Summary
Het is vaak noodzakelijk om te beoordelen van de potentiële cytotoxiciteit van een reeks van verbindingen op gekweekte cellen. Hier beschrijven we een strategie om betrouwbaar op te schermen voor giftige stoffen in een 96-well formaat.
Abstract
Cytotoxiciteit is een kritische parameter die moet worden gekwantificeerd bij het bestuderen van geneesmiddelen die therapeutische voordelen kunnen hebben. Hierdoor, veel drug screening testen maken gebruik van cytotoxiciteit als een van de kritische kenmerken worden geprofileerd voor afzonderlijke verbindingen. Cellen in cultuur zijn een nuttig model om cytotoxiciteit te beoordelen voordat ze overgaan tot het opvolgen van veelbelovende loodverbindingen in duurdere en arbeidsintensieve diermodellen. We beschrijven een strategie voor het identificeren van verbindingen die van invloed zijn op de celgroei in een tdTomato uitdrukken menselijke neurale stamcellen (NSC) lijn. De strategie maakt gebruik van twee complementaire assays om het celnummer te beoordelen. Eén test werkt via de reductie van 3-(4, 5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) naar Formazan als een proxy voor het celnummer en de andere rechtstreeks de tdTomato die NSCs uitdrukt. De twee testen kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd in een enkel experiment en zijn niet arbeidsintensief, snel en goedkoop. De strategie beschreven in deze demonstratie getest 57 verbindingen in een verkennend primair scherm voor toxiciteit in een 96-well plaat formaat. Drie van de hits werden verder gekarakteriseerd in een zespunts dosisrespons met dezelfde assay-opstelling als het primaire scherm. Naast het verstrekken van uitstekende bevestiging voor toxiciteit, vergelijking van de resultaten van de twee assays kan effectief zijn bij het identificeren van verbindingen die andere aspecten van celgroei beïnvloeden.
Introduction
Een van de belangrijkste kenmerken die moet worden bepaald voor een chemische verbinding die therapeutische potentie heeft is de toxiciteit voor dierlijke cellen. Dit kenmerk zal bepalen of een medicijn een goede kandidaat is voor een uitgebreidere studie. In de meeste gevallen, verbindingen met minimale toxiciteit worden gezocht, maar er zijn situaties waarin een verbinding met de capaciteit om specifieke celtypen te doden is van belang, bijvoorbeeld, anti-tumorigene drugs. Hoewel hele dieren de beste modelsystemen zijn om systemische toxiciteit te bepalen, zijn de betrokken kosten en arbeid prohibitief wanneer meer dan een paar verbindingen moeten worden getest. Als zodanig wordt de zoogdier celcultuur over het algemeen gebruikt als het meest efficiënte alternatief1,2. Kleine tot middelgrote doorvoer drug schermen zijn een belangrijke modaliteit waardoor toxiciteit kan worden beoordeeld in de celcultuur. Deze schermen kunnen worden gebruikt voor het interroken van geannoleerde bibliotheken die gericht zijn op individuele signalerings trajecten. Het algemene formaat van een dergelijk scherm is om in eerste instantie alle verbindingen in de bibliotheek te testen met een enkelvoudige dosis (over het algemeen 10 μM) in een verkennend primair toxiciteits scherm, en vervolgens een diepgaand secundair dosisrespons scherm uit te voeren om de toxiciteit volledig te karakteriseren Profiel van hits van het primaire scherm. De methoden om deze strategie uit te voeren worden hier beschreven en bieden een snelle, efficiënte en goedkope manier om toxische verbindingen te identificeren en te karakteriseren.
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld om de cytotoxiciteit van kleine verbindingen en nanomateriaal in zoogdiercellen3,4te beoordelen. Opgemerkt moet worden dat bepaalde materialen kunnen interageren met de test die misleidende resultaten oplevert, en dergelijke interacties moeten worden getest bij het karakteriseren van hits van toxiciteits schermen4. Cytotoxiciteits testen omvatten trypaan blauwe uitsluiting5, lactaat dehydrogenase (LDH) release assay6, Alamar blue assay7, calcien ACETOXYMETHYL Ester (am)8en de ATP-test9. Al deze assays meten verschillende aspecten van celmetabolisme die als een proxy voor het celnummer fungeren kunnen. Terwijl alle voordelen bieden, tetrazolium zout gebaseerde assays zoals 3-(4, 5-dimethylthizol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), 2, 3-bis (2-methoxy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide Inner Salt (XTT)-1, en 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrofenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeen disulfonaat (WST-1)10,11 bieden een goede nauwkeurigheid en gebruiksgemak tegen lage kosten. MTT, dat in deze demonstratie zal worden gebruikt, wordt gereduceerd tot een onoplosbare Formazan door een mitochondriale reductase en de snelheid van deze conversie correleert sterk met het celnummer. Deze test is routinematig gebruikt op zowel een kleine schaal en voor het screenen van bibliotheken met maximaal 2.000 verbindingen12. Direct tellen van cellen door een gelabelde marker biedt een andere methode om het mobiele nummer te beoordelen, en in tegenstelling tot de MTT-assay kan het aanvullende informatie geven over de dynamiek van cellulaire groei. Er zijn verschillende algemeen beschikbare algoritmen beschikbaar om geautomatiseerde celcount-analyses uit te voeren en er zijn ook eigen algoritmen die deel uitmaken van softwarepakketten voor beeldvormings lezers13,14. In deze methode beschrijving, een menselijke neurale stam cel (NSC) lijn die is genetisch bewerkt tot constitutief Express tdTomato15 zal dienen als een test lijn om cellulaire levensvatbaarheid resultaten te vergelijken tussen een MTT assay en een geautomatiseerde celtelling assay in een scherm dat de toxiciteit van 57 teststoffen beoordeelt. Hoewel het primaire doel van deze strategie was om te identificeren en te karakteriseren van giftige stoffen, het heeft het extra voordeel van potentieel identificeren van groei remmende en groei-verbeterende verbindingen en biedt dus een effectieve methode voor het identificeren van drugs die cellulaire groei kan moduleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultuur van de NSC
Opmerking: manipulatie van een menselijke NSC-lijn wordt hieronder beschreven, maar elke cellijn kan voor dit protocol worden gebruikt. Alle celkweek werkzaamheden worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.
- Jas een 96-goed bord met kelder membraan/extracellulaire matrix (ECM).
- Hoeveelheid ecu (tabel met materialen) ontdooien, die de bevestiging van de NSC op ijs zal vergemakkelijken. Verdun de ECM naar de juiste concentratie (in het algemeen 1:100) in 10 mL basismedium (tabel met materialen) en voeg 50 μL per putje toe aan elk van de 60 binnenputten van een 96-wells plaat (Figuur 1). Gebruik alleen de binnenzijde 60 Wells om artefacten te voorkomen die kunnen voortvloeien uit het randeffect16.
- Laat de plaat gedurende ten minste 30 minuten op kamertemperatuur of in een kweek couveuse (37 °C, 5% CO2) zitten.
- Dissociate en plaat neurale stamcellen.
Opmerking: cellen voor gebruik in deze methode moeten worden geteeld tot ten minste 80% samenvloeiing in een T75 kolf.- Kweekcellen in een T75 kolf in een celkweek incubator bij 37 °C en 5% CO2 in NSC-medium dat bestaat uit basismedium, B27, niet-essentiële aminozuren, 2 mm glutamine en 10 ng/ml basis fibroblast-groeifactor (FGFb of FGF2).
- Verwijder cellen uit de incubator zodra ze 80% samenvloeiing bereiken en aspireren uit NSC medium. Voeg een geschikte hoeveelheid celdissociatie reagens toe (3 mL voor een T75 kolf; Tabel met materialen) en incuberen gedurende 5 minuten in de incubator.
- Voeg na incubatie 7 mL NSC-medium toe in de T75 kolf en Pipetteer krachtig om ervoor te zorgen dat alle cellen losraken. Breng de gezien Cell-oplossing over in een buis van 15 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten.
- Na centrifugeren, verwijder supernatant uit de buis en respendeer cellen in 10 mL NSC medium en Tel cellen.
- Readjust concentratie van cellen tot 200.000 cellen/mL met NSC medium. Zorg ervoor dat cellen volledig worden geresuspendeerd voor homogene plating in putten.
- Plaat 100 μL van het celmengsel (20.000 cellen) in de 60 binnenputten van 3 96-boorput platen die zijn gecoat zoals beschreven in punt 1,1. Gebruik zes van de acht sleuven van een 8-kanaals multikanaalpipettor voor kolom-voor-kolom van de plaat cellen.
- Voeg 100 μL basismedium of NSC medium toe aan alle putjes zonder cellen om mogelijke verdamping uit de buitenste putten te minimaliseren.
- Inspecteer onder een celkweek Microscoop ten minste 10 putjes op elk van de 3 96-boorput platen om te bevestigen dat de cellen op de verwachte dichtheid zijn gesest. Ga niet verder met de assay als cellen worden verguld bij een dichtheid te dun of te dicht.
2. behandeling van cellen met verbindingen
Opmerking: de zelfgemaakte bibliotheek getest in deze demonstratie bevat verbindingen die moduleren Wingless/Integrated (WNT), retinoïnezuur, transformeren groeifactor-Beta (TGF-β), en Sonic hedgehog signalering trajecten evenals een verscheidenheid van tyrosine kinases.
-
Verkennend primair scherm voor toxiciteit/celnummer
- Aliquot 50 − 100 mL van tot 57 test verbindingen (aanvullende tabel 1) bij een concentratie van 10 mM in 100% dimethylsulfoxide (DMSO) in het interieur 60 putjes van een U-bodem, V-bodem of ronde bodem 96-putplaat met drie DMSO Wells als controle (Zie Afbeelding 1 voor een plaat kaart). Dit zal dienen als de Master samengestelde plaat met 25 μL van samengestelde die kan worden bevroren en ontdooid meerdere malen.
Opmerking: platte bodemplaten mogen niet worden gebruikt omdat het moeilijker zal zijn om kleine hoeveelheden verbindingen van hen te aspireren met een bench top pipettor. - Verwijder celcultuurplaten uit de incubator 16-24 h na het splitsen zoals beschreven in sectie 1 en zuig de gemiddelde kolom-voor-kolom van NSC op met een 8-kanaals multi-well pipet met slechts zes van de acht multi-well-sleuven. Voeg 95 μL verse NSC-medium toe aan cellen in elk van de drie replicaatplaten en plaats de platen terug in de incubator totdat stap 2.1.4 hieronder is voltooid.
- Voeg 49 μL NSC-medium toe aan elk van de inwendige 60 putten van een lege U-bodem, met V-bodem of met ronde bodem 96-boorput met een 8-kanaals multi-well pipettor. Ontsluit de Master samengestelde plaat en gebruik een bench top pipet of gelijkwaardig instrument om 1 μL verbinding van de Hoofdplaat te pipetteren in de 49 μL van het nsc-medium in elk van de inwendige 60 putjes.
- Meng de verdunde verbinding 3x met de Bench top pipettor.
- Verwijder de 3 96-put platen van de NSCs uit de incubator, Pipetteer 15 μL van elke verdunde verbinding met de bovenste pipetttop en doseer een 5 μL aliquot van een stof in elk van de drie platen.
Opmerking: deze 1:20 verdunning van de verbinding in de cellen in combinatie met de initiële 1:50 verdunning in stap 2.1.3 levert een verdunning van 1:1000 op, zodat de uiteindelijke concentratie van de verbindingen op de NSCs 10 μM zal zijn met een DMSO-concentratie van 0,1% en de uiteindelijke de concentratie voor de DMSO-besturingselementen is 0,1%. - Incuberen cellen met compound voor 72 h en ga verder met cytotoxiciteit testen. Kortere intervallen kunnen worden gebruikt, maar een incubatietijd van 72 uur moet de potentiële cytotoxische effecten van geteste verbindingen maximaliseren.
- Aliquot 50 − 100 mL van tot 57 test verbindingen (aanvullende tabel 1) bij een concentratie van 10 mM in 100% dimethylsulfoxide (DMSO) in het interieur 60 putjes van een U-bodem, V-bodem of ronde bodem 96-putplaat met drie DMSO Wells als controle (Zie Afbeelding 1 voor een plaat kaart). Dit zal dienen als de Master samengestelde plaat met 25 μL van samengestelde die kan worden bevroren en ontdooid meerdere malen.
-
Dosisrespons bepaling
Opmerking: de set-up voor de 96-goed gebruikt voor de dosis-respons wordt weergegeven in Figuur 2.- Gebruik kolom 2 voor zes DMSO-controle-replicaties en test triplicaten van maximaal drie verschillende verbindingen bij twee-voudige seriële verdunningen bij zes doses beginnend met een hoge dosis van 10 μM.
- Verdun 4 μL DMSO-of teststof in DMSO tot 196 μL NSC-medium in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Voeg 25 μL DMSO toe aan de kolom putjes van B2-G2 en 50 μL teststoffen in de rij van B3-B11 met de drie geteste verbindingen in 10 mM-triplicaten in rijen B3-B5, B6-B8 en B9-B11.
- Pipetteer 25 μL NSC-medium naar de resterende lege kolommen in het binnengedeelte van de 96-goed plaat. Verwijder 25 μL verbinding uit Wells B3-B11 met een multikanaalpipettor, voeg toe aan Wells C3-C11 en meng ten minste vijf keer. Herhaal het proces voor de resterende rijen om triplicaten te genereren bij twee-voudige verdunningen voor een totaal van zes doses voor elk van de verbindingen.
- Genereer NSCs voor de dosisrespons precies zoals beschreven voor het primaire scherm in paragraaf 2,1. De verbindingen voor de dosisrespons worden toegevoegd aan en geïntrigeerd op de cellen, precies zoals beschreven in de stappen 2.1.5 en 2.1.6.
Opmerking: drie biologische replicaten van de dosisrespons test worden uitgevoerd door de assay op de NSCs op verschillende passages op afzonderlijke dagen te herhalen.
3. beeldvormings cellen op een plaat lezer
- Nadat cellen voor de toegewezen tijd met verbindingen zijn geïntrigeerd, worden de beeld cellen op een plaat lezer om het voorbehandelings celnummer per put te bepalen.
Opmerking: instructies voor Imaging cellen zijn specifiek voor lezers, maar volgen over het algemeen een vergelijkbare strategie. De onderstaande aanwijzingen zijn van toepassing op de lezer die in deze demonstratie wordt gebruikt (tabel met materialen). - Verwijder de plaat uit de incubator en plaats deze in de plaat lezer. Open de imager-software voor het instellen van protocol-en experiment bestanden voor de studie. Ga naar Imager Manual Mode in Taakbeheer en klik op nu vastleggen....
- Kies 96-well plate als het type vat, selecteer 10x voor de vergroting en rood fluorescerende proteïne (RFP) 531 en 593 voor Imaging tdTomato. Kies een put en klik vervolgens op autofocus om de afbeelding scherp te stellen en Stel automatisch bloot voor de juiste belichtingstijd. Pas indien nodig de scherpstelling en belichting handmatig aan.
- Zodra de juiste scherpstelling en belichting zijn verkregen, klikt u op het camerapictogram om de foto vast te leggen. Klik vervolgens op process/ANALZYE boven afbeelding om door te gaan met het bouwen van het protocol en selecteer de analyse tabblad.
- Klik op mobiele analyse in analyse stap toevoegen aan de rechterkant van de afbeelding en klik op starten. Afbeelding toont gemarkeerde cellen om elke afzonderlijke cel aan te geven. De selectie van opties kan worden geklikt om parameters te wijzigen om beter cellen te selecteren op basis van de fluorescentie drempel of celgrootte. Als de imager de cellen op de juiste manier telt, klikt u op stap toevoegen onder aan het scherm.
- Klik op het pictogram boven aan het scherm om een experiment te maken van de afbeeldingsset, waarmee een venster met het experiment wordt geopend. Eenmaal geopend, klik op procedure onder het tabblad Protocol en in het nieuwe venster dat opent Selecteer Lees, klik vervolgens in het nieuwe venster op volledige plaat om alleen de 60 putten te selecteren die de cellen bevatten (B2... G11). Klik op OK om de wijzigingen op te slaan en klik vervolgens op OK in het venster procedure.
- De plaat kan nu worden afbeelding gemaakt door dit protocol en het experimentele bestand kan worden opgeslagen. Klik op het pictogram afspelen om de plaat uit te voeren. Zodra de eerste plaat is gefotografeerd, beeld de andere twee platen. Nadat de Imaging is voltooid, downloadt u de celtellinggegevens naar een werkblad voor analyse. Neem alle beelden bij 10x vergroting.
4. terminale MTT-cytotoxiciteits test
Opmerking: Start de MTT test binnen twee uur na het voltooien van tdTomato Imaging.
- Maak een MTT-stamoplossing van 5 mg/mL door 25 mg MTT uit te wegen en deze in 5 mL NSC-medium opnieuw op te schorten. Vortex de oplossing totdat er geen zichtbare precipitaten van MTT, die enkele minuten kan duren.
- Verwijder celcultuurplaten uit de incubator en zuig het celkweekmedium op. Verdun MTT 1:10 in het celkweekmedium en voeg 100 μL MTT toe aan elk goed van cellen.
- Incuberen cellen bij 37 °C gedurende 2 uur. Een paars precipitaat moet ruwweg zichtbaar zijn in verhouding tot het aantal cellen in de put. Aspiraat de MTT-oplossing uit platen of Inverteer de plaat snel naar flick oplossing uit de plaat.
- Voeg 50 μL 100% DMSO toe aan elke put en schud de platen bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 400 rpm. Lees de extinctie van elke put op 595 nm in een plaat lezer en exporteer gegevens naar een spreadsheet voor analyse.
5. gegevensanalyse
- Voer een analyse uit van het aantal tdTomato-cellen en gemiddelde met de juiste software (Commercial spreadsheet, R). Bereken gemiddelden voor absorptie of het aantal cellen van de drie DMSO-replicaten op elke plaat voor normalisatie doeleinden, verdeel vervolgens de waarde voor het aantal cellen of gemiddelde voor elke put op de plaat door dit gemiddelde en zet deze om in een percentage. Dit resulteert in het genormaliseerde aantal cellen of de extinctie ten opzichte van de DMSO-regeling voor elke plaat.
- Bereken het gemiddelde genormaliseerde aantal of de extinctie en de standaarddeviatie voor het repliceren van putjes op de drie platen.
Opmerking: op dit moment moeten er vier verschillende sets van genormaliseerde waarden: één voor elk van de platen en één gemiddelde voor de drie replicaatplaten. - Wees conservatief en gebruik een genormaliseerde waarde op of onder 25% voor het gemiddelde over de drie replicaatplaten om een samengestelde als giftig te classificeren. Ook, omdat slechts één behandeling per stof wordt uitgevoerd op elke plaat, alleen label verbindingen die onder deze drempel op alle drie replicaatplaten als giftig vallen. Onderzoek fluorescerende beelden van alle verbindingen die deze analyse filtert als giftig voor het visueel bevestigen van toxiciteit.
Opmerking: de identificatie van verbindingen met een groei remmende of groeibevorderende werking is moeilijker te beoordelen in een verkennende assay van dit type als gevolg van het ontbreken van replicaten op elke plaat. Echter, het volgende is een snelle manier om te identificeren van verbindingen die ofwel vertragen of verbeteren van cellulaire groei. - Bereken de standaarddeviatie voor de drie replicaatdmso-besturingselementen op elke plaat en filter vervolgens op alle verbindingen die gemiddelde waarden hebben ten minste twee standaarddeviaties boven of onder de DMSO-besturing. Verbindingen die op elk van de drie platen uit dit filter vallen, kunnen nader onderzoek rechtvaardigen.
- Gebruik dezelfde analyse strategie voor de dosisrespons als het primaire toxiciteits scherm. Bereken de gemiddelden voor de DMSO-besturingselementen voor elke biologische replicatie en gebruik deze waarden om het percentage levende cellen of procent gemiddelde te normaliseren voor elke samengestelde/dosiscombinatie. Bereken de middelen en de standaardfout van de middelen voor alle samengestelde/dosis combinaties voor de drie biologische replicaten.
- Transformeer de concentratie naar de logwaarde, Genereer een dosisrespons curve voor het log van de concentratie versus genormaliseerde levensvatbaarheid en monteer de curve met een niet-lineaire regressieanalyse (analyse kan worden uitgevoerd in R of verschillende commerciële statistische pakketten). Bereken de dodelijke dosis 50 (of technisch in dit geval de levensvatbare dosis 50) of de concentratie van de stof die resulteert in 50% toxiciteit uit de vergelijking van deze curve. Veel softwarepakketten zullen dit cijfer automatisch berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De geautomatiseerde cel Count gegevens geïdentificeerd elf verbindingen met minder dan 25% levensvatbaarheid wanneer genormaliseerd naar de DMSO-besturingselement terwijl de MTT gegevens geïdentificeerd deze dezelfde verbindingen plus twee extra degenen (tabel 1 en tabel 2, gearceerd rood). De twee verbindingen bleken alleen giftig in de MTT assay (Wells F3 en G10) had 31% en 39%, respectievelijk, het aantal tdTomato-positieve cellen als de controle en de rangorde waren de volgende twee meest toxische stoffen in deze bibliotheek na die als giftig beschouwd. De standaarddeviatie waarden voor deze twee putten suggereren niet dat er een uitschieter was tussen de drie platen die de gemiddelden scheefgetrokken, en bij het onderzoeken van de getallen voor elk van de drie replicaatplaten viel geen van beide verbindingen onder de 25%-drempel op een van de platen (gegevens niet weergegeven). Representatieve beelden van tdTomato fluorescentie zijn te zien in verschillende putjes in Figuur 3. Onderzoek van de beelden van de twee putten discordant voor toxiciteit tussen de MTT en Cell Count assay bleek dat de verbindingen in F3 (Figuur 3B) en G10 (Figuur 3C) beide giftig waren, hoewel in een van de drie replicaatplaten Er waren een paar resterende levende cellen in goed G10 (gegevens niet weergegeven). Het lijkt erop dat in dit geval de MTT-assay beter in staat was om te scoren voor cytotoxiciteit, omdat soms het celtellings algoritme van de imager ten onrechte dode/stervende cellen telt.
De MTT-test is ontworpen voor het bepalen van de toxiciteit, maar omdat een bibliotheek verbindingen kan bevatten die de celgroei verbeteren en remmen, zou het informatief zijn om te beoordelen hoe goed de assay zowel de potentiële groei remmende en proliferatieve effecten van geteste verbindingen. Om dit te doen werd een filter gebruikt waarbij verbindingen werden geclassificeerd als groei remmende als hun genormaliseerde gemiddelde gemiddelde of celtellingen groter waren dan 25% en minder dan twee standaarddeviaties onder de controlemiddelen op elk van de drie replicaatplaten (gearceerde geel in tabel 1 en tabel 2). Elf verbindingen ontmoetten dit criterium voor de bepaling van de celtelling en slechts twee voor de MTT-test met slechts één (E10) overlapping tussen de twee assays, hoewel twee van de elf voor de bepaling van de celtelling degenen waren die eerder als giftig werden genoemd door de MTT-test (F3 , G10).
Verbindingen waarvan de genormaliseerde middelen twee standaarddeviaties waren boven de controlemiddelen op elk van de drie replicaatplaten werden geclassificeerd als groei verbetering (groen gearceerd in tabel 1 en tabel 2). Slechts één samengestelde paste dit criterium voor elke assay en de compound niet overlappen tussen de assays. Verder onderzoek van de beelden van putten met discrepanties tussen de MTT en het aantal cellen gaf aan dat in sommige geval putten waarin MTT overgeschatte celtelling ten opzichte van de tdTomato assay de cellen groter leken te zijn (Figuur 3C) , terwijl die putjes waar MTT het aantal cellen ten opzichte van tdTomato onderschatte, kleiner leken (Figuur 3D). Samengevat, de tdTomato assay geclassificeerd elf verbindingen als giftig, elf als groei remmende, en één als groei verbetering met 34 zonder duidelijk effect op de celgroei (tabel 1). De MTT-test geclassificeerde dertien verbindingen als giftig, twee als groei remmende, en één als groei verbetering met 41 zonder duidelijk effect op de celgroei (tabel 2).
Een zespunts dosisrespons test werd uitgevoerd op drie van de verbindingen die als giftig werden aangemerkt. Deze drie verbindingen waren de STAT3 remmers WP1066 (B5) en stattic (E4) en de epidermale groeifactor receptor remmer tyrphostin 9 (E11). De doses waren opeenvolgende tweevoudige verdunningen beginnend bij een maximale concentratie van 10 μM en gingen naar een minimale concentratie van 312,5 nM. De grafiek van het log van de concentratie versus genormaliseerd percentage van levensvatbare cellen voor zowel de celtelling en MTT assays voor een van deze verbindingen (WP1066) wordt weergegeven in Figuur 4. De curve is relatief plat zonder toxiciteit voor de vier laagste concentraties, daalt snel bij de dosis van 5 μM en daalt tot bijna volledige toxiciteit bij 10 μM. De letale dosis 50 (LD50) werd berekend als 4,4 μm voor de Tdtomassay en 6,0 μm voor de MTT-test. De tdTomato-en MTT LD50 -waarden voor de andere twee verbindingen waren respectievelijk 3,4 μm en 4,7 μm, voor statische en 0,8 μm en 1,6 μm voor tryphostin 9.
Figuur 1 : Plaat kaart voorhoofd samengestelde plaat die wordt gebruikt in het primaire toxiciteits scherm. Alle buitenste putjes zijn grijs gekleurd, wat aangeeft dat ze media bevatten zonder cellen. DMSO-besturingselementen (100%) worden vet gemarkeerd in Wells B2, D6 en G11. Alle putten gelabeld Cmpd bevatte unieke teststoffen bij 10 mM concentratie in 100% DMSO. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Plaat kaart voor de samengestelde plaat die wordt gebruikt in de dosisrespons test. Alle buitenste putjes zijn grijs gekleurd, wat aangeeft dat ze alleen media bevatten zonder cellen. De DMSO-besturingselementen werden ondergebracht in kolom 2. Triplicaten van alle samengestelde/dosis combinaties zijn geïndiceerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Tdtomato fluorescerende beelden van geselecteerde putjes 72 uur na de behandeling. (A) goed B2: DMSO-controle, (B) goed F3: celmeetgegevens suggereerden geen toxiciteit, maar MTT-gegevens deden, (C) goed E6: overgeschatte celtelling door MTT ten opzichte van tdtomato-telling, (D) goed G6 onderschat celtelling door MTT ten opzichte tdTomato. Alle beelden werden genomen bij 10x vergroting met behulp van een RFP filter met 531/593 nm golflengte voor excitatie/emissie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Curve voor log concentratie versus levensvatbaarheid percentage DMSO voor de compound in goed B5. De punten op de curve vertegenwoordigen de gemiddelde genormaliseerde levensvatbare cellen op zes doses ± standaardfout van het gemiddelde voor drie biologische replicaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: gemiddelden van tdTomato cellen genormaliseerd naar percentage DMSO-controle voor drie replicaatplaten ± standaarddeviatie. Goed arcering geeft volgende: rood, giftige verbindingen; geel, potentieel groei remmende; groen, potentieel groei verbetering. Geen arcering geeft aan dat verbindingen niet lijken te beïnvloeden celgroei.
Tabel 2: middelen van MTT-extinctie genormaliseerd naar percentage DMSO-controle voor drie replicaatplaten ± standaarddeviatie. Goed arcering geeft volgende: rood, giftige verbindingen; geel, potentieel groei remmende; groen, potentieel groei verbetering. Geen arcering geeft aan dat verbindingen niet lijken te beïnvloeden celgroei.
| Goed | Samengestelde | Notities |
| B2 | Dmso | Negatieve controle |
| C2 | Kamp | Proteïne kinase een activator |
| D2 | FRACTALKINE | Chemokine |
| E2 | LDN212854 | Botmorfogenetische proteïne (BMP) receptor remmer |
| F2 | AG370 | Bloedplaatjes afgeleide groeifactor receptor (PDGFR) kinase remmer |
| G2 | DAPT | Gamma-secretase remmer; neuronale differentiatie positieve controle |
| B3 | AY9944 | 7-dehydrocholestrol reductase remmer; Egel pathway remmer |
| C3 | STA-21 | Signaal transducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) inhibitor |
| D3 | GM-CSF | Granulkocyte-macrofaag kolonie-stimulerende factor; Cytokine |
| E3 | TNP470 | Methionine aminipeptidase-2-remmer |
| F3 | Bio | Glycogeen synthase kinase-3 inhibitor; WNT pathway Activator |
| G3 | CNTF | Ciliaire neurotrophic factor; Neuropeptide |
| B4 | Sant | Gladgestreekte receptor antagonist; Egel pathway remmer |
| C4 | AG825 | ERBB2 inhibitor |
| D4 | M-CSF | Macrofaag kolonie-stimulerende factor; Cytokine |
| E4 | STATTISCH | Signaal transducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) inhibitor |
| F4 | SC79 | AKT (proteïne kinase B) Activator |
| G4 | DMH1 | Botmorfogenetische proteïne (BMP) receptor remmer |
| B5 | WP1066 | Signaal transducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) inhibitor |
| C5 | Insuline | |
| D5 | IL-3 | Interleukine-3; Cytokine |
| E5 | AG494 | Epidermale groeifactor receptor (EGFR) remmer |
| F5 | LY294002 | Fosfoinosotide 3-kinase remmer |
| G5 | IGF2 | insuline groeifactor-2 |
| B6 | Sag | Gladgestreekte agonist; Egel pathway Activator |
| C6 | AG370 | Bloedplaatjes afgeleide groeifactor receptor kinase remmer |
| D6 | Dmso | Negatieve controle |
| E6 | EC23 | Retinoïnezuur receptor agonist |
| F6 | TORIN2 | Mechanistisch doelwit van rapamycine (MTOR) remmer |
| G6 | Y27362 | Rho-geassocieerde, spiraalvormige spiraal met proteïne kinase (GESTEENTE) remmer |
| B7 | CELECOXCIB | Cyclooxygenase-2 (COX-2) remmer |
| C7 | SB525334 | Transformerende groeifactor Beta-receptor (TGBFR) remmer |
| D7 | DAPT | Gamma-secretase remmer; neuronale differentiatie positieve controle |
| E7 | CHIR99021 | Glycogeen synthase kinase-3 inhibitor; WNT pathway Activator |
| F7 | LDN 193189 | Botmorfogenetische proteïne (BMP) receptor remmer |
| G7 | TARAZOTINE | Retinoïnezuur receptor agonist |
| B8 | AM580 | Retinoïnezuur receptor agonist |
| C8 | DHBP | Calcium afgifte remmer |
| D8 | Jsk | Stikstofmonoxide donor |
| E8 | DORSOMORPHIN | Botmorfogenetische proteïne (BMP) receptor remmer; 5 ' adenosine monophospate-geactiveerde proteïne kinase (AMPK) inhibitor |
| F8 | IMATINIB | Tyrosine kinase remmer |
| G8 | BMS 493 | inverse retinoïnezuur receptor agonist |
| B9 | CYCLOAMINE | Gladgestreekte receptor antagonist; Egel pathway remmer |
| C9 | SEMAGACESTAT | Gamma-secretase remmer |
| D9 | BOSUTINIB | Tyrosine kinase remmer |
| E9 | PURMORPHAMINE | Gladgestreekte agonist; Egel pathway Activator |
| F9 | Jag | Gekartelde Inkeping receptor agonist |
| G9 | SB431542 | Transformerende groeifactor Beta-receptor (TGBFR) remmer |
| B10 | SC79 | AKT (proteïne kinase B) Activator |
| C10 | DANTROLEEN | Ryanodine receptor antagonist |
| D10 | TYRPHOSTIN46 | Epidermale groeifactor receptor (EGFR) remmer |
| E10 | AM80 | Retinoïnezuur receptor agonist |
| F10 | IFN-Y | interferon-gamma; Cytokine |
| G10 | PQ401 | Insuline-achtige groeifactor receptor (IGF1R) inhibitor |
| B11 | DAPT | Gamma-secretase remmer; neuronale differentiatie positieve controle |
| C11 | A2M | Extracellulaire glycoproteïne; proteaseremmer |
| D11 | AG490 | Epidermale groeifactor receptor (EGFR) remmer |
| E11 | TYRPHOSTIN9 | Bloedplaatjes afgeleide groeifactor receptor (PDGFR) kinase remmer |
| F11 | BMP-2 | Botmorfogenetische proteïne-2 |
| G11 | Dmso | Negatieve controle |
Aanvullende tabel 1: lijst van primaire scherm verbindingen. Goed locatie, naam en notities op elk van de verbindingen die werd gebruikt in het primaire scherm worden geleverd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het primaire doel van dit artikel was om een strategie die efficiënt en goedkoop identificeren van verbindingen die van invloed zijn op de celgroei in een low-to matige doorvoer screening te beschrijven. Er werden twee orthogonale technieken gebruikt om het celnummer te beoordelen om het vertrouwen in de conclusies te vergroten en aanvullende inzichten te bieden die niet beschikbaar zouden zijn als slechts één enkele test werd gebruikt. Een van de assays gebruikt een fluorescerende celimager om rechtstreeks tdtomaat-positieve cellen te tellen en de tweede was afhankelijk van het goed gekarakteriseerde vermogen van mitochondriën om MTT te klieven naar formazans en diende dus als een proxy voor cel nummer10. In deze demonstratie werden in totaal 57 teststoffen beoordeeld, hoewel de MTT-vleugel van de test is gebruikt voor het testen van een bibliotheek met maar liefst 2.000 samengestelde14. De resultaten van het scherm wezen erop hoe de twee assays elkaar konden versterken bij het bereiken van bepaalde conclusies met meer vertrouwen, en uitgelichte scenario's waarin de twee assays complementair waren met aanvullende informatie die normaliter moet ten minste twee afzonderlijke experimenten uitvoeren.
De meest kritieke stap in het protocol vindt plaats vlak voordat de cellen worden beplating. Metabole omstandigheden in de celcultuur kunnen zeer volatiel worden, vooral in het geval van glutamine en glucose consumptie, als cellen worden geseeid op een te hoge dichtheid17,18. Onder deze omstandigheden zal celdood te wijten zijn aan factoren die inherent zijn aan de celcultuur omstandigheden en geen verband met de toxiciteit van geteste verbindingen. Het resultaat zal een toename van valse positieven voor cytotoxische verbindingen en moeilijkheden bij het reproduceren van resultaten18. Succes bij deze stap vereist het kennen van de juiste celdichtheid van de cellijn die wordt gebruikt, nauwkeurige bepaling van het celnummer voor het beplating, en volledige resuspensie van cellen om te zorgen voor homogene plating verdeling binnen en tussen de putten van de 96 -goed bord. Het is ook belangrijk om visueel te bevestigen dat cellen aanwezig zijn op ongeveer de juiste dichtheid 2-3 h na het beplating door ze onder een microscoop te bekijken.
Wat de assays zelf betreft, is de meest kritieke stap voor de MTT-test ervoor te zorgen dat MTT volledig wordt opgelost in het celkweekmedium. Residuele precipitaten van MTT kunnen op zichzelf resulteren in acute cellulaire toxiciteit, dus het is belangrijk om MTT volledig te ontbinden met krachtige vortexing. Het meest kritische punt voor de celtelassay is het vaststellen van de juiste blootstellingstijd voor de beeldvorming van tdTomato. Blootstellings tijden die te kort zijn, kunnen resulteren in echt fluorescerende cellen die niet worden geteld door de software, en de blootstellings tijden die te lang zijn, kunnen het signaal zo sterk maken dat het naburige cellen samenvoegt, zodat de software meerdere cellen telt als één cel omdat het niet in staat is om ze op te lossen14. Bij de meeste softwarepakketten die bij Imaging-lezers worden geleverd, kan een voorbeeld stap worden weergegeven waarin wordt aangegeven welke cellen worden geteld. Het is belangrijk om deze voorbeeld stap op verschillende belichtingstijden uit te voeren en degene te kiezen die de fluorescerende cellen het nauwkeurigst identificeert.
Zoals met elke methode zijn er bepaalde beperkingen op deze testen. Om een hogere doorvoer te krijgen, gebruikt de primaire toxiciteitstest slechts één behandeling/enkelvoudige dosis paradigma die kan komen tot de kosten van meer valse positieven en valse negatieven. Bovendien, hoewel verschillende eerdere studies hebben aangetoond dat MTT zeer goed correleert met het nummer van de cel bij gebruik van ofwel een kolonie vormende assay19 of een thymidine incorporatie asssay20, behandeling met bepaalde verbindingen kan ofwel verbeteren of de mitochondriale activiteit op zodanige wijze remmen dat de resultaten van de test met MTT niet langer correleren met het cel nummer21. Resultaten van deze demonstratie geven aan dat terwijl MTT is uitstekend in het identificeren van giftige stoffen, haar vermogen om te identificeren van verbindingen die ofwel remmen of verbeteren van de proliferatie is beperkt misschien omdat dergelijke verbindingen veranderen mitochondriale activiteit in een manier dat het minder goed correleert met het celnummer. Er zijn ook enkele beperkingen aan de tdTomato tellings test. Een duidelijke beperking is de noodzaak om een cellijn stabiel een fluorescerende eiwit te laten uitdrukken. Recente ontwikkelingen in genoom manipulatie hebben het veel gemakkelijker gemaakt om dergelijke lijnen te ontwikkelen, maar het werk dat nodig is om ze te genereren, kan buiten de mogelijkheden van sommige laboratoria liggen. Vanuit technisch oogpunt, de grootste problemen met een celtelassay die beeldanalyse gebruikt, is het onvermogen van deze testen om onderscheid te maken tussen cellen die samen zijn gegroepeerd, resulterend in een ondertelling14, daarom is de juiste beplating cruciaal voor nauwkeurige resultaten. Een ander potentieel probleem is het tellen van dode of stervende cellen die fel fluoresceren zijn. Een manier om dit probleem te voorkomen is om cellen met PBS te wassen voordat deze worden geteld om deze achtergrond cellen te verwijderen. Dit kan niet handig zijn voor bepaalde minder goed aanheende cellen lijnen als levende cellen kunnen loskoppelen bij het wassen. Een alternatieve oplossing voor dit probleem is om de flexibiliteit te benutten die inherent is aan veel analyseprogramma's om de parameters voor celidentificatie binnen een smal bereik aan te passen, zodat alleen levende, fluorescerende cellen worden geteld.
De strategie beschreven in dit artikel biedt een krachtige manier om efficiënt te schermen tot enkele honderden verbindingen. De MTT assay uitlezen is het fysiologische resultaat van mitochondriale activiteit en kan cellijn of samengestelde-specifieke effecten die onnauwkeurige resultaten kunnen produceren4,21. Door het te combineren met een celtelassay met behulp van een fluorescerende Reporter, kunnen deze beperkingen sterk worden verzacht. Zoals u zien, kan het vergelijken van de resultaten van beide assays leiden tot een nauwkeurigheid van 100% bij het identificeren van toxische verbindingen. Een vorige studie heeft aangetoond dat er in een HEK293T lijn die stabiel is voor tdTomato, er een hoge IC50 correlatie bestaat tussen MTT en tdtomato voor een bibliotheek van giftige verbindingen22. Hoewel deze studie geen secundaire bevestigingen heeft uitgevoerd op voldoende hit-verbindingen om een vergelijkbare concordantie analyse uit te voeren, waren de berekende LD50 -waarden voor de drie geteste verbindingen vergelijkbaar.
Naast hun vermogen om conclusies over toxiciteit te versterken, kunnen de twee assays elkaar aanvullen bij het aanpakken van de potentiële groei remmende en proliferatieve effecten van test verbindingen. Voor verschillende teststoffen zijn de gegevens tussen de twee assays substantieel uiteengevoerd. Bij het onderzoeken van beelden van Tdtomaat fluorescentie voor sommige van deze verbindingen, er waren merkbaar morfologische veranderingen tussen de behandeling en controle. Dit suggereert dat de divergentie in de genormaliseerde waarden tussen de twee assays kan worden gebaseerd op fysiologische veranderingen die differentieel invloed hebben op de MTT uitlezen en het aantal tdTomato cellen. De mogelijkheid om dergelijke gegevens met een enkel experiment te verwerven, vergroot de robuustheid van deze strategie aanzienlijk, waardoor deze meer algemeen toepasbaar is. Als zodanig, het heeft de capaciteit niet alleen om toxische verbindingen met hoge nauwkeurigheid te identificeren, maar om te wijzen op verbindingen met meer subtiele effecten op celgroei/fysiologie die meer uitgebreid kan worden gekarakteriseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het NINDS Intramural Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
