Summary
A menudo es necesario evaluar la citotoxicidad potencial de un conjunto de compuestos en las células cultivadas. Aquí, describimos una estrategia para detectar compuestos tóxicos de forma fiable en un formato de 96 pozos.
Abstract
La citotoxicidad es un parámetro crítico que debe cuantificarse al estudiar fármacos que pueden tener beneficios terapéuticos. Debido a esto, muchos ensayos de detección de drogas utilizan citotoxicidad como una de las características críticas a perfilar para compuestos individuales. Las células en cultivo son un modelo útil para evaluar la citotoxicidad antes de proceder a dar seguimiento a compuestos de plomo prometedores en modelos animales más costosos e intensivos en mano de obra. Describimos una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular en una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que expresan tdTomato. La estrategia utiliza dos ensayos complementarios para evaluar el número de celdas. Un ensayo funciona a través de la reducción de 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltetrazolium bromide (MTT) al formazan como apoderado del número de celda y el otro cuenta directamente el tdTomato que expresa NSC. Los dos ensayos se pueden realizar simultáneamente en un solo experimento y no son intensivos en mano de obra, rápidos y baratos. La estrategia descrita en esta demostración probó 57 compuestos en una pantalla primaria exploratoria para la toxicidad en un formato de placa de 96 pocillos. Tres de los éxitos se caracterizaron aún más en una respuesta de dosis de seis puntos utilizando la misma configuración de ensayo que la pantalla principal. Además de proporcionar una excelente corroboración de la toxicidad, la comparación de los resultados de los dos ensayos puede ser eficaz en la identificación de compuestos que afectan a otros aspectos del crecimiento celular.
Introduction
Una de las características más importantes que debe determinarse para un compuesto químico que tiene potencial terapéutico es su toxicidad para las células animales. Esta característica determinará si un medicamento es un buen candidato para un estudio más extenso. En la mayoría de los casos, se buscan compuestos con toxicidad mínima, pero hay situaciones en las que un compuesto con capacidad para matar tipos de células específicas es de interés, por ejemplo, fármacos antitumoraligénicos. Aunque los animales enteros son los mejores sistemas modelo para determinar la toxicidad sistémica, el costo y la mano de obra implicadas es prohibitivo cuando es necesario probar más de unos pocos compuestos. Como tal cultivo celular de mamíferos se utiliza generalmente como la alternativa más eficiente1,2. Las pantallas de fármacos de rendimiento pequeño a mediano son una modalidad importante a través de la cual se puede evaluar la toxicidad en el cultivo celular. Estas pantallas se pueden utilizar para interrogar bibliotecas anotadas dirigidas a vías de señalización individuales. El formato general de una pantalla de este tipo es probar inicialmente todos los compuestos de la biblioteca a una sola dosis (generalmente 10 m) en una pantalla exploratoria de toxicidad primaria, y luego realizar una pantalla de respuesta de dosis secundaria en profundidad para caracterizar completamente la toxicidad perfil de los aciertos de la pantalla principal. Los métodos para implementar esta estrategia se describirán aquí y proporcionarán una manera rápida, eficiente y económica de identificar y caracterizar compuestos tóxicos.
Se han desarrollado múltiples métodos para evaluar la citotoxicidad de compuestos pequeños y nanomateriales en células de mamíferos3,4. Cabe señalar que ciertos materiales pueden interactuar con el ensayo proporcionando resultados engañosos, y tales interacciones deben probarse al caracterizar los golpes de las pantallas de toxicidad4. Los ensayos de citotoxicidad incluyen exclusión azul de trypan5, ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)6, ensayo azul de Alamar7, éster de acetoximetil calcien (AM)8y el ensayo ATP9. Todos estos ensayos miden varios aspectos del metabolismo celular que pueden servir como un proxy para el número de celda. Si bien todos ofrecen beneficios, ensayos a base de sal de tetrazolium como 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltelium bromuro (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sal interna (XTT)-1, y 4-(3-[4-4- El disulfato de yodofenilo]-2-[4-nitrofenilo]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato (WST-1)10,11 proporcionan buena precisión y facilidad de uso a bajo costo. MTT, que se utilizará en esta demostración, se reduce a un formazán insoluble por una reductasa mitocondrial y la tasa de esta conversión se correlaciona fuertemente con el número de celda. Este ensayo se ha utilizado rutinariamente tanto a pequeña escala como para bibliotecas de cribado con hasta 2.000 compuestos12. El recuento directo de células por un marcador etiquetado ofrece otro método para evaluar el número celular, y a diferencia del ensayo MTT puede proporcionar información adicional sobre la dinámica del crecimiento celular. Varios algoritmos disponibles públicamente están disponibles para realizar análisis automatizados de recuento de celdas y también hay algoritmos propietarios que forman parte de paquetes de software para lectores de imágenes13,14. En esta descripción del método, una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que ha sido editada genéticamente para expresar constitutivamente tdTomato15 servirá como una línea de prueba para comparar los resultados de viabilidad celular entre un ensayo MTT y un recuento automatizado de células ensayo en una pantalla que evalúe la toxicidad de 57 compuestos de ensayo. Aunque el objetivo principal de esta estrategia era identificar y caracterizar compuestos tóxicos, tiene el beneficio adicional de identificar potencialmente los compuestos inhibidores del crecimiento y mejorar el crecimiento y por lo tanto proporciona un método eficaz para identificar drogas que puede modular el crecimiento celular.
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Protocol
1. Cultura del NSC
NOTA: La manipulación de una línea NSC humana se describirá a continuación, pero cualquier línea celular se puede utilizar para este protocolo. Todo el trabajo de cultivo celular se realiza en un gabinete de seguridad biológica.
- Recubrir una placa de 96 pocillos con membrana de sótano/matriz extracelular (ECM).
- Descongelar la alícuota de ECM(Tabla de Materiales),lo que facilitará la fijación de NSC, sobre hielo. Diluir ECM a la concentración adecuada (generalmente 1:100) en un medio base de 10 ml(Tabla de materiales)y añadir 50 ml por pocto a cada uno de los 60 pozos interiores de una placa de 96 pocillos(Figura 1). Utilice sólo los 60 pozos interiores para evitar artefactos que puedan resultar del efecto de borde16.
- Deje que la placa se quede a temperatura ambiente o en una incubadora de cultivo celular (37 oC, 5% CO2) durante al menos 30 min.
- Células madre neurales de disociación y placa.
NOTA: Las células para su uso en este método deben crecer a por lo menos 80% de confluencia en un matraz T75.- Células de cultivo en un matraz T75 en una incubadora de cultivo celular a 37oC y 5% co2 en medio NSC que se compone de medio base, B27, aminoácidos no esenciales, glutamina de 2 mM y factor de crecimiento de fibroblasto básico de 10 ng/ml (FGFb o FGF2).
- Retire las células de la incubadora una vez que alcancen el 80% de confluencia y aspire el medio NSC. Añadir una cantidad adecuada de reactivo de disociación celular (3 ml para un matraz T75; Tabla de Materiales) e incubar durante 5 minutos en la incubadora.
- Después de la incubación, agregue 7 ml de medio NSC en el matraz T75 y pipeta vigorosamente para asegurar que todas las células se sequen. Transfiera la solución celular disociada a un tubo de 15 ml y centrífuga a 200 x g durante 5 min.
- Después de la centrifugación, retire el sobrenadante del tubo y resuspenda las células en 10 ml de células medianas de NSC y cuente las células.
- Reajuste la concentración de células a 200.000 células/ml con medio NSC. Asegúrese de que las células estén completamente resuspendidas para un revestimiento homogéneo en pozos.
- Placa de 100 l de la mezcla celular (20.000 células) en los 60 pozos interiores de tres placas de 96 pocillos que han sido recubiertas como se describe en la sección 1.1. Utilice seis de las ocho ranuras de un pipeteador multicanal de 8 canales para placar celdas columna por columna.
- Añadir 100 s de medio base o medio NSC a todos los pozos sin células para minimizar la posible evaporación de los pozos más exteriores.
- Bajo un microscopio de cultivo celular, inspeccione visualmente al menos 10 pozos en cada una de las tres placas de 96 pocillos para confirmar que las células están sembradas a la densidad esperada. No proceda con el ensayo si las células están chapadas a una densidad demasiado dispersa o densa.
2. Tratamiento de células con compuestos
NOTA: La biblioteca casera probada en esta demostración contiene compuestos que modulan las vías de señalización sórtica/integrada (Wnt), el ácido retinoico, la transformación del factor de crecimiento beta (TGF-o) y las vías de señalización sónica de erizos, así como una variedad de quinasas de tirosina.
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Pantalla primaria exploratoria para detectar toxicidad/número celular
- Aliquot 50-100 mL de hasta 57 compuestos de ensayo(Tabla Suplementaria 1) a una concentración de 10 mM en 100% dimetil sulfóxido (DMSO) en los 60 pozos interiores de una placa de 96 pocillos con fondo en U, de fondo en V o de fondo redondo con tres pozos DMSO como control (ver Figura 1 para un mapa de placas). Esto servirá como la placa compuesta maestra con 25 s de compuesto que se puede congelar y descongelar varias veces.
NOTA: Las placas de fondo plano no deben utilizarse, ya que será más difícil aspirar pequeños volúmenes de compuestos de ellos con un pipeteador de sobremesa. - Retire las placas de cultivo celular de la incubadora 16-24 h después de dividirlas como se describe en la sección 1 y aspirar la columna por columna mediana NSC con un pipetador multipozo de 8 canales utilizando solo seis de las ocho ranuras multipozo. Agregue 95 ml de medio NSC fresco a las células en cada una de las tres placas de réplica y vuelva a colocar las placas en la incubadora hasta que se complete el paso 2.1.4 a continuación.
- Añadir 49 l de medio NSC a cada uno de los 60 pozos interiores de una placa vacía de fondo en U, fondo en V o de fondo redondo de 96 pocillos con un pipeteador multipozo de 8 canales. Desensandar la placa compuesta maestra y utilizar un pipetador de sobremesa o un instrumento equivalente para pipetear 1 l de compuesto de la placa maestra en el medio DeNC de 49 ol en cada uno de los 60 pozos interiores.
- Mezclar el compuesto diluido 3x con el pipeteador de la parte superior del banco.
- Retire las tres placas de 96 pocillos de los SCN de la incubadora, pipeta de 15 l de cada compuesto diluido con el pipeteador de la parte superior del banco y dispensar una alícuota de 5 ol de compuesto en cada una de las tres placas.
NOTA: Esta dilución 1:20 del compuesto en las células en combinación con la dilución inicial 1:50 en el paso 2.1.3 produce una dilución de 1:1000 de tal manera que la concentración final de los compuestos en los SCN será de 10 m con una concentración de DMSO de 0,1% y la concentración final concentración para los controles DMSO será del 0,1%. - Incubar células con compuesto durante 72 h y proceder con ensayos de citotoxicidad. Se pueden utilizar intervalos más cortos, pero un período de incubación de 72 horas debe maximizar los posibles efectos citotóxicos de los compuestos probados.
- Aliquot 50-100 mL de hasta 57 compuestos de ensayo(Tabla Suplementaria 1) a una concentración de 10 mM en 100% dimetil sulfóxido (DMSO) en los 60 pozos interiores de una placa de 96 pocillos con fondo en U, de fondo en V o de fondo redondo con tres pozos DMSO como control (ver Figura 1 para un mapa de placas). Esto servirá como la placa compuesta maestra con 25 s de compuesto que se puede congelar y descongelar varias veces.
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Ensayo de respuesta a la dosis
NOTA: La configuración del 96 pozo utilizado para la dosis-respuesta se muestra en la Figura 2.- Utilice la columna 2 para seis réplicas de control DMSO y triplicados de prueba de hasta tres compuestos diferentes a diluciones seriales dobles a seis dosis a partir de una dosis alta de 10 m.
- Diluir 4 ml de DMSO o compuesto de ensayo en DMSO en 196 ml de medio NSC en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 25 l de DMSO a la columna de pozos de B2-G2 y 50 l de compuestos de ensayo a la fila de B3-B11 con los tres compuestos probados en triplicados de 10 mM en las filas B3-B5, B6-B8 y B9-B11.
- Pipetear 25 l de medio NSC a las columnas vacías restantes en la parte interior de la placa de 96 pocillos. Retire 25 ml de compuesto de los pozos B3-B11 con un pipeteador multicanal, agregue a los pozos C3-C11 y mezcle al menos cinco veces. Repita el proceso para que las filas restantes generen triplicados en dos diluciones para un total de seis dosis para cada uno de los compuestos.
- Genere Los NSC para la respuesta de dosis exactamente como se describe para la pantalla primaria en la sección 2.1. Los compuestos para la respuesta a la dosis se añaden e incuban en las células exactamente como se describe en los pasos 2.1.5 y 2.1.6.
NOTA: Se realizan tres réplicas biológicas del ensayo de respuesta a la dosis repitiendo el ensayo en los SCN en diferentes pasajes en días separados.
3. Células de imagen en un lector de placas
- Después de que las células han sido incubadas con compuestos para el tiempo asignado, las células de la imagen en un lector de placas para determinar el número de celda de pretratamiento por pozo.
NOTA: Las instrucciones para las células de imágenes son específicas del lector, pero generalmente siguen una estrategia similar. Las instrucciones siguientes se aplican al lector utilizado en esta demostración (Tabla de materiales). - Retire la placa de la incubadora y colóquela dentro del lector de placas. Abra el software imager para configurar archivos de protocolo y experimento para el estudio. Vaya al modo Manual de Imager en el Administrador de tareas y haga clic en Capturar ahora....
- Elija la placa de 96 pocillos como tipo de recipiente, seleccione 10x para la ampliación y proteína fluorescente roja (RFP) 531 y 593 para la toma de imágenes tdTomato. Elija un pozo y, a continuación, haga clic en Enfoque automático para enfocar la imagen y en Exponer automáticamente para obtener el tiempo de exposición adecuado. Ajuste manualmente el enfoque y la exposición si es necesario.
- Una vez que se hayan obtenido el enfoque y la exposición adecuados, haga clic en el icono de la cámara para capturar la imagen. A continuación, haga clic en PROCESS/ANALZYE arriba de la imagen para continuar construyendo el protocolo y seleccione la pestaña ANALYSIS.
- Haga clic en Análisis celular en AGREGAR PASO DE ANALISIS a la derecha de la imagen y haga clic en INICIO. La imagen mostrará las celdas resaltadas para indicar cada celda individual. Se puede hacer clic en la selección Opciones para modificar los parámetros para seleccionar mejor las celdas en función del umbral de fluorescencia o el tamaño de celda. Si el imager está contando correctamente las celdas, haga clic en AGREGAR PASO en la parte inferior de la pantalla.
- Haga clic en el icono en la parte superior de la pantalla para crear experimento a partir de conjuntode imágenes, que abrirá una ventana con el experimento. Una vez abierto, haga clic en Procedimiento bajo la pestaña Protocolo y en la nueva ventana que abre seleccione Leer, luego en la nueva ventana haga clic en la placa completa para seleccionar sólo los 60 pozos que contienen las celdas (B2... G11). Haga clic en Aceptar para guardar los cambios y, a continuación, haga clic en Aceptar en la ventana Procedimiento.
- La placa ahora puede ser imagendeada por este protocolo y el archivo experimental se puede guardar. Haga clic en el icono de reproducción para ejecutar la placa. Una vez que se haya realizado la imagen de la primera placa, grafique las otras dos placas. Al finalizar la creación de imágenes, descargue los datos del recuento de celdas en una hoja de cálculo para su análisis. Tome todas las imágenes con un aumento de 10x.
4. Ensayo de citotoxicidad de Terminal MTT
NOTA: Comience el ensayo de MTT dentro de las dos horas posteriores a completar la toma de imágenes tdTomato.
- Realice una solución de 5 mg/ml de MTT pesando 25 mg de MTT y reponiéndola en 5 ml de medio NSC. Vortex la solución hasta que no haya precipitados visibles de MTT, que podría tomar varios minutos.
- Retire las placas de cultivo celular de la incubadora y aspire fuera del medio de cultivo celular. Diluir MTT 1:10 en el medio de cultivo celular y añadir 100 l de MTT a cada pozo de células.
- Incubar células a 37oC durante 2 h. Un precipitado púrpura debe ser visible aproximadamente en proporción al número de células en el pozo. Aspirar la solución MTT fuera de las placas o invertir la placa rápidamente para mover la solución fuera de la placa.
- Añadir 50 s de 100% DMSO a cada pocto y agitar las placas a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 rpm. Lea la absorbancia de cada pozo a 595 nm en un lector de placas y exporte datos a una hoja de cálculo para su análisis.
5. Análisis de datos
- Realice un análisis de los recuentos de células tdTomato y absorbancias con el software adecuado (hoja de cálculo comercial, R). Calcule los promedios para la absorbancia o el recuento de celdas de las tres réplicas DMSO en cada placa para fines de normalización, luego divida el valor para los recuentos de celdas o absorbancias para cada pozo de la placa por este promedio y conviértalo en un porcentaje. Esto produce el recuento de celdas normalizado o la absorbancia en relación con el control DMSO para cada placa.
- Calcule el recuento o absorbancia normalizado medio y la desviación estándar para replicar pozos en las tres placas.
NOTA: En este punto debe haber cuatro conjuntos diferentes de valores normalizados: uno para cada una de las placas y una media para las tres placas de réplica. - Sea conservador y utilice un valor normalizado en o por debajo del 25% para el promedio en las tres placas de réplica para clasificar un compuesto como tóxico. Además, debido a que sólo se realiza un único tratamiento por compuesto en cada placa, sólo los compuestos de etiqueta que caen por debajo de este umbral en las tres placas de réplica como tóxicos. Examine las imágenes fluorescentes de todos los compuestos que este análisis filtra como tóxicos para confirmar visualmente la toxicidad.
NOTA: La identificación de compuestos con un efecto inhibitorio de crecimiento o mejora del crecimiento es más difícil de evaluar en un ensayo exploratorio de este tipo debido a la falta de réplicas en cada placa. Sin embargo, la siguiente es una manera rápida de identificar compuestos que pueden ralentizar o mejorar el crecimiento celular. - Calcule la desviación estándar para los tres controles DMSO de réplica en cada placa y, a continuación, filtre los compuestos que tengan valores medios al menos dos desviaciones estándar por encima o por debajo del control DMSO. Los compuestos que caen fuera de este filtro en cada una de las tres placas pueden justificar una investigación adicional.
- Utilice la misma estrategia de análisis para la respuesta a la dosis que la pantalla de toxicidad primaria. Calcule los promedios de los controles DMSO para cada réplica biológica y utilice estos valores para normalizar el porcentaje de células vivas o el porcentaje de absorbancias para cada combinación compuesta/dosis. Calcular los medios y el error estándar de los medios para todas las combinaciones compuestas/dosis para las tres réplicas biológicas.
- Transformar la concentración a su valor de registro, generar una curva de respuesta de dosis para el registro de concentración frente a la viabilidad normalizada, y ajustar la curva con un análisis de regresión no lineal (el análisis se puede realizar en R o en varias estadísticas comerciales paquetes). Calcular la dosis letal 50 (o técnicamente en este caso la dosis viable 50) o la concentración de compuesto que resulta en 50% toxicidad de la ecuación de esta curva. Muchos paquetes de software calcularán automáticamente esta cifra.
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Representative Results
Los datos automatizados del recuento de células identificaron once compuestos con menos del 25% de viabilidad cuando se normalizan al control DMSO, mientras que los datos MTT identificaron estos mismos compuestos más dos adicionales(Tabla 1 y Tabla 2,rojo sombreado). Los dos compuestos encontrados tóxicos sólo en el ensayo MTT (pozos F3 y G10) tenían 31% y 39%, respectivamente, el número de células tdTomato-positivas como el control y por orden de rango fueron los dos compuestos más tóxicos en esta biblioteca después de los considerados como tóxicos. Los valores de desviación estándar para estos dos pozos no sugirieron que hubiera un valor atípico entre las tres placas que sesgaron los promedios, y al examinar los números para cada una de las tres placas de réplica ninguno de los compuestos cayó por debajo del umbral del 25% en ninguna de las placas (datos no mostrados). Las imágenes representativas de la fluorescencia de tdTomato se muestran en varios pozos en la Figura 3. El examen de las imágenes de los dos pozos discordantes de toxicidad entre el MTT y el ensayo de recuento de células reveló que los compuestos de F3(Figura 3B)y G10(Figura 3C)eran tóxicos aunque en una de las tres placas de réplica había algunas células vivas residuales en pozo G10 (datos no mostrados). Parece que en este caso el ensayo MTT fue más capaz de anotar para la citotoxicidad como a veces el algoritmo de recuento de células de la imagen cuenta erróneamente las células muertas / moribundas.
El ensayo MTT está diseñado para determinar la toxicidad, pero debido a que una biblioteca puede contener compuestos que mejoran e inhiben el crecimiento celular sería informativo evaluar qué tan bien el ensayo cuantifica tanto los efectos inhibidores del crecimiento potencial como los efectos proliferativos de compuestos probados. Para ello se utilizó un filtro mediante el cual los compuestos se clasificaron como inhibidores del crecimiento si sus absorbancias medias normalizadas o recuentos celulares fueron superiores al 25% y menos de dos desviaciones estándar por debajo de las medias de control en cada una de las tres placas de réplica (sombreadas amarillo en la Tabla 1 y la Tabla 2). Once compuestos cumplieron este criterio para el ensayo de recuento de células y sólo dos para el ensayo MTT con sólo un (E10) superpuesto entre los dos ensayos, aunque dos de los once para el ensayo de recuento de células fueron los mencionados anteriormente como tóxicos por el ensayo MTT (F3 , G10).
Los compuestos cuyas medias normalizadas eran dos desviaciones estándar por encima de las medias de control en cada una de las tres placas de réplica se clasificaron como potenciadores del crecimiento (verde sombreado en el Cuadro 1 y el Cuadro 2). Sólo un compuesto se ajusta a este criterio para cada ensayo y el compuesto no se superpone entre los ensayos. Un examen adicional de imágenes de pozos con discrepancias entre el MTT y los ensayos de recuento de células indicó que en algunos casos los pozos en los que MTT sobrestimó el recuento de células en relación con el ensayo tdTomato las células parecían ser más grandes(Figura 3C) , mientras que aquellos pozos donde MTT subestimó el recuento de células en relación con tdTomato las células parecían ser más pequeñas (Figura 3D). En resumen, el ensayo tdTomato clasificó once compuestos como tóxicos, once como inhibidores del crecimiento, y uno como crecimiento que mejora con treinta y cuatro sin efecto aparente en el crecimiento celular (Tabla 1). El ensayo MTT clasificó trece compuestos como tóxicos, dos como inhibidores del crecimiento, y uno como mejora del crecimiento con cuarenta y uno sin efecto aparente sobre el crecimiento celular (Tabla 2).
Se llevó a cabo un ensayo de respuesta a la dosis de seis puntos en tres de los compuestos identificados como tóxicos. Estos tres compuestos fueron los inhibidores STAT3 WP1066 (B5) y el ático (E4) y el inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico tirohostina 9 (E11). Las dosis fueron dos diluciones dobles sucesivas a partir de una concentración máxima de 10 m y se fue a una concentración mínima de 312,5 nM. El gráfico del registro de concentración frente al porcentaje normalizado de células viables para el recuento de células y los ensayos MTT para uno de estos compuestos (WP1066) se muestra en la Figura 4. La curva es relativamente plana sin toxicidad para las cuatro concentraciones más bajas, cae rápidamente a la dosis de 5 M y cae a toxicidad casi completa a 10 oM. La dosis letal 50 (LD50) se calculó como 4,4 m para el ensayo tdTomato y 6,0 m para el ensayo MTT. Los valores de tdTomato y MTT LD50 para los otros dos compuestos fueron de 3,4 m y 4,7 m, respectivamente, para estáticos, y de 0,8 m y 1,6 m, respectivamente, para tripphostina 9.
Figura 1 : Mapa de placas para la placa compuesta maestra utilizada en la pantalla de toxicidad primaria. Todos los pozos exteriores están sombreados en gris, lo que indica que contenían medios sin células. Controles DMSO (100%) están etiquetados en negrita en los pozos B2, D6 y G11. Todos los pozos etiquetados Cmpd contenían compuestos de prueba únicos a una concentración de 10 mM en 100% DMSO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Mapa de placas para la placa compuesta utilizada en el ensayo de respuesta a la dosis. Todos los pozos exteriores están sombreados en gris, lo que indica que sólo contenían medios sin celdas. Los controles DMSO se alojaban en la columna 2. Se indican los triplicados de todas las combinaciones de compuestos/dosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : imágenes fluorescentes tdTomato de los pozos seleccionados 72 horas después del tratamiento. (A) Pozo B2: Control DMSO, (B) Bueno F3: los datos del recuento de células sugirieron que no hay toxicidad, pero los datos de MTT hicieron, (C) Bien E6: recuento de células sobreestimado por MTT en relación con el recuento de tdTomato, (D) Bueno G6 subestimado el recuento de células por MTT en relación con tdTomato. Todas las imágenes fueron tomadas con un aumento de 10x utilizando un filtro RFP con 531/593 nm de longitud de onda para excitación/emisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Curva para la concentración de tronco senverto porcentaje de viabilidad DMSO para el compuesto en pozo B5. Los puntos en la curva representan el promedio normalizado de células viables a seis dosis de error estándar de la media para tres réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Medios de recuento de células tdTomato normalizados al porcentaje de control DMSO para tres placas de réplica ± desviación estándar. El sombreado de pozos indica lo siguiente: rojo, compuestos tóxicos; amarillo, potencialmente inhibidor del crecimiento; verde, potencialmente mejorando el crecimiento. Ningún sombreado indica que los compuestos no parecían afectar el crecimiento celular.
Tabla 2: Medios de absorción MTT normalizados al porcentaje de control DMSO para tres placas de réplica ± desviación estándar. El sombreado de pozos indica lo siguiente: rojo, compuestos tóxicos; amarillo, potencialmente inhibidor del crecimiento; verde, potencialmente mejorando el crecimiento. Ningún sombreado indica que los compuestos no parecían afectar el crecimiento celular.
| Bien | Compuesto | Notas |
| B2 | Dmso | Control negativo |
| C2 | Campamento | Proteína quinasa Un activador |
| D2 | FRACTALKINE | Chemokine |
| E2 | LDN212854 | Inhibidor del receptor de proteína morfogenética ósea (BMP) |
| F2 | AG370 | Receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) inhibidor de la quinasa |
| G2 | DAPT | Inhibidor de la gamma-secretasa; control positivo de diferenciación neuronal |
| B3 | AY9944 | Inhibidor de la 7-dehidrocholestrol reductasa; inhibidor de la vía del erizo |
| C3 | STA-21 | Transductor de señal y activador del inhibidor de la transcripción 3 (STAT3) |
| D3 | GM-CSF | Factor estimulante de colonias de granulkocitos-macrofago; Citoquinas |
| E3 | TNP470 | Inhibidor de la metionina aminipeptidasa-2 |
| F3 | Bio | Inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3; Activador de la vía WNT |
| G3 | CNTF | Factor neurotrófico ciliar; Neuropéptido |
| B4 | Sant | Antagonista del receptor suavizado; inhibidor de la vía del erizo |
| C4 | AG825 | Inhibidor de ERBB2 |
| D4 | M-CSF | Factor estimulante de colonias de macrófagos; Citoquinas |
| E4 | STATTIC | Transductor de señal y activador del inhibidor de la transcripción 3 (STAT3) |
| F4 | SC79 | Activador AKT (proteína quinasa B) |
| G4 | DMH1 | Inhibidor del receptor de proteína morfogenética ósea (BMP) |
| B5 | WP1066 | Transductor de señal y activador del inhibidor de la transcripción 3 (STAT3) |
| C5 | Insulina | |
| D5 | IL-3 | Interleucina-3; Citoquinas |
| E5 | AG494 | Inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) |
| F5 | LY294002 | Inhibidor de la fosfoinosotida 3-quinasa |
| G5 | IGF2 | factor de crecimiento de la insulina-2 |
| B6 | Sag | Agonista suavizado; activador de vía de erizo |
| C6 | AG370 | Inhibidor del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas inhibidor de la quinasa |
| D6 | Dmso | Control negativo |
| E6 | EC23 | Agonista del receptor del ácido retinoico |
| F6 | TORIN2 | Objetivo mecanicista del inhibidor de la rapamicina (MTOR) |
| G6 | Y27362 | Inhibidor de la bobina enrollada asociada a Rho que contiene proteína quinasa (ROCK) |
| B7 | CELECOXCIB | Inhibidor de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) |
| C7 | SB525334 | Inhibidor del betareceptor del factor de crecimiento (TGBFR) |
| D7 | DAPT | Inhibidor de la gamma-secretasa; control positivo de diferenciación neuronal |
| E7 | CHIR99021 | Inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa-3; Activador de la vía WNT |
| F7 | LDN 193189 | Inhibidor del receptor de proteína morfogenética ósea (BMP) |
| G7 | TARAZOTINE | Agonista del receptor del ácido retinoico |
| B8 | AM580 | Agonista del receptor del ácido retinoico |
| C8 | DHBP | Inhibidor de la liberación de calcio |
| D8 | Jsk | Donante de óxido nítrico |
| E8 | DORSOMORPHIN | Inhibidor del receptor de proteína morfogenética ósea (BMP); 5' Inhibidor de la proteína quinasa activada por monophosina (AMPK) |
| F8 | Imatinib | Inhibidor de la tirosina quinasa |
| G8 | BMS 493 | agonista del receptor del ácido retinoico inverso |
| B9 | CICLOPAMINA | Antagonista del receptor suavizado; inhibidor de la vía del erizo |
| C9 | SEMAGACESTAT | Inhibidor de la gamma-secretasa |
| D9 | BOSUTINIB | Inhibidor de la tirosina quinasa |
| E9 | PURMORPHAMINE | Agonista suavizado; activador de vía de erizo |
| F9 | Jag | Irregular; Agonista del receptor de muesca |
| G9 | SB431542 | Inhibidor del betareceptor del factor de crecimiento (TGBFR) |
| B10 | SC79 | Activador AKT (proteína quinasa B) |
| C10 | Dantroleno | Antagonista del receptor de ryanodina |
| D10 | TYRPHOSTIN46 | Inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) |
| E10 | AM80 | Agonista del receptor del ácido retinoico |
| F10 | IFN-Y | interferón-gamma; Citoquinas |
| G10 | PQ401 | Receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1R) inhibidor |
| B11 | DAPT | Inhibidor de la gamma-secretasa; control positivo de diferenciación neuronal |
| C11 | A2M | Glicoproteína extracelular; inhibidor de la proteasa |
| D11 | AG490 | Inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) |
| E11 | TYRPHOSTIN9 | Receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) inhibidor de la quinasa |
| F11 | BMP-2 | Proteína morfogenética ósea-2 |
| G11 | Dmso | Control negativo |
Tabla Suplementaria 1: Lista de compuestos de pantalla primarios. Se proporcionan la ubicación, el nombre y las notas de cada uno de los compuestos que se utilizaron en la pantalla principal.
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Discussion
El objetivo principal de este artículo era describir una estrategia que pudiera identificar de manera eficiente y económica compuestos que afectan el crecimiento celular en un cribado de bajo a moderado rendimiento. Se utilizaron dos técnicas ortogonales para evaluar el número de células para aumentar la confianza en las conclusiones y ofrecer información adicional que no estaría disponible si solo se utilizara un solo ensayo. Uno de los ensayos utilizó un imager de células fluorescentes para contar directamente las células tdTomato-positivas y el segundo dependía de la capacidad bien caracterizada de las mitocondrias para cleave MTT a formazans sirviendo así como un proxy para el número de celda10. Un total de 57 compuestos de prueba fueron evaluados en esta demostración, aunque el ala MTT del ensayo se ha utilizado para probar una biblioteca con hasta 2.000 compuestos14. Los resultados de la pantalla señalaron cómo los dos ensayos podían reforzarse mutuamente para llegar a ciertas conclusiones con más confianza, y destacaron escenarios en los que los dos ensayos eran complementarios proporcionando información adicional que normalmente requieren realizar al menos dos experimentos separados.
El paso más crítico en el protocolo ocurre justo antes de enchapar las celdas. Las condiciones metabólicas en el cultivo celular pueden llegar a ser muy volátiles, particularmente en el caso del consumo de glutamina y glucosa, si las células se sembran a una densidad demasiado alta17,18. En estas condiciones, la muerte celular se debe a factores inherentes a las condiciones de cultivo celular y no relacionados con la toxicidad de los compuestos analizados. El resultado será un aumento en los falsos positivos para los compuestos citotóxicos, así como la dificultad en la reproducción de resultados18. El éxito en este paso requiere conocer la densidad celular apropiada de la línea celular que se está utilizando, la determinación precisa del número de celda antes del chapado y la resuspensión completa de las células para garantizar una distribución homogénea del chapado dentro y a través de los pozos del 96 -bien plato. También es importante confirmar visualmente que las células están presentes aproximadamente a la densidad correcta 2-3 h después del revestimiento mirándolas bajo un microscopio.
En cuanto a los propios ensayos, el paso más crítico para el ensayo MTT es asegurar que MTT se disuelva completamente en el medio de cultivo celular. Los precipitados residuales de MTT pueden resultar por sí mismos en toxicidad celular aguda por lo que es importante disolver completamente MTT con vórtice vigoroso. El punto más crítico para el ensayo de recuento celular es establecer el tiempo de exposición correcto para la toma de imágenes tdTomato. Los tiempos de exposición demasiado cortos pueden dar lugar a que las células verdaderamente fluorescentes no cuenten el software, y los tiempos de exposición que son demasiado largos pueden hacer que la señal sea tan fuerte que mezcla las células vecinas de tal manera que el software cuenta varias celdas como una célula porque es incapaz de resolverlos14. La mayoría de los paquetes de software que vienen con lectores de imágenes permiten un paso de vista previa que muestra qué celdas se están contando. Es importante ejecutar este paso de vista previa en varios momentos de exposición y elegir el que identifica las células fluorescentes con mayor precisión.
Al igual que con cualquier método hay ciertas limitaciones a estos ensayos. Para obtener un mayor rendimiento, el ensayo de toxicidad primaria utiliza un solo paradigma de tratamiento/dosis única que puede venir a costa de más falsos positivos y falsos negativos. Además, aunque varios estudios anteriores han demostrado que MTT se correlaciona muy bien con el número de células cuando se utiliza una colonia formando el ensayo19 o un ensayo de incorporación de timidina20, el tratamiento con ciertos compuestos puede mejorar o inhibir la actividad mitocondrial de tal manera que los resultados del ensayo MTT ya no se correlacionan con el número de celda21. Los resultados de esta demostración indican que mientras que MTT es excelente en la identificación de compuestos tóxicos, su capacidad para identificar compuestos que inhiben o mejoran la proliferación es limitada tal vez porque tales compuestos alteran la actividad mitocondrial en un manera que se correlaciona menos bien con el número de celda. También hay algunas limitaciones en el ensayo de recuento tdTomato. Una limitación obvia es la necesidad de tener una línea celular que exprese establemente una proteína fluorescente. Los recientes avances en la manipulación del genoma han hecho que sea mucho más fácil desarrollar este tipo de líneas, pero el trabajo necesario para generarlas puede estar más allá de las capacidades de algunos laboratorios. Desde un punto de vista técnico, los mayores problemas con cualquier ensayo de recuento de células que utiliza el análisis de imágenes es la incapacidad de estos ensayos para distinguir entre las células que se agrupan juntas, lo que resulta en un recuento inferior14,por lo tanto, el revestimiento adecuado es para obtener resultados precisos. Otro problema potencial es el recuento de células muertas o moribundas que fluoran brillantemente. Una manera de evitar este problema es lavar las células con PBS antes de contar para eliminar estas células de fondo. Esto puede no ser conveniente para ciertas líneas de células menos bien adcederas, ya que las células vivas pueden desprenderse al lavarse. Una solución alternativa a este problema es utilizar la flexibilidad inherente a muchos programas de análisis para personalizar los parámetros para la identificación celular dentro de un rango estrecho de modo que solo se cuenten células fluorescentes vivas.
La estrategia descrita en este artículo proporciona una manera poderosa de detectar eficientemente hasta varios cientos de compuestos. La lectura del ensayo MTT es el resultado fisiológico de la actividad mitocondrial y puede tener efectos de línea celular o compuestos específicos que pueden producir resultados inexactos4,21. Al combinarlo con un ensayo de recuento celular usando un reportero fluorescente, estas limitaciones se pueden mitigar en gran medida. Como se muestra, la comparación de los resultados de ambos ensayos puede resultar en una precisión cercana al 100% en la identificación de compuestos tóxicos. Un estudio anterior ha demostrado que en una línea HEK293T que expresa establemente tdTomato, hay una alta correlación IC50 entre MTT y tdTomato para una biblioteca de compuestos tóxicos22. Aunque este estudio no ejecute confirmaciones secundarias en suficientes compuestos de impacto para realizar un análisis de concordancia similar, los valores50 de LD calculados para los tres compuestos que se probaron fueron similares.
Además de su capacidad para reforzar las conclusiones sobre la toxicidad, los dos ensayos pueden complementarse entre sí al abordar los posibles efectos inhibidores del crecimiento y proliferativos de los compuestos de prueba. Para varios compuestos de prueba, los datos entre los dos ensayos divergieron sustancialmente. Al examinar imágenes de fluorescencia tdTomato para algunos de estos compuestos, hubo cambios morfológicos notables entre el tratamiento y el control. Esto sugiere que la divergencia en los valores normalizados entre los dos ensayos puede basarse en cambios fisiológicos que afectan diferencialmente la lectura de MTT y el recuento de células tdTomato. La capacidad de adquirir estos datos con un solo experimento aumenta en gran medida la robustez de esta estrategia, lo que la hace más aplicable de forma general. Como tal, tiene la capacidad no sólo para identificar compuestos tóxicos con alta precisión, sino para señalar compuestos con efectos más sutiles en el crecimiento celular / fisiología que se pueden caracterizar más extensamente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
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