Este protocolo apresenta um método estandardizado para crescer VX2 pilhas na cultura e para criar um modelo VX2 transplantação orthotopic do do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal nos coelhos. Os modelos do cancro endometrial de orthotopic são importantes para o estudo pré-clínico de modalidades novas da imagem latente para o diagnóstico de metástases de nó de linfa.
O cancro endometrial é a malignidade gynecologic a mais comum em America do Norte e a incidência está levantando-se no mundo inteiro. O tratamento consiste em cirurgia com ou sem terapia adjuvante, dependendo da participação do linfonodo, conforme determinado pela linfadenectomia. Lymphadenectomy é um procedimento mórbido, que não seja mostrado para ter um benefício terapêutico em muitos pacientes, e assim um método novo para diagnosticar metástases de nó de linfa é exigido. Para testar os agentes novos da imagem latente, um modelo de confiança do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal é necessário. O modelo VX2 do cancro endometrial foi descrito freqüentemente na literatura; no entanto, existe uma variação significativa no que diz respeito ao método de estabelecimento de modelo. Além disso, nenhum estudo relatou sobre o uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo, pois apenas as células propagadas in vivo têm sido utilizadas anteriormente. Neste estudo, apresentamos um método cirúrgico padronizado e um método de monitorização pós-operatória para o estabelecimento do modelo de câncer endometrial VX2 e relato do primeiro uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo.
O cancro endometrial, ou o cancro do forro do útero, são a segunda malignidade gynecologic a mais comum no mundo inteiro e a malignidade a mais comum em nações desenvolvidas1. A incidência de câncer de endométrio tem aumentado constantemente, elevando-se em 2,3% ao ano entre 2005-2013 com um aumento correspondente de 2,2% na mortalidade1,2,3. O diagnóstico das metástases linfonodais é primordial, pois a presença de linfonodos positivos é um forte preditor negativo desobrevida4,5,6,7e pode orientar a administração de terapia adjuvante8,9,10,11,12,13. As metástases de nó de linfa são diagnosticadas cirurgicamente removendo o tecido linfático que sobrejacente os vasos sanguíneos principais na pelve e no abdômen. Este procedimento, conhecido como lymphadenectomy, é controverso devido aos dados conflitantes da sobrevivência de dois testes grandes14,15,16,17,18 e o conhecido risco de15,19,20 e morbidade pós-operatória21,22,23. Como as modalidades não invasoras atuais da imagem latente não têm a sensibilidade e a especificidade exigidas para substituir a dissecção do nó de linfa24, houve um impulso para desenvolver técnicas diagnósticas novas da imagem latente. Para testar estas técnicas novas em um ajuste pre-Clinical, um modelo de confiança do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal é exigido.
O modelo do tumor do coelho VX2 é um modelo bem estabelecido que seja usado extensivamente para estudar tumores contínuos humanos múltiplos do órgão25 que incluem o pulmão26, a cabeça e a garganta27,28, fígado29, rim30, osso31,32, cérebro33, pâncreas34 e útero35,36,37. O modelo VX2 foi originalmente desenvolvido em 1940 por Kidd e Rous38 ao transplantar com sucesso um vírus de papiloma de coelho de algodão descoberto por Shope em 193339. Desde aquela época, o modelo VX2 foi mantido in vivo, exigindo passagem serial no músculo quadríceps de coelhos brancos da Nova Zelândia40. Mais recentemente entretanto, os grupos múltiplos cresceram com sucesso VX2 pilhas in vitro40,41,42 e demonstraram o tumorigenecity retido da linha de pilha cultivada31, 42,43. Os tumores VX2 são definidos histològica como carcinomas de pilha Squamous Anaplastic44 e contêm as características glandular que se assemelham ao adenocarcinoma26. Os tumores são caracterizados pela facilidade da implantação, pelo crescimento rápido e pelo Hyper-vascularity44,pelo45 e por metastasize confiantemente, o mais geralmente aos nós de linfa regionais e distantes45. Similaridades na anatomia vascular e linfática uterine46 assim como o local transplantação orthotopic do do crescimento asseguram-se de que o teste padrão metastático da carcinoma VX2 do coelho imita aquele do cancro endometrial humano, fazendo ao modelo VX2 um modelo de confiança para estudar o ser humano doença metastática. Além disso, as características histologic tais como a proliferação microvascular anormal47 , assim como48 imunológicos e similaridades genéticas49,50 entre seres humanos e coelhos sugerem que o tumor microambiente pode refletir o de câncer de endométrio humano.
Os grupos múltiplos relataram no uso de VX2 para criar um modelo do cancro endometrial com metástases retroperitoneal com uma taxa relatada elevada do sucesso36,51,52; no entanto, existe uma variação significativa na literatura atual com respeito ao método de criação do modelo. As doses da suspensão da pilha tão baixas quanto 4 x 105 pilhas/chifre uterine51 e tão altamente quanto 5 x 109 pilhas/chifre uterine37,53 foram relatados sem o consenso padrão na dose celular exigida VX2. Também, uma variedade de métodos da inoculação foi relatada que inclui a implantação microcirúrgica do tumor no miométrio uterine36, injeção da suspensão VX2 da pilha37,44,52 , 53 e, em alguns casos, a adição de chifre uterino suturando antes da inoculação52. Finalmente, nenhum grupo relatou o uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo. Assim, a finalidade deste estudo é demonstrar um método padronizado bem sucedido da criação do modelo VX2 e relatar o primeiro uso de pilhas VX2 cultivadas para criar um modelo do cancro endometrial com metástases retroperitoneal em um coelho.
Nisto, nós relatamos um método cirúrgico estandardizado para o estabelecimento de um modelo endometrial do cancro de VX2 e relatado no primeiro uso de pilhas VX2 cultivadas para criar este modelo. O tumor toma a taxa de 75% é mais baixo do que a taxa de 100% por cento relatada previamente na literatura35,37,53,56; Entretanto, a taxa de THW 90% de metástases de nó de linfa patològica conf…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado pelo Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), o Instituto canadense de pesquisa em saúde (Fundação Grant #154326), o Instituto canadense de pesquisa da sociedade do câncer (704718), ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia do Canadá, Fundação сanada para a inovação e a Princesa Margaret Cancer Foundation.
Gostaria de agradecer ao Dr. Marguerite Akens por fornecer as células VX2 iniciais para o estabelecimento do modelo inicial de VX2 e os blocos de tumor VX2 congelados. Gostaria de agradecer a Marco DiGrappa por ajudar a realizar experimentos iniciais de cultura de células VX2 e Lili Ding para ajudar na cultura de células VX2.
11-blade scalpel, Sterile, Disposible | Aspen Surgical (VWR) | 80094-086 | |
22-gague ear vein catheter | CDMV | 14332 | |
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon | Falcon | 352350 | |
Acepromazine (Atravet) | CDMV | 1047 | |
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) | CDMV | 4363 | |
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) | UHN Stores | 457955 | |
Buprenorphine | McGill University | ||
Cefazolin | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Chlorhexidine solution | CDMV | 119872 | |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes | Corning | 354450 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates | Corning | 354408 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates | Corning | 354400 | brand not important |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | |
DMEM/HAM F12 1:1 | Life Technologies | 11320 | brand not important |
DMSO | Caledon Lab Chem | 1/10/4100 | |
Enrofloxacin (Baytril injectable) | CDMV | 11242 | |
Falcon Tube | Corning Centri-Star | 430828 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml | Life Technologies | 12483020 | brand/source not important |
Isoflurane | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Isohexol contrast | GE Healthcare | 407141210 | |
Meloxicam (Metacam 0.5%) | CDMV | 104674 | |
Normal Saline | House Brand (UofT Medstore) | 1011 | |
PBS | Multicell or Sigma | 331-010-CL or D8537-500mL | |
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) | Corning-Cellgro | CA45000-652 | |
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) | T.C.M.F (Dr Bristow) | 28-Jan-11 | |
Surgical Glue (Tissue Adhesive) | 3M Vetbond | 14695B | |
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade | Sigma | T-6567-5X20UG | |
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml | Wisent Inc | 325-542-EL | brand not important |