Summary
Часто необходимо оценить потенциальную цитотоксичность набора соединений на культивированных клетках. Здесь мы описываем стратегию надежного скрининга токсичных соединений в формате 96 скважин.
Abstract
Цитотоксичность является критическим параметром, который должен быть количественно при изучении препаратов, которые могут иметь терапевтические преимущества. Из-за этого, многие анализы скрининга наркотиков использовать цитотоксичность в качестве одной из критических характеристик, которые будут профилированы для отдельных соединений. Клетки в культуре являются полезной моделью для оценки цитотоксичности, прежде чем приступить к последующей деятельности по перспективным свинца соединений в более дорогостоящих и трудоемких моделей животных. Мы описываем стратегию по выявлению соединений, которые влияют на рост клеток в tdTomato, выражающей линию стволовых клеток человека (NSC). Стратегия использует два дополнительных анализа для оценки числа клеток. Один асссеработает работает через уменьшение 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-дифениltэттрацололий бромид (МТТ) в formazan в качестве прокси для номера ячейки, а другой непосредственно рассчитывает tdTomato выражая NSCs. Два анализа могут быть выполнены одновременно в одном эксперименте и не являются трудоемкими, быстрыми и недорогими. Стратегия, описанная в этой демонстрации, протестировала 57 соединений на исследовательском первичном экране на токсичность в 96-колодцном формате пластины. Три из хитов были охарактеризованы далее в шести точках доза ответ с использованием той же настройки ассея, как основной экран. В дополнение к обеспечению отличного подтверждения токсичности, сравнение результатов двух анализов может быть эффективным в выявлении соединений, влияющих на другие аспекты роста клеток.
Introduction
Одной из наиболее важных характеристик, которая должна быть определена для химического соединения, которое имеет терапевтический потенциал является его токсичность для клеток животных. Эта характеристика будет определять, является ли препарат хорошим кандидатом для более обширного исследования. В большинстве случаев, соединения с минимальной токсичностью ищутся, но Есть ситуации, в которых соединение с возможностью убить конкретных типов клеток представляет интерес, например, противоопухолевые препараты. Хотя целые животные являются лучшими модельными системами для определения системной токсичности, затраты и рабочая сила, связанные с этим, являются непомерно высокими, когда необходимо протестировать более нескольких соединений. Как таковой культуры клеток млекопитающих, как правило, используется в качестве наиболее эффективной альтернативой1,2. Малые и средние экраны пропускной способностью наркотиков являются важным способом, с помощью которого токсичность может быть оценена в культуре клеток. Эти экраны могут быть использованы для допроса аннотированных библиотек, ориентированных на отдельные сигнальные пути. Общий формат такого экрана заключается в том, чтобы сначала проверить все соединения в библиотеке в одной дозе (как правило, 10 мкм) в исследовательском первичной токсичности экрана, а затем выполнить углубленный вторичный экран реакции дозы, чтобы полностью охарактеризовать токсичность профиль хитов с основного экрана. Методы реализации этой стратегии будут описаны здесь и обеспечивают быстрый, эффективный и недорогой способ выявления и характеристики токсичных соединений.
Несколько методов были разработаны для оценки цитотоксичности малых соединений и наноматериалов в клетках млекопитающих3,4. Следует отметить, что некоторые материалы могут взаимодействовать с проверкой, обеспечивающей вводящие в заблуждение результаты, и такие взаимодействия должны быть проверены при характеристике хитов от токсичности экранов4. Анализы цитотоксичности включают trypan синий исключение5,лактат дегидрогеназы (LDH) релиз анализ6, Аламар синий анализ7, кальцийет ацетоксиметил эфир (AM)8, и АТФ анализ9. Все эти анализы измеряют различные аспекты клеточного метаболизма, которые могут служить прокси для номера ячейки. В то время как все предлагают преимущества, тетразолий соли на основе assays, таких как 3-(4,5-диметилтизол-2-yl)-2,5-дифенилтетрацололий бромид (MTT), 2,3-бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофени)-2H-тетролийт-5-5-car-2 и 4-(3-4- Иодофенил-2-4-нитрофенил-2H-5-тетразолио)-1,3-бензола дисульфоната (WST-1)10,11 обеспечивают хорошую точность и простоту использования при низкой цене. MTT, который будет использоваться в этой демонстрации, сводится к нерастворимым formazan митохондриальной редуктазы и скорость этого преобразования сильно коррелирует с номером ячейки. Этот анализ регулярно используется как в небольших масштабах, так и для скрининговых библиотек с до 2000 соединений12. Прямой подсчет клеток по маркированному маркеру предлагает другой метод оценки клеточного числа, и в отличие от mtT-оценки он может предоставить дополнительную информацию о динамике клеточного роста. Несколько общедоступных алгоритмов доступны для выполнения автоматизированного анализа количества клеток и Есть также собственные алгоритмы, которые являются частью пакетов программного обеспечения для изображений читателей13,14. В этом описании метода, человеческая нейронная стволовая клетка (NSC) линия, которая была генетически отредактирована, чтобы составно выразить tdTomato15 будет служить в качестве тестовой линии для сравнения результатов клеточной жизнеспособности между MTT анализ и автоматизированный подсчет клеток анализ на экране оценки токсичности 57 испытательных соединений. Хотя основная цель этой стратегии заключалась в выявлении и характеристике токсичных соединений, она имеет дополнительное преимущество потенциального выявления ингибирующих и растущих соединений, усиливающих соединения и тем самым обеспечивающих эффективный метод идентификации лекарств которые могут модулировать клеточный рост.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура НСК
ПРИМЕЧАНИЕ: Манипуляция линии NSC человека будет описана ниже, но любая клеточная линия может быть использована для этого протокола. Вся работа клеточной культуры выполняется в кабинете биологической безопасности.
- Пальто 96-хорошая пластина с мембраной подвала / внеклеточной матрицы (ECM).
- Оттепель aliquot ECM(Таблица материалов), которая будет способствовать креплению НСК, на льду. Разбавить ECM до соответствующей концентрации (как правило, 1:100) в 10 мл базовой среды(Таблица материалов)и добавить 50 л на колодец к каждому из 60 внутренних скважин 96-хорошо пластины (Рисунок 1). Используйте только внутренние 60 скважин, чтобы избежать артефактов, которые могут возникнуть в результате эффекта края16.
- Пусть пластина сидеть при комнатной температуре или в инкубаторе культуры клеток (37 кв.к., 5% CO2) в течение по крайней мере 30 мин.
- Диссоциатив ные и пластины нервных стволовых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки для использования в этом методе должны быть выращены, по крайней мере 80% слияния в колбе T75.- Культурные клетки в колбе T75 в инкубаторе клеточной культуры при 37 КС и 5% CO2 в среде NSC, которая состоит из базовой среды, B27, несущественных аминокислот, 2 ММ глутамина и 10 нг/мЛ базового фактора роста фибробластов (FGFb или FGF2).
- Удалить клетки из инкубатора, как только они достигают 80% слияния и аспирировать от NSC среды. Добавьте соответствующее количество реагента диссоциации клеток (3 мл для колбы T75; Таблица материалов) и инкубировать в течение 5 мин в инкубаторе.
- После инкубации, добавить 7 мл среды NSC в t75 колбу и пипетки энергично, чтобы обеспечить все клетки становятся отделены. Перенесите диссоциированный клеточный раствор на трубку 15 мл и центрифугу на 200 х г в течение 5 мин.
- После центрифугирования, удалить супернатант из трубки и resuspend клеток в 10 мл ЦСК средних и рассчитывать клетки.
- Переговочная концентрация клеток до 200 000 клеток/мл со средой НСК. Убедитесь, что клетки полностью переосвязны для однородного покрытия в колодцы.
- Плита 100 л клеточной смеси (20 000 клеток) в 60 внутренних колодцах из трех 96-колодцев, которые были покрыты, как описано в разделе 1.1. Используйте шесть из восьми слотов 8-канального многоканального пипетатора для столбца ячеек пластин.
- Добавьте 100 л базовой среды или среды NSC ко всем скважинам без клеток, чтобы свести к минимуму потенциальное испарение из внешних скважин.
- Под микроскопом клеточной культуры, визуально осмотреть по крайней мере 10 скважин на каждом из трех 96-колодец пластин, чтобы подтвердить, что клетки посеяны при ожидаемой плотности. Не приступайте к проверке, если клетки покрыты при плотности слишком разреженной или плотной.
2. Лечение клеток соединениями
ПРИМЕЧАНИЕ: Самодельная библиотека, протестированная в этой демонстрации, содержит соединения, которые модулируют бескрылые/интегрированные (Wnt), ретиноиновой кислоты, трансформирующие фактор роста-бета (TGF-я), и звуковой еж сигнализации пути, а также различные тирозиновые киназы.
-
Исследовательский первичный экран для токсичности /номер ячейки
- Aliquot 50-100 мл до 57 испытательных соединений(Дополнительная таблица 1) при концентрации 10 мМ в 100% диметилсульфод (DMSO) в интерьер 60 скважин U-bottomed, V-bottomed или круглогодичной пластины 96-ну ульс с тремя DMSO скважины, как контроль (см. Рисунок 1 для карты пластин). Это будет служить в качестве основной пластины соединения с 25 зл соединения, которые могут быть заморожены и разморожены несколько раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плоские плиты сдном не должны использоваться, так как будет труднее аспирировать небольшие объемы соединений из них со скамейкой сверху пипетки. - Удалите пластины культуры клеток из инкубатора 16-24 ч после расщепления, как описано в разделе 1, и аспирировать с NSC среднего столбца за колонной с 8-канальный многослойный пипеттор, используя только шесть из восьми многоколодцв слотов. Добавьте 95 qL свежих sSC средних к клеткам в каждой из трех пластин репликации и поместите пластины обратно в инкубатор до шага 2.1.4 ниже не будет завершена.
- Добавьте 49 qL среды NSC к каждой из внутренних 60 скважин пустого U-дна, V-дном или круглого дна 96-колодской пластины с 8-канальным многослойным пипеттором. Распечатайте мастерскую смеску пластины и используйте верхний пипетки или эквивалентный инструмент для пипетки 1 злицы соединения из главной пластины в 49-ю часть среды НСК в каждой из 60 скважин.
- Смешайте разбавленное соединение 3x со скамейкой верхней пипетатор.
- Удалите три 96-колодчатые пластины NSCs из инкубатора, пипетку 15 л каждого разбавленного соединения со скамейкой верхней пипетки и распределить 5 qL аликот соединения в каждой из трех пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это 1:20 разбавления соединения в клетки в сочетании с первоначальным 1:50 разбавления в шаге 2.1.3 дает 1:1000 разбавления таким образом, что окончательная концентрация соединений на NSCs будет 10 КМ с концентрацией DMSO 0,1% и окончательное концентрация для контроля DMSO составит 0,1%. - Инкубировать клетки с соединением для 72 h и продолжить с анализами цитотоксичности. Более короткие интервалы могут быть использованы, но 72-часовой инкубационный период должен максимизировать потенциальные цитотоксические эффекты проверенных соединений.
- Aliquot 50-100 мл до 57 испытательных соединений(Дополнительная таблица 1) при концентрации 10 мМ в 100% диметилсульфод (DMSO) в интерьер 60 скважин U-bottomed, V-bottomed или круглогодичной пластины 96-ну ульс с тремя DMSO скважины, как контроль (см. Рисунок 1 для карты пластин). Это будет служить в качестве основной пластины соединения с 25 зл соединения, которые могут быть заморожены и разморожены несколько раз.
-
Доза ответ асссе
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка для 96-хорошо используется для дозы-ответ отображается на рисунке 2.- Используйте колонку 2 для шести репликаторов управления DMSO и тестовых трипликетов до трех различных соединений при двукратных серийных разбавлениях в шести дозах, начиная с высокой дозы 10 км.
- Разбавить 4 Л ДМСО или испытательного соединения в ДМСО в 196 л среды НСК в микроцентрифуговой трубке 1,5 мл. Добавьте 25 кЛ DMSO к столбку скважин из B2-G2 и 50 зл испытательных соединений к ряду от B3-B11 с тремя проверенными соединениями в трипликатах 10 мМ в рядах B3-B5, B6-B8 и B9-B11.
- Пипетка 25 л среднего к оставшимся пустым колоннам во внутренней части 96-колодца пластины. Удалить 25 л соединения из скважин B3-B11 с многоканальным пипеттором, добавить в скважины C3-C11, и перемешать по крайней мере пять раз. Повторите процесс для остальных строк для генерации трипликетов при двукратных разбавлениях в общей сложности шесть доз для каждого из соединений.
- Создание NSCs для дозы ответ точно так, как описано для первичного экрана в разделе 2.1. Соединения для реакции дозы добавляются и инкубируются на клетках точно так, как описано в шагах 2.1.5 и 2.1.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три биологические репликации дозы ответ асссы выполняются путем повторения ассеина на NSCs в различных проходах в отдельные дни.
3. Изображения клеток на плите читателя
- После того, как клетки были инкубированы соединениями в отведенное время, клетки изображения на считывателе пластины, чтобы определить предобработку номер клетки на хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции для визуализации клеток читателей, но в целом следовать аналогичной стратегии. Направления ниже применяются к читателю, используемому в этой демонстрации (Таблица материалов). - Снимите пластину с инкубатора и поместите ее в считыватель пластины. Откройте программное обеспечение для создания файлов-протоколов и экспериментов для исследования. Перейти к Imager Ручной режим на менеджер задач и нажмите Захват сейчас ....
- Выберите 96-хорошую пластину в качестве типа сосуда, выберите 10x для увеличения, и красный флуоресцентный белок (RFP) 531 и 593 для визуализации tdTomato. Выберите хорошо, а затем нажмите Автофокус, чтобы сфокусировать изображение, и авто экспозиция для надлежащего времени экспозиции. При необходимости вручную отрегулируйте фокус и экспозицию.
- После того, как надлежащее внимание и экспозиция были получены, нажмите значок камеры, чтобы захватить картину. Затем щелкните PROCESS/ANALZyE выше изображения, чтобы продолжить создание протокола и выберите вкладку ANALYSIS.
- Нажмите Сотовый анализ в ADD ANALYSIS STEP справа от изображения и нажмите НА START. Изображение покажет выделенные ячейки, чтобы указать каждую отдельную ячейку. Выбор опций может быть нажат, чтобы изменить параметры, чтобы лучше выбрать клетки на основе порога флуоресценции или размера ячейки. Если изображение правильно подсчитывает ячейки, нажмите ADD STEP в нижней части экрана.
- Нажмите значок в верхней части экрана, чтобы создать эксперимент из набора изображений,который откроет окно с экспериментом. После открытия, нажмите Процедура под вкладкой Протокола и в новом окне, которое открывается выберите Читать, затем в новом окне нажмите полную пластину, чтобы выбрать только 60 скважин, которые содержат клетки (B2... G11). Нажмите OK, чтобы сохранить изменения, а затем нажмите OK в окне процедуры.
- Пластина теперь может быть отображана этим протоколом, и экспериментальный файл может быть сохранен. Нажмите значок воспроизведения, чтобы запустить пластину. После того, как первая пластина была изображена, изображение двух других пластин. После завершения изображения загрузите данные подсчета ячеек в электронную таблицу для анализа. Возьмите все изображения при 10-х увеличениях.
4. Терминал MTT цитотоксичность асссы
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните анализ MTT в течение двух часов после завершения tdTomato изображений.
- Сделать 5 мг /мл МТТ фондовый раствор, взвешивая 25 мг МТТ и resuspending его в 5 мл среды НСК. Vortex решение до тех пор, пока Нет видимых осадков MTT, который может занять несколько минут.
- Удалите пластины культуры клеток из инкубатора и аспирировать среды клеточной культуры. Разбавить МТТ 1:10 в среде клеточной культуры и добавить 100 л МТТ к каждой скважине клеток.
- Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию на 2 ч. Пурпурный осадок должен быть виден примерно пропорционально количеству клеток в колодце. Либо аспирировать решение MTT от пластин или инвертировать пластины быстро Флик решение из пластины.
- Добавьте 50 кв.м. 100% ДМСО к каждой скважине и встряхните пластины при комнатной температуре в течение 10 минут при 400 об/мин. Прочитайте абсорбцию каждой скважины на уровне 595 нм в считывателе пластин и экспортите данные в электронную таблицу для анализа.
5. Анализ данных
- Выполните анализ количества клеток tdTomato и абсорбции с соответствующим программным обеспечением (коммерческая таблица, R). Рассчитайте средние значения для абсорбции или количества клеток трех репликаций DMSO на каждой пластине для целей нормализации, а затем разделите значение для клеточных отсчетов или абсорбции для каждой скважины на пластине этим средним значением и преобразуйте в процент. Это дает нормализованное количество клеток или абсорбции по отношению к контролю DMSO для каждой пластины.
- Рассчитайте среднее нормализованное количество или абсорбцию и стандартное отклонение для репликации скважин на трех пластинах.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент должно быть четыре различных набора нормализованных значений: по одному для каждой из пластин и одно среднее для трех пластин репликации. - Будьте консервативны и использовать нормализованное значение на уровне или ниже 25% в среднем через три репликации пластин классифицировать соединение как токсичные. Кроме того, поскольку только одна обработка на соединение выполняется на каждой пластине, только этикетки соединений, которые опадают ниже этого порога на всех трех пластин репликации, как токсичные. Изучите флуоресцентные изображения всех соединений, которые этот анализ фильтрует как токсичные для визуального подтверждения токсичности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификация соединений с ингибирующим эффектом роста или усиливающим рост труднее оценить в исследовательском исследовании этого типа из-за отсутствия репликаций на каждой пластине. Тем не менее, следующий быстрый способ выявления соединений, которые могут либо замедлить или повысить клеточный рост. - Рассчитайте стандартное отклонение для трех реплицитных элементов управления DMSO на каждой пластине, а затем отфильтруйте для любых соединений, которые имеют средние значения по крайней мере два стандартных отклонения выше или ниже управления DMSO. Соединения, которые выпадают из этого фильтра на каждой из трех пластин может потребовать дальнейшего исследования.
- Используйте ту же стратегию анализа для реакции дозы в качестве первичного экрана токсичности. Рассчитайте средние значения для управления DMSO для каждой биологической репликации и используйте эти значения для нормализации процентных живых клеток или процентов абсорбции для каждого соединения/ дозы комбинации. Рассчитайте средства и стандартную ошибку средств для всех комбинаций соединений/доз для трех биологических репликатов.
- Преобразуйте концентрацию в значение журнала, создайте кривую реакции дозы для журнала концентрации по сравнению с нормализованной жизнеспособностью, и всоответствива кривой с нелинейным регрессионным анализом (анализ может быть выполнен в R или различных коммерческих статистических пакеты). Рассчитайте смертельную дозу 50 (или технически в этом случае жизнеспособную дозу 50) или концентрацию соединения, что приводит к 50% токсичности от уравнения этой кривой. Многие пакеты программного обеспечения будут автоматически вычислять эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Автоматизированные данные подсчета ячеек определили одиннадцать соединений с менее чем 25% жизнеспособностью при нормализации управления DMSO, в то время как данные MTT определили эти же соединения плюс два дополнительных(таблица 1 и таблица 2, затененный красный). Два соединения оказались токсичными только в MTT асссе (колодцы F3 и G10) было 31% и 39%, соответственно, количество tdTomato-положительных клеток, как контроль и по рангу порядка были следующие два наиболее токсичных соединений в этой библиотеке после тех, которые считаются токсичными. Стандартные значения отклонения для этих двух скважин не предполагают, что был выброс среди трех пластин, которые перекос среднем, и при изучении номера для каждого из трех пластин реплики ни соединение не упал ниже 25% порога на любой из пластины (данные не показаны). Репрезентативные изображения флуоресценции tdTomato показаны из нескольких скважин на рисунке 3. Изучение изображений двух скважин диссоциируется на токсичность между MTT и количество клеток анализ показал, что соединения в F3 (Рисунок 3B) и G10 (Рисунок 3C) были токсичными, хотя в одном из трех пластин репликации было несколько остаточных живых клеток в хорошо G10 (данные не показаны). Похоже, что в данном случае MTT анализ был лучше в состоянии оценка для цитотоксичности, как иногда алгоритм подсчета ячеек изображения ошибочно считает мертвых / умирающих клеток.
MtT анализ предназначен для определения токсичности, а потому, что библиотека может содержать соединения, которые повышают и подавляют рост клеток было бы информативным для оценки того, насколько хорошо анализ количественно как потенциальный ингибирующие рост и пролиферативного воздействия проверенных соединений. Для этого использовался фильтр, в котором соединения классифицировались как ингибирующие рост, если их нормализованные средние абсорбции или количество клеток превышали 25% и менее двух стандартных отклонений ниже контрольных средств на каждой из трех повторных пластин (затененных желтый в таблице 1 и таблице 2). Одиннадцать соединений встретили этот критерий для анализа количества клеток и только два для MTT анализ только с одним (E10) перекрытия между двумя анализами, хотя два из одиннадцати для подсчета клеток анализ были те, ранее упоминалось, чтобы быть токсичным MTT анализ (F3 , G10).
Соединения, нормализованные средства которых были два стандартных отклонения выше средств контроля на каждом из трех пластин репликации были классифицированы как повышение роста (затененный зеленый в таблице 1 и таблице 2). Только одно соединение соответствует этому критерию для каждого анализа и соединение не перекрывается между анализами. Дальнейшее изучение изображений скважин с расхождениями между MTT и анализы количества клеток показали, что в некоторых случаях скважины, в которых MTT переоценил количество клеток по отношению к tdTomato анализ клетки оказались больше (Рисунок 3C) , в то время как те скважины, где MTT недооценил количество клеток по отношению к tdTomato клетки оказались меньше(Рисунок 3D). Таким образом, tdTomato просаженный классифицированы одиннадцать соединений, как токсичные, одиннадцать как тормозитель роста, и один, как рост повышения с тридцатью четыре, не имеющих видимого влияния на рост клеток (Таблица 1). MTT асссе классифицированы тринадцать соединений, как токсичные, два как тормозитель роста, и один, как рост повышения с сорока одного, не имеющих видимого влияния на рост клеток (Таблица 2).
Шеститочечный ответный ответ был проведен на трех соединениях, которые были идентифицированы как токсичные. Эти три соединения были ингибиторами STAT3 WP1066 (B5) и статическими (E4) и ингибитором рецепторов рецептора эпидермального фактора роста тирпохостин 9 (E11). Дозы были последовательными двукратные разбавления, начиная с максимальной концентрации 10 мкм и до минимальной концентрации 312,5 нм. График журнала концентрации по сравнению с нормализованным процентом жизнеспособных клеток как для количества клеток, так и для анализов МТТ для одного из этих соединений (WP1066) показан на рисунке 4. Кривая является относительно плоской без токсичности для четырех самых низких концентраций, быстро падает на дозу 5 мкм, и падает почти до полной токсичности на 10 мкм. Смертельная доза 50 (LD50) была рассчитана как 4,4 мкм для tdTomato ассссе и 6,0 мкм для асссса MtT. Значения tdTomato и MTT LD50 для двух других соединений составляли 3,4 мкм и 4,7 мкм, соответственно, для статических и 0,8 мкм и 1,6 мкм, соответственно, для трифостина 9.
Рисунок 1 : Карта плиты для основной смесной пластины, используемой на первичном экране токсичности. Все внешние скважины затенены серым цветом, что указывает на то, что они содержали носители без ячеек. Контроль DMSO (100%) помечены жирным шрифтом в скважинах B2, D6 и G11. Все скважины с маркировкой Cmpd содержали уникальные испытательные соединения при концентрации 10 мМ в 100% DMSO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Карта плиты для смесной пластины, используемой в дозе ответного асссе. Все внешние скважины затенены серым цветом, что указывает на то, что они содержали только носители без ячеек. Элементы управления DMSO были размещены в колонке 2. Указаны трипликаты всех комбинаций соединений/доз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : tdTomato флуоресцентные изображения выбранных скважин 72 часов после обработки. ()Ну B2: DMSO управления, (B) Ну F3: данные подсчета клеток предложил не токсичности, но MTT данные сделали, (C) Ну E6: переоцененный количество клеток по MTT по отношению к tdTomato кол, (D) Ну G6 недооцененных клеток по MTT по отношению к tdTomato. Все изображения были сделаны при 10-кратном увеличении с помощью фильтра RFP с длиной волны 531/593 нм для возбуждения/выбросов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Кривая для концентрации журнала по сравнению с процентом жизнеспособности DMSO для соединения в колодце B5. Точки на кривой представляют собой средние нормализованные жизнеспособные клетки в шести дозах и стандартной погрешности среднего значения для трех биологических репликатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Таблица 1: Средства tdTomato ячейки рассчитывает нормализованы в процентах DMSO управления для трех повторных пластин ± стандартное отклонение. Затенение скважин указывает на следующие: красные, токсичные соединения; желтый, потенциально тормозящее рост; зеленый, потенциально повышение роста. Отсутствие затенения указывает на то, что соединения, по-видимому, не влияют на рост клеток.
Таблица 2: Средства абсорбции МТТ нормализовались в процентном соотношении управления DMSO для трех повторных пластин ± стандартное отклонение. Затенение скважин указывает на следующие: красные, токсичные соединения; желтый, потенциально тормозящее рост; зеленый, потенциально повышение роста. Отсутствие затенения указывает на то, что соединения, по-видимому, не влияют на рост клеток.
| Хорошо | Составной | Заметки |
| B2 | Дмсо | Отрицательный контроль |
| C2 | Лагерь | Белковая киназа Активатор |
| D2 | ФРАКТАЛКИН | Чемокин |
| E2 | LDN212854 | Ингибитор рецепторов морфогенетического белка кости (BMP) |
| F2 | AG370 | Тромбоциты производных рецепторов фактора роста (PDGFR) ингибитор киназы |
| G2 | DAPT | ингибитор гамма-секретазы; нейронная дифференциация положительного контроля |
| B3 | AY9944 | ингибитор редуктазы 7-дегидрокректоров; Ингибитор пути ежа |
| C3 | STA-21 | Преобразователь сигнала и активатор ингибитора транскрипции 3 (STAT3) |
| D3 | ГМ-CSF | Гранулькоцит-макрофаг колонии-стимулирующий фактор; Цитокинов |
| E3 | TNP470 | Ингибитор метионина аминипептидаза-2 |
| F3 | Био | Ингибитор гликогена синтазы киназы-3; Активатор пути WNT |
| G3 | CNTF | Килиарный нейротрофический фактор; нейропептид |
| B4 | Sant | Сглаженный антагонист рецепторов; Ингибитор пути ежа |
| C4 | AG825 | Ингибитор ERBB2 |
| D4 | M-CSF | Макрофаг колонии-стимулирующий фактор; Цитокинов |
| E4 | СТАТТИК | Преобразователь сигнала и активатор ингибитора транскрипции 3 (STAT3) |
| F4 | SC79 | Активатор AKT (белковая киназа B) |
| G4 | DMH1 | Ингибитор рецепторов морфогенетического белка кости (BMP) |
| B5 | WP1066 | Преобразователь сигнала и активатор ингибитора транскрипции 3 (STAT3) |
| C5 | Инсулина | |
| D5 | ИЛ-3 | Интерлейкин-3; Цитокинов |
| E5 | AG494 | Ингибитор эпидермального фактора роста (EGFR) |
| F5 | LY294002 | Ингибитор фосфоинозотида 3-киназы |
| G5 | IGF2 | Фактор роста инсулина-2 |
| B6 | Вогнутой | Сглаженная агонист; Активатор пути ежа |
| C6 | AG370 | Тромбоциты производные фактора роста рецептора киназы ингибитор |
| D6 | Дмсо | Отрицательный контроль |
| E6 | EC23 | Агонист рецепторов ретинойной кислоты |
| F6 | TORIN2 | Механистический целевой ингибитор рапамицина (MTOR) |
| G6 | Y27362 | Связанный с Ро, скручиваемый катушки, содержащий ингибитор протеина киназы (ROCK) |
| B7 | CELECOXCIB | Ингибитор циклооксигеназы-2 (COX-2) |
| C7 | SB525334 | Преобразование бета-рецептора фактора роста (TGBFR) ингибитор |
| D7 | DAPT | ингибитор гамма-секретазы; нейронная дифференциация положительного контроля |
| E7 | CHIR99021 | Ингибитор гликогена синтазы киназы-3; Активатор пути WNT |
| F7 | LDN 193189 | Ингибитор рецепторов морфогенетического белка кости (BMP) |
| G7 | ТАРАЗОТИН | Агонист рецепторов ретинойной кислоты |
| B8 | AM580 | Агонист рецепторов ретинойной кислоты |
| C8 | DHBP | Ингибитор высвобождения кальция |
| D8 | Jsk | Донор оксида азота |
| E8 | ДОРСОМОРФИН | Ингибитор рецепторов морфогенетического белка кости (BMP); 5' аденозин монофоспат-активированный протеиновый киназе (AMPK) ингибитор |
| F8 | Иматиниб | Ингибитор тирозинкиназы |
| G8 | BMS 493 | обратная агониста рецепторов ретинойной кислоты |
| B9 | ЦИКЛОПАМИН | Сглаженный антагонист рецепторов; Ингибитор пути ежа |
| C9 | СЕМАГЕСТАТ | Ингибитор гамма-секретазы |
| D9 | БОСУТИНИБ | Ингибитор тирозинкиназы |
| E9 | ПУРМОРФАМИН | Сглаженная агонист; Активатор пути ежа |
| F9 | Jag | Jagged; Нотч рецептор агонист |
| G9 | SB431542 | Преобразование бета-рецептора фактора роста (TGBFR) ингибитор |
| B10 | SC79 | Активатор AKT (белковая киназа B) |
| C10 | ДАНТРОЛЕН | Антагонист рецепторов Райанодина |
| D10 | ТИРХОСТИН46 | Ингибитор эпидермального фактора роста (EGFR) |
| E10 | AM80 | Агонист рецепторов ретинойной кислоты |
| F10 | IFN-Y | интерферон-гамма; Цитокинов |
| G10 | ПЗ401 | Инсулиноподобный рецептор фактора роста (IGF1R) ингибитор |
| B11 | DAPT | ингибитор гамма-секретазы; нейронная дифференциация положительного контроля |
| C11 | A2M | Внеклеточный гликопротеин; ингибитор протеазы |
| D11 | AG490 | Ингибитор эпидермального фактора роста (EGFR) |
| E11 | ТИРХОСТИН9 | Тромбоциты производных рецепторов фактора роста (PDGFR) ингибитор киназы |
| F11 | БМП-2 | Морфогенетический белок кости-2 |
| G11 | Дмсо | Отрицательный контроль |
Дополнительная таблица 1: Список соединений первичного экрана. Ну расположение, имя, и заметки на каждом из соединений, которые были использованы в первичном экране предоставляются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основная цель этой статьи состояла в том, чтобы описать стратегию, которая могла бы эффективно и недорого определить соединения, влияющие на рост клеток в низкой и умеренной пропускной связи скрининга. Два ортогоналовых метода были использованы для оценки числа клеток, чтобы повысить уверенность в выводах и предложить дополнительные идеи, которые не были бы доступны, если бы только один анализ был использован. Один из анализов используется флуоресцентный образ ячейки непосредственно рассчитывать tdTomato-положительных клеток, а второй зависит от хорошо охарактеризованной способности митохондрий расщеплять МТТ для formazans таким образом выступающей в качестве прокси для ячейки номер10. В общей сложности 57 испытательных соединений были оценены в этой демонстрации, хотя крыло MTT анализа был использован для тестирования библиотеки с целых 2000 соединения14. Результаты экрана указали, как два асс-ассена могли бы укрепить друг друга в достижении определенных выводов с большей уверенностью, и подчеркнул сценарии, где два анализа были дополняют предоставление дополнительной информации, которая обычно требуется выполнить по крайней мере два отдельных эксперимента.
Наиболее важный шаг в протоколе происходит непосредственно перед покрытием ячеек. Метаболические условия в клеточной культуре могут стать очень летучими, особенно в случае потребления глутамина и глюкозы, если клетки посеяны при слишком высокой плотности17,18. В этих условиях гибель клеток будет обусловлена факторами, присущими условиям клеточной культуры и не связанными с токсичностью проверенных соединений. Результатом будет увеличение ложных срабатываний для цитотоксических соединений, а также трудности в воспроизведении результатов18. Успех на этом этапе требует знания соответствующей плотности клеток используемой клеточной линии, точного определения числа клеток перед покрытием и полной повторной блокировки клеток для обеспечения однородного распределения покрытия внутри и через скважины 96 -хорошо пластины. Важно также визуально подтвердить, что клетки присутствуют при примерно правильной плотности 2-3 ч после покрытия, глядя на них под микроскопом.
Что касается самих анализов, наиболее важным шагом для MTT анализ является обеспечение того, чтобы MTT полностью растворяется в среде клеточной культуры. Остаточные осадки МТТ могут сами по себе привести к острой клеточной токсичности, поэтому важно полностью растворить МТТ с энергичным вихрем. Наиболее важным моментом для подсчета клеток анализ заключается в том, чтобы установить правильное время экспозиции для изображения tdTomato. Время экспозиции, которое слишком короткое может привести к действительно флуоресцентные клетки происходит неучтенных программного обеспечения, и время воздействия, которые слишком долго может сделать сигнал настолько сильным, что он смешивает соседние клетки вместе так, что программное обеспечение считает несколько клеток, как одна клетка потому что он не в состоянии решить их14. Большинство пакетов программного обеспечения, которые поставляются с считывателей изображений позволяют предварительный шаг, показывающий, какие ячейки подсчитываются. Важно запустить этот этап предварительного просмотра в несколько раз экспозиции и выбрать тот, который определяет флуоресцентные клетки наиболее точно.
Как и в любом методе Есть определенные ограничения на эти анализы. Чтобы получить более высокую пропускную способность, первичный асссс токсичности использует только одну парадигму лечения/одной дозы, которая может прийти за счет более ложных срабатываний и ложных негативов. Дополнительно, хотя несколько более предыдущих изучений показывали что MTT коррелирует очень наилучшим образом с номером клетки используя или обработку колонии формируя19 или асссе20инкорпорации тимидина ингибировать митохондриальную активность таким образом, что результаты mtT-исследования больше не коррелируют с клеточным номером21. Результаты этой демонстрации показывают, что в то время как МТТ отлично определяет токсичные соединения, его способность выявлять соединения, которые либо подавляют или усиливают пролиферацию, ограничена, возможно, потому, что такие соединения изменяют митохондриальную активность в образом, что он коррелирует менее хорошо с номером ячейки. Есть также некоторые ограничения для tdTomato подсчета асссе. Очевидным ограничением является необходимость иметь клеточной линии устойчиво выражая флуоресцентный белок. Недавние достижения в области манипуляции геномом значительно упростили разработку таких линий, но работа, необходимая для их создания, может выходить за рамки возможностей некоторых лабораторий. С технической точки зрения, самые большие проблемы с любой анализ подсчета ячеек, который использует анализ изображений является неспособность этих анализов различать клетки, которые сгруппированы вместе в результате недосчета14, следовательно, надлежащее покрытие критически для точных результатов. Другой потенциальной проблемой является подсчет мертвых или умирающих клеток, которые светят ярко. Один из способов избежать этой проблемы заключается в мытье клеток с PBS перед подсчетом, чтобы удалить эти фоновые клетки. Это не может быть удобно для некоторых менее хорошо придерживаясь линий клеток, как живые клетки могут отделиться при стирке. Альтернативное решение этой проблемы заключается в использовании гибкости, присущей многим программам анализа, для настройки параметров для идентификации клеток в узком диапазоне, так что учитываются только живые, флуоресцентные клетки.
Стратегия, описанная в этой статье, обеспечивает мощный способ эффективного экрана до нескольких сотен соединений. MTT асссес считывание является физиологическим результатом митохондриальной активности и может иметь клеточной линии или соединения конкретных эффектов, которые могут производить неточные результаты4,21. Объединив его с подсчетом клеток с помощью флуоресцентного репортера, эти ограничения могут быть значительно смягчены. Как показано на рисунке, сравнение результатов обоих анализов может привести к почти 100% точности в выявлении токсичных соединений. Предыдущее исследование показало, что в линии HEK293T устойчиво выражая tdTomato, существует высокая корреляция IC50 между MTT и tdTomato для библиотеки токсичныхсоединений 22. Хотя это исследование не проводило вторичных подтверждений на достаточном числе пораженных соединений для проведения аналогичного анализа соответствия, рассчитанные значения LD50 для трех проверенных соединений были схожими.
В дополнение к их способности укрепить выводы о токсичности, два анализа могут дополнять друг друга при решении потенциальных ингибирующих роста и пролиферативного воздействия испытательных соединений. Для нескольких испытательных соединений данные между двумя анализами существенно разошлись. При изучении изображений tdTomato флуоресценции для некоторых из этих соединений, были заметные морфологические изменения между лечением и контролем. Это говорит о том, что расхождение в нормализованных значениях между двумя анализами может быть основано на физиологических изменениях, которые диффереприративно влияют на считывание MTT и количество клеток tdTomato. Возможность получения таких данных с помощью одного эксперимента значительно повышает надежность этой стратегии, что делает ее более применимой. Как таковой, он имеет возможность не только определить токсичные соединения с высокой точностью, но указать на соединения с более тонким воздействием на рост клеток / физиологии, которые могут быть более широко охарактеризованы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Программой интрамуральных исследований NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
