Summary
Spesso è necessario valutare la potenziale citotossicità di un insieme di composti sulle cellule coltivate. Qui, descriviamo una strategia per lo screening affidabile dei composti tossici in un formato di 96 pozze.
Abstract
La citotossicità è un parametro critico che deve essere quantificato quando si studiano farmaci che possono avere benefici terapeutici. Per questo motivo, molti saggi di screening farmacologico utilizzano la citotossicità come una delle caratteristiche critiche da profilare per i singoli composti. Le cellule nella coltura sono un modello utile per valutare la citotossicità prima di procedere a seguire composti di piombo promettenti in modelli animali più costosi e ad alta intensità di lavoro. Descriviamo una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare in una linea di tdTomato che esprime cellule staminali neurali umane (NSC). La strategia utilizza due saggi complementari per valutare il numero di cellulare. Un saggio funziona attraverso la riduzione di 3-(4,5-dimetilthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MTT) a formazan come proxy per il numero di cellulare e l'altro conta direttamente il tdTomato che esprime NSC. I due saggi possono essere eseguiti contemporaneamente in un unico esperimento e non sono laboriosi, rapidi e poco costosi. La strategia descritta in questa dimostrazione ha testato 57 composti in uno schermo primario esplorativo per la tossicità in un formato di piastra di 96 pozze. Tre dei colpi sono stati ulteriormente caratterizzati in una risposta alla dose di sei punti utilizzando lo stesso set-up assay come lo schermo primario. Oltre a fornire un'eccellente corroborazione per la tossicità, il confronto dei risultati dei due saggi può essere efficace nell'identificare i composti che interessano altri aspetti della crescita cellulare.
Introduction
Una delle caratteristiche più importanti che deve essere determinata per un composto chimico che ha un potenziale terapeutico è la sua tossicità per le cellule animali. Questa caratteristica determinerà se un farmaco è un buon candidato per uno studio più ampio. Nella maggior parte dei casi, si cercano composti con tossicità minima, ma ci sono situazioni in cui un composto con la capacità di uccidere specifici tipi di cellule è di interesse, ad esempio, farmaci anti-tumigenici. Anche se gli animali interi sono i migliori sistemi modello per determinare la tossicità sistemica, il costo e la manodopera coinvolti sono proibitivi quando più di un paio di composti devono essere testati. Come tale coltura cellulare mammiferi è generalmente utilizzato come l'alternativa più efficiente1,2. Gli schermi farmacologici di medio-piccolo e medio throughput sono una modalità importante attraverso la quale la tossicità può essere valutata nella coltura cellulare. Queste schermate possono essere utilizzate per interrogare le librerie con notato che prendono di mira singoli percorsi di segnalazione. Il formato generale di tale schermo è quello di testare inizialmente tutti i composti della libreria ad una singola dose (generalmente 10 M) in uno schermo di tossicità primaria esplorativo, e quindi eseguire uno schermo di risposta alla dose secondaria approfondita per caratterizzare completamente la tossicità profilo degli hit dalla schermata principale. I metodi per implementare questa strategia saranno descritti qui e forniranno un modo rapido, efficiente ed economico per identificare e caratterizzare i composti tossici.
Sono stati sviluppati diversi metodi per valutare la citotossicità di piccoli composti e nanomateriali nelle cellule dei mammiferi3,4. Va notato che alcuni materiali possono interagire con il saggio fornendo risultati fuorvianti, e tali interazioni dovrebbero essere testate quando caratterizzano i colpi provenienti da schermi di tossicità4. I saggi di citotossicità includono l'esclusione blu trypan5, lattato dehydrogenase (LDH) rilasciare asdetto6, Alamar blu assay7, calcien acetoxymethyl ester (AM)8, e il test ATP9. Tutti questi saggi misurano vari aspetti del metabolismo cellulare che può servire come proxy per il numero di cellule. Mentre tutti offrono vantaggi, saggi a base di sale di tetrazolium come 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MT ), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sale interno (XTT)-1, e 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonato (WST-1)10,11 fornire una buona precisione e facilità d'uso a basso costo. L'MTT, che verrà utilizzato in questa dimostrazione, è ridotto a un formazan insolubile da una riduttrice mitocondriale e il tasso di questa conversione è fortemente correlato al numero di cellulare. Questo saggio è stato regolarmente utilizzato sia su piccola scala che per le librerie di screening con fino a 2.000 composti12. Il conteggio diretto delle cellule da parte di un marcatore etichettato offre un altro metodo per valutare il numero cellulare e, a differenza dell'analisi MTT, può fornire informazioni aggiuntive sulle dinamiche della crescita cellulare. Diversi algoritmi pubblicamente disponibili sono disponibili per eseguire analisi automatizzate del conteggio delle celle e ci sono anche algoritmi proprietari che fanno parte di pacchetti software per lettori di imaging13,14. In questa descrizione del metodo, una linea di cellule staminali neurali umane (NSC) che è stata geneticamente modificata per sovrattuazionalmente esprimere tdTomato15 servirà come una linea di prova per confrontare i risultati della vitalità cellulare tra un saggio MTT e un conteggio automatico delle cellule un'immagine in una schermata che valuta la tossicità di 57 composti di prova. Anche se l'obiettivo principale di questa strategia era quello di identificare e caratterizzare i composti tossici, ha il vantaggio aggiuntivo di identificare potenzialmente i composti inibitori della crescita e di miglioramento della crescita e quindi fornisce un metodo efficace per identificare i farmaci che può modulare la crescita cellulare.
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Protocol
1. Cultura NSC
NOTA: La manipolazione di una linea NSC umana verrà descritta di seguito, ma qualsiasi linea cellulare può essere utilizzata per questo protocollo. Tutto il lavoro di coltura cellulare viene eseguito in un armadietto di sicurezza biologica.
- Cappotto una piastra di 96 pozzetto con membrana seminterrato/matrice extracellulare (ECM).
- Scongelare l'aliquota di ECM (Tabella dei materiali), che faciliterà l'attaccamento di NSC, sul ghiaccio. Diluire l'ECM alla concentrazione appropriata (generalmente 1:100) nel mezzo di base di 10 mL (Tabella dei materiali) e aggiungere 50 L per pozzo a ciascuno dei 60 pozzi interni di una piastra di 96 pozzetti ( Figura1). Utilizzare solo gli interni 60 pozzi per evitare artefatti che possono derivare dall'effetto bordo16.
- Lasciare che la piastra si sieda a temperatura ambiente o in un'incubatrice a coltura cellulare (37 gradi centigradi, 5% CO2) per almeno 30 min.
- Dissociare e placare cellule staminali neurali.
NOTA: Le celle da utilizzare in questo metodo devono essere coltivate ad almeno l'80% di confluenza in un pallone T75.- Cellule di coltura in un pallone T75 in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 nel mezzo NSC che è composto da mezzo di base, B27, aminoacidi non essenziali, 2 m glutamon, e 10 ng/mL fattore di crescita fibroblasto di base 10 ng/mL (FGFb o FGF2).
- Rimuovere le cellule dall'incubatrice una volta raggiunto l'80% di confluenza e aspirare il mezzo NSC. Aggiungere una quantità appropriata di reagente di dissociazione cellulare (3 mL per un pallone T75; Tabella dei materiali) e incubare per 5 min nell'incubatrice.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 7 mL di mezzo NSC nel flacone T75 e pipetta vigorosamente per garantire che tutte le cellule si staccano. Trasferire la soluzione a cellule dissociate in un tubo da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante dal tubo e risospendere le cellule in 10 mL di NSC medio e contare le cellule.
- Riadattare la concentrazione delle cellule a 200.000 cellule / mL con mezzo NSC. Assicurarsi che le celle siano completamente sospese per la placcatura omogenea in pozze.
- Piastra 100 -L della miscela cellulare (20.000 cellule) nei 60 pozzi interni di tre piastre 96 che sono state rivestite come descritto nella sezione 1.1. Utilizzare sei degli otto slot di un pipettor multicanale a 8 canali per lastrare le celle colonna per colonna.
- Aggiungere 100 l di mezzo di base o NSC a tutti i pozzi senza cellule per ridurre al minimo la potenziale evaporazione dai pozzi esterni.
- Al microscopio a coltura cellulare, ispezionare visivamente almeno 10 pozze su ciascuna delle tre lastre del 96 po'per confermare che le cellule vengono seminate alla densità prevista. Non procedere con il saggio se le cellule sono placcate ad una densità troppo scarsa o densa.
2. Trattamento di cellule con composti
NOTA: La libreria fatta in casa testata in questa dimostrazione contiene composti che modulano senza ali/integrati (Wnt), acido retinoico, trasformazione del fattore di crescita-beta (TGF-z) e vie di segnalazione riccio sonore, nonché una varietà di chinasi di tirosina.
-
Schermo primario esplorativa per tossicità/numero di cella
- Aliquota di 50-100 mL fino a 57 composti di prova (Tabella supplementare 1) ad una concentrazione di 10 mM in solistere dimetilo 100% (DMSO) negli interni 60 pozze di una piastra 96-well con fondo A, V o a fondo rotondo con tre pozzi DMSO come controllo (vedi. Figura 1 per una mappa piastra). Questo servirà come la piastra composta master con 25 -L di composto che può essere congelato e scongelato più volte.
NOTA: Piastre con fondo piatto non dovrebbero essere utilizzati in quanto sarà più difficile aspirare piccoli volumi di composti da loro con un pipettor panca superiore. - Rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatrice 16-24 h dopo la divisione come descritto nella sezione 1 e aspirare NSC medio colonna per colonna con un pipettor multi-bene a 8 canali utilizzando solo sei degli otto slot multi-bene. Aggiungere 95 -L di mezzo NSC fresco alle celle in ciascuna delle tre piastre di replica e rimettere le piastre in incubatrice fino al completamento della fase 2.1.4 riportata di seguito.
- Aggiungete 49 ldi di mezzo NSC a ciascuno degli interni 60 pozze di una piastra 96 ben con fondo A vuota, a V o a fondo rotondo con un pipettor multi-bene a 8 canali. Sbloccare la piastra composta principale e utilizzare un pipettor panca superiore o uno strumento equivalente per pipettare 1 - L di composto dalla piastra master nel mezzo 49 L di NSC in ciascuno degli interni 60 pozzi.
- Mescolare il composto diluito 3x con il pipettor panca top.
- Togliere le tre lastre di NSC 96 pozzetto dall'incubatrice, la pipetta 15 -L di ogni composto diluito con il pipettor della panca e erogare un 5 - L' di composto in ciascuna delle tre piastre.
NOTA: Questa diluizione 1:20 del composto nelle cellule in combinazione con la diluizione iniziale 1:50 al punto 2.1.3 produce una diluizione 1:1000 in modo tale che la concentrazione finale dei composti sui NSC sarà di 10 M con una concentrazione DMSO dello 0,1% e la finale concentrazione per i controlli DMSO sarà dello 0,1%. - Incubare cellule con composto per 72 h e procedere con saggi di citotossicità. Intervalli più brevi possono essere utilizzati, ma un periodo di incubazione di 72 ore dovrebbe massimizzare i potenziali effetti citotossici dei composti testati.
- Aliquota di 50-100 mL fino a 57 composti di prova (Tabella supplementare 1) ad una concentrazione di 10 mM in solistere dimetilo 100% (DMSO) negli interni 60 pozze di una piastra 96-well con fondo A, V o a fondo rotondo con tre pozzi DMSO come controllo (vedi. Figura 1 per una mappa piastra). Questo servirà come la piastra composta master con 25 -L di composto che può essere congelato e scongelato più volte.
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Saggio di risposta alla dose
NOTA: la configurazione per il 96-bene utilizzato per la risposta alla dose viene visualizzato nella Figura 2.- Utilizzare la colonna 2 per sei repliche di controllo DMSO e testare triplicati fino a tre composti diversi a due diluizioni seriali a sei dosi a partire da una dose elevata di 10 M.
- Diluire 4 l di DMSO o composto di prova in DMSO in 196 - L di NSC medio in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 25 l di DMSO alla colonna di pozze da B2-G2 e 50 l di composti di prova alla riga da B3-B11 con i tre composti testati in triplici da 10 mM nelle righe B3-B5, B6-B8 e B9-B11.
- Pipette 25 - L di NSC medio alle restanti colonne vuote nella parte interna della piastra 96-po. Togliere 25 l di composto dai pozze B3-B11 con un pipettor multicanale, aggiungerlo ai pozze C3-C11 e mescolare almeno cinque volte. Ripetere il processo per le righe rimanenti per generare triplicati a diluizioni bilido per un totale di sei dosi per ciascuno dei composti.
- Generare NSC per la risposta alla dose esattamente come descritto per la schermata principale nella sezione 2.1. I composti per la risposta alla dose vengono aggiunti e incubati sulle cellule esattamente come descritto nei passaggi 2.1.5 e 2.1.6.
NOTA: Tre repliche biologiche del saggio di risposta alla dose vengono eseguite ripetendo il saggio sulle NSC in diversi passaggi in giorni separati.
3. Celle di imaging su un lettore di lastre
- Dopo che le cellule sono state incubate con composti per il tempo assegnato, le cellule di immagine su un lettore di piastre per determinare il numero di cellule pre-trattamento per bene.
NOTA: le istruzioni per le celle di imaging sono specifiche del lettore, ma generalmente seguono una strategia simile. Le istruzioni riportate di seguito si applicano al lettore utilizzato in questa dimostrazione (Tabella dei materiali). - Rimuovere la piastra dall'incubatrice e posizionarla all'interno del lettore di piastre. Aprire il software imager per impostare i file di protocollo e di esperimento per lo studio. Passare alla modalità manuale Imager in Task Manager e fare clic su Acquisisci ora....
- Scegli la piastra di 96 e ben come tipo di vaso, seleziona 10x per l'ingrandimento e le proteine fluorescenti rosse (RFP) 531 e 593 per l'imaging tdTomato. Selezionare un pozzo, quindi fare clic su Messa a fuoco automatica per mettere a fuoco l'immagine e su Esponi automaticamente per un tempo di esposizione corretto. Se necessario, regolare manualmente la messa a fuoco e l'esposizione.
- Una volta ottenuta la messa a fuoco e l'esposizione corretta, fare clic sull'icona della fotocamera per acquisire l'immagine. Quindi, fare clic su PROCESS/ANAL-AE sopra per continuare a compilare il protocollo e selezionare la scheda ANALYSIS.
- Fare clic su Analisi cellulare in ADD ANALYSIS STEP a destra dell'immagine e fare clic su START. L'immagine mostrerà le celle evidenziate per indicare ogni singola cella. È possibile fare clic sulla selezione Opzioni per modificare i parametri per selezionare meglio le celle in base alla soglia di fluorescenza o alle dimensioni della cella. Se l'imager sta contando correttamente le celle, quindi fare clic su AGGIUNGI STEP nella parte inferiore dello schermo.
- Fare clic sull'icona nella parte superiore dello schermo per creare esperimento dal setdi immagini, che aprirà una finestra con l'esperimento. Una volta aperto, fare clic su Procedura nella scheda Protocollo e nella nuova finestra che si apre selezionare Lettura, quindi nella nuova finestra fare clic su piastra completa per selezionare solo i 60 pozzi che contengono le celle (B2... G11). Fare clic su OK per salvare le modifiche, quindi fare clic su OK nella finestra Procedura.
- La piastra può ora essere immagine da questo protocollo e il file sperimentale può essere salvato. Fare clic sull'icona di riproduzione per eseguire la piastra. Una volta che la prima piastra è stata immagine, immagine le altre due piastre. Al termine dell'imaging, scaricare i dati del conteggio delle celle in un foglio di calcolo per l'analisi. Scatta tutte le immagini con un ingrandimento di 10 volte.
4. Saggio di citotossicità della citotossicità dell'MTT terminale
NOTA: Iniziare il saggio MTT entro due ore dal completamento dell'imaging tdTomato.
- Fare una soluzione di 5 mg/mL MTT di pesare 25 mg di MTT e riaverlo in 5 mL di mezzo NSC. Vorticare la soluzione fino a quando non ci sono precipitati visibili di MTT, che potrebbe richiedere diversi minuti.
- Rimuovere le lastre di coltura cellulare dall'incubatrice e aspirare fuori mezzo di coltura cellulare. Diluire MTT 1:10 nel mezzo di coltura cellulare e aggiungere 100 L di MTT a ogni pozzetto di cellule.
- Incubano le cellule a 37 gradi centigradi per 2 h. Un precipitato violaceo dovrebbe essere visibile approssimativamente in proporzione al numero di cellule nel pozzo. Aspirate la soluzione MTT fuori piastre o invertire la piastra rapidamente per flick soluzione fuori dalla piastra.
- Aggiungere 50 L di 100% DMSO ad ogni pozzo e agitare le piastre a temperatura ambiente per 10 min a 400 giri/m. Leggere l'assorbimento di ogni pozzo a 595 nm in un lettore di lastre ed esportare i dati in un foglio di calcolo per l'analisi.
5. Analisi dei dati
- Eseguire un'analisi dei conteggi delle cellule tdTomato e degli assorbimenti con software appropriato (foglio di calcolo commerciale, R). Calcolare le medie per l'assorbimento o il numero di cellule delle tre repliche DMSO su ogni piastra per scopi di normalizzazione, quindi dividere il valore per il conteggio delle cellule o le assorbiture per ogni bene sulla piastra per questa media e convertire in una percentuale. Questo produce il conteggio delle cellule normalizzate o l'assorbimento relativo al controllo DMSO per ogni piastra.
- Calcolare il conteggio medio normalizzato o l'assorbimento e la deviazione standard per replicare i pozze sulle tre piastre.
NOTA: A questo punto dovrebbero esserci quattro diversi set di valori normalizzati: uno per ciascuna delle piastre e una media per le tre piastre di replica. - Essere conservativi e utilizzare un valore normalizzato pari o inferiore al 25% per la media tra le tre piastre di replica per classificare un composto come tossico. Inoltre, poiché su ogni piastra viene eseguito un solo trattamento per composto, solo i composti etichetta che scendono al di sotto di questa soglia su tutte e tre le piastre di replicazione come tossiche. Esaminare le immagini fluorescenti di tutti i composti che questa analisi filtra come tossici per confermare visivamente la tossicità.
NOTA: L'identificazione di composti con un inibitorio della crescita o effetto di miglioramento della crescita è più difficile da valutare in un saggio esplorativo di questo tipo a causa della mancanza di repliche su ogni piastra. Tuttavia, il seguente è un modo rapido per identificare i composti che possono rallentare o migliorare la crescita cellulare. - Calcolare la deviazione standard per i tre controlli DMSO replicati su ogni piastra e quindi filtrare per tutti i composti che hanno valori medi almeno due deviazioni standard sopra o sotto il controllo DMSO. Composti che non rientrano in questo filtro su ciascuna delle tre piastre possono giustificare ulteriori indagini.
- Utilizzare la stessa strategia di analisi per la risposta alla dose come schermata di tossicità primaria. Calcolare le medie per i controlli DMSO per ogni replica biologica e utilizzare questi valori per normalizzare la percentuale di cellule vive o la percentuale di assorbimenti per ogni combinazione composto/dose. Calcolare i mezzi e l'errore standard dei mezzi per tutte le combinazioni composto/dose per le tre repliche biologiche.
- Trasformare la concentrazione nel suo valore di log, generare una curva di risposta alla dose per il registro della concentrazione rispetto alla vitalità normalizzata e adattare la curva con un'analisi di regressione non lineare (l'analisi può essere eseguita in R o in varie statistiche commerciali pacchetti). Calcolare la dose letale 50 (o tecnicamente in questo caso la dose praticabile 50) o la concentrazione di composto che si traduce in 50% tossicità dall'equazione di questa curva. Molti pacchetti software calcoleranno automaticamente questa cifra.
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Representative Results
I dati automatizzati del conteggio delle cellule hanno identificato undici composti con minore del 25% di fattibilità quando vengono normalizzati al controllo DMSO, mentre i dati MTT identificavano questi stessi composti più due ulteriori (Tabella 1 e Tabella 2, rosso scuro). I due composti trovati tossici solo nell'esempio MTT (pozzi F3 e G10) avevano rispettivamente il 31% e il 39%, il numero di cellule tdTomato-positive come controllo e per ordine di rango erano i successivi due composti tossici in questa libreria dopo quelli ritenuti tossici. I valori di deviazione standard per questi due pozze non indicavano che vi fosse un outlier tra le tre piastre che inclinavano le medie, e quando esaminavano i numeri per ciascuna delle tre piastre di replica né il composto è sceso al di sotto della soglia del 25% su una qualsiasi delle piastre (dati non visualizzati). Immagini rappresentative della fluorescenza tdTomato sono mostrate da diversi pozzi in Figura 3. L'esame delle immagini dei due pozzi discordanti per la tossicità tra l'MTT e il conteggio cellulare ha rivelato che i composti in F3 (Figura 3B) e G10 (Figura 3C) erano entrambi tossici, anche se in una delle tre piastre di replica c'erano alcune cellule vive residue in g10 ben (dati non mostrati). Sembra che in questo caso l'analisi MTT sia stata meglio in grado di segnare per la citotossicità poiché a volte l'algoritmo di conteggio cellulare dell'imager conta erroneamente le cellule morte/morte.
L'analisi MTT è progettata per determinare la tossicità, ma poiché una libreria può contenere composti che migliorano e inibiscono la crescita cellulare sarebbe informativo valutare quanto bene il saggio quantifica sia l'inibitorio potenziale della crescita che gli effetti proliferativi di composti testati. Per fare questo è stato utilizzato un filtro in base al quale i composti sono stati classificati come inibitori della crescita se le loro assorbizioni medie normalizzate o i conteggi delle cellule erano superiori al 25% e meno di due deviazioni standard al di sotto dei mezzi di controllo su ciascuna delle tre piastre di replica (ombreggiate giallo nella Tabella 1 e nella Tabella 2). Undici composti soddisfacevano questo criterio per l'esaggio del conteggio cellulare e solo due per l'ansaggio MTT con una sola (E10) sovrapposta tra i due saggi, anche se due degli undici per il saggio del conteggio cellulare erano quelli precedentemente menzionati come tossici dal saggio MTT (F3 , G10).
I composti i cui mezzi normalizzati erano due deviazioni standard al di sopra del controllo significano su ciascuna delle tre piastre di replica sono stati classificati come miglioramento della crescita (verde ombreggiato nella tabella 1 e nella tabella 2). Solo un composto si adatta a questo criterio per ogni saggio e il composto non si sovrapponeva tra i saggi. Un ulteriore esame delle immagini di pozzi con discrepanze tra l'MTT e i saggi del conteggio cellulare ha indicato che in alcuni casi i pozzi in cui MTT sopravvalutava il numero di cellule rispetto al saggio tdTomato, le cellule sembravano essere più grandi (Figura 3C) , mentre quei pozzi in cui la MTT ha sottovalutato il numero di cellule rispetto al tdTomato le cellule sembravano essere più piccole (Figura 3D). In sintesi, il saggio tdTomato ha classificato undici composti come tossici, undici come inibitori della crescita e uno come aumento della crescita con trentaquattro che non hanno alcun effetto apparente sulla crescita cellulare (Tabella 1). Il saggio MTT ha classificato tredici composti come tossici, due come inibitori della crescita e uno come aumento della crescita con quarantuno che non ha alcun effetto apparente sulla crescita cellulare (Tabella 2).
Un test di risposta alla dose in sei punti è stato condotto su tre dei composti identificati come tossici. Questi tre composti erano gli inibitori STAT3 WP1066 (B5) e stattic (E4) e il recettore di crescita epidermico recettore di crescita inibitore tirocchi 9 (E11). Le dosi erano diluizioni successive di due volte a partire da una concentrazione massima di 10 m e andando ad una concentrazione minima di 312,5 gM. Il grafico del registro di concentrazione rispetto alla percentuale normalizzata di cellule vitali sia per il conteggio cellulare che per gli saggi MTT per uno di questi composti (WP1066) è illustrato nella Figura 4. La curva è relativamente piatta senza tossicità per le quattro concentrazioni più basse, cade rapidamente alla dose di 5 m e scende a una tossicità quasi piena a 10 M. La dose letale 50 (LD50) è stata calcolata come 4,4 M per il saggio tdTomato e 6,0 M per il saggio MTT. I valori di tdTomato e MTT LD50 per gli altri due composti erano rispettivamente di 3,4 E M e 4,7 M, rispettivamente, per static, e di 0,8 M e 1,6 M, rispettivamente, per tryphostin 9.
Figura 1 : mappa della piastra per la piastra composta principale utilizzata nella schermata di tossicità primaria. Tutti i pozze esterne sono ombreggiati in grigio, il che indica che contenevano supporti senza celle. Controlli DMSO (100%) sono etichettati in grassetto nei pozzi B2, D6 e G11. Tutti i pozzi etichettati Cmpd contenevano composti di prova unici a concentrazione di 10 mM in 100% DMSO. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : mappa della piastra per la piastra composta utilizzata nell'esempio di risposta alla dose. Tutti i pozze esterne sono ombreggiati in grigio, il che indica che contenevano solo supporti senza celle. I controlli DMSO erano ospitati nella colonna 2. Sono indicati triplicati di tutte le combinazioni composto/dose. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : immagini fluorescenti tdTomato di pozzi selezionati 72 ore dopo il trattamento. (A) Bene B2: Controllo DMSO, (B) Beh F3: i dati sul conteggio delle cellule non hanno suggerito alcuna tossicità, ma i dati MTT hanno fatto, (C) Beh E6: numero di cellule sopravvalutato per MTT rispetto al conteggio tdTomato, (D) Beh G6 ha sottovalutato il conteggio delle celle da MTT rispetto a MTT rispetto a tdTomato. Tutte le immagini sono state scattate con ingrandimento 10 volte superiore utilizzando un filtro RFP con lunghezza d'onda 531/593 nm per l'eccitazione/emissione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Curva per la concentrazione del log rispetto alla percentuale di DMSO di vitalità per il composto nel pozzo B5. I punti sulla curva rappresentano le cellule vitali normalizzate medie a sei dosi - errore standard della media per tre repliche biologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Mezzi dei conteggi delle cellule tdTomato normalizzati al controllo DMSO percentuale per tre piastre di replica ± deviazione standard. L'ombreggiatura del pozzo indica quanto segue: composti rossi e tossici; giallo, potenzialmente inibitorio della crescita; verde, potenzialmente migliorando la crescita. Nessuna ombreggiatura indica che i composti non sembrano influenzare la crescita delle cellule.
Tabella 2: Mezzi di assorbimento MTT normalizzati a controllo DMSO percentuale per tre piastre di replica ± deviazione standard. L'ombreggiatura del pozzo indica quanto segue: composti rossi e tossici; giallo, potenzialmente inibitorio della crescita; verde, potenzialmente migliorando la crescita. Nessuna ombreggiatura indica che i composti non sembrano influenzare la crescita delle cellule.
| bene | composto | Note |
| B2 | Dmso | Controllo negativo |
| C2 | campeggio | Protein chinase A attivatore |
| D2 | FRACTALKINE | Chemiochine |
| E2 (in questo modo) | LDN212854 | Inibitore del recettore delle proteine morfogenetiche ossee (BMP) |
| F2 | AG370 | Recettore del fattore di crescita derivato da piastrine (PDGFR) inibitore della chinasi |
| G2 | DAPT | Inibitore della gamma-secretasi; controllo positivo della differenziazione neuronale |
| B3 | AY9944 | 7-dehydrocholestrol reductase inibitore; inibitore della via del riccio |
| C3 | L'A-21 | Trasduttore di segnale e attivatore dell'inibitore della trascrizione 3 (STAT3) |
| D3 | GM-CSF | Fattore stimolante della colonia di Granulkociti-macrofano; Citochina |
| E3 (in questo stato del sistema | TNP470 | Mehionina aminipeptidase-2 inibitore |
| F3 | Bio | Glicogen synthase kinase-3 inibitore; Attivatore percorso WNT |
| G3 | CNTF | Fattore neurotrofico ciliare; Neuropeptide |
| B4 | Sant | Antagonista recettore levigato; inibitore della via del riccio |
| C4 | AG825 (ag825) | Inibitore ERBB2 |
| D4 | M-CSF | Fattore stimolante della colonia di macrofago; Citochina |
| E4 | RETITIC | Trasduttore di segnale e attivatore dell'inibitore della trascrizione 3 (STAT3) |
| F4 | SC79 (informazioni in base al ta4) | AKT (proteina chinasi B) attivatore |
| G4 | DMH1 | Inibitore del recettore delle proteine morfogenetiche ossee (BMP) |
| B5 | WP1066 | Trasduttore di segnale e attivatore dell'inibitore della trascrizione 3 (STAT3) |
| C5 | insulina | |
| D5 | IL-3 | Interleuchino-3; Citochina |
| E5 | AG494 | Recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) |
| F5 | LY294002 | Fosfoinosotide 3-kinasi |
| G5 | IGF2 | fattore di crescita dell'insulina 2 |
| B6 | incurvarsi | Agonista levigato; attivatore percorso riccio |
| C6 | AG370 | Piastra derivato recettore del fattore di crescita kinasi inibitore |
| D6 | Dmso | Controllo negativo |
| E6 | EC23 | agonista recettore dell'acido retinoico |
| Tasto F6 | TORIN2 | Bersaglio meccanicistico dell'inibitore della rapamicia (MTOR) |
| G6 | Y27362 | Rho-associato, coiled-coil contenente proteina chinasi (ROCK) inibitore |
| B7 | CELECOXCIB | Cicloossigenosi-2 (COX-2) inibitore |
| C7 | SB525334 | Trasformare l'inibitore del fattore di crescita beta-recettore (TGBFR) |
| D7 | DAPT | Inibitore della gamma-secretasi; controllo positivo della differenziazione neuronale |
| E7 | CHIR99021 | Glicogen synthase kinase-3 inibitore; Attivatore percorso WNT |
| F7 (in stato di | LDN 193189 | Inibitore del recettore delle proteine morfogenetiche ossee (BMP) |
| G7 | TARA-TINE | agonista recettore dell'acido retinoico |
| B8 | AM580 | agonista recettore dell'acido retinoico |
| C8 | DHBP | Inibitore del rilascio di calcio |
| D8 | Jsk | Donatore di ossido nitrico |
| E8 (in questo stato del sistema | DORSOMORPHIN | Proteina morfogenetica ossea (BMP) inibitore del recettore; 5' inibitore della proteina cellofasi attivata da adenosina (AMPK) |
| F8 (in stato di inad | Imatinib | Inibitore della cellasi tirosina |
| G8 | BMS 493 | recettore dell'acido retinoico inverso agonista |
| B9 (in stato di | CYCLOPAMINE | Antagonista recettore levigato; inibitore della via del riccio |
| C9 | SEMAGACESTAT | Inibitore della gamma-secretasi |
| D9 | BOSUTINIB | Inibitore della cellasi tirosina |
| E9 | PURMORPHAMINE | Agonista levigato; attivatore percorso riccio |
| F9 (in stato di | Jag | Riscavato; agonista recettore notch |
| G9 | SB431542 | Trasformare l'inibitore del fattore di crescita beta-recettore (TGBFR) |
| B10 (in questo modo) | SC79 (informazioni in base al ta4) | AKT (proteina chinasi B) attivatore |
| C10 (in frui' la vita" | Dantrolene | Antaginista recettore di ryanodine |
| D10 | TYRPHOSTIN46 | Recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) |
| E10 | AM80 (IN modo DA L80) | agonista recettore dell'acido retinoico |
| F10 | IFN-Y | interferone-gamma; Citochina |
| G10 | PQ401 | Recettore del fattore di crescita insulino-simile (IGF1R) inibitore |
| B11 (in questo modo) | DAPT | Inibitore della gamma-secretasi; controllo positivo della differenziazione neuronale |
| C11 (in tissuma del XVI | A2M (in modo inequisto | Glicoproteina extracellulare; inibitore della proteasi |
| D11 | AG490 | Recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) |
| E11 (in vie tla | TYRPHOSTIN9 | Recettore del fattore di crescita derivato da piastrine (PDGFR) inibitore della chinasi |
| F11 | BMP-2 | Proteina morfogenetica ossea-2 |
| G11 | Dmso | Controllo negativo |
Tabella supplementare 1: elenco dei composti dello schermo primario. Bene posizione, nome, e note su ciascuno dei composti che è stato utilizzato nella schermata principale sono forniti.
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Discussion
L'obiettivo principale di questo articolo era descrivere una strategia in grado di identificare in modo efficiente e conveniente i composti che influenzano la crescita delle cellule in uno screening a bassa o moderata velocità effettiva. Sono state utilizzate due tecniche ortogonali per valutare il numero di cellule per aumentare la fiducia nelle conclusioni e offrire ulteriori approfondimenti che non sarebbero disponibili se fosse stato utilizzato un solo saggio. Uno dei saggi ha usato un imager cellulare fluorescente per contare direttamente le cellule tdTomato-positive e il secondo dipendeva dalla capacità ben caratterizzata dei mitocondri di fendere l'MTT a formazans servendo così come proxy per la cella numero10. Un totale di 57 composti di prova sono stati valutati in questa dimostrazione, anche se l'ala MTT del saggio è stata utilizzata per testare una libreria con ben 2.000 composti14. I risultati dello schermo hanno evidenziato come i due saggi potrebbero rafforzarsi a vicenda nel giungere a certe conclusioni con maggiore fiducia e hanno evidenziato scenari in cui i due saggi erano complementari fornendo informazioni aggiuntive che normalmente avrebbero richiedono l'esecuzione di almeno due esperimenti separati.
Il passo più critico nel protocollo si verifica appena prima di placcare le cellule. Le condizioni metaboliche nella coltura cellulare possono diventare molto volatili, in particolare nel caso del consumo di glutammina e glucosio, se le cellule vengono semiate ad una densità troppo alta17,18. In queste condizioni la morte cellulare sarà dovuta a fattori inerenti alle condizioni di coltura cellulare e non correlati alla tossicità dei composti testati. Il risultato sarà un aumento dei falsi positivi per i composti citotossici e la difficoltà di riprodurre i risultati18. Il successo in questo passaggio richiede la conoscenza della densità cellulare appropriata della linea cellulare utilizzata, la determinazione accurata del numero di celle prima della placcatura e la completa sospensione delle celle per garantire una distribuzione omogenea della placcatura all'interno e attraverso i pozzi del 96 - Bene piatto. È anche importante confermare visivamente che le cellule sono presenti approssimativamente alla densità corretta 2-3 h dopo la placcatura guardandole al microscopio.
Per quanto riguarda gli stessi saggi, il passo più critico per il saggio MTT è garantire che l'MTT sia completamente dissolto nel mezzo di coltura cellulare. I precipitati residui di MTT possono darsi provocare tossicità cellulare acuta, quindi è importante sciogliere completamente la MTT con vortice vigoroso. Il punto più critico per l'analisi del conteggio cellulare è quello di stabilire il tempo di esposizione corretto per l'imaging tdTomato. I tempi di esposizione troppo brevi possono causare cellule veramente fluorescenti non conteggiate dal software, e i tempi di esposizione troppo lunghi possono rendere il segnale così forte che fonde le cellule vicine in modo tale che il software conta più celle come una cella perché non è in grado di risolverli14. La maggior parte dei pacchetti software forniti con lettori di imaging consente un passaggio di anteprima che mostra quali celle vengono conteggiate. È importante eseguire questo passaggio di anteprima in più momenti di esposizione e scegliere quello che identifica le cellule fluorescenti in modo più accurato.
Come con qualsiasi metodo ci sono alcune limitazioni a questi saggi. Per ottenere una maggiore produttività, il test di tossicità primaria utilizza un solo paradigma di trattamento/dose singola che può venire a costo di più falsi positivi e falsi negativi. Inoltre, anche se diversi studi precedenti hanno dimostrato che la MTT è correlata molto bene con il numero di cellulare quando si utilizza un saggio di colonia19 o un assaggio di incorporazione ditimina22, il trattamento con alcuni composti può migliorare o inibire l'attività mitocondriale in modo tale che i risultati del saggio MTT non siano più correlati al numero di cellulare21. I risultati di questa dimostrazione indicano che mentre la MTT è eccellente nell'identificare i composti tossici, la sua capacità di identificare i composti che inibiscono o migliorano la proliferazione è limitata forse perché tali composti alterano l'attività mitocondriale in un modo che correla meno bene con il numero di cella. Ci sono anche alcune limitazioni al saggio di conteggio tdTomato. Un'ovvia limitazione è la necessità di avere una linea cellulare che esprima stabilmente una proteina fluorescente. I recenti progressi nella manipolazione del genoma hanno reso molto più facile lo sviluppo di tali linee, ma il lavoro necessario per generarle potrebbe andare oltre le capacità di alcuni laboratori. Dal punto di vista tecnico, i maggiori problemi con qualsiasi analisi di conteggio delle celle che utilizza l'analisi delle immagini è l'incapacità di questi saggi di distinguere tra le celle raggruppate insieme con conseguente sottoconteggio14, quindi, una corretta placcatura è fondamentale per risultati accurati. Un altro potenziale problema è il conteggio delle cellule morte o morenti che fluorescenza brillantemente. Un modo per evitare questo problema è quello di lavare le cellule con PBS prima di contare per rimuovere queste cellule di sfondo. Questo potrebbe non essere conveniente per alcune linee di cellule meno bene aderenti come cellule vive possono staccarsi al lavaggio. Una soluzione alternativa a questo problema consiste nell'utilizzare la flessibilità insita in molti programmi di analisi per personalizzare i parametri per l'identificazione delle celle all'interno di un intervallo ristretto in modo che vengano conteggiate solo le celle fluorescenti vive.
La strategia descritta in questo articolo fornisce un modo efficace per lo screening efficiente fino a diverse centinaia di composti. La lettura del saggio MTT è il risultato fisiologico dell'attività mitocondriale e può avere effetti linea cellulare o composti specifici che possono produrre risultati imprecisi4,21. Combinandolo con un saggio di conteggio cellulare utilizzando un reporter fluorescente, queste limitazioni possono essere notevolmente attenuate. Come mostrato, confrontare i risultati di entrambi i saggi può portare a quasi 100% precisione nell'identificazione di composti tossici. Uno studio precedente ha dimostrato che in una linea HEK293T che esprime stabilmente tdTomato, c'è un'alta correlazione IC50 tra MTT e tdTomato per una libreria di composti tossici22. Anche se questo studio non ha eseguito conferme secondarie su abbastanza composti colpiti per eseguire un'analisi di concordanza simile, i valori calcolati di LD50 per i tre composti che sono stati testati erano simili.
Oltre alla loro capacità di rafforzare le conclusioni sulla tossicità, i due saggi possono integrarsi a vicenda quando affrontano i potenziali effetti inibitori della crescita e proliferativi dei composti di prova. Per diversi composti di prova i dati tra i due saggi sono divergenti sostanzialmente. Esaminando le immagini della fluorescenza tdTomato per alcuni di questi composti, ci sono stati notevoli cambiamenti morfologici tra trattamento e controllo. Ciò suggerisce che la divergenza nei valori normalizzati tra i due saggi può essere basata su cambiamenti fisiologici che influenzano in modo differenziale la lettura MTT e il numero di cellule tdTomato. La capacità di acquisire tali dati con un singolo esperimento aumenta notevolmente la robustezza di questa strategia rendendola più generalmente applicabile. Come tale, ha la capacità non solo di identificare composti tossici con alta precisione, ma di sottolineare composti con effetti più sottili sulla crescita cellulare / fisiologia che può essere più ampiamente caratterizzata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NINDS Intramural Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
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