Summary
多くの場合、培養細胞上の化合物のセットの潜在的な細胞毒性を評価する必要があります。ここでは、96ウェル形式で有毒化合物を確実にスクリーニングする戦略について説明する。
Abstract
細胞毒性は、治療上の利点を有する可能性のある薬物を研究する際に定量化する必要がある重要なパラメータです。このため、多くの薬物スクリーニングアッセイは、個々の化合物に対してプロファイリングされる重要な特性の1つとして細胞毒性を利用する。培養中の細胞は、より高価で労働集約的な動物モデルで有望な鉛化合物のフォローアップを進める前に細胞毒性を評価するのに有用なモデルです。ヒト神経幹細胞(NSC)ラインを発現するtdTomatoの細胞増殖に影響を与える化合物を同定する戦略について述べた。この戦略では、2 つの相補的なアッセイを使用して細胞数を評価します。1つのアッセイは、3-(4,5-ジメチルチゾル-2-yl)-2,5-ジフェニルテルゾルム臭化物(MTT)の還元を介して働き、細胞数のプロキシとして形成し、もう一方はNSCを発現するtdTomatoを直接カウントする。2つのアッセイは単一の実験で同時に行うことができ、労働集約的で、急速で、安価ではない。このデモンストレーションで説明した戦略は、96ウェルプレート形式で毒性のための探索的一次スクリーンで57の化合物をテストしました。3つのヒットは、プライマリ画面と同じアッセイ設定を用いた6点線量応答でさらに特徴付けられた。毒性に対して優れた腐食を提供することに加えて、2つのアッセイからの結果の比較は、細胞増殖の他の側面に影響を与える化合物を同定するのに有効である可能性がある。
Introduction
治療の可能性を有する化学化合物のために決定する必要がある最も重要な特性の一つは、動物細胞への毒性です。この特性は、薬物がより広範な研究のための良い候補であるかどうかを決定します.ほとんどの場合、毒性を最小限に抑えた化合物が求められますが、特定の細胞型を殺す能力を持つ化合物が、例えば抗腫瘍性薬物が関心を持つ状況があります。全動物は全身毒性を決定するための最良のモデルシステムですが、少数の化合物をテストする必要がある場合、関連するコストと労力は非常に高くなります。このような哺乳動物細胞培養は、一般に最も効率的な代替1、2として使用される。小~中スループットの薬物スクリーンは、細胞培養中に毒性を評価できる重要なモダリティである。これらの画面は、個々のシグナリング経路を対象とする注がれたライブラリを調知るために使用できます。このような画面の一般的な形式は、最初に探索的一次毒性スクリーンで単回用量(一般に10μM)でライブラリ内のすべての化合物をテストし、その後、毒性を完全に特徴付けるために詳細な二次用量応答スクリーンを実行することですプライマリ画面からのヒットのプロファイル。この戦略を実装する方法をここで説明し、有毒化合物を識別し、特徴付ける迅速で効率的かつ安価な方法を提供します。
哺乳動物細胞3,4における小さな化合物およびナノ材料の細胞毒性を評価するために、複数の方法が開発されている。特定の材料が誤解を招く結果を提供するアッセイと相互作用することができ、そのような相互作用は毒性スクリーン4からのヒットを特徴付けるときテストされるべきであることに留意すべきです。細胞毒性アッセイは、トリパンブルー排除5、乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイ6、アラマーブルーアッセイ7、カルシエンアセトキシメチルエステル(AM)8、およびATPアッセイ9を含む。これらのアッセイはすべて、細胞数のプロキシとして機能することができる細胞代謝の様々な側面を測定します。いずれも3-(4,5-ジメチルチゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテルゾリウム臭化物(MTT)、2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニ)-2H-テトラゾリウム(塩-5-カルボニウム)などの塩系アッセイを提供しています。 4-(3-4-ヨウドフェニル]-2-[4-ニトロフェニル]-2H-5-テトラゾリオ)-1,3−ベンゼンジスルホン酸(WST-1)10、11は、低コストで良好な精度と使いやすさを提供します。このデモンストレーションで使用されるMTTは、ミトコンドリア還元酵素によって不溶性のフォルマザンに減少し、この変換の速度は細胞数と強く相関する。このアッセイは、小規模で、最大2,000化合物12のスクリーニングライブラリのために日常的に利用されています。標識マーカーによる細胞の直接カウントは、細胞数を評価する別の方法を提供し、MTTアッセイとは異なり、細胞増殖のダイナミクスに関する追加情報を提供することができます。いくつかの一般に利用可能なアルゴリズムは、自動セル数分析を実行するために利用可能であり、イメージングリーダー13、14のためのソフトウェアパッケージの一部である独自のアルゴリズムもあります。この方法の説明では、tdTomato15を構成的に発現するように遺伝的に編集されたヒト神経幹細胞(NSC)ラインは、MTTアッセイと自動細胞計数との間の細胞生存率の結果を比較するためのテストラインとして機能する。57のテスト化合物の毒性を評価するスクリーンでのアッセイ。この戦略の主な目的は、有毒化合物を同定し、特徴付けさせることでしたが、成長抑制および増殖増強化合物を潜在的に同定する追加の利点があり、したがって、薬物を同定するための効果的な方法を提供します細胞の成長を調節することができます。
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Protocol
1. NSC文化
注:ヒトNSCラインの操作は以下に説明しますが、このプロトコルには任意のセルラインを使用できます。すべての細胞培養作業は、生物学的安全キャビネットで行われる。
- 96ウェルプレートに地下膜/細胞外マトリックス(ECM)を塗ります。
- 氷上にNSCの取り付けを容易にするECM(材料の表)のアリコートを解凍します。ECMを10mL塩基媒体(材料表)で適切な濃度(一般に1:100)に希釈し、96ウェルプレートの60の内部ウェルのそれぞれにウェルあたり50 μLを加えます(図1)。エッジエフェクト16に起因するアーティファクトを避けるために、内部60ウェルのみを使用してください。
- プレートを室温または細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で少なくとも30分間座らせます。
- 神経幹細胞を解離し、プレートします。
注:この方法で使用するセルは、T75フラスコ内の少なくとも80%の合流点に成長する必要があります。- ベース培地、B27、非必須アミノ酸、2mMグルタミン、および10ng/mL基本線維芽細胞増殖因子(FGFbまたはFGF2)からなるNSC培地における細胞培養インキュベーター中のT75フラスコ中の培養細胞。
- 80%の合流点に達したらインキュベーターから細胞を取り出し、NSC培地を吸引します。適切な量の細胞解離試薬(T75フラスコの場合は3mL;材料の表)インキュベーターで5分間インキュベートします。
- インキュベーション後、T75フラスコとピペットに7mLのNSC培地を加え、すべての細胞が剥離されるようにします。解離した細胞溶液を15mLチューブに移し、遠心分離機を200 x gで5分間移します。
- 遠心分離後、チューブから上清を取り出し、NSC培地の10mLで細胞を再中断し、細胞を数えます。
- 細胞の濃度をNSC培地で200,000細胞/mLにリバジャストします。均質なめっきのために細胞が完全に再懸濁されていることを確認してください。
- セクション1.1に記載されているように被覆された3つの96ウェルプレートの60内部ウェルにおける細胞混合物(20,000細胞)のプレート100μL。8 チャンネルマルチチャンネルピペットの 8 つのスロットのうち 6 つのスロットを使用して、セルを列ずつプレートします。
- 細胞のないすべてのウェルに100 μLの塩基培地またはNSC培地を追加し、最も外側のウェルからの潜在的な蒸発を最小限に抑えます。
- 細胞培養顕微鏡では、3つの96ウェルプレートのそれぞれに少なくとも10個のウェルを目視で検査し、細胞が期待される密度で播種されていることを確認します。細胞があまりにもまばらまたは密度の高い密度でめっきされている場合は、アッセイを続行しないでください。
2. 化合物による細胞の治療
注:このデモンストレーションでテストされた自家製ライブラリには、翼レス/統合(Wnt)、レチノイン酸、成長因子β(TGF-β)、およびソニックヘッジホッグシグナル伝達経路、および様々なチロシンキナーゼを調節する化合物が含まれています。
-
毒性/細胞番号のための探索的なプライマリ画面
- アリコート50−100 mL最大57の試験化合物(補足表1)を100%ジメチルスルホキシド(DMSO)の濃度で、Uボトム、Vボトムまたは丸底96ウェルプレートの内部60ウェルに3つのDMSOとコントロールを有する(コントロールを参照)プレートマップの図 1)。これは、凍結および解凍することができる化合物の25 μLを持つマスター化合物プレートとして機能します。
注:平らな底板は、ベンチトップピペットでそれらから化合物の少量を吸引することがより困難になりますので、使用しないでください。 - セクション1で説明するように分割した後、インキュベーター16-24 hから細胞培養プレートを取り出し、8チャンネルのマルチウェルピペットでNSC中列を吸引し、8つのマルチウェルスロットのうち6つだけを使用します。3つの反復プレートのそれぞれに95 μLの新鮮なNSC培地を加え、下のステップ2.1.4が完了するまでプレートをインキュベーターに戻します。
- 空のUボトム、Vボトムまたは丸底96ウェルプレートの内部60ウェルの各内部に49 μLのNSC培地を8チャンネルマルチウェルピフェッタで追加します。マスターコンパウンドプレートのシールを外し、ベンチトップピペッタまたは同等の器具を使用して、マスタープレートから内部60ウェルの各々のNSC培地の49 μLに化合物のピペット1 μLを使用します。
- 希釈した化合物をベンチトップピペッタと混ぜます。
- インキュベーターからNSCの3つの96ウェルプレートを取り出し、ベンチトップピペットで各希釈化合物のピペット15μLを取り出し、3つのプレートのそれぞれに化合物の5 μLアリコットを分配します。
注:ステップ2.1.3の最初の1:50希釈と組み合わせて細胞への化合物のこの1:20希釈は、NSC上の化合物の最終的な濃度が0.1%のDMSO濃度と最終の10 μMとなるように1:1000の希釈を生み出します。DMSO制御の濃度は0.1%になります。 - 72時間の化合物で細胞をインキュベートし、細胞毒性アッセイを進めます。より短い間隔を使用することができますが、72時間のインキュベーション期間は、テストされた化合物の潜在的な細胞傷害性の効果を最大化する必要があります。
- アリコート50−100 mL最大57の試験化合物(補足表1)を100%ジメチルスルホキシド(DMSO)の濃度で、Uボトム、Vボトムまたは丸底96ウェルプレートの内部60ウェルに3つのDMSOとコントロールを有する(コントロールを参照)プレートマップの図 1)。これは、凍結および解凍することができる化合物の25 μLを持つマスター化合物プレートとして機能します。
-
用量応答アッセイ
注: 線量応答に使用される 96 ウェルのセットアップを図 2 に示します。- 10 μMの高用量から始まる6回の用量で、2倍のシリアル希釈で最大3つの異なる化合物の3つのDMSO制御反復および試験三重化に列2を使用します。
- DMSOまたは試験化合物の4μLを1.5 mLマイクロ遠心管中のNSC培地の196 μLに希釈します。B2-G2 からウェルのカラムに 25 μL の DMSO を追加し、B3-B11 から B3-B11 の行に対して 50 μL の試験化合物を、B3-B5、B6-B8、および B9-B11 の 3 つの mM 三元に並べて行に追加します。
- 96ウェルプレートの内部部分の残りの空柱にNSC培地のピペット25μL。マルチチャンネルピペットでウェルB3-B11から化合物の25 μLを取り出し、ウェルC3-C11に加え、少なくとも5回混合する。残りの行のプロセスを繰り返して、各化合物に対して合計 6 回の用量の 2 倍の希釈で三重化を生成します。
- セクション 2.1 のプライマリ画面で説明したとおりに、線量応答の NSC を生成します。用量応答のための化合物は、ステップ2.1.5および2.1.6で説明されているとおりに細胞上に添加およびインキュベートされる。
注:用量応答アッセイの3つの生物学的複製は、別々の日に異なる通路でNSC上のアッセイを繰り返すことによって行われる。
3. プレートリーダー上のイメージングセル
- 細胞を割り当てられた時間の化合物でインキュベートした後、プレートリーダー上の画像細胞は、ウェル当たりの前処理細胞数を決定する。
注: イメージング セルの手順は読者固有ですが、一般的には同様の方法に従います。以下の指示は、このデモで使用するリーダー (材料の表)に適用されます。 - インキュベーターからプレートを取り出し、プレートリーダーの中に入れます。イメージャーソフトウェアを開いて、スタディ用のプロトコルと実験ファイルを設定します。タスク マネージャのイメージャーマニュアルモードに移動し、[今すぐキャプチャ]をクリックします。
- 容器タイプとして96ウェルプレートを選択し、倍率に対して10倍を選択し、赤色蛍光タンパク質(RFP)531および593をtdTomatoをイメージングします。ウェルを選択し、[オートフォーカス]をクリックして画像にフォーカスを合わせ、適切な露出時間を設定します。必要に応じて、フォーカスと露出を手動で調整します。
- 適切なフォーカスと露出が得られたら、カメラアイコンをクリックして画像をキャプチャします。次に、上の画像の [プロセス/ANALZYE] をクリックしてプロトコルの構築を続行し、[分析] タブを選択します。
- 画像の右側にある[解析の追加ステップ]で[細胞解析]をクリックし、[開始]をクリックします。画像には、個々のセルを示す強調表示されたセルが表示されます。オプションの選択をクリックすると、蛍光閾値または細胞サイズに基づいて細胞をより良く選択するためにパラメータを変更できます。イメージャーがセルを正しくカウントしている場合は、画面下部の [ステップを追加] をクリックします。
- 画面上部のアイコンをクリックして、実験でウィンドウを開く画像セットから実験を作成します。開いたら、[プロトコル] タブの下にある[手順]をクリックし、[読み取り]を開いた新しいウィンドウで [読み取り] をクリックし、新しいウィンドウでフル プレートをクリックして、セルを含む 60 のウェルのみを選択します (B2...G11)。[OK]をクリックして変更を保存し、[プロシージャ] ウィンドウで[OK]をクリックします。
- プレートはこのプロトコルでイメージ化でき、実験ファイルを保存できるようになりました。再生アイコンをクリックしてプレートを実行します。最初のプレートをイメージしたら、他の 2 つのプレートをイメージします。イメージングが完了すると、セルカウント データをスプレッドシートにダウンロードして分析します。すべての画像を10倍の倍率で撮影します。
4. 末端MTT細胞毒性アッセイ
注:tdTomatoイメージングを完了してから2時間以内にMTTアッセイを開始します。
- MTTの25 mgを計量し、NSC培地の5 mLで再中断することにより、5 mg/mL MTTストック溶液を作ります。MTTの目に見える沈殿物が見られないまで溶液を渦にし、数分かかることがあります。
- インキュベーターから細胞培養プレートを取り出し、細胞培養培地を吸引します。細胞培養培地でMTT1:10を希釈し、細胞の各ウェルに100μLのMTTを添加する。
- 細胞を37°Cで2時間インキュベートする。紫色の沈殿物は、井戸内の細胞数に比例して大まかに見える必要があります。MTT溶液をプレートから取り外すか、プレートを素早く反転してプレートから溶液をフリックします。
- 各ウェルに100%DMSOの50 μLを追加し、400 rpmで10分間室温でプレートを振ります。プレートリーダーの595 nmで各井戸の吸光度を読み取り、分析のためにスプレッドシートにデータをエクスポートします。
5. データ分析
- tdTomato細胞数と吸光度の分析を適切なソフトウェア(商用スプレッドシート、R)で行います。正規化の目的で各プレート上の 3 つの DMSO 反復の吸光度またはセル数の平均を計算し、プレート上の各ウェルのセル数または吸光度の値をこの平均で除算し、パーセンテージに変換します。これにより、各プレートの DMSO 制御に対する正規化されたセル数または吸光度が得られます。
- 3つのプレート上のレプリケートウェルの平均正規化数または吸光度と標準偏差を計算します。
注: この時点で、4 つの異なる正規化された値のセットが必要です。 - 控えめにし、3つの反復プレート全体の平均に対して25%以下の正規化値を使用して、化合物を有毒として分類します。また、各プレートに対して化合物1回の処理のみが行われるため、3つのレプリケートプレートすべてに対してこの閾値を下回る標識化合物のみが有毒であると考える。この分析が毒性としてフィルタリングするすべての化合物の蛍光画像を調べ、毒性を視覚的に確認します。
注:成長抑制または成長増強効果を持つ化合物の同定は、各プレート上の反復の欠如のために、このタイプの探索的アッセイで評価することがより困難です。しかし, 以下は、細胞の成長を遅くまたは高めることができる化合物を識別するための迅速な方法. - 各プレート上の 3 つの反復 DMSO コントロールの標準偏差を計算し、DMSO コントロールの上または下に平均値が少なくとも 2 つある化合物をフィルタリングします。3つのプレートのそれぞれにこのフィルタから抜け落ちる化合物は、さらなる調査を必要とする場合があります。
- 一次毒性スクリーンと同じ分析戦略を使用して用量応答を使用します。各生物学的反復のDMSOコントロールの平均を計算し、これらの値を使用して、各化合物/用量の組み合わせに対する生細胞の割合またはパーセント吸光度を正規化します。3つの生物学的反復に対するすべての化合物/用量の組み合わせに対する平均値と標準誤差を計算します。
- 濃度をその対数値に変換し、濃度対正規化された生存率の対数に対する線量応答曲線を生成し、非線形回帰分析で曲線を適合させる(分析はRまたは様々な商業統計で行うことができる)パッケージ)。この曲線の方程式から50%の毒性をもたらす化合物の致死用量50(または技術的にはこの場合は生存可能な用量50)または濃度を計算する。多くのソフトウェア パッケージは、この数値を自動的に計算します。
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Representative Results
自動化された細胞数データは、DMSO制御に正規化された場合、25%未満の生存率を有する11の化合物を同定し、MTTデータはこれらの同じ化合物に加えて2つの追加化合物を同定した(表1および表2、赤色のシェーディング)。MTTアッセイ(ウェルF3およびG10)でのみ有毒であることが判明した2つの化合物は、それぞれ31%および39%であり、対照およびランク順としてのtdTomato陽性細胞の数は、毒性があると考えられた後、このライブラリ内の次の2つの最も有毒な化合物であった。これら2つの井戸の標準偏差値は、平均を歪めた3つのプレートの間に外れ値があることを示唆しておらず、3つの反復プレートのそれぞれに対する数値を調べると、いずれの化合物もいずれの化合物も25%の閾値を下回らなかった。プレート(データは表示されません)。tdTomato蛍光の代表的な画像は、図3のいくつかのウェルから示されている。MTTと細胞数アッセイの間の毒性に対する2つのウェルの画像の検査は、F3(図3B)とG10(図3C)の化合物が3つの複製プレートのうちの1つではあるが、両方とも有毒であったことを明らかにした。井戸G10にはいくつかの残留生細胞があった(データは示されていない)。この場合、MTTアッセイは、イメージャーの細胞計数アルゴリズムが誤って死んでいる/死んでいる細胞を数えるので、細胞毒性のスコアを上げたようです。
MTTアッセイは毒性を決定するために設計されていますが、ライブラリには細胞増殖を増強および阻害する化合物が含まれている可能性があるため、アッセイが潜在的な増殖抑制効果と増殖効果の両方をどの程度定量化できるかを評価する有益であろう。テストされた化合物。これを行うには、正規化された平均吸光度または細胞数が25%を超え、3つの反復プレートのそれぞれに対する制御手段以下の2つの標準偏差未満であった場合に、化合物が成長抑制剤として分類されたフィルタを使用しました(シェーディング)表1および表 2の黄色)11の化合物は、細胞数アッセイのこの基準を満たし、2つのアッセイの間に1つ(E10)だけが重複するMTTアッセイの2つだけを満たしましたが、細胞数アッセイの11個のうち2つはMTTアッセイ(F3)によって毒性があると述べたものです。、G10)。
正規化された手段が3つの反復プレートのそれぞれに対する制御手段を上回る2つの標準偏差であった化合物は、成長増強として分類された(表1および表2の緑色のシェーディング)。各アッセイのこの基準に適合する化合物は1つだけであり、化合物はアッセイ間で重複しなかった。MTTと細胞数アッセイの間に不一致のある井戸の画像をさらに調べると、MTTがtdTomatoアッセイに対して細胞数を過大にしたウェルが大きく見える場合があることを示しました(図3C)。一方、MTTがtdTomatoに対して細胞数を過小評価しているウェルは、細胞が小さく見えた(図3D)。要約すると、tdTomatoアッセイは11化合物を毒性として分類し、11個は増殖抑制剤として、1つは細胞増殖に明らかな影響を及ぼさない34を伴う増殖増強として1つである(表1)。MTTアッセイは、13の化合物を毒性として分類し、2つは増殖抑制剤として、1つは細胞増殖に明らかな影響を及ぼさない41を有する成長増強として分類した(表2)。
毒性が認められている化合物のうち3件について6点の用量応答アッセイを行った。これらの3つの化合物は、STAT3阻害剤WP1066(B5)および統計(E4)および表皮成長因子受容体阻害剤チルホスティン9(E11)であった。用量は、10 μMの最大濃度から始まり、312.5 nMの最小濃度に行く連続した二重希釈であった。これらの化合物の1つ(WP1066)に対する細胞数およびMTTアッセイの両方に対する生存細胞の濃度対正規化された割合の対数のグラフを図4に示す。曲線は4つの最も低い濃度のための毒性なしで比較的平坦であり、5 μMの線量で急速に落ち、10 μMでほぼ完全な毒性に落ちる。致死用量50(LD50)は、tdTomatoアッセイの場合は4.4μM、MTTアッセイでは6.0μMとして算出した。他の2つの化合物のtdTomatoおよびMTT LD50値は、それぞれ3.4μMおよび4.7 μMであり、それぞれ静的で、トリプホスチン9については0.8 μMおよび1.6 μMであった。
図 1:一次毒性スクリーンで使用されるマスター化合物版のプレートマップ。すべての外側のウェルは灰色でシェードされ、セルのないメディアが含まれていることを示します。DMSO コントロール (100%)ウェル B2、D6、および G11 では太字でラベル付けされています。Cmpdに標識されたすべてのウェルは、100%DMSOで10mM濃度でユニークな試験化合物を含んでいた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:用量応答アッセイで使用される化合物プレートのプレートマップ。すべての外側のウェルは灰色でシェードされ、セルのないメディアのみが含まれていることを示します。DMSO コントロールは、列 2 に収容されました。すべての化合物/用量の組み合わせの三重化が示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:tdTomatoの選択したウェルの蛍光画像72時間後の処理後。(A) ウェル B2: DMSO コントロール, (B) ウェル F3: 細胞カウントデータは毒性を示唆していないが MTT データは、 (C) まあ E6: tdTomato カウントに対する MTT による過大評価されたセル数,(D)まあ G6 に対する MTT によるセル数の過大評価tdTomato.すべての画像は、励起/発光のための531/593 nm波長のRFPフィルタを使用して10倍の倍率で撮影されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: ウェルB5における化合物に対する対数濃度対生存率%DMSOの曲線。曲線上の点は、3つの生物学的反復の平均の平均±標準誤差で平均正規化生存細胞を表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:3つのレプリケートプレートのパーセンテージDMSO制御に正規化されたtdTomato細胞数の平均±標準偏差。ウェルシェーディングは、次のことを示しています: 赤, 有毒な化合物;黄色, 潜在的に成長抑制;グリーン、潜在的に成長を高める。シェーディングは、化合物が細胞の成長に影響を与えるようには見えなかったことを示します。
表2:3つのレプリケートプレートのパーセンテージDMSO制御に正規化されたMTT吸光度の手段±標準偏差。ウェルシェーディングは、次のことを示しています: 赤, 有毒な化合物;黄色, 潜在的に成長抑制;グリーン、潜在的に成長を高める。シェーディングは、化合物が細胞の成長に影響を与えるようには見えなかったことを示します。
| まぁ | 化合 物 | ノート |
| B2 | Dmso | 負のコントロール |
| C2 | キャンプ | プロテインキナーゼ活性化剤 |
| D2 | フラッコキン | ケモカイン |
| E2 | LDN212854 | 骨形態形成タンパク質(BMP)受容体阻害剤 |
| F2 | AG370 | 血小板由来成長因子受容体(PDGFR)キナーゼ阻害剤 |
| G2 | DAPT | ガンマセクレクターゼ阻害剤;ニューロン分化陽性コントロール |
| B3 | AY9944 | 7-デヒドロコレストロール還元酵素阻害剤;ヘッジホッグ経路阻害剤 |
| C3 | STA-21 | 転写3(STAT3)阻害剤のシグナルトランスデューサおよび活性化剤 |
| D3 | GM-CSF | 顆粒コサイト-マクロファージコロニー刺激因子;サイトカイン |
| E3 | TNP470 | メチオニンアミニペプチダーゼ-2阻害剤 |
| F3 | バイオ | グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3阻害剤;WNT 経路活性化剤 |
| G3 | CNTF | 毛様性神経栄養因子;ニューロペプチド |
| B4 | サン | 平滑化された受容体拮抗薬;ヘッジホッグ経路阻害剤 |
| C4 | AG825 | ERBB2阻害剤 |
| D4 | M-CSF | マクロファージコロニー刺激因子;サイトカイン |
| E4 | スタティック | 転写3(STAT3)阻害剤のシグナルトランスデューサおよび活性化剤 |
| F4 | SC79 | AKT(プロテインキナーゼB)活性化剤 |
| G4 | DMH1 | 骨形態形成タンパク質(BMP)受容体阻害剤 |
| B5 | WP1066 | 転写3(STAT3)阻害剤のシグナルトランスデューサおよび活性化剤 |
| C5 | インスリン | |
| D5 | IL-3 | インターロイキン-3;サイトカイン |
| E5 | AG494 | 表皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤 |
| F5 | LY294002 | ホスオイノソチド3-キナーゼ阻害剤 |
| G5 | IGF2 | インスリン成長因子-2 |
| B6 | サグ | 滑らかなアゴニスト;ヘッジホッグ経路活性化剤 |
| C6 | AG370 | 血小板由来成長因子受容体キナーゼ阻害剤 |
| D6 | Dmso | 負のコントロール |
| E6 | EC23 | レチノイン酸受容体アゴニスト |
| F6 | トーリン2 | ラパマイシン(MTOR)阻害剤の機械的標的 |
| G6 | 27362年 | ロー関連、タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤を含むコイルコイル |
| B7 | セレコクシブ | シクロオキシゲナーゼ-2 (COX-2) 阻害剤 |
| C7 | SB525334 | 成長因子β受容体(TGBFR)阻害剤の変換 |
| D7 | DAPT | ガンマセクレクターゼ阻害剤;ニューロン分化陽性コントロール |
| E7 | チル99021 | グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3阻害剤;WNT 経路活性化剤 |
| F7 | LDN 193189 | 骨形態形成タンパク質(BMP)受容体阻害剤 |
| G7 | タラゾチン | レチノイン酸受容体アゴニスト |
| B8 | AM580 | レチノイン酸受容体アゴニスト |
| C8 | DHBP | カルシウム放出阻害剤 |
| D8 | ジャンパー スカート | 一酸化窒素ドナー |
| E8 | ドルソモルフィン | 骨形態形成タンパク質 (BMP) 受容体阻害剤;5' アデノシンモノポスフェート活性化タンパク質キナーゼ (AMPK) 阻害剤 |
| F8 | イマチニブ | チロシンキナーゼ阻害剤 |
| G8 | BMS 493 | 逆レチノイン酸受容体アゴニスト |
| B9 | シクロパミン | 平滑化された受容体拮抗薬;ヘッジホッグ経路阻害剤 |
| C9 | セマガスタット | ガンマ・セクレクターゼ阻害剤 |
| D9 | ボスティニブ | チロシンキナーゼ阻害剤 |
| E9 | プルモルファミン | 滑らかなアゴニスト;ヘッジホッグ経路活性化剤 |
| F9 | ジャグ | ギザギザ;ノッチ受容体アゴニスト |
| G9 | SB431542 | 成長因子β受容体(TGBFR)阻害剤の変換 |
| B10 | SC79 | AKT(プロテインキナーゼB)活性化剤 |
| C10 | ダントロレン | リャノジン受容体拮抗薬 |
| D10 | チルプホスティン46 | 表皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤 |
| E10 | 午前80時 | レチノイン酸受容体アゴニスト |
| F10 | IFN-Y | インターフェロンガンマ;サイトカイン |
| G10 | PQ401 | インスリン様成長因子受容体(IGF1R)阻害剤 |
| B11 | DAPT | ガンマセクレクターゼ阻害剤;ニューロン分化陽性コントロール |
| C11 | A2M | 細胞外糖タンパク質;プロテアーゼ阻害剤 |
| D11 | AG490 | 表皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤 |
| E11 | チルプホスティン9 | 血小板由来成長因子受容体(PDGFR)キナーゼ阻害剤 |
| F11 | BMP-2 | 骨形態形成タンパク質-2 |
| G11 | Dmso | 負のコントロール |
補足表1:一次スクリーン化合物のリスト。プライマリ画面で使用された各化合物の位置、名前、およびメモが提供されます。
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Discussion
この記事の主な目的は、低スループットスクリーニングで細胞増殖に影響を与える化合物を効率的かつ安価に同定できる戦略を説明することでした。2つの直交技術を用いて、細胞数を評価して結論に対する信頼度を高め、1つのアッセイしか使用できない追加の洞察を提供しました。アッセイの1つは、tdTomato陽性細胞を直接カウントするために蛍光細胞イメージャーを使用し、2つ目は、MTTを形成するためにMTTを形成するミトコンドリアの十分に特徴付けられた能力に依存していたので、細胞数10のプロキシとして機能した。このデモでは合計57の試験化合物が評価されたが、アッセイのMTT翼は2,000化合物14を有するライブラリの試験に使用されている。画面の結果は、2つのアッセイがより自信を持って特定の結論に達する上で互いを補強する方法を指摘し、2つのアッセイが通常的に追加情報を提供する補完的なシナリオを強調しました。少なくとも2つの別々の実験を行う必要があります。
プロトコルの最も重要なステップは、細胞をめっきする直前に起こります。細胞培養における代謝条件は、特にグルタミンおよびグルコース消費の場合、細胞があまりにも高密度17、18で播種された場合、非常に揮発性になることがある。これらの条件下では、細胞死は細胞培養条件に固有の要因に起因し、試験された化合物の毒性とは無関係である。その結果、細胞傷害性化合物に対する偽陽性の増加と結果18の再生の困難が生じる。このステップでの成功は、使用される細胞株の適切な細胞密度、めっき前の細胞数の正確な決定、および96の井戸内およびウェル間での均質なめっき分布を確保するために細胞の完全な再懸濁を知る必要があります。- 井戸板また、顕微鏡下で見てめっき後、約2~3時間の正しい密度で細胞が存在することを視覚的に確認することも重要です。
アッセイ自体に関しては、MTTアッセイの最も重要なステップは、MTTが細胞培養培地に完全に溶解していることを保証することです。MTTの残留沈殿物は、それ自体が急性細胞毒性をもたらす可能性があるため、激しい渦でMTTを完全に溶解することが重要です。細胞計数アッセイの最も重要なポイントは、tdTomatoのイメージングのための正しい露光時間を確立することです。露光時間が短すぎると、真の蛍光細胞がソフトウェアによってカウントされずに行き、露光時間が長すぎると、信号が強くなり、ソフトウェアが複数のセルを1つの細胞としてカウントするように、隣接する細胞をブレンドする可能性があります。それはそれらを解決することができないので14.イメージング リーダーに付属しているほとんどのソフトウェア パッケージでは、カウントされるセルを示すプレビュー ステップを使用できます。このプレビューステップを数回の露光時間で実行し、蛍光細胞を最も正確に識別するプレビューステップを選択することが重要です。
他の方法と同様に、これらのアッセイには一定の制限があります。より高いスループットを得るために、一次毒性アッセイは、より多くの偽陽性および偽陰性を犠牲にして来ることができる単一の治療/単一用量パラダイムのみを使用する。さらに、いくつかの以前の研究は、MTTがコロニー形成アッセイ19またはチミジン組み込みアッセイ20のいずれかを使用する場合、細胞数と非常によく相関することを示しているが、特定の化合物による治療は、増強することができるか、またはMTTアッセイの結果がもはや細胞数21と相関しないような方法でミトコンドリア活性を阻害する。このデモンストレーションの結果は、MTTが有毒化合物の同定に優れている一方で、増殖を阻害または増強する化合物を同定する能力が限られていることを示している。セル番号との相関が少ない方法です。tdTomato カウントアッセイにもいくつかの制限があります。明らかな制限は、蛍光タンパク質を安定的に発現する細胞株を有する必要がある。近年のゲノム操作の進歩により、このようなラインの開発がはるかに容易になりましたが、それらを生成するために必要な作業は、いくつかのラボの能力を超えている可能性があります。技術的な観点から見ると、画像解析を使用する細胞計の最大の問題は、これらのアッセイが一緒にクラスター化された細胞を区別できないことであり、その結果、アンダーカウント14が生じるため、適切なめっきが可能である。正確な結果を生み出すには重要です。もう一つの潜在的な問題は、明るく蛍光する死んだ細胞または死んでいる細胞のカウントです。この問題を回避する 1 つの方法は、これらの背景セルを除去するためにカウントする前に PBS でセルを洗浄することです。これは、生細胞が洗浄時に剥離する可能性があるため、細胞の付着が少ない特定の細胞に対しては都合が悪い場合があります。この問題に対する別の解決策は、多くの分析プログラムに内在する柔軟性を利用して、生きている蛍光細胞だけがカウントされるように、狭い範囲内で細胞同定のためのパラメータをカスタマイズすることです。
この記事で説明する戦略は、数百の化合物を効率的にスクリーニングするための強力な方法を提供します。MTTアッセイ読み出しは、ミトコンドリア活性の生理学的結果であり、不正確な結果4、21を生成することができる細胞株または化合物特異的効果を有することができる。蛍光レポーターを用いて細胞計と組み合わせることで、これらの制限を大幅に軽減することができます。図に示すように、両方のアッセイの結果を比較すると、有毒化合物の同定において100%近くの精度が得られます。以前の研究では、TdTomatoを安定的に発現するHEK293Tラインにおいて、有毒化合物22のライブラリーに対してMTTとtdTomatoとの間に高いIC50相関があることを示している。この研究は、同様の一致解析を実行するのに十分なヒット化合物に対して二次確認を実行しませんでしたが、テストされた3つの化合物について計算されたLD50値は類似していました。
毒性に関する結論を補強する能力に加えて、2つのアッセイは、試験化合物の潜在的な増殖抑制および増殖効果に対処する際に互いを補完することができる。いくつかの試験化合物について、2つのアッセイ間のデータは実質的に分岐した。これらの化合物の一部についてtdTomato蛍光の画像を調べると、治療と制御の間に顕著な形態変化があった。これは、2つのアッセイ間の正規化された値の発散が、MTT読み出しとtdTomato細胞数に差異的に影響を与える生理学的変化に基づいている可能性があることを示唆している。単一の実験でこのようなデータを取得する能力は、この戦略の堅牢性を大幅に向上させ、より一般的に適用可能になります。そのため、毒性化合物を高精度で同定するだけでなく、細胞の増殖/生理学に対してより微妙な影響を及ぼす化合物を指摘する能力を有する。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、NINDS内部壁画研究プログラムによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
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