Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde methode om te groeien VX2 cellen in de cultuur en om een orthotopic VX2 model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen bij konijnen te creëren. Orthotopic endometriumkanker modellen zijn belangrijk voor de pre-klinische studie van nieuwe beeldvormings modaliteiten voor de diagnose van lymfeklier metastasen.
Endometriumkanker is de meest voorkomende gynecologic maligniteit in Noord-Amerika en de incidentie stijgt wereldwijd. De behandeling bestaat uit chirurgie met of zonder adjuvante therapie, afhankelijk van de lymfeklier-betrokkenheid zoals bepaald door lymfadenectomie. Lymfadenectomie is een morbide procedure, waarvan niet is aangetoond dat het een therapeutisch voordeel heeft bij veel patiënten, en daarom is een nieuwe methode vereist om lymfeklier metastasen te diagnosticeren. Om nieuwe beeldvormings middelen te testen, is een betrouwbaar model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen nodig. Het VX2 endometriumkanker model is vaak beschreven in de literatuur; Er bestaat echter een aanzienlijke variatie met betrekking tot de methode van model inrichting. Bovendien, geen studies hebben gemeld over het gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken als alleen cellen die zijn gekweekt in vivo eerder zijn gebruikt. Hierin presenteren we een gestandaardiseerde chirurgische methode en post-operatieve bewakingsmethode voor de oprichting van het VX2 endometriumkanker model en rapporteren over het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken.
Endometriumkanker, of kanker van de bekleding van de baarmoeder, is de tweede meest voorkomende gynecologic maligniteit wereldwijd en de meest voorkomende maligniteit in ontwikkelde landen1. De incidentie van endometriumkanker is gestaag toegenomen en stijgt met 2,3% per jaar tussen 2005-2013 en een overeenkomstige toename van 2,2% in sterfte1,2,3. De diagnose van lymfeklier metastasen is van het grootste belang omdat de aanwezigheid van positieve lymfeklieren een sterke negatieve voorspeller is van overleving4,5,6,7 en kan leiden tot de toediening van adjuvante therapie8,9,10,11,12,13. Lymfeklier metastasen worden momenteel gediagnosticeerd door chirurgisch verwijderen van het lymfeweefsel boven de grote bloedvaten in het bekken en de buik. Deze procedure, bekend als een lymfadenectomie, is controversieel als gevolg van conflicterende overlevings gegevens van twee grote proeven14,15,16,17,18 en de bekende risico van intra-operatieve15,19,20 en postoperatieve morbiditeit21,22,23. Aangezien de huidige niet-invasieve beeldvormings modaliteiten niet de vereiste gevoeligheid en specificiteit hebben om lymfeklier dissectie24te vervangen, is er een duw geweest om nieuwe diagnostische beeldvormingstechnieken te ontwikkelen. Om deze nieuwe technieken te testen in een pre-klinische setting, is een betrouwbaar model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen vereist.
Het konijn VX2 tumor model is een gevestigde model dat uitgebreid is gebruikt voor het bestuderen van meerdere menselijke solide orgel tumoren25 met inbegrip van Long26, hoofd ennek 27,28, lever29, nier30, bot31,32, hersenen33, alvleesklier34 en baarmoeder35,36,37. Het VX2 model werd oorspronkelijk ontwikkeld in 1940 door Kidd en Rous38 door het succesvol verplanten van een Cottontail konijn papillomavirus virus ontdekt door shope in 193339. Sinds die tijd is het VX2-model in vivo gehandhaafd, waarbij seriële passage in de quadriceps spier van witte Nieuw-Zeelandse konijnen40nodig is. Meer recent echter, meerdere groepen hebben succesvol gegroeid VX2 cellen in vitro40,41,42 en toonde de behouden tumorigenecity van de gekweekte cellijn lijn31, 42,43. VX2 tumoren zijn histologisch gedefinieerd als anaplastisch plaveiselcel carcinomen44 en bevatten klierweefsel kenmerken die lijken op adenocarcinoom26. Tumoren worden gekenmerkt door het gemak van implantatie, snelle groei en Hyper-vasculariteit44,45 en betrouwbaar metastasize, meestal op regionale en verre lymfeklieren45. Overeenkomsten in de baarmoeder vasculaire en lymfatische anatomie46 evenals de orthotopic groeiplaats zorgen ervoor dat het metastatische patroon van konijn VX2 carcinoom dat van humaan endometriumkanker nabootst, waardoor het VX2 model een betrouwbaar model is voor het bestuderen van menselijke gemetastaseerde ziekte. Bovendien suggereren histologische kenmerken zoals abnormale microvasculaire proliferatie47 , evenals immunologische48 en genetische gelijkenissen49,50 tussen mensen en konijnen dat de tumor micro-omgeving kan weerspiegelen die van humaan endometriumkanker.
Meerdere groepen hebben gerapporteerd over het gebruik van VX2 te maken van een model van endometriumkanker met retroperitoneale metastasen met een hoge gerapporteerde succespercentage36,51,52; Er bestaat echter een aanzienlijke variatie in de huidige literatuur met respect voor de methode van model creatie. Cel schorsing doses zo laag als 4 x 105 cellen/baarmoeder hoorn51 en zo hoog als 5 x 109 cellen/baarmoeder hoorn37,53 zijn gemeld met geen standaard consensus over de vereiste VX2 cellulaire dosis. Ook is er een verscheidenheid aan inoculatie methoden gemeld, waaronder micro-chirurgische implantatie van tumor in de baarmoeder myometrium36, injectie van VX2 celsuspensie37,44,52 , 53 en in sommige gevallen, de toevoeging van baarmoeder hoorn voorafgaand aan de en52. Ten slotte hebben geen groepen het gebruik van gekweekte VX2 cellen gemeld om dit model te maken. Het doel van deze studie is dus om een succesvolle gestandaardiseerde methode van VX2 model creatie te demonstreren en het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen te rapporteren om een model van endometriumkanker met retroperitoneale metastasen in een konijn te creëren.
Hierin hebben we een gestandaardiseerde chirurgische methode voor de oprichting van een VX2 endometriumkanker model gerapporteerd en gerapporteerd over het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken. De tumor nemen tarief van 75% is lager dan de 100% percentage eerder gerapporteerd in de literatuur35,37,53,56; echter, thw 90% snelheid van pathologisch bevestigde lymfeklier me…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gefinancierd door het Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), het Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), het Canadian Cancer Society Research Institute (704718), natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada, Stichting сanada voor innovatie en Prinses Margaret Cancer Foundation.
Ik wil Dr. Marguerite Akens bedanken voor het leveren van de initiële VX2 cellen voor de oprichting van het oorspronkelijke VX2 model en de bevroren VX2 tumor blokken. Ik wil Marco DiGrappa bedanken voor het helpen bij het uitvoeren van initiële VX2 Cell Culture experimenten en Lili ding voor het helpen met VX2 celcultuur.
11-blade scalpel, Sterile, Disposible | Aspen Surgical (VWR) | 80094-086 | |
22-gague ear vein catheter | CDMV | 14332 | |
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon | Falcon | 352350 | |
Acepromazine (Atravet) | CDMV | 1047 | |
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) | CDMV | 4363 | |
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) | UHN Stores | 457955 | |
Buprenorphine | McGill University | ||
Cefazolin | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Chlorhexidine solution | CDMV | 119872 | |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes | Corning | 354450 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates | Corning | 354408 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates | Corning | 354400 | brand not important |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | |
DMEM/HAM F12 1:1 | Life Technologies | 11320 | brand not important |
DMSO | Caledon Lab Chem | 1/10/4100 | |
Enrofloxacin (Baytril injectable) | CDMV | 11242 | |
Falcon Tube | Corning Centri-Star | 430828 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml | Life Technologies | 12483020 | brand/source not important |
Isoflurane | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Isohexol contrast | GE Healthcare | 407141210 | |
Meloxicam (Metacam 0.5%) | CDMV | 104674 | |
Normal Saline | House Brand (UofT Medstore) | 1011 | |
PBS | Multicell or Sigma | 331-010-CL or D8537-500mL | |
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) | Corning-Cellgro | CA45000-652 | |
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) | T.C.M.F (Dr Bristow) | 28-Jan-11 | |
Surgical Glue (Tissue Adhesive) | 3M Vetbond | 14695B | |
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade | Sigma | T-6567-5X20UG | |
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml | Wisent Inc | 325-542-EL | brand not important |