Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוח של חומצה והידרוקסימית מקבילים בנמייה הודית קטנה (הרבלס) סרה לשימוש בתור חיסון בעל פה כלבת מרקר ביולוגי

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

הצענו בשבי מונגוז פלצבו בכלבת אוראלי חיסון פיתיונות עם החומצה אתיל או מתיל בצורת ביוארקר וספיגת פיתיון מאומת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית הרומן עם טנדם המסה (LC-ms/MS) שיטה.

Abstract

הנמייה ההודית הקטנה היא מאגר של וירוס כלבת (RABV) בפוארטו ריקו, וכוללת מעל 70% ממקרי כלבת בעלי חיים שדווחו מדי שנה. השליטה של מחזור RABV במאגרים של חיות הבר מושגת בדרך כלל על ידי אסטרטגיה של חיסון לכלבת אוראלי (ORV). כרגע אין תוכנית ORV חיות בר קיים בפורטו ריקו. מחקר על חיסונים לכלבת אוראלי וסוגי פיתיון שונים עבור מונגוז נערכו עם תוצאות מבטיחות. ניטור ההצלחה של ORV מסתמך על אומדן ספיגת הפיתיון על ידי מינים היעד, אשר בדרך כלל כרוך בהערכת שינוי ב-RABV נוגדנים נטרול (RVNA) לאחר החיסון. אסטרטגיה זו עלולה להיות קשה לפרש באזורים עם תוכנית החיות הפעיל ORV או באזורים שבהם RABV הוא ברמות הרקע enzootic ו-RVNA הם נמצאים מינים המאגר. במצבים כאלה, משולב בסמנים עם החיסון או מטריצה הפיתיון עשוי להיות שימושי. הצענו 16 בשבי מונגוסס פלצבו ORV המכיל את חומצה אתיל-מאוקסימית (et-IPA) בריכוזים של 0.4% ו 1% בתוך הפיתיון ו 0.14% במטריקס הפיתיון החיצוני. כמו כן, הצענו 12 מונגוז ORV בשבי מכיל חומצה מועלת (me-IPA) בריכוזים של 0.035%, 0.07% ו 0.14% ב מטריצה הפיתיון החיצוני. אספנו דגימת נסיוב לפני הצעת הפיתיון ושבוע לאחר מכן עד שמונה שבועות שלאחר ההנפקה. הצלחנו לחלץ את חומצות הנלואוקמית מסרה לתוך השימוש בספקטרומטר כרומטוגרפיה/ספקטרומטריה כרומטוגרפית נוזלית. בעזרת ספקטרומטר כרומטוגרפיה. נוזלי מאסיבי מצאנו יכולת סימון נאותה לפחות שמונה וארבעה שבועות עבור et-ו-IPA, בהתאמה. נגזרות IPA שני יכול להיות מתאים להערכת שטח של ספיגת פיתיון ORV ב mongooses. בשל תוחלת החיים של הסמן ב נמייה, הטיפול חייב להילקח כדי לא לבלבל את התוצאות באמצעות נגזרות IPA אותו במהלך הערכות רצופות.

Introduction

וירוס כלבת (RABV) הוא הגיון שלילי אחד שנתקע lyssavirus, ו מסתובב בין מינים שונים של מאגר חיות הבר בתוך הזמנות טורפים וכפות. מינים מרובים של נמייה הם מאגרים של RABV, והנמייה ההודית הקטנה (הרסוויס אורובוטאוס) היא המאגר היחיד בפוארטו ריקו ובאיים הקאריביים בחצי הכדור המערבי1,2,3 . השליטה על מחזור RABV במאגרים של חיות הבר מושגת בדרך כלל באמצעות אסטרטגיה של חיסון נגד כלבת (ORV). בארצות הברית (ארה ב), פעילות ניהול זו מתואמת על ידי התוכנית לניהול כלבת משרד החקלאות/שירותי הטבע (NRMP)4. כרגע אין תוכנית ORV חיות בר קיים בפורטו ריקו. מחקר לחיסונים כלבת וסוגי פיתיון שונים עבור מונגוז נערך עם תוצאות מבטיחות המציעה תוכנית orv עבור מונגוז אפשרי5,6,7,8.

ניטור ההשפעה של ORV מסתמך על אומדן ספיגת הפיתיון על ידי מינים היעד, אשר בדרך כלל כרוך בהערכת שינוי של נוגדן RV seroprevalence. עם זאת, אסטרטגיה זו עשויה להיות מאתגרת באזורים עם תוכניות בעלי חיים הפעיל ORV או באזורים שבהם RV הוא ברמות הרקע enzootic ו של בעלי החיים לנטרול נוגדנים (RVNA) נמצאים מינים מאגר. במצבים כאלה, ניתן לעשות שימוש בסמנים הנכללים בפיתיון או במטריצת הפיתיון החיצונית.

סמנים ביולוגיים שונים שימשו כדי לפקח על ספיגת הפיתיון במינים רבים, כוללדביבונים (procyon לואטור)9,10, stoats (מוסטאלהארמין)11,12, גיריות אירופאיות ( מלוז מלכים) 13, חזירי בר (סוס)14, מונגוז הודית קטנה15 וכלבי ערבה (קינויסלדוסינוס)16,17, בין היתר. בארה ב, מבצעי orv בבית לעתים קרובות כוללים 1% טטרציקלין ביוארקר במטריקס הפיתיון כדי לפקח על ספיגת הפיתיון18,19. עם זאת, החסרונות לשימוש טטרציקלין כוללים דאגה גוברת על התפלגות של אנטיביוטיקה לסביבה ואיתור של טטרציקלין הוא פולשני בדרך כלל, המחייב שאיבת שיניים או הרס של בעל החיים כדי להשיג עצם . דוגמיות של20 Rhodamine B כבר הוערך כסמן במגוון של רקמות ניתן להבחין באמצעות אולטרה סגול (UV) אור וזריחה בשיער ושפמונים10,21.

חומצה וולקסימית (IPA) היא אבקה לבנה וגבישית ששימשו להערכת צריכת הפיתיון בזאבי ערבות (כלב לאטטרנס)22, שועל ארקטי (וולפסי לגונה)23,שועל אדום (וולפסי)24, דביבונים מיכל בן 10 , 25, בר חזיר14, צבאים אדומים (סרבייוס אלאפיוס סקוקוס)26, גיריות אירופאיות12 וחמוסים (מ. furo)27, בין מינים אחרים של יונקים. זמני שמירה של IPA משתנה על ידי מינים מתוך פחות משבועיים בכמה חיות כיס28,29, לפחות 26 שבועות בפרסתנים26 ומעל 52 שבועות כלבים ביתיים (כלב זאב משפחה)30. זמני השמירה עשויים להיות גם תלויים במינון31. חומצה והאנקסימית נקשר בחוזקה לאלבומין הנסיוב והוא זוהה היסטורית על ידי מדידת רמות יוד בדם32. גישה עקיפה זו הייתה מתבצעת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים כדי למדוד במישרין את ריכוזי החומצה המיאוקסיליים עם זיהוי UV33, ובסופו של דבר עם כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטר מסה (lcms) . 34,35. עבור מחקר זה, כרומטוגרפיה מאוד רגיש וסלקטיבי של נוזל עם מספר ספקטרומטר מאסיבי (LC-MS/MS) שיטת פותחה העושה שליטה מרובה התגובה (MRM) כדי לכמת שני אנמים אנלוגיים של חומצה ולבן. המטרה שלנו היתה להשתמש בשיטה זו LC-MS/MS כדי להעריך את היכולת סימון של 2-(3-הידרוxy-2, 4, 6-טרייודובנזיל חומצה (מתיל-IPA או me-IPA) ו 2-(3-הידרוxy-2, 4, 6-טרייודובנזיל) חומצה בוטאית (אתיל-IPA או et-IPA) וכאשר נמסר ORV פיתיון. למונגוסים שבשבי

מונגוסס היו חיים שנתפסו במלכודות כלוב עם נקניקים מעושנים זמין מסחרית שמן דגים. Mongooses היו שוכנו בודדים 60 ס מ x 60 ס"מ x 40 ס מ כלובי פלדת אל-חלד האכיל הקצבה יומית של ~ 50 g מסחרי מזון חתול יבש, שיושלם פעמיים בשבוע עם ירך עוף זמין מסחרית. . המים היו זמינים לפרסום הבאנו שני נגזרים של IPA, אתיל-ipa ו-מתיל-ipa, בשבי מונגוז ב פלצבו orv baits. כל פיתיונות היו מורכבים 28 מ"מ x 20 מ"מ x 9 מ"מ חבילת שלפוחית לסכל עם ציפוי חיצוני (להלן" מטריצה הפיתיון ") המכיל אבקת עוף ביצה ו ג'לטין (טבלת חומרים). Baits הכיל 0.7 mL של נגזרות מים או IPA ושקל כ 3 גרם, אשר ~ 2 g היה מטריצה הפיתיון החיצוני.

הצענו 16 בשבי מונגוז-IPA בשלושה ריכוזים 0.14% (2.8 מ ג et-IPA ב ~ 2 g מטריצה פיתיון; 3 גברים [m], 3 נקבות [f]), 0.4% (2.8 mg et-IPA ב-0.7 mL חבילת נפח שלפוחית; 3m, 3m), ו-1.0% (7.0 mg אתיל-IPA בשנת 0.7 שלפוחית לארוז נפח; 2m , 2f). המינון הכולל של 2.8 mg מקביל לשיעור מינון של 5 מ"ג/ק"ג27,36 והוא מבוסס על משקל נמייה ממוצע של 560 g בפורטו ריקו. בחרנו 1% כריכוז הגבוה ביותר כמו מחקר מרמז על שנאת הטעם כמה בסמנים עשויים להתרחש בריכוזים > 1% מינים מסוימים37. הצענו את המנה היחידה בחבילת השלפוחית כחומר מונע את המסיסות מלהתמוסס בממס מספיק כדי להיות משולב באופן שווה לתוך מטריצת הפיתיון. קבוצת שליטה אחת (2m, 1f) קיבלה פיתיונות מלא מים סטרילי ללא IPA. הצענו פיתיונות למונגוסס בבוקר (~ 8 בבוקר) במהלך או לפני האכלה הקצבה היומית שלהם. שרידי הפיתיון הוסרו לאחר כ -24 שעות. אספנו דגימות דם לפני טיפול, יום אחד לאחר הטיפול ולאחר מכן שבועי עד 8 שבועות לאחר הטיפול. אנו מלדמים מונגוז על ידי שאיפת של גז isof, ונאסף עד 1.0 mL של דם שלם על ידי והניקוב של הווריד הגולגולתית כפי שתוארה עבור חמוסים38. אנחנו centrifuged דגימות דם שלמות, העבירו את סרה לקריובקבוקונים ואחסנו אותם ב-80 ° צ' עד לניתוח. לא כל החיות נדגמו במהלך כל פרקי הזמן כדי למזער את ההשפעות של הדם החוזר על בריאותם של בעלי החיים. שליטה בעלי חיים שנדגמו ביום 0, ואז שבועי של עד 8 שבועות לאחר הטיפול.

שמנו אותי-IPA בשלושה ריכוזים: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) ו-0.14% (2.8 mg), כל שולבו בתוך מטריצה הפיתיון, עם 2 זכרים ו-2 נקבות לכל קבוצת הטיפול. שני זכרים ושתי נקבות קיבלו את המנה המלאה במים סטריליים ובלי IPA. שעות ההנפקה וההרדמה מתוארות לעיל. אספנו דגימות דם לפני טיפול ביום 1, ולאחר מכן שבוע עד 4 שבועות לאחר הטיפול.

בדקנו את הסרום מידע עבור נורמליות ואמצעים מוערכים עבור ריכוזי הסרום IPA של קבוצות טיפול שונות. השתמשנו במודל מעורב ליניארי כדי להשוות ריכוזי הסרום et-IPA במאגר על פני אנשים. סוג פיתיון (מטריקס/שלפוחית pack) היה השפעה קבועה בנוסף ליום ניסיוני, בעוד מזהה בעלי חיים היה השפעה אקראית. כל ההליכים הנוהלים באמצעות תוכנה סטטיסטיתמשותפת (טבלת חומרים) ומשמעות הוערך ב α = 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת המחקר הלאומית של משרד החקלאות של המרכז לחקר החי והשימוש תחת פרוטוקול מחקר מאושר QA-2597.

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את נוהל הניתוח כדי לזהות חומצה מללית בסרום נמייה. שיטה זו היא הגרסה הסופית של תהליך איטראטיבי שהחל בניתוח של חומצה אתיל-מורקסימית בסרום נמייה. במהלך הערכה ראשונית של חומצה אתיל-מורן שינויים משניים נעשו בשיטות, והתוצאה היא הפרוטוקול הסופי המוצג להלן. תוצאות הנציג כוללות את אלה שהתקבלו במהלך שני האיטראציות.

1. הכנת פתרונות ותקנים

  1. לרכוש לי-IPA ו-et-IPA.
  2. עבור השלב הנייד A, להכין 1 L של 0.1% (v/v) החומצה הפורמית במים על ידי שילוב של 1 מ ל של חומצה פורמית עם 1 L של המים אלקטרופורזה (≥ 18 MΩ). עבור שלב הנייד B, להכין 1 L של 0.1% (v/v) החומצה פורמית ב acetonitrile (acn) על ידי שילוב של 1 מ ל חומצה פורמית עם 1 L של acn.
  3. לדילול, להכין 200 mL של 0.5% (v/v) חומצה trifluoroacetic (TFA) ב ACN על ידי שילוב של 1 מ ל TFA עם 200 mL של ACN.
  4. הכנת פתרונות מלאי IPA מרוכז של me-IPA ו-IPA ב ACN בריכוזים של כ 1,000 μg/mL.
    1. שוקלים כ 10 מ"ג me-IPA על מיקרו מאזן ולהקליט את המסה ± 0.0001 mg. בדיקת כימות me-IPA ל 10 mL מחלקה בקבוקון נפחי באמצעות 45 mL ACN. Sonicate 1 דקות כדי לפזר את כל המוצקים, ולאחר מכן להביא נפח עם ACN.
    2. העברה ~ 8 מ ל של כל מלאי כדי לאמבר 8 מ"ל זכוכית מבחנות עם פולי הטטרפלואורואתילן (מצופה)-כמוסות מרופדות. חנות בטמפרטורת החדר (RT). העבר את המניה הנותרת לפסולת מסוכנת.
  5. עבור מלאי 25x-7 me-IPA (שולחן 1), להכין מלאי של ME-IPA ב acn ב כ 200 μg/mL. דוגמה: העברה 1 מ ל של מלאי me-IPA מרוכז משלב 1.4.2 ל 5 mL מחלקה בקבוקון נפחי באמצעות 1,000 μL מזרק זכוכית. לדלל את העוצמה עם ACN. העבירו את המניה לבקבוקון זכוכית. באורך 8 מ ל עם כובע מצופה חנות ב-RT.
  6. הכינו את ששת המניות הנוספות של 25x me-IPA שתוארו בלוח 1. עבור כל מניה, לשלב את אמצעי האחסון שצוין באמצעות צינורות החזרה בתוך כתום של 8 מ"ל כתום בקבוקון זכוכית עם כובע מצופה. אחסן כל מניה ב-RT.
  7. עבור מלאי הפונדקאית 25x, להכין מלאי פונדקאית של me-IPA ב ACN ב כ 10 μg/mL מהמלאי מרוכז הכין בשלב 1.4.2. העברת 0.100 mL של מלאי מרוכז me-IPA כדי 10 mL מחלקה A בקבוקון נפחי באמצעות 100 μL מזרק זכוכית, ולאחר מכן לדלל את עוצמת הקול עם ACN.
    1. העברה של ~ 8 מ ל לבקבוקון זכוכית באורך 8 מ ל עם כובע מצופה. חנות ב RT. העבר את המניה הנותרת לפסולת מסוכנת.
  8. הכינו 4x מניות המכיל את שני האנליטים ב 2 מ ל בורג העליון זכוכית מבבחנות אוטומטית כמתואר בטבלה 2.
    1. לדוגמה, כדי להכין את מלאי 4x-7, לבקבוקון של 2 מ ל, הוסף 0.20 mL של מלאי 25x-7 me-IPA משלב 1.5 באמצעות פיפטורים חוזרים עם מערך 0.5 mL. הוסף 0.20 mL של המניה הפונדקאית של 25x et-IPA משלב 1.7 באמצעות פיפטורים חוזרים עם טיפ קיבולת mL של 0.5.
    2. הוסף 0.85 mL של ACN באמצעות פיפטורים חוזרת עם טיפ קיבולת של mL 1. Cap את המבחנה באופן מאובטח להפוך 5x כדי לערבב.
  9. הכן את העקומה הסטנדרטית ב-2 מ ל בבקבוקונים ברגים אוטומטיים כמתואר בטבלה 3.
    1. לדוגמה, כדי להכין תקן 7 (Std 7), על בקבוקון 2-mL, להוסיף 0.20 mL של 4x-7 מניות משלב 1.8.2 באמצעות פיפיטאור חוזר עם 0.5 mL טיפ קיבולת. הוסיפו 0.60 מ ל של מים אולטרה-מ, בעזרת פיפטורים חוזרים עם טיפ בקיבולת של 1 mL. Cap את המבחנה באופן מאובטח להפוך 5x כדי לערבב.

2. הכנה לדוגמא

התראה: כוח אדם המבצע הליך זה חייב היה לקבל את הסדרה המלאה של כלבת מניעה טרום חשיפה מונע יש נוגדן כלבת מתועדת סיכוייו מעל 0.5 IU מבית החולים הפדרלי בריאות בתחום הרפואי המיועד. על האדם ללבוש מעילים ולהגן על העין כל הזמן בעת ביצוע החילוץ. התראה: בצע את השלבים 2.3-2.6 בארון בטיחות מסוג II.

  1. לכל דוגמה, הכינו שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכילה 200 ל-300 מ ג של נאל. סדר את הצינורות במדף פלסטיק 80-תנוחה. הגדר בצד לשימוש בשלב 2.6.
    הערה: סקופ מיקרו (או מכשיר מדידה קטן אחר) מומלץ למספר רב של דגימות.
  2. עבור כל דוגמה, תווית 2 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות: אחד כמו "A" והשני כמו "B". לסדר את הצינורות במדף פלסטיק 80-מיקום.
  3. הציבו את החומרים והציוד הבאים הדרושים להפקת סרום בארון בטיחות ממדרגה ב': צינורות מיקרו-צנטריפוגה (בארונות תקשורת) שהוכנו בשלבים 2.1 ו-2.2, מערבל מערבולת, חזרה על הצנרת עם 0.5 mL ו-5 מוצרים בעלי קיבולת mL, 100 למעלה מתזוזה אווירית של 1000 ליטר פיפטה עם 1,000 μl טיפים, מכולות עם כ 100 מ ל כל המים מדלל ו-אלקטרופורזה, מכולה פסולת ביולוגית.
  4. להסיר דגימות סרום מאחסון קפוא וחמים ל RT בארון בטיחות. המערבולת לערבב כל דגימת סרום לפני הדגימה.
  5. שימוש בצינורות חוזרים עם 0.5 mL, טיפ, מוותר 0.050 mL של הסרום נמייה לתוך צינור "A" ולהוסיף 0.050 mL של מלאי הפונדקאית 25x. לאחר מכן להוסיף 0.950 mL של דילול לצינור "A" באמצעות פיפטורים חוזרת עם 5 קיבולת mL. שילוב מאובטח של כובע ומערבולת עבור 10-15.
  6. לחלק את שוקלת מראש את הדרך משלב 2.1 לתוך צינור "A" ו מערבולת לערבב 3x עבור 8-12. לנגב את המשטחים החיצוניים של מתלה הבקבוקון המכיל צינור "A" באמצעות 70% (v/v) איזופנול.
    הערה: מתלה הדגימות עשוי כעת להיות מוסר מארון הביובטיחות של המחלקה II.
  7. שפופרת צנטריפוגה "A" ב 12,000 x g עבור 1 דקות כדי להפריד את השלבים מימית ו acn. פיפטה 0.80 mL של השלב העליון ACN לצינור "B" באמצעות 100-1000 μL העקירה האוויר הצינורות. העבר את הפתרון הנותר בצינור "A" לפסולת מסוכנת ולהשליך את הצינור הריק במיכל פסולת ביולוגי.
  8. הסרת ACN ו-TFA מן הצינור "B" עם זרימה עדינה של N2 גז באמבט מים 45 ° c.
  9. הוסף 0.250 mL של ACN לצינור "B" באמצעות פיטאור חוזר, תערובת מערבולת עבור 4-5, ולאחר מכן צנטריפוגה בקצרה (2-4 של) ב 12,000 x g כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור.
  10. הוסף 0.750 mL של המים אלקטרופורזה די לצינור "B" באמצעות פיפטורים חוזרים עם 5 לקיבולת mL טיפ, תערובת מערבולת עבור 4-5-s, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 12,000 x g כדי להבהיר את המדגם.
  11. העברת 0.75 mL של סופרנטאנט לבקבוקון בקבוקון אוטומטי באמצעות מעבר האוויר באמצעות הזחה בצנרת 1,000 μL. התעלם מקצות הצנרת במיכל פסולת ביולוגית.
  12. כיפה בדגימות תעשיה באופן מאובטח ולנתח על ידי LC-ms/ms (סעיף 4). העבר את הפתרון הנותר בצינור "B" לפסולת מסוכנת ולהשליך את הצינור הריק למיכל פסולת ביולוגי. היפטר מכל הפסולת הביו-מסוכנת באמצעות אוטוקלינג או השריפה.

3. דגימות בקרת איכות

התראה: בצע את הצהרות האזהרה המתוארות בסעיף 2.

הערה: ההליך הבא מתאר את המספר המינימלי של דגימות בקרת איכות (QC) הנדרשות לניתוח. משכפל בכל רמה מומלץ אם יש מספיק סרום נמייה זמין.

  1. הכינו ארבעה שפופרות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילות 200-300 מ ג של נאל. לסדר את הצינורות במדף פלסטיק 80-מיקום.
  2. עבור כל דגימת QC, תווית 2 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות: אחד כמו "A" והשני כמו "B". לסדר את הצינורות במדף פלסטיק 80-מיקום.
  3. חזור על שלב 2.3.
  4. הסרת שליטה סרום נמייה מאחסון קפוא וחמים כדי RT בתוך הקבינט אבטחה טיחות. מערבולת לערבב את סרום הבקרה לפני הדגימה.
  5. לחלק 0.050 מ ל של בקרת נמייה סרום לתוך ארבעה 1.5-mL "" A "צינורות באמצעות פיפטורים חוזרת עם הקיבולת של 0.5 mL.
  6. לחזק כל אחד מארבעת דגימות ה-QC כפי שצוין בטבלה 4 באמצעות פיפטורים חוזרים עם טיפ קיבולת 0.5 mL. כיסוי כל לדגום QC מאובטח ומערבולת במשך 10-15.
  7. בצע את תהליך החילוץ כפי שמתואר בשלבים 2.6-2.12.

4. מנתח LC-MS/MS

  1. הגדר את התצורה של LC-MS/MS עם כל הפרמטרים המתוארים בטבלה 5. הכוח ב-LC-MS/MS ולאפשר לעמודה להגיע 70 ° צ' לפני הגדרת קצב הזרימה 0.800 mL/min.
  2. הגדר רצף בתוכנת רכישת הנתונים (טבלת חומרים) כדי להזריק את העקומה הסטנדרטית לפני ואחרי כל אצווה המורכבת מדגימות בקרת איכות ודגימות לא ידועות.
  3. הכנס את כל התקנים והדגימות ורכוש את MRM כרומטוגרמות באמצעות פרמטרים המפורטים בטבלה 5.
  4. לאחר השלמת רצף, כבה את ה-LC-MS/MS והיפטר מכל הבקבוקונים של הדוגם האוטומטי כפסולת מסוכנת.

5. כמת

  1. השתמש בתוכנת ניתוח הנתונים כדי ליצור עקומת כיול של תגובות יחסיות לעומת ריכוזים יחסיים עבור me-IPA באמצעות et-IPA כסטנדרט הפנימי. חשב את התגובות היחסיות ממעבר MRM לקוונט עבור me-IPA (556.6 → 428.7) מחולק במעבר MRM עבור et-IPA (570.7 → 442.7). בנו עקומת כיול ברמת 7 ברמה תוך שימוש בפונקציה ריבועית של הזמנה שניה המשוקלל 1/x ומתעלמת מהמקור.
  2. חישוב הריכוז סרום (סרוםC) של ME-IPA באמצעות המשוואה הבאה:
    Equation 1
    כאשר c מכשיר הוא הריכוז נקבע על ידי המכשיר מן עקומת הכיול ביחידות של μg/mL, 1.25 הוא Equation 2 גורם הדילול, v הסופי הוא נפח המדגם הסופי (1.0 mL), vסרום הוא נפח הנסיוב mL ( 0.050 מ ל נומינלי).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כרומטוגרמות מייצגת מתוך ניתוח me-IPA מוצגות באיור 1. סרום נמייה השליטה (איור 1A) ממחיש את זמן השמירה של ET-ipa (מחליף) והעדר ME-ipa בזמן ההחזקה המצוין. דגימת בקרת האיכות (איור 1B) ממחישה את ההפרדה הבסיסית של ME-ipa מ-ET-ipa וכן את מעברי הקוונט והמזהה עבור ME-ipa. איור 1C מציג דוגמה ייצוגית מתוך המחקר עם ריכוז סרום נצפה של 33.5 μg/mL ME-IPA.

עקומת כיול ייצוגית מתוך ניתוח me-IPA מוצגת באיור 2. העקומה הסטנדרטית בת 14 הנקודות נעה בין 0.00202 ל-8.27 μg/mL me-IPA עם מקדם מתאם (r2) של 0.9998. מקדמי המתאם נעו מ-0.9998 עד 0.99997 עבור הניתוחים האני-IPA. הריכוז המחליף של et-IPA היה 0.502 μg/mL בכל הסטנדרטים.

טבלה 6 מציג את הדיוק ואת התוצאות הדיוק עבור שליטה בסרום נמייה מחוזק עם 0, 1.3, 31, ו 82 Μg/mL ME-IPA (n = 10 בכל רמה). התוצאות נאספו מחמישה ניתוחים נפרדים. אחוז שחזורים נעו מ 96.9% עד 109%. סטיית התקן היחסית (% RSD) בשלוש רמות הביצורים היתה 3.4%, 1.7% ו-2.3%, בהתאמה.

היחס אות לרעש (S/N) נצפה בדגימות בקרת איכות (n = 10 פקדים שליליים; n = 10 ב 1.3 μg/mL me-IPA) שימש כדי לקבוע את מגבלת הזיהוי (DL; 3 x S/N) ו-מגבלת כימות (QL; 10 x S/N). DL ו-QL עבור me-IPA סרום נמייה היו 0.012 μg/mL ו 0.042 μg/mL, בהתאמה.

התגובות באזור השיא של מעבר MRM של המזהה מחולקות במעברEquation 3 mrm כימות (מחושב עבור כל התקנים והדגימות. יחס זה עבור כל דוגמה חולקה לאחר מכן ביחס הממוצע שנצפה בתקני הכיול כדי לקבוע את ההתאמה של אחוזי המזהה. יחס המזהה עבור הדוגמה המוצגת באיור 1C היה 0.439, עם התאמה של 96.3%.

ההתאוששות של מתקן החלופי et-IPA חושבה עבור כל דגימות ה-QC ודגימות לא ידועות על ידי חלוקת התגובה של אזור השיא et IPA על ידי תגובת אזור השיא הממוצע et-IPA נצפתה בתקני כיול. ממוצע החלמה ממוצעת פונדקאית היו 91.0% (פקדים שליליים), 91.4% (1.3 μg/mL), 92.8% (31 μg/mL), ו 95.4% (82 μg/mL).

אין פסגות הפרעה עבור כימות או מזהה מעברים של me-IPA נצפו בקרת נמייה סרום (איור 1A).

תהליך החילוץ והתנאים האינסטרומנטליים המשמשים לקביעת ה-et-IPA בסרום נמייה (איור 3 ושולחן 7) היה זהה לשיטת me-ipa, אך עם השינויים הבאים. פרופיל-חומצה הידרוקסימית (pr-IPA) שימש את האנליטה פונדקאית ו מבוגר, פחות רגיש LC-MS/MS שימש. הטמפרטורה של מקור ייבוש גז היה 350 ° c עם זרימה של 12 L/min והלחץ המנייצר של 35 psi. מתח הקפילר היה-2,500 V. למקור לא היה גז מעטפת או אמצעי להתאמת מתח החרירים. מעבר MRM בכמת עבור et-IPA היה 570.7 → 442.8 (584.7 → 456.8 עבור pr-IPA). ואנרגיית ההתנגשות הייתה. ב -10 וולט לשני האנליטים 80 המזהה MRM עבור et-IPA היה 570.7 → 126.8 עם אנרגיה התנגשות של 40 V.

הבדיקה של כל דגימות הנסיוב של הנמייה עבור et-IPA בוצעה על שמונה ניתוחים. עקומת כיול 7 ברמה נע בין 0.00207 אל 8.48 μg/mL עם מקדמי מתאם (r2) החל 0.9990 כדי 0.9999. הריכוז המחליף של pr-IPA היה 0.512 μg/mL. טבלה 7 מציג את הדיוק ואת התוצאות הדיוק עבור שליטה בסרום נמייה מחוזק עם 0, 1.3, 13, 32, 85, ו-ו170 μg/mL ME-IPA. התוצאות נאספו משמונה ניתוחים נפרדים. אחוז שחזורים נעו מ 89.5% עד 115%. ה% RSD בחמש רמות הביצורים היה 4.3%, 1.5%, 2.3%, 5.6% ו-1.1%, בהתאמה. S/N נצפתה בדגימות בקרת איכות (n = 21 פקדים שליליים; n = 21 ב 1.3 μg/mL me-IPA) שימש כדי לקבוע את DL ו-QL. DL ו-QL עבור me-IPA סרום נמייה היו 0.12 μg/mL ו 0.42 μg/mL, בהתאמה. ההתאוששות ממוצע מחליף השחזור מדגימות בקרת איכות היה 86.8% (n = 75). אין פסגות הפרעות עבור כימות או מזהה מעברים של et-IPA נצפו בשליטה סרום נמייה.

כל מונגוז הציעו et-IPA ב-≥ 25% של הפיתיון בתוך האילוץ 24 שעות זמן והיה רמות הניתנות לשינוי של et-IPA ב-סרה שלהם (שולחן 8). מתוך ניתוח מעורב מודל, כולל ריכוזי ה-IPA סרום ברמה גבוהה יותר מ פיתיונות עם 2.8 מ"ג של ביונקר במטריצת הפיתיון (17.5 μg/ml, 95% CI 18.9 למעלה/ml) בהשוואה לחבילת השלפוחית (9.8 μg/ml, 95% CI 4.0-15.6 μg/ml) (F = 3.6 , P = 0.07). ריכוזי שני סוגי פיתיון התפורר עם יום ניסיוני (β =-0.15 ± 0.04, F = 14.4, P = 0.0005). שינויים ברמה האישית בריכוזים של סרום IPA נצפתה (מזהה בעלי חיים הערכה הפרמטרים המשותפת = 46.6 ± 20.7). כל מונגוז צרכו 100% של פיתיונות בקרה עם רק את חבילת שלפוחית הנייר ריק הנותרים. הריכוז הממוצע של שאריות et-IPA בסרום היה משתנה בתקופת הזמן ולא נראה שהוא הגיע לירידה בעקביות לאורך זמן (איור 3).

כל מונגוז הציעו לי-IPA פיתיונות ≥ 25% של הפיתיון בתוך הגבלת 24 שעות הזמן והיה רמות הניתנות לכימות של me-ipa ב-סרה שלהם (שולחן 9). משמעות הריכוז לוגיקה מסרויה של et-ו-IPA ב נמייה הופיעה תלויה בריכוז הIPA בפיתיון. ריכוזים גבוהים יותר של IPA בפיתיון הביא שאריות סרום גבוה גם במקרים בהם את המינון הכולל (2.8 mg במקרה של et-IPA) נשאר אותו דבר. מעניין, אני-IPA הופיע לייצר דפוס השפלה אפילו יותר לאורך זמן עם יתד הראשונית ביום 1, ואחריו ירידה קבועה עד יום 14 שבו הריכוזים הופיעו לרמה (איור 4).

Figure 1
איור 1 : יון כרומאטוגרמות מייצג. (א) מייצג את MRM-יון כרומאטוגרם של שליטה מנמייה סרום מחוזק עם הפונדקאית מטפל אתיל-והאנאוקמית חומצה (ET-IPA). החץ מציין את זמן השמירה של חומצה מלומית (me-IPA). (ב) הנציג MRM כרומטוגרם של שליטה מנמייה סרום מחוזק עם 31 μg/mL ME-IPA. העוצמות היחסיות של כימות המתים (Quant) ומעברי המזהה (Quant) מוצגים. (ג) מייצג את MRM הכולל את מדגם ה סרום של נמייה עם ריכוז ME-IPA של 33.5 μg/mL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : עקומת כיול ייצוגית. עקומת כיול מקורית שנוצרת על-ידי תוכנת ניתוח הנתונים עבור חומצה של מתיל-והאנקסימית (me-IPA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : סרום אתיל-הגייה (et-IPA) הריכוז של סוג פיתיון וריכוז לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : הריכוז הממוצע של הנסיוב מתיל (me-ipa) על ידי ריכוז פיתיון לאורך זמן. כל ריכוזי ה-IPA שולבו. במטריצת הפיתיון החיצונית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ריכוז me-IPA (μg/mL)
זהה
25x-7 התייחס לשלב 1.6 200
25x-6 שילוב 1.000 mL 25x-7 מניות עם 3.000 mL ACN 50
25x-5 שילוב 1.000 mL 25x-6 מניות עם 3.000 mL ACN 13
25x-4 שילוב 1.000 mL 25x-5 מלאי עם 3.000 mL ACN 3.1
25x-3 שילוב 1.000 mL 25x-4 מניות עם 3.000 mL ACN 0.78
25x-2 שילוב 1.000 mL 25x-3 מלאי עם 3.000 mL ACN 0.2
25x-1 שילוב 1.000 mL 25x-2 מלאי עם 3.000 mL ACN 0.049

טבלה 1: הכנת מניות 25x me-IPA ב ACN (ב 8-mL כתום מבחנות זכוכית).

ריכוז (μg/mL)
זהה me-IPA et-IPA
4x -7 0.200 mL 25x-7 + 0.200 מ ל 25x ממלאי + 0.850 mL ACN 32 1.6
4x-6 0.200 מ ל 25x-6 + 0.200 מ ל 25x ממלאי + 0.850 mL ACN 8 1.6
4x-5 0.200 מ"ל 25x-5 + 0.200 מ ל 25x ממלאי + 0.850 mL ACN 2 1.6
4x-4 0.200 מ"ל 25x-4 + 0.200 מ ל 25x ממלאי + 0.850 mL ACN 0.5 1.6
4x-3 0.200 מ"ל 25x-3 + 0.200 מ ל 25x ממלאי + 0.850 mL ACN 0.12 1.6
4x-2 0.200 מ"ל 25x-2 + 0.200 מ ל 25x ממלאי + 0.850 mL ACN 0.031 1.6
4x-1 0.200 mL 25x-1 + 0.200 mL 25x ממלאי + 0.850 mL ACN 0.008 1.6
4x-0 0.200 מ ל 25x ממלאי + 1.050 mL ACN 0 1.6

שולחן 2: הכנת מניות 4x IPA ב acn (ב 2-mL מבחנות תעשיה).

ריכוז (μg/mL)
זהה me-IPA et-IPA
מיכל סטנדרטי 0.200 מ"ל 4x-7 + 0.600 mL-מים DI 8 0.4
מחלת מין 6 0.200 מ"ל 4x-6 + 0.600 mL-מים DI 2 0.4
התקן 5 0.200 מ"ל 4x-5 + 0.600 mL-מים DI 0.5 0.4
מחלת מין 4 0.200 מ"ל 4x-4 + 0.600 mL-מים DI 0.13 0.4
מתקן 3 0.200 מ"ל 4x-3 + 0.600 mL-מים DI 0.03 0.4
מחלת מין 2 0.200 מ"ל 4x-2 + 0.600 mL-מים DI 0.0078 0.4
מחלת מין 1 0.200 מ"ל 4x-1 + 0.600 mL-מים DI 0.002 0.4
סטיית תקן 0 0.200 מ"ל 4x-0 + 0.600 mL-מים DI 0 0.4
ריק 0.200 מ ל ACN + 0.600 מ"ל מים 0 0

שולחן 3: הכנת תקני me-IPA ב 75/25 מים/acn (ב 2-mL מבחנות תעשיה).

ריכוז (μg/mL) בסרום
זהה me-IPA et-IPA
בקרה שלילית 0.050 מ ל 25x מחליף + 0.950 mL מדלל 0 10
מבצר נמוך 0.050 מ ל 25x מחליף + 0.020 mL 25x-4 + 0.930 mL מדלל 1.2 10
באמצע מבצר 0.050 מ ל 25x מחליף + 0.030 mL 25x-6 + 0.920 mL דילול 30 10
מבצר גבוה 0.050 מ ל 25x מחליף + 0.020 mL 25x-7 + 0.930 mL מדלל 80 10

שולחן 4: בקרת איכות הביצורים מדגם (להכין בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5-mL).

כרומטוגרפיה נוזלית:
עמודה סי18, 2.1 x 50 מ"מ, 2.5 יקרומטר גודל החלקיקים
טמפרטורת עמודה: 70 ° c
עוצמת הזרקה: 5 מיקרומטר
קצב זרימה: 0.800 mL/min
שלב נייד: ממיס A: 0.1% חומצה פורמית במים
ממיס ב: 0.1% חומצה פורמית ב-ACN
תוכנית מעבר צבע:
זמן (מזערי): 0 0.25 2.25 2.26 3.4 3.41 4.75
B 40 40 55 100 100 40 40
מחטים לשטוף: ACN, 3 s
מקור MS/MS: ESI (מצב שלילי)
טמפרטורת הדלק: 300 ° c
זרימת גז: 5 L/דקות
שאף 45 psi
קפילר -4000 V
מתח החרירים: -500 V
גז נדן טמפרטורה: 250 ° c
נדן זרימת גז: 7 L/דקות
מעברי MRM:
אנליטה יון קודמן (ז/ז) מוצר יון (ז/ז) * פרגמנטורה (נ) התנגשות אנרגיה (V) זמן להתעכב (אלפיות שאני) מקטע זמן
Me-IPA 556.6 428.7 74 12 60 2
126.9 65 60
126.8 61 60
Et-IPA 570.7 442.7 87 16 60
מקטעי זמן:
קטע התחלה (דקות) סוף (דקות) סוג וביל עומס דלתא EMV קוטביות נתונים מאוחסנים
1 0 0.6 סריקה MS2 לבזבז 0 שלילי לא
2 0.6 2 MRM ל-MS -100 שלילי כן
3 2 4.75 סריקת MS2 לבזבז 0 חיובי לא
* מעברים כמתים מודגשים.

טבלה 5: פרמטרים מבוססי LC-ms/MS. יוני מוצר כימות מודגשים.

יעד נצפו אחוז
זהה יום me-IPA me-IPA שחזור
קוו-1 1 0 ND N/A
קוו-2 1 0 ND N/A
קוו-11 2 0 ND N/A
קוו-12 2 0 ND N/A
קוו-21 3 0 ND N/A
קוו-22 3 0 ND N/A
קוו-31 4 0 ND N/A
קוו-32 4 0 ND N/A
קוו-3 מיכל 5 0 ND N/A
קוו-4 מיכל 5 0 ND N/A
קוו-13 1 1.25 1.26 101% Ave (10) = 102%
קוו-14 1 1.25 1.23 98.40% SD = 3.50%
קוו-23 2 1.25 1.26 101% % RSD = 3.40%
קוו-24 2 1.25 1.28 102%
קוו-33 3 1.29 1.3 101%
קוו-34 3 1.29 1.25 96.90%
קוו-5 4 1.29 1.37 106%
קוו-6 4 1.29 1.41 109%
קוו-15 מיכל 5 1.29 1.3 101%
קוו-16 מיכל 5 1.29 1.34 104%
קוו-25 1 30.1 30.2 100% Ave (10) = 103%
קוו-26 1 30.1 31.2 104% SD = 1.80%
קוו-35 2 30.1 31.1 103% % RSD = 1.70%
קוו-36 2 30.1 31.1 103%
קוו-7 3 31 31.6 102%
קוו-8 3 31 31.4 101%
קוו-17 4 31 32.5 105%
קוו-18 4 31 32.8 106%
קוו-27 מיכל 5 31 31.7 102%
קוו-28 מיכל 5 31 32.1 104%
קוו-37 1 80.2 77.8 97.00% Ave (10) = 101%
קוו-38 1 80.2 78.9 98.40% SD = 2.30%
קוו-9 2 80.2 81.8 102% % RSD = 2.30%
קוו-10 2 80.2 79.8 99.50%
קוו-19 3 82.7 83.5 101%
קוו-20 3 82.7 84 102%
קוו-29 4 82.7 84.7 102%
קוו-30 4 82.7 87.2 105%
קוו-39 מיכל 5 82.7 83 100%
קוו-40 מיכל 5 82.7 84.1 102%

שולחן 6: תוצאות QC עבור me-IPA סרום נמייה (μg/mL).

היעד et-IPA (μg/mL) N ממוצע (%) SD (%) % RSD
0 21
1.3 12 103 4.5 4.3
13 9 91.7 1.4 1.5
32 12 106 2.4 2.3
85 12 105 5.8 5.6
170 9 106 1.1 1.1

שולחן 7: תוצאות QC עבור et-IPA סרום נמייה (μg/mL).

סוג פיתיון וריכוז הפיתיון אתיל IPA (μg/mL)
תקופת הזמן 0.4%-שלפוחית 1.0%-שלפוחית 0.14%-מטריקס פקד
ממוצע (SD) N ממוצע (SD) N ממוצע (SD) N ממוצע (SD) N
היום האפס ND מיכל 5 ND 4 ND 6 ND 3
היום הראשון 13.7 (10.9) 2 11.2 (10.4) 4 20.6 (17.3) 2 נה נה
יום 7 11.5 (6.3) 6 9.9 (9.6) 4 21.4 (10.9) 6 ND 3
. היום ה -14 10.2 (5.2) 6 5.7 (2.5) 3 17.8 (10.2) 6 ND 3
. היום ה -21 8.9 (4.1) 4 10.0 (9.5) 4 23.8 (5.3) 3 ND 2
היום ה28 8.5 (3.9) מיכל 5 11.1 (10.6) 3 17.7 (9.3) 4 ND 3
יום 35 17.0 (NA) 1 9.1 (9.0) 4 21.7 (9.3) 2 ND 1
יום 42 נה 0 8.4 (8.5) 4 16.5 (NA) 1 ND 2
יום 49 10.2 (5.8) 2 8.1 (8.4) 4 17.5 (4.7) 2 ND 2
יום 56 10.9 (5.4) 2 3.8 (1.1) 3 17.6 (6.1) 2 ND 2

שולחן 8: ממוצע (סטייה לעמוד [SD]) הריכוז סרום אתיל-IPA מסוג פיתיון. ND = לא זוהה, NA = אינו ישים.

ריכוז מינון ומתיל (μg/mL)
תקופת הזמן 0.04% 0.07% 0.14% פקד
ממוצע (SD) N ממוצע (SD) N ממוצע (SD) N ממוצע (SD) N
היום האפס ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4
היום הראשון 7.8 (7.1) 4 22.2 (9.2) 4 29.1 (16.0) 4 ND (NA) 4
יום 7 4.4 (4.8) 4 14.4 (4.6) 4 21.3 (12.0) 4 ND (NA) 4
. היום ה -14 5.7 (5.9) 4 12.0 (3.5) 4 19.6 (10.6) 4 ND (NA) 4
. היום ה -21 4.9 (4.5) 4 12.0 (0.8) 3 18.3 (9.9) 4 ND (NA) 4
היום ה28 5.4 (5.0) 4 9.8 (2.4) 4 16.4 (8.1) 4 ND (NA) 4

טבלה 9: ממוצע (SD) סרום מתיל-IPA הריכוז על ידי מינון. ND = לא זוהה, NA = אינו ישים. ריכוזי מתיל הIPA שולבו במטריקס הפיתיון החיצוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה LC-MS/MS שפותחה עבור המחקרים ניצל את הסלקטיביות של ניטור תגובה מרובה כדי לכמת את me-IPA ו-et-IPA בסרום נמייה. הסלקטיביות של זיהוי MS/MS מותר גם עבור פרוטוקול ניקוי פשוט להסתמך רק על acetonitrile כדי לזרז חלבונים מסרום לפני ניתוח.

החומצות הפוקסיאיות מסיסים ב-ACN אך הן כמעט לא מסיסות במים. כדי לא לכלול את המים מן החילוץ ACN, נתרן כלוריד נוספה כוח מים צלולים: הפרדת הפאזה ACN על ידי הגברת החוזק היונית של השלב (סרום) מימית. החומצה הנדיף trifluoracetic חומצה (TFA) נוספה גם כדי להבטיח כי חומצות מורן היו protonated במהלך החילוץ יהיה יותר בקלות מסיסות בשלב ACN. TFA מוסרת במהלך התהליך היבש לפני ניתוח LC-MS/MS.

דם שואבת מנמייה היו בערך 1 מ ל, מניב 0.5 mL או פחות של סרה. כדי לבצע ניתוחים שכפול של כל מדגם, הליך הכנה לדוגמה מיקרו בקנה מידה נדרש כי השתמשו בצינורות מיקרוצנטריפוגה במקום בכלי זכוכית מעבדה אנליטית כגון מחלקה A ומבחנות נפחי. כדי להשיג תוצאות מדויקות ומדויקות יש צורך כי אנליסטים להיות מיומנים בשימוש של מזרקים מיקרוליטר זכוכית והזחה חיובית לחזור על צינורות עם טיפים בגודל מיקרוליטר.

מגבלה של שיטה זו היא כי הוא דורש יקר מיכשור LC-MS/MS ואנליסטים מאומנים בשימוש ותחזוקה. עם זאת, מכיוון שאני-IPA ו-et-IPA נפתרות בסיס באמצעות התנאים המתוארים כמתואר, השיטה יכולה להיות מותאמת ל-LCMS בעל ארבעה בלבד או מבחנות עם גלאי UV בתנאי שלא נצפו הפרעות.

ההבדל בין ריכוזי הנסיוב הממוצע בין מונגוז שצרכו פיתיונות עם et-IPA ב pack שלפוחית מטריצה הפיתיון במינון 2.8 mg מציע התעלה כאשר הסמן מכיל את חבילת שלפוחית, ולא שולבו לתוך מטריצה הפיתיון. זה יכול להיות השלכות על המטרה של הערכת החיסון לעומת ספיגת הפיתיון. לדוגמה, שילוב הסמן לתוך מטריצה הפיתיון החיצוני עשוי לנפח את הערכה של כיסוי החיסון אם החיה אוכלת את המטריצה אבל החיסון נשפך. עם זאת, הגבלות רגולטוריות עשוי למנוע את היכולת ערבוב של סמן ביולוגי ישירות עם חיסון בתוך חבילת שלפוחית. במקרים שבהם נרשמה < 100%, שלושה מקרים היו עם המכיל את ה-et-IPA באריזת השלפוחית, שניים מהם היו הריכוז הגבוה ביותר של אחוז. זה מרמז על שנאת טעם פוטנציאלית כאשר et-IPA הוא בריכוזים גבוהים. כאשר פיתיונות המכיל 1% (20.0 mg) et-IPA שולבו מטריצה הפיתיון הוצעו mongooses, כל החיות דחו את הפיתיון.

ריכוזי IPA ממוצע עבור et-ו-IPA ביום 14 היו כ 17 ו 19 μg/mL, בהתאמה. מחקר דומה שבוצע במכון המחקר והדרום, סיודאד ריאל, ספרד, באמצעות בוטיל ו פנטקסיל-IPA נמצאו יום 14 ריכוזי של כ 45 ו 10 μg/mL ב נמייה סרה כאשר נמסר באותו ריכוז ופיתיון ניסוח כמו במחקר שלנו. הבדלים אלה מצביעים על כך שנגזרים שונים של IPA עשוי להיות מטבוליזם בשיעורים שונים ב-mongooses, אשר יכול להיות שימושי כאשר החזקת סמן (או שמירה קצרה או ארוכת טווח) היא דאגה.

הבדלים בפיזיולוגיה של מערכת העיכול עשויים להשפיע על ספיגת והוצאת IPA במינים שונים. ביטול הפלזמה מחצית החיים של IPA בחתולים ביתיים (Felis catus) כאשר נמסר ב 1.5 מ"ג/ק"ג היה 107 ימים בעוד שיעור של אופוסומים במכחול באותה שיעור מינון היה בערך יום אחד28. כאשר IPA ניתנה העזים הביתית (קפרה אגינה הירקוס) בשיעור מינון של 1.5 מ"ג/ק"ג חיסול מסוף מחצית החיים של IPA היה 81 ימים, למרות החוקרים המשיכו למצוא ריכוזי יוד מוגבה עד 160 ימים לאחר המינהל 39. מערכת העיכול של חברי ודומיתיים (המשפחה שאליה הוקצו מונגוז בעבר40) מתוארת כדומה לזו של החתול המקומי41, אשר עשוי להסביר את זמן ההחזקה של IPA ב מונגוז. המחקר מציע גם IPA עשוי להיות מטבוליזם שונה בחיות כיס, המאפשר הפרשה מהירה יותר מאשר מינים eutherian29.

שני נגזרים של IPA העריכו במחקר זה סיפק לטווח ארוך (4-8 שבועות) לסימון יכולת במונגוסס. השימוש ב-IPA כסמן ביולוגי ב-מונגוז צריך לקחת בחשבון את יעדי המחקר ואת המשך הרצוי של סימון. במקרים שבהם יש לסמן בעלי חיים מאותם אתרי לימוד במהלך תקופות זמן רצופות, ניתן להשתמש בנגזרים שונים של IPA כדי להבטיח שהתוצאות של אחד מאירועי הסימון לא יהיו מבוצרות על-ידי סימון במהלך האירועים הקודמים. במסגרת ORV מבצעית עבור חיות בר בארה ב, דגימת מינים היעד ובדיקות לנוכחות של RVNA ו ביואריקר מתנהל בדרך כלל 4-6 שבועות לאחר הפצת ORV42. מנקודת מבט מעשית, הוא מופיע et-או me-IPA ניתן להבחין בקלות בתקופה זו. מחקר עתידי כדי להעריך את הפונקציה ריקבון שאריות ב מונגוז הציעו ריכוזים שונים של שני congeners של IPA העריך במחקר זה יהיה שימושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מחברים AV ו-SO הם עובדים במשרה מלאה של יצרן החיסון בעל פה לכלבת.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר הפנים של מחלקת החקלאות של ארה ב, בעלי חיים ובריאות הצמח שירות, שירותי חיות הבר, התוכנית לניהול כלבת לאומי IDT ביולוגיקה (Dessau-Rosslau, גרמניה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
  2. Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
  3. Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
  4. Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
  5. Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
  6. Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
  7. Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
  8. Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
  9. Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
  10. Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
  11. Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
  12. de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
  13. Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
  14. Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
  15. Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
  16. Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
  17. Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
  18. Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
  19. Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
  20. Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
  21. Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  22. Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. Shumake, S. A., Bullard, R. W. , American Society for Testing and Materials. Philadelphia. 5th Volume. STP 974 141-147 (1987).
  23. Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
  24. Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
  25. Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
  26. Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
  27. Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
  28. Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
  29. Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
  30. Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
  31. Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
  32. Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
  33. Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
  34. Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
  35. Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
  36. Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
  37. Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
  38. Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
  39. Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
  40. Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. Mongooses: their natural history. , Oliver and Boyd. Edinburgh and London. (1967).
  41. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
  42. National Rabies Management Program (NRMP). Oral rabies vaccination draft operations manual. , USDA APHIS Wildlife Services. (2009).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 147 מרקר ביולוגי הרפס אורופטאוס חומצה מיוקסימית כלבת נמייה הודית קטנה LC-MS/ms
ניתוח של חומצה והידרוקסימית מקבילים בנמייה הודית קטנה (<em>הרבלס</em>) סרה לשימוש בתור חיסון בעל פה כלבת מרקר ביולוגי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T.,… More

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter