Este protocolo presenta un método estandarizado para cultivar células VX2 en cultivo y para crear un modelo ortotópico VX2 de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales en conejos. Los modelos de cáncer de endometrio ortotópico son importantes para el estudio preclínico de nuevas modalidades de diagnóstico por imágenes para el diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos.
El cáncer de endometrio es la neoplasia maligna ginecológica más común en América del Norte y la incidencia está aumentando en todo el mundo. El tratamiento consiste en cirugía con o sin tratamiento adyuvante dependiendo de la afectación de los ganglios linfáticos según lo determinado por la linfadenectomía. La linfadenectomía es un procedimiento mórbido, que no ha demostrado tener un beneficio terapéutico en muchos pacientes, por lo que se requiere un nuevo método para diagnosticar metástasis de ganglios linfáticos. Para probar nuevos agentes de imágenes, se necesita un modelo fiable de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales. El modelo de cáncer de endometrio VX2 se ha descrito con frecuencia en la literatura; sin embargo, existe una variación significativa con respecto al método de establecimiento de modelos. Además, no se han reportado estudios sobre el uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo, ya que sólo las células propagadas in vivo se han utilizado previamente. En este documento, presentamos un método quirúrgico estandarizado y un método de monitoreo postoperatorio para el establecimiento del modelo de cáncer de endometrio VX2 e informamos sobre el primer uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo.
El cáncer de endometrio, o cáncer del revestimiento del útero, es la segunda neoplasia maligna ginecológica más común a nivel mundial y la neoplasia maligna más común en las naciones desarrolladas1. La incidencia de cáncer de endometrio ha aumentado constantemente, aumentando un 2,3% anual entre 2005-2013, con un correspondiente aumento del 2,2% en la mortalidad1,2,3. El diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos es primordial ya que la presencia de ganglios linfáticos positivos es un fuerte predictor negativo de supervivencia4,5,6,7 y puede guiar la administración de terapia adyuvante8,9,10,11,12,13. Actualmente, las metástasis de los ganglios linfáticos se diagnostican mediante la extirpación quirúrgica del tejido linfático que cubre los vasos sanguíneos principales de la pelvis y el abdomen. Este procedimiento, conocido como linfadenectomía, es controvertido debido a los datos de supervivencia contradictorios de dos grandes ensayos14,15,16,17,18 y los conocidos riesgo intraoperatorio15,19,20 y morbilidad postoperatoria21,22,23. Dado que las modalidades de imagen no invasivas actuales no tienen la sensibilidad y especificidad necesarias para reemplazar la disección24de los ganglios linfáticos, se ha producido un impulso para desarrollar nuevas técnicas de diagnóstico por imágenes. Para probar estas nuevas técnicas en un entorno preclínico, se requiere un modelo fiable de cáncer de endometrio con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales.
El modelo tumoral de conejo VX2 es un modelo bien establecido que se ha utilizado ampliamente para estudiar múltiples tumores de órganos sólidos humanos25 incluyendo pulmón26,cabeza y cuello27,28, hígado29, riñón30, hueso31,32, cerebro33, páncreas34 y útero35,36,37. El modelo VX2 fue desarrollado originalmente en 1940 por Kidd y Rous38 trasplantando con éxito un virus del papiloma de conejo de cola de algodón descubierto por Shope en 193339. Desde entonces, el modelo VX2 se ha mantenido in vivo, requiriendo paso en serie en el músculo cuádriceps de conejos blancos de Nueva Zelanda40. Más recientemente, sin embargo, múltiples grupos han cultivado con éxito células VX2 in vitro40,41,42 y demostrado la tumorigeneidad retenida de la línea celular cultivada31, 42,43. Los tumores VX2 se definen histológicamente como carcinomas de células escamosas anaplásicas44 y contienen rasgos glandulares que se asemejan al adenocarcinoma26. Los tumores se caracterizan por la facilidad de implantación, crecimiento rápido e hipervascularización44,45 y metástasis fiable, más comúnmente a los ganglios linfáticos regionales y distantes45. Las similitudes en la anatomía uterina vascular y linfática46, así como en el sitio de crecimiento ortotópico aseguran que el patrón metastásico del carcinoma VX2 del conejo imita al del cáncer de endometrio humano, haciendo del modelo VX2 un modelo fiable para el estudio humano enfermedad metastásica. Además, características histológicas como la proliferación microvascular anormal47, así como las similitudes inmunológicas48 y genéticas49,50 entre humanos y conejos sugieren que el tumor microambiente puede reflejar el del cáncer de endometrio humano.
Múltiples grupos han informado sobre el uso de VX2 para crear un modelo de cáncer de endometrio con metástasis retroperitoneales con una alta tasa de éxito reportado36,51,52; sin embargo, existe una variación significativa dentro de la literatura actual con respecto al método de creación de modelos. Dosis de suspensión celular tan bajas como 4 x 105 células/cuerno uterino51 y tan altas como 5 x 109 células/cuerno uterino37,53 se han reportado sin consenso estándar sobre la dosis celular VX2 requerida. También, una variedad de métodos de inoculación se han divulgado incluyendo la implantación microquirúrgica del tumor en el miometrio uterino36, inyección de suspensión celular VX237,44,52 , 53 y en algunos casos, la adición de cuerno uterino suturando antes de la innoculación52. Por último, ningún grupo ha informado del uso de celdas VX2 cultivadas para crear este modelo. Por lo tanto, el propósito de este estudio es demostrar un método estandarizado exitoso de creación de modelos VX2 e informar del primer uso de células VX2 cultivadas para crear un modelo de cáncer endometrial con metástasis retroperitoneales en un conejo.
En este documento, hemos informado de un método quirúrgico estandarizado para el establecimiento de un modelo de cáncer de endometrio VX2 y reportado sobre el primer uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo. La tasa de toma de tumores del 75% es inferior a la tasa del 100% reportada anteriormente en la literatura35,37,53,56; sin embargo, la tasa del 90% de metástasis de ganglio…
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue financiado por el Terry Fox Research Institute (PPG-1075), el Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (Foundation Grant #154326), el Canadian Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Fundación para la Innovación y Fundación Princesa Margaret contra el Cáncer.
Me gustaría dar las gracias a la Dra. Marguerite Akens por proporcionar las células VX2 iniciales para el establecimiento del modelo VX2 inicial y los bloques tumorales VX2 congelados. Me gustaría agradecer a Marco DiGrappa por ayudar a realizar experimentos iniciales de cultivo celular VX2 y Lili Ding por ayudar con el cultivo celular VX2.
11-blade scalpel, Sterile, Disposible | Aspen Surgical (VWR) | 80094-086 | |
22-gague ear vein catheter | CDMV | 14332 | |
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon | Falcon | 352350 | |
Acepromazine (Atravet) | CDMV | 1047 | |
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) | CDMV | 4363 | |
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) | UHN Stores | 457955 | |
Buprenorphine | McGill University | ||
Cefazolin | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Chlorhexidine solution | CDMV | 119872 | |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes | Corning | 354450 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates | Corning | 354408 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates | Corning | 354400 | brand not important |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | |
DMEM/HAM F12 1:1 | Life Technologies | 11320 | brand not important |
DMSO | Caledon Lab Chem | 1/10/4100 | |
Enrofloxacin (Baytril injectable) | CDMV | 11242 | |
Falcon Tube | Corning Centri-Star | 430828 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml | Life Technologies | 12483020 | brand/source not important |
Isoflurane | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Isohexol contrast | GE Healthcare | 407141210 | |
Meloxicam (Metacam 0.5%) | CDMV | 104674 | |
Normal Saline | House Brand (UofT Medstore) | 1011 | |
PBS | Multicell or Sigma | 331-010-CL or D8537-500mL | |
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) | Corning-Cellgro | CA45000-652 | |
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) | T.C.M.F (Dr Bristow) | 28-Jan-11 | |
Surgical Glue (Tissue Adhesive) | 3M Vetbond | 14695B | |
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade | Sigma | T-6567-5X20UG | |
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml | Wisent Inc | 325-542-EL | brand not important |