Questo protocollo presenta un metodo standardizzato per far crescere le cellule VX2 in coltura e per creare un modello ortotopico VX2 di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali nei conigli. I modelli di cancro endometriali ortotopici sono importanti per lo studio preclinico di nuove modalità di imaging per la diagnosi delle metastasi dei linfonodi.
Il cancro dell’endometrio è la malignità ginecologica più comune in Nord America e l’incidenza è in aumento in tutto il mondo. Il trattamento consiste in un intervento chirurgico con o senza terapia adiuvante a seconda del coinvolgimento del linfonodo determinato dalla linfadenectomia. La linfodenectomia è una procedura morbosa, che non è stata dimostrata avere un beneficio terapeutico in molti pazienti, e quindi è necessario un nuovo metodo per diagnosticare le metastasi dei linfonodi. Per testare nuovi agenti di imaging, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali. Il modello di cancro endometriale VX2 è stato descritto frequentemente nella letteratura; tuttavia, esiste una variazione significativa rispetto al metodo di stabilimento del modello. Inoltre, non sono stati riportati studi sull’uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello in quanto solo le cellule propagate in vivo sono state utilizzate in precedenza. Qui, vi presentiamo un metodo chirurgico standardizzato e un metodo di monitoraggio post-operatorio per la creazione del modello di cancro endometriale VX2 e riferiamo sul primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare questo modello.
Il cancro dell’endometrio, o cancro del rivestimento dell’utero, è la seconda malignità ginecologica più comune al mondo e la malignità più comune nelle nazioni sviluppate1. L’incidenza del cancro endometriale è aumentata costantemente, aumentando del 2,3% all’anno tra il 2005 e il 2013 con un corrispondente aumento del 2,2% della mortalità1,2,3. La diagnosi delle metastasi dei linfonodi è fondamentale in quanto la presenza di linfonodi positivi è un forte predittore negativo di sopravvivenza4,5,6,7 e può guidare la somministrazione di terapia adiuvante8,9,10,11,12,13. Le metastasi dei linfonodi sono attualmente diagnosticate rimuovendo chirurgicamente il tessuto linfatico sovrastante i principali vasi sanguigni del bacino e dell’addome. Questa procedura, nota come linfodenectomia, è controversa a causa di dati di sopravvivenza contrastanti da due grandi prove14,15,16,17,18 e il noto rischio di15,19,20 e morbilità post-operatoria21,22,23. Poiché le attuali modalità di imaging non invasivo non hanno la sensibilità e la specificità necessarie per sostituire la dissezionen. 24dei linfonodi, c’è stata una spinta a sviluppare nuove tecniche di imaging diagnostico. Per testare queste nuove tecniche in un ambiente preclinico, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali.
Il coniglio VX2 modello tumorale è un modello ben consolidato che è stato ampiamente utilizzato per studiare più tumori dell’organo solido umano25 tra cui polmone26, testa e collo27,28, fegato29, rene30, osso31,32, cervello33, pancreas34 e utero35,36,37. Il modello VX2 è stato originariamente sviluppato nel 1940 da Kidd e Rous38 trapiantando con successo un papilloma di coniglio di cotone scoperto da Shope nel 193339. Da quel momento, il modello VX2 è stato mantenuto in vivo, richiedendo il passaggio seriale nel muscolo quadricipite dei conigli bianchi della Nuova èelanda40. Più recentemente, tuttavia, più gruppi sono cresciuti con successo cellule VX2 in vitro40,41,42 e dimostrato la tumorigeneità mantenuta della linea cellulare coltivata31, 42,43. I tumori VX2 sono istologicamente definiti come carcinomi a cellule squamose anaplastiche44 e contengono caratteristiche ghiandolari che assomigliano adenocarcinoma26. I tumori sono caratterizzati da facilità di impianto, rapida crescita e ipervascolarizzazione44,45 e metastatizza in modo affidabile, più comunemente ai linfonodi regionali e distanti45. Le somiglianze nell’anatomia vascolare e linfatica uterina46 così come il sito di crescita ortotopica assicurano che il modello metastatico del coniglio VX2 carcinoma mimi quello del cancro endometriale umano, rendendo il modello VX2 un modello affidabile per lo studio umano malattia metastatica. Inoltre, caratteristiche istologiche come la proliferazione microvascolare anormale47 , così come immunologiche48 e somiglianze genetiche49,50 tra gli esseri umani e i conigli suggeriscono che il tumore microambiente può riflettere quello del cancro dell’endometrio umano.
Più gruppi hanno riferito sull’uso di VX2 per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali con un alto tasso riportato di successo36,51,52; tuttavia, esiste una variazione significativa all’interno della letteratura attuale rispetto al metodo di creazione del modello. Dosi di sospensione cellulare a partire da 4 x 105 cellule / corno uterino51 e fino a 5 x 109 cellule / corno uterino37,53 sono stati segnalati con nessun consenso standard sulla dose cellulare VX2 richiesta. Inoltre, una varietà di metodi di inoculazione sono stati segnalati tra cui l’impianto micro-chirurgico del tumore nel miometrio uterino36, iniezione di sospensione cellulare VX237,44,52 , 53 e in alcuni casi, l’aggiunta di corno uterino sutura prima dell’innoculazione52. Infine, nessun gruppo ha segnalato l’uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di dimostrare un metodo standardizzato di successo di creazione del modello VX2 e di segnalare il primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali in un coniglio.
Qui, abbiamo segnalato un metodo chirurgico standardizzato per la creazione di un modello di cancro dell’endometrio VX2 e riportato sul primo uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Il tumore prendere tasso di 75% è inferiore al 100% percentuale tasso precedentemente riportato nella letteratura35,37,53,56; tuttavia, il tasso del 90% di metastasi di linfonodi patologicamente con…
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato finanziato dal Terry Fox Research Institute (PPG-1075), dal Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), dal Canadian Cancer Society Research Institute (704718), dal Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada, Fondazione per l’Innovazione e Principessa Margaret Cancer Foundation.
Vorrei ringraziare il Dr. Marguerite Akens per aver fornito le cellule VX2 iniziali per la creazione del modello VX2 iniziale e i blocchi tumorali VX2 congelati. Vorrei ringraziare Marco DiGrappa per aver contribuito a eseguire esperimenti iniziali di coltura cellulare VX2 e Lili Ding per aver contribuito con la coltura cellulare VX2.
11-blade scalpel, Sterile, Disposible | Aspen Surgical (VWR) | 80094-086 | |
22-gague ear vein catheter | CDMV | 14332 | |
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon | Falcon | 352350 | |
Acepromazine (Atravet) | CDMV | 1047 | |
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) | CDMV | 4363 | |
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) | UHN Stores | 457955 | |
Buprenorphine | McGill University | ||
Cefazolin | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Chlorhexidine solution | CDMV | 119872 | |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes | Corning | 354450 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates | Corning | 354408 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates | Corning | 354400 | brand not important |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | |
DMEM/HAM F12 1:1 | Life Technologies | 11320 | brand not important |
DMSO | Caledon Lab Chem | 1/10/4100 | |
Enrofloxacin (Baytril injectable) | CDMV | 11242 | |
Falcon Tube | Corning Centri-Star | 430828 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml | Life Technologies | 12483020 | brand/source not important |
Isoflurane | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Isohexol contrast | GE Healthcare | 407141210 | |
Meloxicam (Metacam 0.5%) | CDMV | 104674 | |
Normal Saline | House Brand (UofT Medstore) | 1011 | |
PBS | Multicell or Sigma | 331-010-CL or D8537-500mL | |
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) | Corning-Cellgro | CA45000-652 | |
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) | T.C.M.F (Dr Bristow) | 28-Jan-11 | |
Surgical Glue (Tissue Adhesive) | 3M Vetbond | 14695B | |
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade | Sigma | T-6567-5X20UG | |
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml | Wisent Inc | 325-542-EL | brand not important |