाक्तता के बारे में निष्कर्ष को सुदृढ़ करने की क्षमता के अलावा, दो assays एक दूसरे के पूरक जब परीक्षण यौगिकों के संभावित विकास निरोधात्मक और proliferative प्रभाव को संबोधित कर सकते हैं. कई परीक्षण यौगिकों के लिए दोनों परख के बीच डेटा काफी भिन्न. इन यौगिकों में से कुछ के लिए tdTomato फ्लोरोसेंट की छवियों की जांच करते समय, उपचार और नियंत्रण के बीच ध्यान देने योग्य रूपात्मक परिवर्तन थे। यह पता चलता है कि दो परख के बीच सामान्यीकृत मूल्यों में विचलन शारीरिक परिवर्तन है कि अंतर MTT readout और tdTomato सेल गिनती को प्रभावित पर आधारित हो सकता है. एक ही प्रयोग के साथ इस तरह के डेटा प्राप्त करने की क्षमता इस रणनीति की मजबूती को बहुत बढ़ाती है जिससे इसे अधिक आम तौर पर लागू किया जाता है। इस प्रकार, यह न केवल उच्च सटीकता के साथ विषाक्त यौगिकों की पहचान करने की क्षमता है, लेकिन सेल विकास पर अधिक सूक्ष्म प्रभाव के साथ यौगिकों बाहर बात करने के लिए /
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम एनआईडीएस Intramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
