Summary
לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.
Abstract
רעילות ציטוזה הוא פרמטר קריטי שצריך לכמת כאשר לימוד תרופות שעשויות להיות בעלי הטבות טיפוליות. בגלל זה, הרבה סמים הקרנת התרופה לנצל את הרעילות בתור אחד המאפיינים הקריטיים להיות פרופיל עבור תרכובות בודדות. תאים בתרבות הם מודל שימושי כדי להעריך את הרעילות לפני שתמשיך לעקוב אחר תרכובות עופרת מבטיח יקר יותר, עבודה אינטנסיבית בעלי חיים מודלים. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים ב tdTomato ביטוי בתאי גזע האדם העצבי (המועצה לבטחון לאומי) קו. האסטרטגיה משתמשת בשני משלים משלימים להערכת מספר התא. שיטת עבודה אחת פועלת באמצעות הפחתה של 3-(4, 5-diמתילתיול-2-yl)-2, 5-diפנילטיזויום ברומיד (MTT) כדי formazan כמו פרוקסי עבור מספר התא והשני במישרין סופרת את tdTomato המבטאת NSCs. שתי הדרישות יכולות להתבצע בו זמנית בניסוי אחד ואינן העבודה האינטנסיבית, המהירה והזולה. האסטרטגיה המתוארת בהפגנה זו נבדקה 57 תרכובות במסך ראשי מנוסה לרעילות בפורמט 96-באר הצלחת. שלוש מהתצפיות הוגדרו עוד יותר בתגובה למינון של שש נקודות, תוך שימוש באותה מערכת הערכה כמסך הראשי. בנוסף למתן אימות מעולה עבור רעילות, השוואה של תוצאות שתי בחני עשוי להיות יעיל בזיהוי תרכובות המשפיעות על היבטים אחרים של צמיחת תאים.
Introduction
אחד המאפיינים החשובים ביותר שצריך להיקבע עבור תרכובת כימית כי יש פוטנציאל טיפולי הוא רעילות שלה לתאי בעלי חיים. מאפיין זה יקבע אם הסם הוא מועמד טוב למחקר מקיף יותר. ברוב המקרים, תרכובות עם רעילות מינימלית מבוקשים אך ישנם מצבים בהם מתחם בעל יכולת להרוג סוגי תאים ספציפיים הוא עניין, למשל, תרופות אנטי-מוריגניות. למרות בעלי חיים שלמים הם מערכות מודל הטובה ביותר כדי לקבוע רעילות מערכתית, העלות והעבודה מעורבים הוא מונע כאשר כמה תרכובות צריך להיבדק. כגון תרבות תא של היונקים משמש בדרך כלל כחלופה היעילה ביותר1,2. מסכי הסמים קטנים עד בינוניים הם מודאליות חשוב שדרכו רעילות ניתן להעריך בתרבות התא. מסכי אלה ניתן להשתמש כדי לחקור ספריות מסומן מיקוד מסלולים בודדים איתות. הפורמט הכללי של מסך כזה הוא בתחילה לבדוק את כל התרכובות בספרייה במינון אחד (בדרך כלל 10 μM) במסך רעילות העיקרי גישוש, ולאחר מכן לבצע מינון מעמיק התגובה במינון המסך כדי לאפיין במלואו את רעילות פרופיל של כניסות מהמסך הראשי. השיטות ליישום אסטרטגיה זו יתואר כאן ויספקו דרך מהירה, יעילה וזולה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות.
פותחו מספר שיטות כדי להעריך את הרעילות של תרכובות קטנות וננו בתאי מיונקים3,4. יש לציין כי חומרים מסוימים יכולים לקיים אינטראקציה עם הספקות המספקים תוצאות מטעות, ואינטראקציות כאלה יש לבדוק כאשר מדובר במאפיינים של מסכי רעילות4. רעילות ציטודיטוקסין כוללת טריפן כחול5, לקטט דהידרוגנאז (ldh) שחרור התשובה6, alamar שיטת כחול7, מתיל אסתר (AM)8, ואת שיטת ATP9. כל אלה בחני למדוד היבטים שונים של מטבוליזם התא אשר יכול לשמש proxy עבור מספר התא. בעוד שכולם מציעים יתרונות, aszo, מלח מבוסס על מלחים כגון 3-(4, 5-diמתילthizol-2-yl)-2, 5-דיפנפניזויום ברומיד (MTT), 2, 3-bis (2-מתיונין-4-ניטרו-5-sulfopheny)-2H-טטרזויום-5-carboxyande מלח פנימי (XTT)-1, ו-4-(3-[4- שפתי-על-2-[4-ניטרוגליצרין)-2H-5-טטרזוליו-1, 3-בנזין דיסולולאט (WST-1)10, 11 לספק דיוק טוב וקלות השימוש בעלות נמוכה. MTT, אשר ישמשו בהפגנה זו, הוא הופחת לתוך בלתי מסיסים על ידי מיטוכונדריאלי ושיעור ההמרה הזאת באופן מאוד מתאים למספר התא. מקרה זה נוצל באופן שגרתי הן בקנה מידה קטן והן לסינון ספריות עם עד 2,000 תרכובות12. ספירה ישירה של תאים על-ידי סמן המסומן בתווית מציעה שיטה נוספת להערכת המספר הסלולרי, ובשונה מהזמינותו של MTT היא יכולה לספק מידע נוסף על הדינמיקה של צמיחת הסלולר. מספר אלגוריתמים זמינים לציבור זמינים לביצוע ניתוחים אוטומטיים של ספירת תאים וקיימים גם אלגוריתמים קנייניים המהווים חלק מחבילות תוכנה לקוראי תמונות13,14. בתיאור שיטה זה, קו גזע הגוף האנושי (למועצה לבטחון לאומי) שנערך באופן גנטי כדי להשוות את תוצאות הכדאיות התאית בין שיטת mtt וספירת תאים אוטומטיים הערכה במסך הערכת רעילות של 57 תרכובות מבחן. למרות שהמטרה העיקרית של האסטרטגיה הזאת הייתה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות, יש לה יתרון נוסף של הפוטנציאל לזיהוי מעכבות צמיחה ושיפור תרכובות הצמיחה וכך מספקת שיטה יעילה לזיהוי סמים שיכולים לווסת את הצמיחה התאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות המועצה לבטחון לאומי
הערה: מניפולציה של קו המועצה לבטחון לאומי מתוארת להלן, אך ניתן להשתמש בכל קו תא לפרוטוקול זה. כל העבודות בתרבית תאים מתבצעות בארון בטיחות ביולוגי.
- מעיל a 96-צלחת עם מטריצות קרום מרתף/מטריתאי (ECM).
- הפשרה של ECM (טבלת חומרים), שתקל על ההחזקה של המועצה לבטחון לאומי, על הקרח. לדלל ECM לריכוז המתאים (בדרך כלל 1:100) ב 10 mL בינונית בסיס (הטבלה של חומרים) ולהוסיף 50 μl לכל טוב לכל אחד 60 הבארות הפנימיות של צלחת 96-באר (איור 1). השתמש רק הפנים 60 בארות כדי למנוע חפצים שעלולים לנבוע אפקט הקצה16.
- תנו לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר או בחממה לתרבות התא (37 ° c, 5% CO2) לפחות 30 דקות.
- . תאי גזע עצביים
הערה: תאים לשימוש בשיטה זו יש לגדל לפחות 80% זרימה בבקבוקון T75.- תאי תרבות בבקבוקון T75 בחממה לתרבות התא ב-37 ° c ו-5% CO2 במדיום המועצה לבטחון לאומי המורכב בסיס בסיסי, B27, חומצות אמינו לא חיוניות, גלוטמין 2 מ"מ, ו-10 Ng/mL בסיסי הצמיחה פיברופיצוץ גורם (FGFb או FGF2).
- להסיר תאים מן החממה ברגע שהם מגיעים 80% המפגש ומוריד את מדיום המועצה לבטחון לאומי. הוסף כמות מתאימה של מגיב הדיסוציאציה של התא (3 מ ל עבור בקבוקון T75; רשימת חומרים) ו הדגירה עבור 5 דקות בחממה.
- לאחר הדגירה, להוסיף 7 מ ל של מדיום המועצה לבטחון לאומי ב T75 תרמוס ו פיפטה במרץ כדי להבטיח את כל התאים להיות מנותקים. העבר את פתרון התא המנתק ל-15 מ ל שפופרת ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט מהצינור והשהה את התאים מחדש ב-10 מ ל של בינונית ולאחר מכן מונה תאים.
- לקרוא ריכוז של תאים כדי 200,000 תאים/mL עם מדיום המועצה לבטחון לאומי. ודא שהתאים מושעים מחדש באופן מלא לציפוי אחיד לבארות.
- צלחת 100 μL של תערובת התא (20,000 תאים) ב 60 בארות הפנים של 3 96-טוב צלחות כי כבר מצופה כמתואר בסעיף 1.1. השתמש בשישה מתוך שמונת החריצים של משבצות רב-ערוצי בעלת 8 ערוצים לתאי לוח בטור בעמודה.
- הוסף 100 μL של בסיס בינוני או מדיום לבטחון לאומי לכל הבארות ללא תאים כדי למזער את האידוי הפוטנציאלי מבארות החיצוני.
- תחת מיקרוסקופ של תרבות התא, לבדוק באופן חזותי לפחות 10 בארות על כל אחד 3 96-היטב צלחות כדי לוודא כי התאים הם שנזרע על הצפיפות הצפויה. אל תמשיכו עם המבדק אם התאים מצופים בצפיפות דלילה מדי או צפופה מדי.
2. טיפול בתאים עם תרכובות
הערה: הספרייה תוצרת בית נבדק בהפגנה זו מכילה תרכובות לווסת את wingless/משולב (Wnt), חומצה retinoic, שינוי גורם הצמיחה-בטא (TGF-β), ו קיפוד קולי מסלולים איתות כמו גם מגוון של טירולי.
-
מסך ראשי גישוש עבור רעילות/מספר תאים
- מספר 50 ל-100 מ ל של עד 57 תרכובות מבחן (שולחן משלים 1) בריכוז של 10 מ"מ ב 100% diמתיל סולפוקסיד (dmso) לתוך הפנים 60 בארות של U-התחתית, V-תחתית או עגול-התחתית 96-באר צלחת עם שלושה dmso בארות כפקד (לראות איור 1 עבור מפת צלחת). זה ישמש את הצלחת המתחם הראשי עם 25 μL של תרכובת זה יכול להיות קפוא להפשיר מספר פעמים.
הערה: לוחות בעלי תחתית שטוחה לא צריך לשמש כפי שיהיה קשה יותר לחלק כמויות קטנות של תרכובות מתוכם עם פיאור ספסל העליון. - הסר את לוחיות התרבות של התאים מחממה 16-24 h לאחר פיצול כמתואר בסעיף 1 ולאחר שהוא מוריד את המועצה ההמועצה לבטחון לאומי על-ידי עמודה עם שמונה ערוצים רב-ממדי, תוך שימוש בשישה מתוך שמונה משבצות מרובות היטב. הוסף 95 μL של מדיום טרי לבטחון לאומי לתאים בכל אחד משלושת הצלחות לשכפל לוחות למקם בחזרה בחממה עד שלב 2.1.4 למטה הוא הושלם.
- הוסף 49 μL של המדיום המועצה לבטחון לאומי לכל אחד הפנים 60 בארות של התחתית הריקה U, V-בתחתית או התחתית העגולה 96-באר עם שמונה ערוצים multi-היטב פיפטורים. בטל את החותם של צלחת המתחם הראשי ולהשתמש בצינורות העליון הספסל או מכשיר שווה ערך לפיילט 1 μL של תרכובת מלוחית הבסיס לתוך 49 μL של המועצה לבטחון לאומי בכל אחד הפנים 60 בארות.
- מערבבים את מתחם 3x מדולל עם הספסל העליון מושב צינורות.
- הסר את 3 96-צלחות הבאר של NSCs מן החממה, פיפטה 15 μL של כל מתחם מדולל עם פיאור הספסל העליון ולוותר 5 μL ליטר של תרכובת לתוך כל אחד משלושת הצלחות.
הערה: זה 1:20 דילול של תרכובת לתוך התאים בשילוב עם הראשונית 1:50 דילול בשלב 2.1.3 תשואות 1:1000 לדילול כזה את הריכוז הסופי של תרכובות על NSCs יהיה 10 μM עם ריכוז DMSO של 0.1% ואת הסופי ריכוז עבור שולטת DMSO יהיה 0.1%. - התאים דגירה עם תרכובת עבור 72 h ולהמשיך עם הרעלת ציטוזה. מרווחי זמן קצרים יותר ניתן להשתמש אבל תקופת הדגירה של 72 שעות צריך למקסם את ההשפעות הפוטנציאליות ציטוטוקסיים של תרכובות נבדק.
- מספר 50 ל-100 מ ל של עד 57 תרכובות מבחן (שולחן משלים 1) בריכוז של 10 מ"מ ב 100% diמתיל סולפוקסיד (dmso) לתוך הפנים 60 בארות של U-התחתית, V-תחתית או עגול-התחתית 96-באר צלחת עם שלושה dmso בארות כפקד (לראות איור 1 עבור מפת צלחת). זה ישמש את הצלחת המתחם הראשי עם 25 μL של תרכובת זה יכול להיות קפוא להפשיר מספר פעמים.
-
שיטת התגובה של המינון
הערה: ההגדרה עבור 96-השימוש הטוב במינון-תגובה מוצגת באיור 2.- השתמש בעמודה 2 עבור שישה משכפל בקרת DMSO ולבדוק טריליטים של עד שלושה תרכובות שונות בשתי מנות טוריות מתקפלות בשישה מינונים החל במינון גבוה של 10 μM.
- לדלל 4 μL של DMSO או מתחם בדיקה ב DMSO לתוך 196 μL של מדיום המועצה לבטחון לאומי בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. הוסף 25 μL של DMSO לעמודה של בארות מ-B2-G2 ו-50 μL של תרכובות הבדיקה לשורה מ B3-B11 עם שלושת התרכובות נבדק 10 מ"מ מטריפליטים בשורות B3-B5, B6-B8, ו B9-B11.
- פיפטה 25 μL של מדיום המועצה לבטחון לאומי לעמודות הריקות שנותרו בחלק הפנימי של צלחת 96-ובכן. הסרת 25 μL של תרכובת מבארות B3-B11 עם פיפטורים רב-ערוצית, להוסיף בארות C3-C11, ולערבב לפחות חמש פעמים. חזור על התהליך עבור השורות הנותרות כדי ליצור מטריליטים בשתי מנות מתקפלות עבור סכום כולל של שישה מינונים עבור כל אחד מהתרכובות.
- צור NSCs עבור תגובת המינון בדיוק כפי שמתואר עבור המסך הראשי בסעיף 2.1. תרכובות עבור תגובת המינון מתווספים ו מודבטים על התאים בדיוק כפי שמתואר בשלבים 2.1.5 ו 2.1.6.
הערה: שלושה משכפל ביולוגי של שיטת המענה המינון מתבצעים על-ידי חזרה על הNSCs במעברים שונים בימים נפרדים.
3. הדמיה של תאים בקורא לוחית
- לאחר התאים כבר מודבטים עם תרכובות עבור הזמן המוקצב, התמונה בתאי על הקורא צלחת לקבוע את מספר התא טרום הטיפול לכל טוב.
הערה: הוראות לתאי דימות הן ספציפיות לקורא, אך בדרך כלל מעקב אחר אסטרטגיה דומה. ההנחיות שלהלן חלות על הקורא המשמש בהפגנה זו (טבלת חומרים). - להסיר את הצלחת מן החממה ולמקם אותו בתוך קורא לוחית. פתח את תוכנת צמידה כדי להגדיר פרוטוקול ולהתנסות בקבצים עבור המחקר. עבור למצב ידני Imager על מנהל המשימות ולחץ על לכידת כעת....
- בחר 96-צלחת הבאר כסוג כלי, בחר 10x עבור ההגדלה, ו חלבון פלורסנט אדום (RFP) 531 ו 593 עבור הדמיה tdTomato. בחר באר, ולאחר מכן לחץ על פוקוס אוטומטי כדי למקד את התמונה, ו לחשוף אוטומטית לזמן חשיפה נאותה. התאם ידנית את המיקוד והחשיפה במידת הצורך.
- לאחר ההתמקדות הנכונה וחשיפה הושגו, לחץ על סמל המצלמה כדי ללכוד את התמונה. לאחר מכן לחץ על תהליך/לאנלאזי מעל התמונה כדי להמשיך בבניית הפרוטוקול ובחר בכרטיסיה ניתוח.
- לחץ על ניתוח סלולארי בשלב הוספת ניתוח לימין התמונה ולחץ על START (התחל). התמונה תציג תאים מסומנים כדי לציין כל תא בודד. ניתן ללחוץ על בחירת האפשרויות כדי לשנות פרמטרים כדי לבחור בתאים טובים יותר בהתבסס על סף הזריחה או על גודל התא. אם הצמידה סופר כראוי את התאים, ולאחר מכן לחץ על הוסף שלב בתחתית המסך.
- לחץ על הסמל בחלק העליון של המסך כדי ליצור ניסוי מערכת התמונות, אשר יפתח חלון עם הניסוי. לאחר פתיחה, לחץ על פרוצדורה תחת הכרטיסיה פרוטוקול ובחלון החדש שנפתח בחר קרא, ואז בחלון החדש לחץ על הצלחת המלאה כדי לבחור רק את 60 בארות המכילות את התאים (B2... G11). לחץ על אישור כדי לשמור את השינויים ולאחר מכן לחץ על אישור בחלון השגרה.
- הצלחת יכול כעת להיות בתמונה על ידי פרוטוקול זה ואת הקובץ ניסיוני ניתן לשמור. לחץ על סמל המחזה כדי להפעיל את הצלחת. לאחר שלוחית הרישוי הראשונה הייתה מהתמונה, התמונה של שני הצלחות האחרות. עם סיום ההדמיה, הורד את הנתונים של ספירת התאים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח. לקחת את כל התמונות בהגדלה 10x.
4. שיטת הרעילות מטרמינל MTT
הערה: הפעל את שיטת MTT בתוך שעתיים של השלמת הדמיה tdTomato.
- לעשות 5 מניות mg/mL MTT פתרון על ידי שקילה החוצה 25 מ"ג של MTT ולהשעות אותו ב 5 מ ל של מדיום המועצה לבטחון לאומי. וורטקס הפתרון עד שלא יהיו מאיצים גלויים של MTT, אשר יכול להימשך מספר דקות.
- הסר את לוחיות התרבות של התאים מהאינקובטור ושרטט את מדיום תרבות התא. לדלל MTT 1:10 בינונית תרבות התא ולהוסיף 100 μL של MTT כל טוב של תאים.
- התאים הדגירה ב 37 ° צ' צלזיוס עבור 2 h. מזרז ארגמני צריך להיות גלוי בערך בפרופורציה למספר התאים בבאר. או מוריד את פתרון MTT את הצלחות או להפוך את הצלחת במהירות כדי לחבוט פתרון מתוך הצלחת.
- הוסף 50 μL של 100% DMSO לכל היטב ולנענע צלחות בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות ב 400 rpm. קראו את ספיגת הבאר ב595 nm בקורא צלחות והיצוא נתונים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח.
5. ניתוח נתונים
- בצע ניתוח של ספירות תאים של tdTomato וספיגת התוכנה עם התוכנות המתאימות (גיליון אלקטרוני מסחרי, R). חישוב ממוצעים לספיגה או ספירת תאים של שלושה משכפל DMSO על כל צלחת לצורך נורמליזציה, לאחר מכן לחלק את הערך עבור ספירת תאים או ספיגה של כל הבאר על הצלחת על ידי ממוצע זה ולהמיר לאחוזים. הדבר מניב את ספירת התאים המנורמלת או הספיגה ביחס ל-DMSO עבור כל צלחת.
- חשב את הספירה המנורמלת או הספיגה וסטיית התקן עבור שכפול בארות על שלושת הלוחות.
הערה: בשלב זה אמורות להיות ארבע סדרות שונות של ערכים מנורמל: אחד עבור כל אחד מהלוחות וממוצע אחד עבור שלושת לוחיות השכפול. - להיות שמרני ולהשתמש בערך מנורמל בתוך או מתחת 25% עבור הממוצע על פני שלושה לוחות לשכפל לסווג תרכובת כמו רעילים. גם, כי רק טיפול יחיד לכל מתחם מבוצע על כל צלחת, רק התווית תרכובות ליפול מתחת לסף זה על כל שלושת לוחיות לשכפל כמו רעיל. לבחון תמונות פלורסנט של כל התרכובות כי ניתוח זה מסננים רעילים כדי לאשר חזותית רעילות.
הערה: הזיהוי של תרכובות עם אפקט של המשך צמיחה או שיפור הצמיחה קשה יותר להעריך את הערך הניסויי של סוג זה עקב חוסר שכפול על כל צלחת. עם זאת, להלן דרך מהירה לזהות תרכובות שעשויות להאט או לשפר את הצמיחה התאית. - חשב את סטיית התקן עבור שלושת שכפול הפקדים DMSO על כל צלחת ולאחר מכן לסנן עבור כל התרכובות בעלי ערכים ממוצעים לפחות שתי סטיות סטנדרטיות מעל או מתחת לפקד DMSO. תרכובות שנופלות ממסנן זה על כל אחד משלושת הלוחות רשאים לבצע חקירה נוספת.
- השתמש באותה אסטרטגיית ניתוח למענה המינון כמסך הרעילות העיקרי. חשב את הממוצעים עבור בקרת DMSO עבור כל שכפול ביולוגי והשתמש בערכים אלה כדי לנרמל את אחוז התאים החיים או אחוזי הספיגה של אחוזים עבור כל שילוב של תרכובת/מינון. חשב את האמצעים ואת השגיאה הסטנדרטית של האמצעים עבור כל שילובי התרכובת/מינון עבור שלושת המשכפלת הביולוגית.
- הפוך את הריכוז לערך יומן הרישום שלו, צור עקומת מינון עבור יומן הריכוז לעומת יכולת הקיום המנורמלת, והתאם את העקומה באמצעות ניתוח רגרסיה לא ליניארי (ניתן לבצע ניתוח ב-R או במספר סטטיסטי מסחרי חבילות). לחשב את המינון הקטלני 50 (או מבחינה טכנית במקרה זה מינון קיימא 50) או ריכוז של תרכובת שתוצאתה 50% רעילות מהמשוואה של עקום זה. חבילות תוכנה רבות יחושבו באופן אוטומטי איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנתונים האוטומטיים ספירת תאים זיהה אחד-עשר תרכובות עם פחות מ -25% כדאיות כאשר מנורמל לפקד DMSO בעוד נתוני MTT זיהה אותם תרכובות ועוד שני אחרים (טבלה 1 ושולחן 2, מוצל אדום). שני תרכובות נמצאו רעילים רק בתוך שיטת MTT (בארות F3 ו G10) היו 31% ו 39%, בהתאמה, מספר תאים tdTomato-חיוביים כפקד ועל ידי סדר הדירוג היו שני תרכובות רעילות ביותר הבאה בספריה זו לאחר אלה שנחשבו רעילים. ערכי סטיית התקן עבור שתי הבארות האלה לא הציעו שתהיה הבחנה בין שלושת הצלחות שמסטנות את הממוצע, וכאשר בודקים את המספרים עבור כל אחד משלושת הלוחיות שכפול, התרכובת לא ירדה מתחת ל -25% מסף הלוחות (הנתונים אינם מוצגים). תמונות מייצגות של זריחה tdTomato מוצגים ממספר בארות באיור 3. בחינת התמונות של שתי בארות הבדיקה של רעילות בין mtt ו ספירת תאים גילה כי תרכובות ב F3 (איור 3ב) ו G10 (איור 3ג) היו רעילים גם אם באחד משלושת הצלחות שכפול היו כמה שאריות תאים חיים בבאר G10 (נתונים לא מוצגים). נראה כי במקרה זה שיטת MTT היה מסוגל יותר להבקיע עבור רעילות ציטומות כמו לפעמים את האלגוריתם ספירת התא של imager בטעות נחשב תאים מתים/גוססים.
שיטת MTT מיועדת לקביעת רעילות, אך מכיוון שספריה עשויה להכיל תרכובות המשפרות ומעכבות את צמיחת התאים זה יהיה אינפורמטיבי כדי להעריך כיצד היכולת לכמת גם את ההשפעה הפוטנציאלית של העכבות והשפעות ההתרבות של תרכובות נבדק. כדי לעשות זאת נעשה שימוש במסנן לפיו תרכובות סווגו כמעכבות גדילה אם הספיגה המנורמלת שלהם או ספירות התאים היו גדולים מ -25% ופחות משתי סטיות סטנדרטיות מתחת לפקד משמעו על כל אחד משלושת הלוחות שכפול (מוצלל צהוב בטבלה 1 ובטבלה 2). אחד-עשר תרכובות נפגשו קריטריון זה לצורך ספירת תאים ורק שניים עבור שיטת MTT עם אחד בלבד (E10) חופפים בין שני מוסר למרות ששניים מתוך אחד עשר עבור שיטת ספירת תאים היו אלה שהוזכרו קודם לכן להיות רעילים על ידי שיטת MTT (F3 , G10).
תרכובות שהנורמלות שלהם היו שתי סטיות סטנדרטיות מעל אמצעי השליטה על כל אחד משלושת לוחיות השכפול סווגו כשיפור גדילה (ירוק מוצלל בטבלה 1 ובטבלה 2). רק תרכובת אחת מתאימה לקריטריון זה לכל שיטת הפעולה והתרכובת לא חופפת בין הנאמר. בדיקה נוספת של תמונות של בארות עם אי-התאמות בין MTT לבין ספירת התאים מציין כי בבארות מסוימים מסוימים שבהם התאים MTT ההערכת היתר ביחס לבחינה tdTomato שהתאים נראו גדולים יותר (איור 3ג) , ואילו אלה בארות שבהם MTT העריכו התאים ביחס tdTomato התאים הופיעו קטן (איור 3ד). לסיכום, שיטת tdTomato מסווגת אחד-עשר תרכובות כמו רעילים, 11 כמו מעכבות גדילה, ואחד כמו צמיחה שיפור עם 34 אין השפעה נראית לעין על צמיחת תאים (שולחן 1). השיטת MTT סיווג שלוש תרכובות רעיל, שניים כמו מעכבות גדילה, ואחד כמו צמיחה שיפור עם 41 אין השפעה נראית לעין על צמיחת תאים (שולחן 2).
מינון שש נקודות במינון התגובה נערך על שלושה תרכובות שזוהו כרעילים. אלה שלושה תרכובות היו STAT3 מעכבי WP1066 (B5) ו stattic (E4) ו הקולטן באפידרמיס גורם מעכב הגידול טירל (E11). מינונים היו רצופים שתי קיפול שני להתחיל בריכוז מרבי של 10 μM וללכת ריכוז מינימלי של 312.5 ננומטר. הגרף של יומן הריכוז לעומת אחוז מנורמל של תאים קיימא הן עבור ספירת תאים והן mtt בחני עבור אחד מתרכובות אלה (WP1066) מוצג באיור 4. העקומה הוא שטוח יחסית ללא רעילות עבור ארבעת הריכוזים הנמוכים ביותר, נופל במהירות על מינון 5 μM, ויורד הרעילות כמעט מלא ב 10 μM. המנה הקטלנית 50 (LD50) חושבה כ 4.4 μm עבור השיטת tdTomato ו6.0 μm עבור שיטת ה-mtt. TdTomato ו MTT LD50 ערכים עבור שני התרכובות האחרות היו 3.4 μm ו 4.7 μm, בהתאמה, עבור סטטי, ו0.8 μm ו-1.6 μm, בהתאמה, עבור טרימhostin 9.
איור 1 : מפת הלוח עבור צלחת מתחם מאסטר בשימוש במסך רעילות הראשי. כל הבארות החיצוניות מוצללות באפור המעיד על כך שהם הכילו מדיה ללא תאים. שולטת DMSO (100%) מסומנות באותיות מודגשות בבארות B2, D6 ו-G11. כל הבארות המסומנים Cmpd הכילו תרכובות מבחן ייחודי בריכוז 10 מ"מ ב 100% DMSO. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : מפת הלוח עבור צלחת המתחם המשמש את התשובה במינון התגובה. כל הבארות החיצוניות מוצללות באפור המעיד על כך שהם הכילו רק אמצעי תקשורת ללא תאים. הפקדים של DMSO שוכנו בטור 2. מטריפליטים של כל שילובי התרכובת/המינון מצוינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : תמונות פלורסנט Tdtomato של בארות נבחרות 72 שעות לאחר הטיפול. (A) טוב B2: dmso שליטה, (ב) טוב F3: ספירת תאים נתונים הציע לא רעילות אבל mtt נתונים עשה, (ג) ובכן E6: ספירת תאים מהערכת הגודל על-ידי Mtt יחסית לספירת Tdtomato, (ד) גם G6 ספירת תאים לא העריכו על ידי mtt יחסית . אני מבין. כל התמונות צולמו בהגדלה של 10 x באמצעות מסנן RFP עם 531/593 ננומטר אורך גל עבור עירור/פליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : עקומת הריכוז של יומן הרישום מול הכדאיות אחוז DMSO עבור המתחם ב-B5 גם. הנקודות על העקומה מייצגות את התאים המנורמנים המנורמל הממוצעים בשש מנות ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע עבור שלושה משכפל ביולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: אמצעי של תא tdTomato הספירות מנורמל לאחוז DMSO בקרה עבור שלושה לוחיות שכפול ± סטיית תקן. הצללה מציינת בהמשך: תרכובות אדומות, רעילות; צהוב, פוטנציאל העכבות הצמיחה; ירוק, פוטנציאל לשיפור הצמיחה. אין הצללה מציינת כי לא נראה שתרכובות משפיעות על צמיחת תאים.
טבלה 2: אמצעי ספיגה של MTT מנורמל לאחוז בקרת DMSO עבור שלושה לוחיות שכפול ± סטיית תקן. הצללה מציינת בהמשך: תרכובות אדומות, רעילות; צהוב, פוטנציאל העכבות הצמיחה; ירוק, פוטנציאל לשיפור הצמיחה. אין הצללה מציינת כי לא נראה שתרכובות משפיעות על צמיחת תאים.
| ובכן | מתחם | ערות |
| B2 | דימתיל סולפוקסיד | שליטה שלילית |
| C2 | מחנה | קינאז activator חלבון |
| D2 | שבירה | כימוקין |
| E2 | LDN212854 | מעכב הקולטן חלבון מורורגנטי (BMP) |
| F2 | AG370 | טסית דם הנגזרת קולטן גורם הגדילה (PDGFR) קינאז מעכבי |
| G2 | DAPT | מעכבי גמא-הפרשה; בקרה עצבית |
| B3 | AY9944 | 7-dehydro, מעכב רדוקטאז; קיפוד מעכב מסלול |
| C3 | כוכב המשך 21 | מתמר האות והactivator של שעתוק 3 (STAT3) מעכב |
| D3 | מוטורס-שדרתי | ממקרופאג גר, גורם ממריץ מושבה; ציטוקינים |
| E3 | TNP470 | מתיונין אמיניפטיפדאז-2 מעכבי |
| F3 | ביו | גליקוגן סינתאז קינאז-3 מעכבי; מסלול WNT activator |
| G3 | מיכל הונגרי | הגורם הneurotrophic סיליארי; נוירופפטיד |
| B4 | SANT | היריב הקולטן Smoothened; קיפוד מעכב מסלול |
| C4 | AG825 | מעכבי ERBB2 |
| D4 | מדיום-שדרתי | גורם ממריץ המושבה המקרופאג; ציטוקינים |
| E4 | מיכל סטטיק | מתמר האות והactivator של שעתוק 3 (STAT3) מעכב |
| F4 | SC79 | AKT (קינאז) מactivator |
| G4 | DMH1 | מעכב הקולטן חלבון מורורגנטי (BMP) |
| B5 | WP1066 | מתמר האות והactivator של שעתוק 3 (STAT3) מעכב |
| C5 | אינסולין | |
| D5 | איל-3 | אינטרלוקין-3; ציטוקינים |
| E5 | AG494 | קולטן של גורם גדילה עוריות (EGFR) מעכב |
| F5 | LY294002 | פוספולנוסוטייד 3-קינאז |
| G5 | IGF2 | גידול אינסולין פקטור 2 |
| B6 | תאנ | Smoothened אגוניסט; קיפוד מסלול activator |
| C6 | AG370 | טסית דם נגזר גורם הצמיחה הקולטן קינאז מעכבי |
| D6 | דימתיל סולפוקסיד | שליטה שלילית |
| E6 | EC23 | אגוניסט קולטן חומצה retinoic |
| F6 | TORIN2 | המטרה המכונה של rapamycin (MTOR) מעכב |
| G6 | Y27362 | מעכב-סליל המכיל את מעכבי החלבון קינאז (ROCK) |
| B7 | לינה והנקה | מעכב ציקלוחמצן 2 (קוקס-2) |
| C7 | SB525334 | שינוי גורם הגדילה קולטן ביתא (TGBFR) מעכב |
| D7 | DAPT | מעכבי גמא-הפרשה; בקרה עצבית |
| E7 | CHIR99021 | גליקוגן סינתאז קינאז-3 מעכבי; מסלול WNT activator |
| F7 | LDN 193189 | מעכב הקולטן חלבון מורורגנטי (BMP) |
| G7 | טאראזובטין | אגוניסט קולטן חומצה retinoic |
| B8 | AM580 | אגוניסט קולטן חומצה retinoic |
| C8 | מבעלי לחץ דם | מעכבי שחרור סידן |
| D8 | ג'מסק | תרומת תחמוצת החנקן |
| E8 | דורסופין | העצם מורפולגנטיקה של חלבון (BMP) מעכב קולטן; 5 ' אדנוזין monophospate-הופעל חלבון קינאז (AMPK) מעכב |
| F8 | IMATINIB | מעכבי טירולך קינאז |
| G8 | . עב מ 493 | אגוניסט לקולטן חומצה retinoic הופכי |
| B9 | ציקלופאפין | היריב הקולטן Smoothened; קיפוד מעכב מסלול |
| C9 | מיכל ששון | מעכבי גמא-הפרשה |
| D9 | בוסוטיקוב | מעכבי טירולך קינאז |
| E9 | מיכל פרמורמינה | Smoothened אגוניסט; קיפוד מסלול activator |
| F9 | יגואר | שוננים אגוניסט קולטן מדרגה |
| G9 | SB431542 | שינוי גורם הגדילה קולטן ביתא (TGBFR) מעכב |
| B10 | SC79 | AKT (קינאז) מactivator |
| C10 | מיכל בלנוב | היריב הקולטן ריאנבודן |
| D10 | TYRPHOSTIN46 | קולטן של גורם גדילה עוריות (EGFR) מעכב |
| E10 | AM80 | אגוניסט קולטן חומצה retinoic |
| F10 | IFN-Y | אינטרפרון-גמא; ציטוקינים |
| G10 | PQ401 | מעכב (IGF1R) של קולטן גורם הגדילה כמו אינסולין |
| B11 | DAPT | מעכבי גמא-הפרשה; בקרה עצבית |
| C11 | A2M | תמציות גליקופרוטאין; מעכב פרוטאז |
| D11 | AG490 | קולטן של גורם גדילה עוריות (EGFR) מעכב |
| E11 | TYRPHOSTIN9 | טסית דם הנגזרת קולטן גורם הגדילה (PDGFR) קינאז מעכבי |
| F11 | BMP-2 | העצם מורורגנטית חלבון-2 |
| G11 | דימתיל סולפוקסיד | שליטה שלילית |
טבלה משלימה 1: רשימה של תרכובות המסך הראשי. ובכן מיקום, שם והערות על כל אחד מהתרכובות ששימשו במסך הראשי מסופקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה העיקרית של מאמר זה הייתה לתאר אסטרטגיה שיכולה ביעילות ובזול לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים בהקרנה נמוכה עד בינונית תפוקה. שתי טכניקות אורתוגונאליות נוצלו להערכת מספר התאים כדי להגביר את האמון במסקנות ולהציע תובנות נוספות שלא יהיו זמינות אם נעשה שימוש באחד בלבד. אחד הבחני אומר השתמשו תא פלורסנט צמידה כדי לספור ישירות tdtomato-חיוביים תאים השני היה תלוי היכולת המאופיינת היטב של המיטוסים כדי לדבוק mtt כדי formazans ובכך משמש proxy עבור תא מספר10. סך של 57 תרכובות מבחן העריכו בהפגנה זו למרות האגף MTT של הבחינה שימש לבדיקת ספרייה עם רבים כמו 2,000 מתחם14. תוצאות המסך הצביעו על האופן שבו שני הדברים יכולים לחזק אחד את השני בהשגת מסקנות מסוימות ביתר ביטחון, ותרחישים מסומנים שבהם שני הדברים היו משלימים המספקים מידע נוסף שהיה בדרך כלל דורשות ביצוע לפחות שני ניסויים נפרדים.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול מתרחש רק לפני ציפוי התאים. התנאים מטבולית בתרבות התא יכול להיות נדיף מאוד, במיוחד במקרה של הצריכה גלוטמין וגלוקוז, אם התאים הם שנזרע בצפיפות גבוהה מדי17,18. תחת תנאים אלה תא מוות יהיה בשל גורמים הקשורים לתנאי תרבות התא ולא קשור רעילות של תרכובות נבדק. התוצאה תהיה להגדיל בתוצאות חיוביות שווא עבור תרכובות ציטוטוקסיים, כמו גם קושי בתוצאות שחזור18. הצלחה בשלב זה דורש לדעת את צפיפות התא המתאים של קו התא בשימוש, קביעת מדויק של מספר התא לפני ציפוי, והשעיית מחדש של תאים כדי להבטיח הפצת ציפוי הומוגנית בתוך ומעבר הבארות של 96 . צלחת טובה חשוב גם לאשר באופן חזותי כי תאים נמצאים בערך בגובה 2-3 h הצפיפות הנכונה לאחר ציפוי על ידי מסתכל עליהם תחת מיקרוסקופ.
ככל שהasas מספר את עצמם, הצעד הקריטי ביותר עבור שיטת MTT הוא להבטיח כי MTT מומס לחלוטין במדיום תרבות התא. משקעים שיורית של MTT עשוי בעצמם לגרום לרעילות תאית חריפה, כך חשוב לפזר לחלוטין MTT עם vortexing נמרץ. הנקודה הקריטית ביותר עבור שיטת ספירת התאים היא לקבוע את זמן החשיפה הנכון להדמיה tdTomato. זמני חשיפה כי הם קצרים מדי יכול לגרום לתאי פלורסנט באמת הולך שלא נספר על ידי התוכנה, וזמני חשיפה כי הם ארוכים מדי יכול להפוך את האות חזק כל כך שהוא מערבב תאים שכנים יחד כך התוכנה סופרת תאים מרובים בתא אחד משום שאינו מסוגל לפתור אותם14. רוב חבילות התוכנה הגיעות עם קוראי תמונות מאפשרות לשלב תצוגה מקדימה המציגה את התאים הנספרים. חשוב להריץ את הצעד הזה בתצוגה מקדימה בכמה פעמים חשיפה ולבחור את זה שמזהה תאי פלורסנט באופן מדויק ביותר.
כמו בכל שיטה יש מגבלות מסוימות על אלה מספר. כדי לצבור תפוקה גבוהה יותר, שיטת הרעילות העיקרית משתמשת רק טיפול יחיד/פרדיגמה מינון יחיד אשר יכול לבוא בעלות של תוצאות חיוביות שווא יותר שליליות שווא. בנוסף, למרות מספר מחקרים מוקדם יותר הראו כי mtt התואם מאוד טוב עם מספר הטלפון כאשר משתמשים או מושבה היווצרות שיטת19 או תימידין התאגדות asssay20, טיפול עם תרכובות מסוימות יכול לשפר או לעכב פעילות מיטוכונדריאלי באופן כזה, כי התוצאות של שיטת MTT כבר לא לתאם עם תא מספר21. תוצאות מתוך הפגנה זו עולה כי בעוד mtt הוא מצוין בזיהוי תרכובות רעילות, יכולתה לזהות תרכובות כי או לעכב או לשפר את התפשטות מוגבלת אולי בגלל תרכובות כאלה לשנות פעילות מיטוכונדריאלי ב אופן שבו הוא מתאים פחות טוב עם מספר התאים. ישנן גם מספר מגבלות לחישוב ספירת tdTomato. מגבלה ברורה היא הצורך להיות קו התא ביטוי באופן בלתי נשכח חלבון פלורסנט. ההתקדמות האחרונה בטיפול הגנום הפכו את זה הרבה יותר קל לפתח את הקווים האלה, אבל העבודה הנדרשת כדי לייצר אותם יכול להיות מעבר ליכולות של כמה מעבדות. מנקודת מבט טכנית, הבעיות הגדולות ביותר עם כל שיטת ספירת תאים המשתמשת בניתוח תמונה היא חוסר היכולת של אלה שאומר להבחין בין תאים המקובצים יחד וכתוצאה מכך של מספר14, ולכן, ציפוי נאות הוא קריטיים לתוצאות מדויקות. עוד בעיה פוטנציאלית היא ספירת התאים מת או גוסס שזוהר בבהירות. אחת הדרכים למנוע בעיה זו היא לשטוף תאים עם PBS לפני ספירה כדי להסיר את תאי הרקע האלה. זה לא יכול להיות נוח עבור מסוימים פחות הקפדה על שורות תאים כמו תאים חיים עשויים להתנתק על כביסה. פתרון אלטרנטיבי לבעיה זו הוא לנצל את הגמישות הטמונה בתוכניות ניתוח רבות כדי להתאים אישית את הפרמטרים לזיהוי תאים בתוך טווח צר, כך שחיים רק, תאי פלורסנט נספרים.
האסטרטגיה המתוארת במאמר זה מספקת דרך רבת עוצמה למסך ביעילות עד כמה מאות תרכובות. שיטת הבדיקה mtt היא התוצאה הפיזיולוגית של פעילות מיטוכונדריאלי ויכולה להיות בעלת קו תאים או אפקטיםספציפיים לתרכובת שיכולים להפיק תוצאות לאמדויקות 4,21. על-ידי שילובם בעזרת מונה התאים באמצעות כתב פלורסנט, ניתן לקבל מגבלות אלה במידה ניכרת. כפי שמוצג, השוואת התוצאות של שני בחני יכול לגרום קרוב ל 100% דיוק בזיהוי תרכובות רעילות. המחקר הקודם הראה כי בשורה HEK293T באופן בלתי נשכח tdTomato, יש גבוהה IC50 מתאם בין mtt ו tdtomato לספרייה של תרכובות רעילות22. למרות שהמחקר הזה לא הפעיל אישורים משניים על תרכובות פגע מספיק כדי לבצע ניתוח קונקורדנציה דומה, LD50 הערכים המחושבים עבור שלושת תרכובות שנבדקו היו דומים.
בנוסף ליכולתם לחזק את המסקנות בנוגע לרעילות, שתי האפשרויות יכולות להשלים אחד את השני כאשר מתייחסות לטיפול המעכבות וההשפעות המתרבים של תרכובות הניסוי. עבור מספר תרכובות בדיקה את הנתונים בין שתי המטרות מתפצלות באופן משמעותי. בעת בדיקת תמונות של זריחה tdTomato עבור חלק מהתרכובות הללו, היו שינויים מורפולוגיים בולטים בין הטיפול והשליטה. הדבר מרמז על כך שהסטייה בערכים המנורמניים בין שתי הפונקציות עשויה להתבסס על שינויים פיזיולוגיים שמשפיעים באופן מהותי על הבדיקה MTT ועל ספירת התאים של tdTomato. היכולת לרכוש נתונים כאלה באמצעות ניסוי אחד מגבירה במידה רבה את החוסן של האסטרטגיה הזאת והיא ישימה באופן כללי יותר. ככזה, יש לו את היכולת לא רק לזהות תרכובות רעילות עם דיוק גבוה אלא להצביע על תרכובות עם אפקטים עדינים יותר על צמיחת תאים/פיזיולוגיה שניתן לאפיין יותר בהרחבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר של NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
