Summary
غالباً ما يكون من الضروري تقييم السمية الخلوية المحتملة لمجموعة من المركبات على الخلايا المستزرعة. هنا، ونحن نصف استراتيجية لفحص موثوق للمركبات السامة في شكل 96 جيدا.
Abstract
السمية الخلوية هي معلمة حرجة تحتاج إلى تحديد كمية عند دراسة الأدوية التي قد تكون لها فوائد علاجية. وبسبب هذا، يستخدم العديد من الاختبارات فحص المخدرات السمية الخلوية باعتبارها واحدة من الخصائص الحرجة التي ينبغي تحديدها للمركبات الفردية. الخلايا في الثقافة هي نموذج مفيد لتقييم السمية الخلوية قبل الشروع في متابعة مركبات الرصاص الواعدة في نماذج حيوانية أكثر تكلفة وكثيفة العمالة. نحن نصف استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا في tdTomato التعبير عن الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSC) خط. وتستخدم الاستراتيجية اثنين من الاختبارات التكميلية لتقييم رقم الخلية. يعمل اختبار واحد عن طريق تخفيض 3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيزول-2-yl)-2,5-ثنائي الفينيل بروميد التترازوليوم (MTT) لتشكلكوكالة كوكيل لرقم الخلية والآخر يعد مباشرة tdTomato التعبير عن NSCs. يمكن إجراء الفحصين في وقت واحد في تجربة واحدة وليست كثيفة العمالة وسريعة وغير مكلفة. وقد اختبرت الاستراتيجية الموصوفة في هذه المظاهرة 57 مركباً في شاشة أولية استكشافية للسمية في شكل لوحة من 96 بئراً. وقد تم وصف ثلاثة من الضربات أكثر في استجابة جرعة من ست نقاط باستخدام نفس الإعداد اختبار الشاشة الأولية. وبالإضافة إلى تقديم دعم ممتاز للسمية، فإن مقارنة النتائج من الاختبارين قد تكون فعالة في تحديد المركبات التي تؤثر على جوانب أخرى من نمو الخلايا.
Introduction
واحدة من أهم الخصائص التي تحتاج إلى تحديد لمجمع كيميائي له إمكانات علاجية هو سميته للخلايا الحيوانية. هذه الخاصية ستحدد ما إذا كان الدواء هو مرشح جيد لدراسة أكثر شمولا. في معظم الحالات، يتم البحث عن مركبات مع الحد الأدنى من السمية ولكن هناك حالات فيها مركب مع القدرة على قتل أنواع محددة من الخلايا هو موضع اهتمام، على سبيل المثال، الأدوية المضادة للورم. على الرغم من أن الحيوانات كلها هي أفضل أنظمة نموذجية لتحديد السمية النظامية، فإن التكلفة والعمالة التي ينطوي عليها الأمر باهظة عندما تحتاج إلى اختبار أكثر من عدد قليل من المركبات. كما أن مثل هذه الثقافة الخلية الثدييات يستخدم عموما كبديل الأكثر كفاءة1،2. وشاشات المخدرات الصغيرة والمتوسطة الإنتاجية هي طريقة هامة يمكن من خلالها تقييم السمية في زراعة الخلايا. يمكن استخدام هذه الشاشات لاستجواب المكتبات المشروحة التي تستهدف مسارات الإشارات الفردية. الشكل العام لمثل هذه الشاشة هو اختبار في البداية جميع المركبات في المكتبة بجرعة واحدة (عموما 10 درجة مئوية) في شاشة سمية أولية استكشافية، ومن ثم إجراء شاشة استجابة جرعة ثانوية متعمقة لتوصيف السمية بشكل كامل ملف تعريف الزيارات من الشاشة الأساسية. وسيجري هنا وصف أساليب تنفيذ هذه الاستراتيجية وتوفير طريقة سريعة وفعالة وغير مكلفة لتحديد المركبات السمية وتوصيفها.
وقد وضعت أساليب متعددة لتقييم السمية الخلوية للمركبات الصغيرة والمواد النانوية في خلايا الثدييات3،4. وتجدر الإشارة إلى أن بعض المواد يمكن أن تتفاعل مع الفحص الذي يوفر نتائج مضللة، وينبغي اختبار هذه التفاعلات عند وصف الضربات من شاشات السمية4. وتشمل اختبار السمية الخلوية تريبان استبعاد الأزرق5، لاكتات dehydrogenase (LDH) اختبار الإصدار6، ألامار الأزرق اختبار7، استر الأسيتوإكسيميثيل (AM)8، وATP اختبار9. كل هذه الاختبارات قياس جوانب مختلفة من استقلاب الخلايا التي يمكن أن تكون بمثابة وكيل لرقم الخلية. في حين أن جميع الفوائد تقدم، والاختبارات المستندة إلى ملح تيترازوليوم مثل 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium بروميد (MTT)، 2،3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide الملح الداخلي (XTT)-1، و4-(3-4- يودوفينيل]-2-[4-نيتروفينل]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonate (WST-1)10,11 توفر دقة جيدة وسهولة الاستخدام بتكلفة منخفضة. يتم تقليل MTT، والتي سيتم استخدامها في هذه المظاهرة، إلى شكل غير قابل للذوبان عن طريق اختزال الميتوكوندريا ويرتبط معدل هذا التحويل بقوة مع رقم الخلية. وقد استخدم هذا الفحص بشكل روتيني على نطاق صغير وللمكتبات التي تعرض ما يصل إلى 000 2 مركب12. يوفر العد المباشر للخلايا بواسطة علامة مسماة طريقة أخرى لتقييم رقم الخلايا الخلوية، وعلى عكس فحص MTT يمكن أن يوفر معلومات إضافية حول ديناميات النمو الخلوي. تتوفر العديد من الخوارزميات المتاحة للجمهور لإجراء تحليلات حساب الخلايا الآلي وهناك أيضا خوارزميات الملكية التي هي جزء من حزم البرمجيات لقراء التصوير13،14. في هذا الوصف الأسلوب، فإن خط الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSC) التي تم تحريرها وراثيا للتعبير عن المكونة tdTomato15 بمثابة خط اختبار لمقارنة نتائج الصلاحية الخلوية بين اختبار MTT وحساب الخلايا الآلي الفحص في شاشة تقييم سمية 57 مركبات الاختبار. على الرغم من أن الهدف الرئيسي لهذه الاستراتيجية كان تحديد وتوصيف المركبات السامة، إلا أن لها فائدة إضافية تتمثل في احتمال تحديد مركبات النمو المثبطة وتعزيز النمو، وبالتالي توفر طريقة فعالة لتحديد الأدوية التي يمكن أن تعدل النمو الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1- ثقافة مجلس الأمن القومي
ملاحظة: سيتم وصف معالجة خط NSC الإنسان أدناه ولكن يمكن استخدام أي خط خلية لهذا البروتوكول. يتم تنفيذ جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية.
- معطف لوحة 96 جيدا مع غشاء الطابق السفلي / مصفوفة خارج الخلية (ECM).
- ذوبان aliquot من ECM(جدول المواد)،والتي من شأنها أن تسهل مرفق NSC، على الجليد. تخفيف ECM إلى التركيز المناسب (عموما 1:100) في 10 مل قاعدة متوسطة(جدول المواد)وإضافة 50 درجة مئوية لكل بئر من 60 الآبار الداخلية من لوحة 96 جيدا(الشكل 1). استخدام فقط الداخلية 60 الآبار لتجنب القطع الأثرية التي قد تنتج عن تأثير الحافة16.
- دع اللوحة تقع في درجة حرارة الغرفة أو في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- تفكك الخلايا الجذعية العصبية ولوحة.
ملاحظة: يجب أن تنمو الخلايا للاستخدام في هذا الأسلوب إلى التقاء 80% على الأقل في قارورة T75.- خلايا الثقافة في قارورة T75 في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في وسط NSC التي تتكون من المتوسطة الأساسية، B27، الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2 مل الجلوتامين، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الليفياللي الأساسية (FGFb أو FGF2).
- إزالة الخلايا من الحاضنة بمجرد أن تصل إلى 80٪ التقاء واستنشاق قبالة الأمن القومي المتوسطة. إضافة كمية مناسبة من كاشف انفصال الخلية (3 مل لقارورة T75؛ جدول المواد) وحضانة لمدة 5 دقائق في الحاضنة.
- بعد الحضانة، أضف 7 مل من وسط NSC في قارورة T75 والماصة بقوة لضمان انفصال جميع الخلايا. نقل حل الخلية المنفصلة إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
- بعد الطرد المركزي، إزالة supernatant من الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من الخلايا المتوسطة وحساب NSC.
- إعادة ضبط تركيز الخلايا إلى 200،000 خلية / مل مع وسط NSC. تأكد من إعادة تعليق الخلايا بالكامل للطلاء المتجانس في الآبار.
- لوحة 100 درجة مئوية من خليط الخلية (20،000 خلية) في 60 الآبار الداخلية من ثلاثة لوحات 96 جيدا التي تم المغلفة كما هو موضح في القسم 1.1. استخدم ستة من الفتحات الثمانية لـ pipettor متعدد القنوات 8 قنوات إلى خلايا اللوحة عمودًا بعمود.
- إضافة 100 درجة مئوية من المتوسطة الأساسية أو NSC المتوسطة إلى جميع الآبار دون خلايا لتقليل التبخر المحتمل من الآبار الخارجية.
- تحت مجهر ثقافة الخلية، فحص بصريا ما لا يقل عن 10 آبار على كل من لوحات 96 جيدا الثلاثة للتأكد من أن الخلايا هي البذر في الكثافة المتوقعة. لا تمضي قدما في فحص إذا كانت الخلايا مطلية بكثافة متفرقة جدا أو كثيفة.
2. علاج الخلايا مع المركبات
ملاحظة: المكتبة المصنوعة في المنزل التي تم اختبارها في هذه المظاهرة تحتوي على المركبات التي تعدل بدون جناح / متكاملة (Wnt)، حمض الريتينويك، وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، ومسارات الإشارات القنفذ سونيك، فضلا عن مجموعة متنوعة من كيناز التيروزين.
-
شاشة أولية استكشافية للسمية/رقم الخلية
- Aliquot 50-100 مل من ما يصل إلى 57 مركب اختبار(الجدول التكميلي 1)بتركيز 10 ملي متر في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في الآبار الداخلية 60 من لوحة U-bottomed، V-bottomed أو جولة القاع 96-جيدا مع ثلاثة آبار DMSO كتحكم (انظر الشكل 1 لخريطة لوحة). وهذا سيكون بمثابة لوحة مركب الرئيسي مع 25 درجة مئوية من المركب التي يمكن تجميدها وذابها عدة مرات.
ملاحظة: لا ينبغي استخدام لوحات مسطحة القاع كما أنه سيكون من الصعب أكثر لاستنشاق كميات صغيرة من المركبات منها مع أعلى pipettor مقاعد البدلاء. - إزالة لوحات ثقافة الخلية من حاضنة 16-24 ح بعد تقسيم كما هو موضح في القسم 1 واستنشاق قبالة NSC المتوسطة عمود اب بعمود مع 8 قناة متعددة الآبار pipettor باستخدام ستة فقط من فتحات متعددة الآبار الثمانية. إضافة 95 درجة مئوية من المتوسطة NSC الطازجة إلى الخلايا في كل من لوحات تكرار الثلاثة ووضع لوحات مرة أخرى في حاضنة حتى يتم الانتهاء من الخطوة 2.1.4 أدناه.
- إضافة 49 درجة مئوية من خط الأمن القومي المتوسطة إلى كل من الآبار الداخلية 60 من فارغة U-القاع، V-القاع أو جولة القاع 96 جيدا لوحة مع 8 قناة متعددة الآبار pipettor. فك لوحة مركب الرئيسي واستخدام أعلى pipettor مقاعد البدلاء أو ما يعادلها أداة لماصة 1 € L من مركب من لوحة رئيسية في 49 درجة مئوية من وسط NSC في كل من الآبار الداخلية 60.
- خلط مركب المخفف 3X مع أعلى pipettor مقاعد البدلاء.
- إزالة لوحات 96 جيدا من NSCs من الحاضنة، ماصة 15 درجة مئوية من كل مركب مخفف مع أعلى pipettor مقاعد البدلاء والاستغناء عن aliquot 5 ميكرول من المركب في كل من لوحات الثلاثة.
ملاحظة: هذا التخفيف 1:20 من المركب في الخلايا في تركيبة مع تخفيف الأولي 1:50 في الخطوة 2.1.3 ينتج تخفيف 1:1000 بحيث يكون التركيز النهائي للمركبات على NSCs 10 μM مع تركيز DMSO من 0.1٪ والنهائي سيكون تركيز عناصر تحكم DMSO 0.1%. - حضانة الخلايا مع مركب لمدة 72 ساعة والمضي قدما مع الاختبارات السمية الخلوية. ويمكن استخدام فترات أقصر ولكن فترة حضانة مدتها 72 ساعة ينبغي أن تزيد إلى أقصى حد من الآثار المحتملة للسمية الخلوية للمركبات المختبرة.
- Aliquot 50-100 مل من ما يصل إلى 57 مركب اختبار(الجدول التكميلي 1)بتركيز 10 ملي متر في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في الآبار الداخلية 60 من لوحة U-bottomed، V-bottomed أو جولة القاع 96-جيدا مع ثلاثة آبار DMSO كتحكم (انظر الشكل 1 لخريطة لوحة). وهذا سيكون بمثابة لوحة مركب الرئيسي مع 25 درجة مئوية من المركب التي يمكن تجميدها وذابها عدة مرات.
-
فحص استجابة الجرعة
ملاحظة: يتم عرض الإعداد لـ 96-well المستخدمة للاستجابة للجرعة في الشكل 2.- استخدام العمود 2 لستة DMSO التحكم يكرر واختبار ثلاثة مركبات مختلفة في تخفيف تسلسلي مرتين في ست جرعات بدءا من جرعة عالية من 10 μM.
- تخفيف 4 ميكرولتر من DMSO أو مركب اختبار في DMSO إلى 196 ميكرولتر من وسط NSC في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. إضافة 25 ميكرولتر من DMSO إلى عمود الآبار من B2-G2 و 50 ميكرولتر من مركبات الاختبار إلى الصف من B3-B11 مع المركبات الثلاثة المختبرة في ثلاثة أضعافم 10 m في الصفوف B3-B5 و B6-B8 و B9-B11.
- ماصة 25 درجة مئوية من NSC المتوسطة إلى الأعمدة الفارغة المتبقية في الجزء الداخلي من لوحة 96 جيدا. إزالة 25 ميكرولتر من المركب من الآبار B3-B11 مع pipettor متعددة القنوات، إضافة إلى الآبار C3-C11، ومزيج خمس مرات على الأقل. كرر عملية الصفوف المتبقية لتوليد ثلاثة توائم في تخفيف مزدوجة لما مجموعه ست جرعات لكل من المركبات.
- توليد NSCs للاستجابة للجرعة تماما كما هو موضح للشاشة الأولية في القسم 2.1. وتضاف مركبات استجابة الجرعة إلى الخلايا وتحتضنها تماماً كما هو موضح في الخطوتين 2-1-5 و2-1-6.
ملاحظة: يتم إجراء ثلاثة نسخ بيولوجية من اختبار استجابة الجرعة عن طريق تكرار الاختبار على NSCs في مقاطع مختلفة في أيام منفصلة.
3. خلايا التصوير على قارئ لوحة
- بعد أن تم احتضان الخلايا مع المركبات للوقت المخصص، خلايا الصورة على قارئ لوحة لتحديد رقم الخلية قبل المعالجة لكل بئر.
ملاحظة: إرشادات خلايا التصوير خاصة بالقارئ ولكن هاهي بشكل عام اتباع استراتيجية مشابهة. تنطبق الإرشادات أدناه على القارئ المستخدم في هذه المظاهرة(جدول المواد). - إزالة لوحة من الحاضنة ووضعها داخل قارئ لوحة. افتح برنامج الصور لإعداد ملفات البروتوكول والتجارب للدراسة. انتقل إلى الوضع اليدوي للصور على إدارة المهام وانقر فوق التقاط الآن... .
- اختيار لوحة 96 جيدا كنوع السفينة، حدد 10X للتكبير، والبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) 531 و 593 لتصوير tdTomato. اختر بئرًا، ثم انقر على التركيز التلقائي لتركيز الصورة، والمعرض التلقائي لوقت التعرض المناسب. ضبط التركيز والتعرض يدويًا إذا لزم الأمر.
- بمجرد الحصول على التركيز والتعرض المناسبين، انقر فوق رمز الكاميرا لالتقاط الصورة. ثم انقر فوق عملية/ANALZYE فوق الصورة لمتابعة إنشاء البروتوكول وحدد علامة التبويب تحليل.
- انقر فوق تحليل شبكة الجوّال في إضافة خطوة تحليل إلى يمين الصورة ثم انقر فوق ابدأ. ستظهر الصورة الخلايا المميزة للإشارة إلى كل خلية فردية. قد يتم النقر فوق تحديد الخيارات لتغيير المعلمات لتحديد الخلايا بشكل أفضل استناداً إلى عتبة الفلورة أو حجم الخلية. إذا كان الصور يقوم بحساب الخلايا بشكل صحيح، ثم انقر فوق إضافة خطوة في أسفل الشاشة.
- انقر فوق الرمز الموجود أعلى الشاشة لإنشاء تجربة من مجموعة الصور، والتي ستفتح نافذة مع التجربة. بمجرد فتحه، انقر فوق الإجراء ضمن علامة التبويب بروتوكول وفي الإطار الجديد الذي يفتح حدد قراءة، ثم في الإطار الجديد انقر فوق لوحة كاملة لتحديد الآبار 60 فقط التي تحتوي على الخلايا (B2... G11). انقر فوق موافق لحفظ التغييرات ثم انقر فوق موافق في الإطار إجراء.
- يمكن الآن تصوير اللوحة بواسطة هذا البروتوكول ويمكن حفظ الملف التجريبي. انقر فوق رمز التشغيل لتشغيل اللوحة. بمجرد أن يتم تصوير اللوحة الأولى، صورة لوحات اثنين آخرين. عند الانتهاء من التصوير، قم بتنزيل بيانات عدد الخلايا إلى جدول بيانات للتحليل. التقاط جميع الصور في التكبير 10X.
4. محطة MTT السمية الخلوية
ملاحظة: ابدأ اختبار MTT في غضون ساعتين من إكمال التصوير tdTomato.
- جعل 5 ملغ / مل MTT الأوراق المالية الحل عن طريق وزنها من 25 ملغ من MTT وإعادة تعليقه في 5 مل من متوسط NSC. دوامة الحل حتى لا يكون هناك رواسب مرئية من MTT، والتي يمكن أن يستغرق عدة دقائق.
- إزالة لوحات ثقافة الخلية من الحاضنة واستنشاق قبالة خلية الثقافة المتوسطة. تخفيف MTT 1:10 في خلية الثقافة المتوسطة وإضافة 100 درجة مئوية من MTT إلى كل بئر من الخلايا.
- حضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. وينبغي أن يكون الترسيب الأرجواني مرئيا تقريبا بما يتناسب مع عدد الخلايا في البئر. إما يستنشق حل MTT من لوحات أو عكس لوحة بسرعة لنفض الغبار الحل من لوحة.
- إضافة 50 درجة مئوية من DMSO 100٪ إلى كل بئر ويهز لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 400 دورة في الدقيقة. قراءة امتصاص كل بئر في 595 نانومتر في قارئ لوحة وتصدير البيانات إلى جدول بيانات للتحليل.
5 - تحليل البيانات
- إجراء تحليل لعد خلايا tdTomato وامتصاصها مع البرامج المناسبة (جدول البيانات التجاري، R). حساب المتوسطات لامتصاص أو عدد الخلايا من DMSO الثلاثة يكرر على كل لوحة لأغراض التطبيع، ثم تقسيم القيمة لتعداد الخلايا أو الامتصاص لكل بئر على لوحة من قبل هذا المتوسط وتحويلها إلى نسبة مئوية. وهذا ينتج عن عدد الخلايا الطبيعية أو الامتصاص بالنسبة إلى التحكم DMSO لكل لوحة.
- حساب متوسط العد العادي أو الامتصاص والانحراف المعياري لتكرار الآبار على لوحات الثلاث.
ملاحظة: عند هذه النقطة يجب أن يكون هناك أربع مجموعات مختلفة من القيم التي تمت تسويتها: واحدة لكل من لوحات ومتوسط واحد للوحات النسخ المتماثل الثلاثة. - أن تكون محافظة واستخدام قيمة طبيعية في أو أقل من 25٪ للمتوسط عبر لوحات تكرار ثلاثة لتصنيف مركب على أنها سامة. أيضا، لأنه يتم تنفيذ علاج واحد فقط لكل مركب على كل لوحة، فقط المركبات التسمية التي تقع تحت هذه العتبة على جميع لوحات تكرار الثلاثة كما سامة. فحص الصور الفلورية لجميع المركبات التي مرشحات هذا التحليل كما سامة لتأكيد السمية بصريا.
ملاحظة: تحديد المركبات مع تأثير النمو المثبطة أو تعزيز النمو هو أكثر صعوبة لتقييم في اختبار استكشافي من هذا النوع بسبب عدم وجود تكرار على كل لوحة. ومع ذلك, ما يلي هو وسيلة سريعة لتحديد المركبات التي قد تبطئ أو تعزيز النمو الخلوي. - حساب الانحراف المعياري لعناصر تحكم DMSO الثلاثة المتماثلة على كل لوحة ثم قم بتصفية أي مركبات لها قيم متوسطة على الأقل اثنين من الانحرافات المعيارية فوق أو أقل من عنصر تحكم DMSO. المركبات التي تسقط من هذا المرشح على كل من لوحات الثلاث قد تبرر المزيد من التحقيق.
- استخدام نفس استراتيجية التحليل لاستجابة الجرعة كشاشة السمية الأولية. حساب المتوسطات لعناصر تحكم DMSO لكل تكرار بيولوجي واستخدام هذه القيم لتطبيع النسبة المئوية للخلايا الحية أو النسبة المئوية للامتصاص لكل مركب/جرعة تركيبة. حساب الوسائل والخطأ القياسي للوسائل لجميع تركيبات المركبة/الجرعة للتكرارات البيولوجية الثلاثة.
- تحويل التركيز إلى قيمة السجل، وتوليد منحنى استجابة الجرعة لسجل التركيز مقابل الجدوى الطبيعية، وتناسب المنحنى مع تحليل الانحدار غير الخطي (يمكن إجراء التحليل في R أو مختلف الإحصائية التجارية حزم). حساب الجرعة المميتة 50 (أو تقنيا في هذه الحالة الجرعة القابلة للحياة 50) أو تركيز المركب الذي يؤدي إلى سمية 50٪ من معادلة هذا المنحنى. العديد من حزم البرامج سيتم حساب هذا الرقم تلقائيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وحددت بيانات عدد الخلايا الآلية أحد عشر مركباً ذات قدرة قابلة للبقاء تقل عن 25 في المائة عند تطبيعها إلى عنصر التحكم في نظام إدارة الوجهات السياحية، في حين حددت بيانات MTT هذه المركبات نفسها بالإضافة إلى مركبين إضافيين(الجدول 1 والجدول 2،أحمر مظلل). وكان المركبان اللذين تبين أنهما سامان فقط في اختبار MTT (بئرا F3 وG10) 31 في المائة و39 في المائة، على التوالي، وكان عدد الخلايا الإيجابية tdTomato كعنصر التحكم وترتيب الرتبة هما المركبان التاليان الأكثر سمية في هذه المكتبة بعد تلك التي تعتبر سامة. قيم الانحراف المعياري لهذين البئرين لا تشير إلى أن هناك خارج بين لوحات الثلاثة التي حرفت المتوسطات، وعند فحص الأرقام لكل من لوحات تكرار الثلاثة لم يسقط أي مركب أقل من عتبة 25٪ على أي من لوحات (البيانات غير تظهر). وتظهر الصور التمثيلية للفلورة tdTomato من عدة آبار في الشكل 3. كشف فحص صور البئرين المنافرين للسمية بين MTT وفرز عدد الخلايا أن المركبات في F3(الشكل 3B)وG10(الشكل 3C)كانت سامة على الرغم من أن في واحدة من ثلاث لوحات تكرار كان هناك عدد قليل من الخلايا الحية المتبقية في G10 جيدا (البيانات لم تظهر). يبدو أنه في هذه الحالة كان من الأفضل أن يسجل مؤشر MTT للسمية الخلوية كما في بعض الأحيان خوارزمية عد الخلايا الصور يعدد عن طريق الخطأ الخلايا الميتة / الموت.
تم تصميم تقييم MTT لتحديد السمية، ولكن لأن المكتبة قد تحتوي على مركبات تعزز وتمنع نمو الخلايا سيكون من المفيد لتقييم مدى قياس التقييم لكل من الآثار المثبطة للنمو والتكاثرية المحتملة لل المركبات المختبرة. للقيام بذلك تم استخدام مرشح حيث تم تصنيف المركبات على أنها مثبطة للنمو إذا كانت الامتصاصات المتوسطة العادية أو عدد الخلايا أكبر من 25٪ وأقل من انحرافين معياريين أقل من وسائل التحكم على كل من لوحات تكرار الثلاثة (مظللة الأصفر في الجدول 1 والجدول 2). وقد اسفي أحد عشر مركباً هذا المعيار لمعيار عدد الخلايا ومركبتين فقط في عملية تقييم MTT مع تداخل واحد فقط (E10) بين العيان، على الرغم من أن اثنين من المركبات الأحد عشر في عملية تحديد عدد الخلايا هما الما كانا المذكورين سابقاً على أنهما سامان من خلال معيار MTT (F3) ، G10).
وقد صُنفت المركبات التي كانت وسائلها العادية انحرافين معياريين فوق وسائل التحكم في كل لوحة من اللوحات الثلاث المنسوخة نسخاً متماثلاً على أنها معززة للنمو (الأخضر المظلل في الجدول 1 والجدول 2). مركب واحد فقط يناسب هذا المعيار لكل تقييم والمجمع لم تتداخل بين الاختبارات. وأشار مزيد من الدراسة لصور الآبار مع الاختلافات بين MTT وتعداد الخلايا إلى أنه في بعض الحالات الآبار التي MTT المبالغة في تقدير عدد الخلايا نسبة إلى فحص tdTomato يبدو أن الخلايا أكبر(الشكل 3C) ، في حين أن تلك الآبار حيث MTT التقليل من عدد الخلايا نسبة إلى tdTomato يبدو أن الخلايا أصغر(الشكل 3D). وباختصار، فإن فحص tdTomato صنف أحد عشر مركباً على أنها سامة، وأحد عشر مركبة مثبطة للنمو، وواحدة على أنها تعزيز للنمو مع وجود أربعة وثلاثين مركبة ليس لها تأثير واضح على نمو الخلايا(الجدول 1). وصنف اختبار MTT ثلاثة عشر مركباً على أنها سامة، اثنان منها مثبطة للنمو، وواحدة على أنها تعزيز النمو مع وجود 41 مركبة ليس لها تأثير واضح على نمو الخلايا(الجدول 2).
وأجري فحص للاستجابة للجرعات من ست نقاط على ثلاثة من المركبات التي تم تحديدها على أنها سامة. وكانت هذه المركبات الثلاثة مثبطات STAT3 WP1066 (B5) وstattic (E4) ومستقبلات مستقبلات عامل نمو البشرة مثبطات tyrphostin 9 (E11). وكانت الجرعات تخفيفات متتالية مزدوجة تبدأ بتركيز أقصى قدره 10 ميكرومتر وإلى تركيز لا يقل عن 312.5 نم. ويبين الشكل 4الرسم البياني لسجل التركيز مقابل النسبة المئوية الطبيعية للخلايا القابلة للحياة لكل من عدد الخلايا والاختبارات MTT لأحد هذه المركبات (WP1066). المنحنى مسطح نسبياً مع عدم وجود سمية لأدنى تركيزات الأربعة، ويسقط بسرعة عند جرعة 5 ميكرومتر، وينخفض إلى سمية كاملة تقريباً عند 10 ميكرومتر. تم حساب الجرعة المميتة 50 (LD50)على أنها 4.4 ميكرومتر لفحص tdTomato و 6.0 ميكرومتر لفحص MTT. وكانت قيم tdTomato وMTT LD50 للمركبين الآخرين 3.4 ميكرومتر و4.7 ميكرومتر، على التوالي، للثابت، و0.8 ميكرومتر و1.6 ميكرومتر، على التوالي، للتريبهوتين 9.
الشكل 1 خريطة لوحة للوحة مركب رئيسي المستخدمة في شاشة السمية الأولية. جميع الآبار الخارجية مظللة باللون الرمادي مما يشير إلى أنها تحتوي على وسائل الإعلام دون خلايا. ضوابط DMSO (100٪) وصفت في جريئة في الآبار B2، D6، وG11. تحتوي جميع الآبار المسماة Cmpd على مركبات اختبار فريدة من نوعها عند تركيز 10 mM في DMSO 100%. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 خريطة لوحة للوحة مركب المستخدمة في فحص استجابة الجرعة: جميع الآبار الخارجية مظللة باللون الرمادي مما يشير إلى أنها تحتوي على وسائل الإعلام فقط دون خلايا. تم توجد عناصر تحكم DMSO في العمود 2. يشار إلى ثلاثية من جميع تركيبات مركب / جرعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 tdTomato صور الفلورسنت من الآبار المختارة 72 ساعة بعد العلاج. (أ)حسنا B2: DMSO السيطرة،(B)حسنا F3: بيانات عدد الخلايا تشير إلى أي سمية ولكن البيانات MTT لم،(C)حسنا E6: المبالغة في تقدير عدد الخلايا من قبل MTT بالنسبة إلى عدد الطماطم،(D)حسنا G6 تقدير عدد الخلايا من قبل MTT بالنسبة لMTT الطماطم. وقد التقطت جميع الصور في التكبير 10X باستخدام مرشح RFP مع الطول الموجي 531/593 نانومتر للإثارة / الانبعاثات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 منحنى لتركيز السجل مقابل نسبة البقاء DMSO للمركب في بئر B5. النقاط على منحنى تمثل متوسط الخلايا القابلة للحياة تطبيع في ست جرعات ± خطأ قياسي من المتوسط لثلاث نسخ بيولوجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تطبيع وسائل عد خلايا الطماطم إلى النسبة المئوية للتحكم في DMSO لثلاث لوحات تكرارية ± الانحراف المعياري. المظلل جيدا يشير إلى ما يلي: الأحمر، والمركبات السامة؛ والمركبات السامة؛ والمركبات السامة؛ والمركبات السامة؛ والمركبات السامة؛ والمركبات ال الأصفر، مثبط النمو المحتمل. الخضراء، وربما تعزيز النمو. لا المظلل يشير إلى أن المركبات لا يبدو أن تؤثر على نمو الخلايا.
الجدول 2: تطبيع وسائل امتصاص الـ MTT إلى النسبة المئوية للتحكم في نظام إدارة الوجهات السياحية لثلاث لوحات من أجهزة النسخ المتماثل ± الانحراف المعياري. المظلل جيدا يشير إلى ما يلي: الأحمر، والمركبات السامة؛ والمركبات السامة؛ والمركبات السامة؛ والمركبات السامة؛ والمركبات السامة؛ والمركبات ال الأصفر، مثبط النمو المحتمل. الخضراء، وربما تعزيز النمو. لا المظلل يشير إلى أن المركبات لا يبدو أن تؤثر على نمو الخلايا.
| حسنا | مجمع | تلاحظ |
| B2 | إدارة الشؤون الإدارية | التحكم السلبي |
| جيم 2 | المخيم | بروتين كيناز منشط |
| مد-2 | فراكلكين | تشيماكين |
| هاء2 | LDN212854 | مثبطات مستقبلات البروتين المورفوجيجيني للعظام (BMP) |
| F2 | AG370 | الصفائح الدموية المستمدة من مستقبلات عامل النمو (PDGFR) مثبطات كيناز |
| زاي -2 | DAPT | مثبطات غاما سيكريتاز; التحكم الإيجابي في التمايز العصبي |
| B3 | AY9944 | 7-ديهيدروكلولزترول مثبطات اختزال; القنفذ مسار المانع |
| جيم-3 | STA-21 | محول الإشارة والمنشط للنسخ 3 (STAT3) المانع |
| مد-3 | GM-CSF | المحببة الضامة الضامة مستعمرة تحفيز عامل. محمد المحمد |
| هاء3 | TNP470 | ميثيونين أمينبيبتيداز-2 المانع |
| واو3 | الحيويه | الجليكوجين synthase كيناز-3 المانع; منشط مسار WNT |
| خ ع-3 | فى هذا العنونة | عامل التغذية العصبية الهدبية; الببتيد العصبي |
| B4 | سانت | ملطف مستقبلات خصم; القنفذ مسار المانع |
| جيم-4 | AG825 | مثبطERBB2 |
| مد-4 | M-CSF | عامل تحفيز مستعمرة الضامة. محمد المحمد |
| هاء 4 | STATTIC | محول الإشارة والمنشط للنسخ 3 (STAT3) المانع |
| F4 | SC79 | AKT (بروتين كيناز B) المنشط |
| زاي - ٤ | DMH1 | مثبطات مستقبلات البروتين المورفوجيجيني للعظام (BMP) |
| B5 | WP1066 | محول الإشارة والمنشط للنسخ 3 (STAT3) المانع |
| جيم-5 | الانسولين | |
| مد-5 | IL-3 | إنترلوكين-3; محمد المحمد |
| E5 | AG494 | مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) المانع |
| F5 | LY294002 | فوسفوينوسوتيد 3-كيناز المانع |
| خ ع-5 | منتدى إدارة الإنترنت2 | عامل نمو الأنسولين-2 |
| B6 | تبلد | ملطف مؤثر. القنفذ مسار المنشط |
| جيم-6 | AG370 | مثبطات كيناز مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية |
| مد-6 | إدارة الشؤون الإدارية | التحكم السلبي |
| E6 | EC23 | ناهض مستقبلات حمض الريتينويك |
| F6 | TORIN2 | الهدف الميكانيكي لمثبط راباميسين (MTOR) |
| خ ع-6 | Y27362 | الرو المرتبطة، لفائف لفائف تحتوي على بروتين كيناز (ROCK) المانع |
| B7 | CELECOXCIB | سيكلوأوكسجيناز-2 (كوكس-2) المانع |
| جيم-7 | SB525334 | تحويل عامل النمو بيتا مستقبلات (TGBFR) المانع |
| مد-7 | DAPT | مثبطات غاما سيكريتاز; التحكم الإيجابي في التمايز العصبي |
| E7 | CHIR99021 | الجليكوجين synthase كيناز-3 المانع; منشط مسار WNT |
| F7 | LDN 193189 | مثبطات مستقبلات البروتين المورفوجيجيني للعظام (BMP) |
| G7 | تارازوتين | ناهض مستقبلات حمض الريتينويك |
| B8 | AM580 | ناهض مستقبلات حمض الريتينويك |
| C8 | DHBP | مثبط إطلاق الكالسيوم |
| مد-8 | JSK | متبرع بأكسيد النيتريك |
| هاء 8 | دورسومورفين | مثبطات مستقبلات البروتين المورفوجيجيني للعظام (BMP)؛ 5' أدينوزين مونوفوسي تنشيط البروتين كيناز (AMPK) المانع |
| F8 | Imatinib | مثبطات كيناز التيروزين |
| مجموعة الثمانية | BMS 493 | معكوس حمض الريتينويك مستقبلات ناهض |
| B9 | سيكلوبامين | ملطف مستقبلات خصم; القنفذ مسار المانع |
| C9 | SEMAGACESTAT | مثبطات غاما سيكريتيز |
| D9 | بوتوتينيب | مثبطات كيناز التيروزين |
| E9 | بورمورفامين | ملطف مؤثر. القنفذ مسار المنشط |
| F9 | النتوء | خشنة ، ولكن كان هناك الكثير من المؤثر مستقبلات الشق |
| G9 | SB431542 | تحويل عامل النمو بيتا مستقبلات (TGBFR) المانع |
| B10 | SC79 | AKT (بروتين كيناز B) المنشط |
| C10 | دانترولين | مضادات مستقبلات ريانودين |
| D10 | محمد الدوسري | مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) المانع |
| E10 | AM80 | ناهض مستقبلات حمض الريتينويك |
| F10 | IFN-Y | الإنترفيرون غاما. محمد المحمد |
| G10 | PQ401 | مستقبلات عامل النمو الشبيهة بالأنسولين (IGF1R) المانع |
| B11 | DAPT | مثبطات غاما سيكريتاز; التحكم الإيجابي في التمايز العصبي |
| C11 | A2M | بروتين سكري خارج الخلية. مثبطات البروتياز |
| D11 | AG490 | مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) المانع |
| E11 | محمد محمد | الصفائح الدموية المستمدة من مستقبلات عامل النمو (PDGFR) مثبطات كيناز |
| F11 | BMP-2 | بروتين العظام المورفوجيجيني-2 |
| G11 | إدارة الشؤون الإدارية | التحكم السلبي |
الجدول التكميلي 1: قائمة بمركبات الشاشة الأولية. يتم توفير موقع جيدا، والاسم، والملاحظات على كل من المركبات التي تم استخدامها في الشاشة الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان الهدف الرئيسي من هذه المقالة هو وصف استراتيجية يمكن أن تحدد بكفاءة وبتكلفة غير مكلفة المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا في فحص الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة. واستُخدمت تقنيتان متعامدة لتقييم رقم الخلية لزيادة الثقة في الاستنتاجات وتقديم رؤى إضافية لن تكون متاحة إذا ما استُخدم سوى تقييم واحد. واحدة من الاختبارات تستخدم صورة خلية الفلورسنت لحساب الخلايا الإيجابية tdTomato مباشرة، والثاني كان يعتمد على قدرة تتميز جيدا من الميتوكوندريا لشق MTT لتشكيل شكل، وبالتالي بمثابة وكيل للخلية رقم10. وقد تم تقييم ما مجموعه 57 مركب اختبار في هذه المظاهرة على الرغم من أن جناح MTT من الفحص قد استخدم لاختبار مكتبة مع ما يصل إلى 2000 مجمع14. وأشارت نتائج الشاشة إلى كيف يمكن للاختبارين أن يعزز كل منهما الآخر في التوصل إلى استنتاجات معينة بمزيد من الثقة، وسلطت الضوء على السيناريوهات التي يكون فيها الحالبان متكاملين في توفير معلومات إضافية من شأنها عادة أن تتطلب إجراء تجربتين منفصلتين على الأقل.
تحدث الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول قبل طلاء الخلايا مباشرة. الظروف الأيضية في زراعة الخلايا يمكن أن تصبح متقلبة جدا، لا سيما في حالة الجلوتامين واستهلاك الجلوكوز، إذا كانت الخلايا بذر في كثافة عالية جدا17،18. وفي ظل هذه الظروف، يكون موت الخلايا بسبب عوامل متأصلة في ظروف زراعة الخلايا ولا علاقة لها بسمية المركبات المختبرة. والنتيجة ستكون زيادة في الإيجابيات كاذبة للمركبات السامة للخلايا، فضلا عن صعوبة في استنساخ النتائج18. النجاح في هذه الخطوة يتطلب معرفة كثافة الخلية المناسبة من خط الخلية المستخدمة، وتحديد دقيق لعدد الخلايا قبل الطلاء، وإعادة تعليق كاملة للخلايا لضمان توزيع الطلاء متجانسة داخل وعبر آبار 96 - لوحة جيدة. من المهم أيضا أن نؤكد بصريا أن الخلايا موجودة في الكثافة الصحيحة تقريبا 2-3 ح بعد الطلاء من خلال النظر إليها تحت المجهر.
وفيما يتعلق بالاختبارات نفسها، فإن الخطوة الأكثر أهمية في فحص MTT هي ضمان أن يتم حل MTT بالكامل في وسط ثقافة الخلية. الرواسب المتبقية من MTT قد تؤدي في حد ذاتها إلى سمية خلوية حادة لذلك من المهم أن تذوب تماما MTT مع دوامة قوية. النقطة الأكثر أهمية في فحص عد الخلايا هي تحديد وقت التعرض الصحيح لتصوير tdTomato. أوقات التعرض التي هي قصيرة جدا يمكن أن يؤدي إلى خلايا الفلورسنت حقا الذهاب لا يمكن حسابها من قبل البرنامج، وأوقات التعرض التي هي طويلة جدا يمكن أن تجعل إشارة قوية بحيث يمزج الخلايا المجاورة معا بحيث يعد البرنامج خلايا متعددة كخلية واحدة لأنه غير قادر على حلها14. تسمح معظم حزم البرامج التي تأتي مع قارئات التصوير بخطوة معاينة توضح الخلايا التي يتم حسابها. من المهم تشغيل هذه الخطوة المعاينة في عدة أوقات التعرض واختيار واحد الذي يحدد الخلايا الفلورية الأكثر دقة.
كما هو الحال مع أي طريقة هناك بعض القيود على هذه الاختبارات. وللحصول على زيادة الإنتاجية، لا يستخدم الفحص الأولي للسمية سوى نموذج علاج واحد/جرعة واحدة يمكن أن يأتي على حساب إيجابيات أكثر زيفاً وسلبيات زائفة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العديد من الدراسات السابقة قد أظهرت أن MTT يرتبط بشكل جيد جدا مع رقم الخلية عند استخدام إما مستعمرة تشكيل الفحص19 أو الثيميدين إدراج الفحص20، والعلاج مع بعض المركبات يمكن أن تعزز أو تمنع نشاط الميتوكوندريا بطريقة أن نتائج التبيّد MTT لم تعد مرتبطة برقم الخلية21. وتشير نتائج هذه المظاهرة إلى أنه في حين أن MTT ممتازة في تحديد المركبات السامة، فإن قدرته اما على تحديد المركبات التي تمنع أو تعزز الانتشار محدودة ربما لأن هذه المركبات تغير نشاط الميتوكوندريا في الطريقة التي يرتبط أقل بشكل جيد مع رقم الخلية. وهناك أيضا بعض القيود على فحص عد tdTomato. وهناك قيد واضح هو الحاجة إلى وجود خط خلية تعبر عن بروتين الفلورسنت بشكل ملحوظ. وقد جعلت التطورات الأخيرة في التلاعب بالجينوم من الأسهل بكثير تطوير هذه الخطوط ولكن العمل اللازم لتوليدها قد يتجاوز قدرات بعض المختبرات. من وجهة نظر تقنية، فإن أكبر القضايا مع أي اختبار عد الخلايا التي تستخدم تحليل الصورة هو عدم قدرة هذه الاختبارات على التمييز بين الخلايا التي يتم تجميعها معا مما أدى إلى نقص العدد14،وبالتالي، الطلاء السليم هو حاسمة للحصول على نتائج دقيقة. وهناك مشكلة محتملة أخرى هي عد الخلايا الميتة أو المحتضرة التي تفلور بشكل مشرق. طريقة واحدة لتجنب هذه المشكلة غسل الخلايا مع PBS قبل العد لإزالة هذه الخلايا الخلفية. قد لا يكون هذا مناسبًا لبعض خطوط الخلايا الأقل تمسكًا بشكل جيد حيث قد تنفصل الخلايا الحية عند الغسيل. حل بديل لهذه المشكلة هو الاستفادة من المرونة المتأصلة في العديد من برامج التحليل لتخصيص المعلمات لتحديد الخلية ضمن نطاق ضيق بحيث يتم حساب خلايا الفلورسنت الحية فقط.
الاستراتيجية الموصوفة في هذه المقالة توفر طريقة قوية لفحص بكفاءة تصل إلى عدة مئات من المركبات. قراءة اختبار MTT هي النتيجة الفسيولوجية لنشاط الميتوكوندريا ويمكن أن يكون لها خط الخلية أو الآثار الخاصة بالمركب التي يمكن أن تنتج نتائج غير دقيقة4،21. من خلال الجمع بين ذلك مع فحص عد الخلية باستخدام مراسل الفلورسنت، يمكن تخفيف هذه القيود إلى حد كبير. وكما هو مبين، فإن مقارنة نتائج كلا الاختبارين يمكن أن تؤدي إلى دقة تقارب 100% في تحديد المركبات السامة. وقد أظهرت دراسة سابقة أنه في خط HEK293T التعبير عن tdTomato بشكل ملحوظ، وهناك ارتفاع IC50 الارتباط بين MTT و tdTomato لمكتبة من المركبات السامة22. وعلى الرغم من أن هذه الدراسة لم تقم بإجراء تأكيدات ثانوية بشأن مركبات ضرب كافية لإجراء تحليل توافق مماثل، فإن قيم الـLD 50 المحسوبة للمركبات الثلاثة التي تم اختبارها كانت متشابهة.
وبالإضافة إلى قدرتهما على تعزيز الاستنتاجات المتعلقة بالسمية، يمكن أن يكمل الاختباران بعضهما البعض عند معالجة الآثار المحتملة لمثبطات النمو والتكاثرية لمركبات الاختبار. وبالنسبة لعدة مركبات اختبار، تباينت البيانات بين الاختبارين تبايناً كبيراً. عند فحص صور الفلورة tdTomato لبعض هذه المركبات، كانت هناك تغيرات مورفولوجية ملحوظة بين العلاج والسيطرة. وهذا يشير إلى أن الاختلاف في القيم الطبيعية بين الاختبارات اثنين قد يستند إلى التغيرات الفسيولوجية التي تؤثر بشكل تفاضلي على قراءة MTT وعدد الخلايا tdTomato. والقدرة على الحصول على هذه البيانات باستخدام تجربة واحدة تزيد إلى حد كبير من قوة هذه الاستراتيجية مما يجعلها قابلة للتطبيق بشكل أعم. على هذا النحو، لديها القدرة ليس فقط على تحديد المركبات السامة بدقة عالية ولكن للإشارة إلى المركبات مع آثار أكثر دهاء على نمو الخلايا / علم وظائف الأعضاء التي يمكن أن تتميز على نطاق أوسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل برنامج NINDS للبحوث داخل الجدارية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
