Summary
バイオマーカーとしてエチルまたはメチルイオフェノシン酸を用いた捕虜マングースプラセボ経口狂犬病ワクチンを提供し、タンデム質量分析法(LC-MS/MS)法を用いた新規液体クロマトグラフィーを用いた餌取り込みを検証した。
Abstract
小さなインドのマングース(ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)は、プエルトリコの狂犬病ウイルス(RABV)の貯水池であり、毎年報告される動物狂犬病症例の70%以上を占めています。野生動物貯水池におけるRABV循環の制御は、通常、口腔狂犬病ワクチン接種(ORV)の戦略によって達成される。現在、プエルトリコには野生動物ORVプログラムは存在しません。口腔狂犬病ワクチンやマングースの各種餌型の研究が有望な結果で行われました。ORVの成功のモニタリングは、標的種による餌摂取の推定に依存しており、これは通常、RABV中和抗体(RVNA)後のワクチン接種後の変化を評価することを含む。この戦略は、アクティブな野生生物ORVプログラムを有する地域、またはRABVが活性化し、RVNAのバックグラウンドレベルが貯水池種に存在する地域では解釈が困難な場合があります。このような状況では、ワクチンまたは餌マトリックスに組み込まれたバイオマーカーが有用であり得る。エチル-イオフェノク酸(et-IPA)を含む16個の捕虜マングースプラセボORV餌を、餌の中に0.4%と1%、外餌マトリックスで0.14%の濃度で提供しました。また、メチル-イオフェノク酸(me-IPA)を含む12個の捕虜マングースORV餌を、外部餌マトリックスに0.035%、0.07%、0.14%の濃度で提供しました。餌の提供の前に血清サンプルを収集し、その後、最大8週間のポストオファリングのために毎週。セラからイオフェノキ酸をアセトニトリルに抽出し、液体クロマトグラフィー/質量分析法を用いて定量した。液体クロマトグラフィー質量分析により、et-IPAまたはme-IPAのセラを分析した。et-IPAとme-IPAに対して、少なくとも8週間と4週間は適切なマーキング能力を見出した。いずれのIPA誘導体も、マングースにおけるORV餌取り込みのフィールド評価に適している可能性がある。マングースセラのマーカーの寿命が長いため、連続した評価中に同じIPA誘導体を使用して結果を混乱させないように注意する必要があります。
Introduction
狂犬病ウイルス(RABV)は、負の感覚一本鎖リサウイルスであり、カルニヴォラとチロプテラの順序内の多様な野生生物貯水池種の間で循環する。マングースの複数の種はRABVの貯水池であり、小さなインドのマングース(ヘルペステス・オーロプンクタトゥス)は、西半球のプエルトリコと他のカリブ海の島々で唯一の貯水池です 1,2,3.野生動物貯水池におけるRABV循環の制御は、通常、口腔狂犬病ワクチン接種(ORV)の戦略を通じて達成される。米国(米国)では、この管理活動はUSDA/APHIS/野生生物サービス国家狂犬病管理プログラム(NRMP)4によって調整されています。現在、プエルトリコには野生動物ORVプログラムは存在しません。狂犬病ワクチンとマングースの様々な餌の種類に関する研究は、マングースのためのORVプログラムが可能であることを示唆する有望な結果で行われてきました 5,6,7,8.
ORVの影響を監視することは、標的種による餌摂取の推定に依存し、これは通常、RV抗体血清の変化を評価することを含む。しかし、この戦略は、活性野生生物ORVプログラムを有する地域、またはRVが活性化し、RABV中和抗体(RVNA)のバックグラウンドレベルが貯蔵所種に存在する地域において困難である可能性がある。このような状況では、餌または外部餌マトリックスに含まれるバイオマーカーが有用であり得る。
様々な生物学的マーカーは、アライグマ(プロシオンローター)9、10、ストット(ムステラエルミン)11、12、ヨーロッパのバッジ()を含む多数の種の餌の取り込みを監視するために使用されています。メレスメレス)13、イノシシ(Ssscroofa)14,小さなインドのマングース15と草原の犬 (シノミスルドビシアヌス)16,17, とりわけ.米国では、オペレーショナルORV餌は、餌の取り込み18、19を監視するために餌マトリックスに1%テトラサイクリンバイオマーカーを含むことが多い。しかし、テトラサイクリンの使用に対する欠点は、環境への抗生物質の分布に対する懸念の高まりと、テトラサイクリンの検出は典型的に侵襲的であり、骨を得るために動物の歯の抽出または破壊を必要とする。サンプル20.ローダミンBは、種々の組織におけるマーカーとして評価されており、毛髪及びウィスカー10、21における紫外線(UV)光および蛍光を用いて検出することができる。
イオフェノキ酸(IPA)は、コヨーテ(Canislatrans)22、北極キツネ(ヴァルペス・ラゴプス)23、赤キツネ(ヴァルペス・ヴァルペス)24、アライグマの餌消費量を評価するために使用されている白色の結晶性粉末です。9,25、イノシシ14、赤鹿(セルヴス・エラフス・スコティカス)26、ヨーロッパのバッジ12およびフェレット(M.フロ)27、他のいくつかの哺乳類種の中で。IPAの保持時間は、一部のマーシャル28、29、無秩序26で少なくとも26週間、家畜犬で52週間以上(Canis lupus familiaris)30で2週間未満の種によって異なる。保持時間はまた、用量依存性31であってもよい。イオフェノキ酸は血清アルブミンに強く結合し、血中ヨウ素レベル32を測定することによって歴史的に検出された。この間接的アプローチは、UV検出33でイオフェノキ酸濃度を直接測定する高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)法に取って代わられ、最終的には液体クロマトグラフィーおよび質量分析(LCMS)を用いた。34、35。本研究では、多重反応モニタリング(MRM)を利用してイオフェノク酸の2つの類似体を定量化する、アンデム質量分析法(LC-MS/MS)法を用いた高感度かつ選択的液体クロマトグラフィーを開発した。私たちの目的は、このLC-MS/MS法を使用して、2-(3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨードベンジル)プロパニン酸(メチル-IPAまたはme-IPA)および2-(3-ヒドロキシ-2,4,6-トリリオドベンジル)ブタノイン酸(エチル-IPAまたはOR-IPA)およびAl-IPAのマーキング能力を評価することにした。捕獲マングースに餌。
マングースは、市販のスモークソーセージと魚油で餌付けされたケージトラップで捕獲されました。マングースは、個々の60 cm x 60 cm x 40 cmステンレス鋼ケージに収容され、約50gの市販の乾燥キャットフードの毎日の配給を供給し、市販の鶏もも肉で週2回補充した。水はアドリビタムを利用できました。我々は、IPAの2つの誘導体、エチル-IPAおよびメチル-IPAをプラセボORV餌で捕獲マングースに送達した。すべての餌は、粉末状の鶏卵とゼラチン(材料の表)を含む外部コーティング(以下「餌マトリックス」)を含む28mm x 20mm x 9mm箔ブリスターパックで構成されました。餌は0.7mLの水またはIPA誘導体を含み、約3gの重量を量り、そのうち約2gは外部餌マトリックスであった。
我々は3つの濃度で16捕獲マングースet-IPAを提供しました: 0.14% (2.8 mg et-IPA〜2g餌マトリックス; 3 オス [m],3 メス [f]], 0.4% (0.7 mL ブリスターパック体積で 2.8 mg et-IPA; 3m, 3f), 1.0% (0.7 mL ブリスターパック体積で 7.0 mg エチル-IPA; 2m)、2f)。2.8 mgの全体的な用量は5 mg/kg 27,36の用量率に対応し、プエルトリコで560gの平均マングース重量に基づいています。我々は、研究がいくつかのバイオマーカーに対する味の嫌悪感が一部の種で発生する可能性があることを示唆しているように、最高濃度として1%を選択しました >1%は、いくつかの種37で発生する可能性があります。我々は、凝集が十分に溶媒に溶解するのを防ぎ、餌マトリックスに均等に組み込まれるのを防ぐため、ブリスターパック内の1%の用量のみを提供した。1つの対照群(2m、1f)は、無菌水とIPAなしで満たされた餌を受け取った。私たちは、毎日のメンテナンス配給の間または前に午前中(〜午前8時)にマングースに餌を提供しました。餌の残骸は約24時間後に取り除かれた。治療前に血液サンプルを採取し、治療後1日、治療後8週間まで毎週採取した。我々は、イソムランガスの吸入によってマングースを麻酔し、フェレット38について説明するように頭蓋静脈カバの静脈穿刺によって全血の1.0 mLまで集めた。全血サンプルを遠心分離し、血精膜を凍結物に移し、分析するまで-80°Cで保存した。すべての動物が、繰り返し発生する血液が動物の健康に与える影響を最小限に抑えるために、すべての期間中にサンプリングされたわけではありません。対照動物を0日目にサンプリングし、その後毎週最大8週間の治療後にサンプリングした。
私たちは、0.035%(0.7mg)、0.07%(1.4mg)、0.14%(2.8mg)の3つの濃度でme-IPAを送達し、いずれも餌マトリックスに組み込まれ、治療群当たり2人の男性と2人の女性を含む。2人の男性と2人の女性は、無菌の水で満たされた餌を受け取り、IPAはありません。餌提供時間とマングース麻酔は、上記で説明します。1日目に治療前に血液サンプルを採取し、治療後4週間まで毎週採取した。
異なる治療群の血清IPA濃度の正常性と推定手段について血清濃度データを試験した。我々は、線形混合モデルを使用して、個人間でプールされた平均血清et-IPA濃度を比較した。餌型(マトリックス/ブリスターパック)は実験日に加えて固定効果であったのに対し、動物IDはランダム効果であった。すべての手順は、共通の統計ソフトウェア(材料の表)を使用して実行され、有意性はα= 0.05で評価された。
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Protocol
すべての手順は、承認された研究プロトコルQA-2597の下でUSDA国立野生生物研究センターの機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。
注:以下のプロトコルは、マングース血清中のメチル-イオフェノシン酸を検出するための分析手順について説明する。この方法は、マングース血清中のエチル-イオフェノシン酸の分析から始まった反復プロセスの最終版である。エチル-イオフェノキ酸のマイナーな修飾の初期評価の間に方法に行われ、結果として以下に提示される最終プロトコルが得られた。代表的な結果には、両方の反復中に得られた結果が含まれます。
1. ソリューションと標準の準備
- 私-IPAとet-IPAを購入します。
- 移動相Aの場合は、1mLのギ酸と1Lの超純水(≥18 MΩ)を組み合わせて、1Lの0.1%(v/v)ギ酸を水中に調調します。移動相Bの場合は、1mLのギ酸とACNの1Lを組み合わせてアセトニトリル(ACN)に0.1%(v/v)ギ酸の1Lを調出します。
- 希釈剤の場合は、TFAの1mLとACNの200mLを組み合わせて、ACNで0.5%(v/v)のトリフルオロ酢酸(TFA)の200mLを調調します。
- 約1,000 μg/mLの濃度でACNにiPAおよびet-IPAの濃縮IPAストック溶液を調製する。
- マイクロバランスで約10mgのme-IPAを計量し、質量を±0.0001mgに記録し、45mL ACNを用いて10mLクラスA体積フラスコに測定量を移す。すべての固体を溶解し、ACNでボリュームに持って来るために1分を超音波。
- 各ストックの約8mLを、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)裏地キャップを持つアンバー8 mLガラスバイアルに移します。室温(RT)で保存します。残りの在庫を有害廃棄物に移します。
- 25x-7 me-IPAストック(表1)の場合は、ACNでme-IPAのストックを約200μg/mLで準備します。例:1,000 μLガラスシリンジを使用して、me-IPA濃縮ストックの1 mLをステップ1.4.2から5 mLクラスA容積フラスコに移します。ACNで体積に希釈します。PTFEラインキャップ付きの琥珀色の8mLガラスバイアルにストックを移します。RTで保存します。
- 表 1に記載されている 6 つの追加の 25x me-IPA 株式を準備します。各ストックについて、PTFEラインキャップと琥珀色の8mLアンバーガラスバイアルでリピートピペッタを使用して示されたボリュームを組み合わせます。RTで各在庫を保存します。
- 25x代理株式の場合は、ステップ1.4.2で調製した濃縮ストックから約10μg/mLでACNでme-IPAの代理在庫を準備します。濃縮されたme-IPAストックの0.100mLを10mLクラスA体積フラスコに100μLガラスシリンジを使用して移し、ACNで体積に希釈します。
- PTFEラインキャップ付きの琥珀色の8mLガラスバイアルに~8mLを移します。RTで保管し、残りの在庫を有害廃棄物に移します。
- 表2に記載されているように、2 mLスクリュートップガラスオートサンプラーバイアルに両方の検解物を含む4xストックを準備する。
- 例えば、ストック4x-7を調製するには、2mLのバイアルに、0.5 mL容量先端を持つリピートピペッタを使用してステップ1.5から25x-7 me-IPAストックの0.20 mLを追加します。0.5 mL容量チップを持つリピートピペッタを使用して、ステップ1.7から25xサロゲートet-IPAストックの0.20 mLを追加します。
- 1 mL容量先端を持つリピートピペッタを使用してACNの0.85 mLを追加します。バイアルをしっかりとキャップし、5xを反転して混ぜます。
- 表 3に示すように、2 mL スクリュートップ オートサンプラーバイアルに標準カーブを準備します。
- たとえば、標準 7 (Std 7) を 2 mL バイアルに調製するには、0.5 mL の容量チップを持つリピート ピペッタを使用して、ステップ 1.8.2 から 4x-7 ストックの 0.20 mL を追加します。1 mL容量チップを持つリピートピペッタを使用して、0.60 mLの超純DI水を追加します。バイアルをしっかりとキャップし、5xを反転して混ぜます。
2. サンプル調製
注意:この手順を実行する担当者は、狂犬病の一連の暴露前予防を受け、連邦労働衛生指定医療施設から0.5 IU以上の文書化された狂犬病抗体のチターを持っている必要があります。担当者は、抽出を実行しながら、常にラボコートと目の保護を着用する必要があります。注意: クラス II バイオセーフティ キャビネットで手順 2.3−2.6 を実行します。
- 各サンプルについて、NaCl.80位置のプラスチックラックにチューブを配置し、200-300 mgを含む1.5 mLマイクロ遠心管を準備します。ステップ 2.6 で使用するために取っておきます。
注:マイクロスクープ(またはその他の小型測定装置)は、多数のサンプルに推奨されます。 - 各サンプルについて、2本の1.5mLマイクロ遠心分離管にラベルを付けます:1つは「A」、もう1つは「B」です。チューブを80桁のプラスチックラックに配置します。
- 血清抽出に必要な次の材料と機器をクラスIIバイオセーフティキャビネットに配置する:ステップ2.1および2.2で調製されたマイクロ遠心管(ラック内)、渦ミキサー、0.5 mLおよび5 mL容量の先端、100−1,000 μLの空気変位を繰り返すピピッタ1,000 μLの先端が付いているピペット、希釈剤および超pure DI水のそれぞれ約100 mLの容器およびバイオハザードの廃棄物の容器。
- 凍結保存から血清サンプルを取り出し、バイオセーフティキャビネット内のRTに温めます。渦はサンプリングの前に各血清サンプルを混合する。
- 0.5 mL容量先端のリピートピペッタを使用して、マングース血清の0.050 mLをチューブ「A」に分配し、25倍の代理ストックの0.050 mLを追加します。次に、5 mL容量チップを持つリピートピペッタを使用してチューブ「A」に希釈剤の0.950 mLを追加します。しっかりとキャップし、10−15秒の渦ミックス。
- ステップ2.1からチューブ「A」に予備のNaClを分配し、8−12秒の渦ミックス3xを70%(v/v)イソプロパノールを使用してチューブ「A」を含むバイアルラックの外側の表面を拭き取ります。
注:サンプルのラックは、クラスIIバイオセーフティキャビネットから取り外しできます。 - 遠心管「A」は12,000 x gで1分間、水性相とACN相を分離する。100−1,000 μL空気変位ピペットを使用してチューブ「B」に上部ACN相のピペット0.80 mL。チューブ「A」の残りの溶液を有害廃棄物に移し、空のチューブを生体有害廃棄物容器に捨てます。
- 45°Cの水浴でN2ガスの穏やかな流れで管「B」からACNおよびTFAを取り除きます。
- 繰り返しピペットを使用してチューブ「B」にACNの0.250 mLを追加し、4−5秒の渦ミックスを使用し、12,000 x gで短心分離機(2−4秒)を使用してチューブの底部に液体を集めます。
- 5 mL容量先端のリピートピペッタを使用してチューブ「B」に0.750 mLの超純物DI水を加え、4-5sの渦ミックスを使用し、12,000 x gで1分間遠心分離機を使用してサンプルを明らかにします。
- 1,000 μL空気変位ピペットを使用して、上清の0.75 mLをオートサンプラーバイアルに移します。バイオハザード廃棄物容器にピペットの先端を廃棄します。
- キャップオートサンプラーバイアルを安全にキャップし、LC-MS/MS(セクション4)で分析します。チューブ「B」の残りの溶液を有害廃棄物に移し、空のチューブを生体有害廃棄物容器に捨てます。オートクレーブまたは焼却により、すべての生体有害廃棄物を処分します。
3. 品質管理サンプル
注意: セクション 2 に記載されている注意事項に従ってください。
注:次の手順では、解析に必要な品質管理 (QC) サンプルの最小数について説明します。十分な制御マングース血清が利用可能な場合は、各レベルでの反復が推奨されます。
- NaClの200−300 mgを含む4つの1.5 mLマイクロ遠心分離管を準備する。チューブを80桁のプラスチックラックに配置します。
- QC サンプルごとに、2 つの 1.5 mL マイクロ遠心分離管にラベルを付けます: 1 つは "A" で、もう 1 つは "B" とラベル付けします。チューブを80桁のプラスチックラックに配置します。
- 手順 2.3 を繰り返します。
- 冷凍貯蔵からコントロールマングース血清を取り除き、バイオセーフティキャビネット内のRTに暖めます。渦はサンプリングの前に対照血清を混合する。
- 0.050 mLのコントロールマングース血清を0.5mL容量先端のリピートピペッタを使用して4本の1.5mL「A」チューブに分配します。
- 表 4で指定した 4 つの QC サンプルのそれぞれを、0.5 mL 容量の先端を持つリピート ピペッタを使用して増強します。各QCサンプルをしっかりとキャップし、10−15秒の渦ミックスを使用します。
- 手順 2.6−2.12に記載されているように、抽出手順を実行します。
4. LC-MS/MS解析
- 表 5に記載されているすべてのパラメーターを使用して LC-MS/MS を設定します。LC-MS/MSの電源を入れ、流量を0.800 mL/minに設定する前にカラムが70°Cに達するようにします。
- 品質管理サンプルと未知のサンプルで構成される各バッチの前後に標準曲線を注入するデータ集録ソフトウェア (材料の表)でシーケンスを設定します。
- すべての規格とサンプルを注入し、表5に記載されているパラメータを使用してMRMイオンクロマトグラムを取得します。
- シーケンス完了後、LC-MS/MSをオフにし、すべてのオートサンプラーバイアルを有害廃棄物として廃棄します。
5. 定量化
- データ解析ソフトウェアを使用して、内部標準として et-IPA を使用して me-IPA の相対応答のキャリブレーション曲線を生成します。i-IPA (556.6 → 428.7) の定量化子 MRM 遷移からの相対応答を、et-IPA (570.7 → 442.7) の MRM 遷移で割った値を計算します。1/x の重み付けされ、原点を無視する 2 次二次関数を使用して、7 レベルのキャリブレーション カーブを作成します。
- 次の式を用いてme-IPAの血清濃度(C血清)を計算します。
ここで、c計測器はμg/mL単位の較正曲線から計測器によって決定される濃度であり、1.25は希釈係数
であり、V最終は最終サンプル体積(1.0mL)であり、V血清はmL(mL)の血清容積である(0.050 mL 公称)。
であり、V最終は最終サンプル体積(1.0mL)であり、V血清はmL(mL)の血清容積である(0.050 mL 公称)。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
me-IPA分析からの代表的なイオンクロマトグラムを図1に示す。対照マングース血清(図1A)は、et-IPA(サロゲートアナリテ)の保持時間および示された保持時間におけるme-IPAの不在を示す。品質管理サンプル(図1B)は、et-IPAからのme-IPAのベースライン分離と、me-IPAの定量子および修飾子遷移を示しています。図1Cは、33.5 μg/mL me-IPAの観察された血清濃度を有する研究からの代表的なサンプルを示す。
me-IPA 解析の代表的なキャリブレーション曲線を図 2に示します。7 レベルの 14 ポイントの標準曲線の範囲は 0.00202 ~ 8.27 μg/mL me-IPAで、相関係数 (r 2) は 0.9998 です。相関係数は、5つのme-IPA分析で0.9998から0.99997の範囲であった。サロゲートアナライトet-IPA濃度は、すべての規格で0.502 μg/mLであった。
表6は、0、1.3、31、および82 μg/mL me-IPA(各レベルでn =10)で強化された制御マングース血清の精度と精度の結果を示しています。結果は5つの別々の分析から集められた。回収率は96.9%から109%の範囲であった。3つの要塞レベルの相対標準偏差(%RSD)の割合は、それぞれ3.4%、1.7%、および2.3%であった。
品質管理サンプルで観察された信号対雑音比(S/N)(n = 10陰性コントロール、n = 1.3 μg/mL me-IPA)を使用して検出限界(DL; 3 x S/N)と定量限界(QL; 10 x S/N)を決定しました。マングース血清におけるme-IPAのDLおよびQLはそれぞれ0.012 μg/mLおよび0.042 μg/mLであった。
修飾子MRM遷移のピーク領域応答を定量化MRM遷移で割った(
すべての標準およびサンプルについて計算した。次いで、各サンプルに対するこの比率を、較正基準で観察された平均比で割り、修飾子パーセントの一致を決定した。図 1Cに示すサンプルの修飾子比率は 0.439 で、一致率は 96.3% でした。
et-IPAサロゲート分析体の回収は、キャリブレーション基準で観察された平均et-IPAピーク面積応答でet-IPAピーク領域応答を除算することにより、すべてのQCサンプルおよび未知サンプルについて計算された。平均サロゲート検骨回収率は91.0%(陰性対照)、91.4%(1.3μg/mL)、92.8%(31μg/mL)、95.4%(82μg/mL)であった。
コントロールマングース血清では、i-IPAの定量子または修飾遷移の干渉ピークは認められなかった(図1A)。
マングース血清(図3および表7)でet-IPAを決定するために使用される抽出手順および器械条件は、me-IPA法と同一であったが、以下の変化を伴う。プロピル-イオフェノキ酸(pr-IPA)をサロゲート検光液として使用し、古くて感度の低いLC-MS/MSを用いた。源乾燥ガス温度は350°Cで、流量は12L/min、ネブライザー圧力は35psiであった。毛細血管電圧は-2,500Vであった。ソースにはシースガスやノズル電圧を調整する手段がありませんでした。et-IPAの定量化MRM遷移は570.7→442.8(pr-IPAの場合は584.7→456.8)であった。フラグメンターは80Vで、衝突エネルギーは両方の解答物で10Vであった。et-IPAの修飾子MRMは570.7 →126.8で、衝突エネルギーは40Vであった。
et-IPAに対するすべてのマングース血清サンプルの試験は、8回にわたって行った。7レベルのキャリブレーション曲線は、0.00207から8.48 μg/mLの相関係数(r2)の範囲で0.9990から0.9999まで及びます。サロゲートアナリテpr-IPA濃度は0.512 μg/mLであった。表 7は、0、1.3、13、32、85、および 170 μg/mL me-IPA で強化された制御マングース血清の精度と精度の結果を示しています。結果は8つの別々の分析から集められた。回復率は89.5%から115%の範囲であった。5つの要塞レベルのRSDの%はそれぞれ4.3%、1.5%、2.3%、5.6%、1.1%であった。品質管理サンプルで観察されたS/N(n = 21陰性対照、n = 21 1.3 μg/mL me-IPA)を使用してDLおよびQLを決定した。マングース血清におけるme-IPAのDLおよびQLはそれぞれ0.12 μg/mLおよび0.42 μg/mLであった。品質管理サンプルからの平均サロゲート分析体回収率は86.8%であった(n= 75)。コントロールマングース血清では、et-IPAの定量子または修飾遷移の干渉ピークは認められなかった。
すべてのマングースは、24時間の時間制約内で餌の≥25%を消費し、そのセラでet-IPAの定量化可能なレベルを持っていたet-IPAを提供しました(表8)。混合モデル分析から、全体的な平均血清IPA濃度は、ブリスターパック(9.8 μg/mL、95%CI 4.0μg/mL、95%CI 4-0μmL)と比較して、餌マトリックス中のバイオマーカーの2.8mg(17.5 μg/mL、95%CI 11.3 μg/mL)からわずかに高かった(、P = 0.07)。両方の餌の種類の濃度は、実験日で減衰した(β = -0.15 ± 0.04、F = 14.4、P = 0.0005)。血清IPA濃度における個々のレベル変動が認められた(動物ID共分散パラメータ推定= 46.6±20.7)。すべてのマングースは、空のホイルブリスターパックだけが残っているコントロール餌の100%を消費しました。血清中のet-IPA残渣の平均濃度は期間によって変動し、時間の経過とともに一貫して減少するようには見えなかった(図3)。
すべてのマングースは、24時間の制限時間内に餌の≥25%を消費し、そのセラでme-IPAの定量化可能なレベルを持っていた私-IPA餌を提供しました(表9)。マングース血清におけるet-およびme-IPAの血清濃度は、餌中のIPAの濃度に依存して現れた。餌中のIPAの高濃度は、全体的な用量(et-IPAの場合は2.8mg)が同じままであった場合でも、より高い血清残渣をもたらした。興味深いことに、me-IPAは1日目の最初のスパイクで時間の経過とともにより均一な劣化パターンを生み出し、その後、濃度が高原に現れた14日目まで着実に減少した(図4)。
図 1:代表的なイオンクロマトグラム。(A)代表的なMRMイオンクロマトグラムのコントロールマングース血清をサロゲート検体エチル-イオフェノキ酸(et-IPA)で強化した。矢印は、メチル-イオフェノキ酸(me-IPA)の保持時間を示す。(B)代表的なMRMイオンクロマトグラムの対照マングース血清を31μg/mL me-IPAで強化した。me-IPA の量量 (クォント) および修飾子 (Qual) 遷移の相対強度が示されます。(C) 33.5 μg/mLの観察されたme-IPA濃度を有するマングース血清試料の代表的なMRMイオンクロマトグラム。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:代表的なキャリブレーション曲線。メチル-イオフェノク酸(me-IPA)のデータ解析ソフトウェアによって生成されたオリジナルの較正曲線。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:平均血清エチルIPA(et-IPA)の餌の種類と経度の経過に伴う濃度による濃度。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:経時の餌濃度による血清メチルIPA(me-IPA)濃度を平均する。すべてのme-IPA濃度を外部餌マトリックスに組み込んだ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| me-IPA濃度 (μg/mL) | ||
| Id | ||
| 25x-7 | 手順 1.6 を参照してください。 | 200年 |
| 25x-6 | 1.000 mL 25x-7 ストックと 3.000 mL ACN を組み合わせる | 50歳 |
| 25x-5 | 1.000 mL 25x-6 ストックと 3.000 mL ACN を組み合わせる | 13歳 |
| 25x-4 | 1.000 mL 25x-5 ストックと 3.000 mL ACN を組み合わせる | 3.1年 |
| 25x-3 | 1.000 mL 25x-4 ストックと 3.000 mL ACN を組み合わせる | 0.78円 |
| 25x-2 | 1.000 mL 25x-3 ストックと 3.000 mL ACN を組み合わせる | 0.2年 |
| 25x-1 | 1.000 mL 25x-2 ストックと 3.000 mL ACN を組み合わせる | 0.049 |
表1:ACN(8mLアンバーガラスバイアル)における25x me-IPA株の調製。
| 濃度 (μg/mL) | |||
| Id | ミー-IPA | et-IPA | |
| 4x-7 | 0.200 mL 25x-7 + 0.200 mL 25x サロゲート + 0.850 mL ACN | 32歳 | 1.6年 |
| 4x-6 | 0.200 mL 25x-6 + 0.200 mL 25x サロゲート + 0.850 mL ACN | 8 | 1.6年 |
| 4x-5 | 0.200 mL 25x-5 + 0.200 mL 25x サロゲート + 0.850 mL ACN | 2 | 1.6年 |
| 4x-4 | 0.200 mL 25x-4 + 0.200 mL 25x サロゲート + 0.850 mL ACN | 0.5年 | 1.6年 |
| 4x-3 | 0.200 mL 25x-3 + 0.200 mL 25x サロゲート + 0.850 mL ACN | 0.12分 | 1.6年 |
| 4x-2 | 0.200 mL 25x-2 + 0.200 mL 25x サロゲート + 0.850 mL ACN | 0.031 | 1.6年 |
| 4x-1 | 0.200 mL 25x-1 + 0.200 mL 25x サロゲート + 0.850 mL ACN | 0.008 | 1.6年 |
| 4x-0 | 0.200 mL 25x サロゲート + 1.050 mL ACN | 0 | 1.6年 |
表2:ACNにおける4x IPA株の調製(2mLオートサンプラーバイアル)。
| 濃度 (μg/mL) | |||
| Id | ミー-IPA | et-IPA | |
| Std 7 | 0.200 mL 4x-7 + 0.600 mL DI水 | 8 | 0.4年 |
| Std 6 | 0.200 mL 4x-6 + 0.600 mL DI水 | 2 | 0.4年 |
| Std 5 | 0.200 mL 4x-5 + 0.600 mL DI水 | 0.5年 | 0.4年 |
| Std 4 | 0.200 mL 4x-4 + 0.600 mL DI水 | 0.13 | 0.4年 |
| Std 3 | 0.200 mL 4x-3 + 0.600 mL DI水 | 0.03 | 0.4年 |
| Std 2 | 0.200 mL 4x-2 + 0.600 mL DI水 | 0.0078 | 0.4年 |
| Std 1 | 0.200 mL 4x-1 + 0.600 mL DI水 | 0.002 | 0.4年 |
| Std 0 | 0.200 mL 4x-0 + 0.600 mL DI水 | 0 | 0.4年 |
| 空白 | 0.200 mL ACN + 0.600 mL DI水 | 0 | 0 |
表3:75/25水/ACN(2mLオートサンプラーバイアル)におけるme-IPA規格の準備。
| 血清中濃度(μg/mL) | |||
| Id | ミー-IPA | et-IPA | |
| 負のコントロール | 0.050 mL 25x サロゲート + 0.950 mL 希釈剤 | 0 | 10歳 |
| 低要塞化 | 0.050 mL 25x サロゲート + 0.020 mL 25x-4 + 0.930 mL 希釈 | 1.2年 | 10歳 |
| ミッドフォーティフィケーション | 0.050 mL 25x サロゲート + 0.030 mL 25x-6 + 0.920 mL 希釈 | 30歳 | 10歳 |
| 高い要塞化 | 0.050 mL 25x サロゲート + 0.020 mL 25x-7 + 0.930 mL 希釈剤 | 80歳 | 10歳 |
表4:品質管理サンプル強化(1.5mLマイクロ遠心管で調製)。
| 液体クロマトグラフィー: | |||||||||||||||||||||
| 列： | C18、2.1 x 50 mm、2.5 μm の粒度 | ||||||||||||||||||||
| カラム温度: | 70 °C | ||||||||||||||||||||
| 射出音量: | 5 μL | ||||||||||||||||||||
| 流量： | 0.800 mL/分 | ||||||||||||||||||||
| モバイルフェーズ: | 溶剤A: | 0.1% 水中のギ酸 | |||||||||||||||||||
| 溶剤B: | ACN中のギ酸0.1% | ||||||||||||||||||||
| グラデーションプログラム: | |||||||||||||||||||||
| 時間(分): | 0 | 0.25分 | 2.25 | 2.26分 | 3.4年 | 3.41 | 4.75 | ||||||||||||||
| % B: | 40歳 | 40歳 | 55歳 | 100人 | 100人 | 40歳 | 40歳 | ||||||||||||||
| ニードルウォッシュ:ACN、3 s | |||||||||||||||||||||
| MS/MS ソース: ESI (負モード) | |||||||||||||||||||||
| ガス温度: | 300 °C | ||||||||||||||||||||
| ガスの流れ: | 5 L/分 | ||||||||||||||||||||
| 噴霧器： | 45 psi | ||||||||||||||||||||
| キャピラリー： | -4000 V | ||||||||||||||||||||
| ノズル電圧: | -500 V | ||||||||||||||||||||
| シースガス温度: | 250 °C | ||||||||||||||||||||
| シースガスの流れ: | 7 L/分 | ||||||||||||||||||||
| MRM 遷移: | |||||||||||||||||||||
| 検体 | 前駆体イオン (m/z) | 製品イオン (m/z) * | フラグメンター (V) | 衝突エネルギー(V) | ドウェルタイム (ミリ秒) | 時間セグメント | |||||||||||||||
| ミー-IPA | 556.6の | 428.7円 | 74歳 | 12歳 | 60歳 | 2 | |||||||||||||||
| 126.9年 | 65歳 | 60歳 | |||||||||||||||||||
| 126.8年 | 61歳 | 60歳 | |||||||||||||||||||
| エトイパ | 570.7の | 442.7年 | 87歳 | 16歳 | 60歳 | ||||||||||||||||
| 時間セグメント: | |||||||||||||||||||||
| セグメント | 開始 (分) | 終了 (分) | 型 | ダイバータ | デルタ EMV | 極性 | 保存されたデータ | ||||||||||||||
| 1 | 0 | 0.6年 | MS2 スキャン | 廃棄物へ | 0 | 負 | 違います | ||||||||||||||
| 2 | 0.6年 | 2 | Mrm | MS へ | -100 | 負 | うん | ||||||||||||||
| 3 | 2 | 4.75 | MS2 スキャン | 廃棄物へ | 0 | 正 | 違います | ||||||||||||||
| *量的遷移は太字です。 | |||||||||||||||||||||
表 5: LC-MS/MS パラメータ。量量化された製品イオンは太字です。
| ターゲット | 観察 | パーセント | ||||
| Id | 日 | ミー-IPA | ミー-IPA | 回復 | ||
| QC-1 | 1 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-2 | 1 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-11 | 2 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-12 | 2 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-21 | 3 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-22 | 3 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-31 | 4 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-32 | 4 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-3 | 5 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-4 | 5 | 0 | Nd | N/a | ||
| QC-13 | 1 | 1.25 | 1.26分 | 101パーセント | アベニュー (10) = | 102パーセント |
| QC-14 | 1 | 1.25 | 1.23 | 98.40パーセント | SD = | 3.50パーセント |
| QC-23 | 2 | 1.25 | 1.26分 | 101パーセント | % RSD = | 3.40パーセント |
| QC-24 | 2 | 1.25 | 1.28件 | 102パーセント | ||
| QC-33 | 3 | 1.29件 | 1.3年 | 101パーセント | ||
| QC-34 | 3 | 1.29件 | 1.25 | 96.90パーセント | ||
| QC-5 | 4 | 1.29件 | 1.37 | 106パーセント | ||
| QC-6 | 4 | 1.29件 | 1.41分 | 109パーセント | ||
| QC-15 | 5 | 1.29件 | 1.3年 | 101パーセント | ||
| QC-16 | 5 | 1.29件 | 1.34分 | 104パーセント | ||
| QC-25 | 1 | 30.1年 | 30.2歳 | 100パーセント | アベニュー (10) = | 103パーセント |
| QC-26 | 1 | 30.1年 | 31.2歳 | 104パーセント | SD = | 1.80パーセント |
| QC-35 | 2 | 30.1年 | 31.1年 | 103パーセント | % RSD = | 1.70パーセント |
| QC-36 | 2 | 30.1年 | 31.1年 | 103パーセント | ||
| QC-7 | 3 | 31歳 | 31.6歳 | 102パーセント | ||
| QC-8 | 3 | 31歳 | 31.4歳 | 101パーセント | ||
| QC-17 | 4 | 31歳 | 32.5歳 | 105パーセント | ||
| QC-18 | 4 | 31歳 | 32.8歳 | 106パーセント | ||
| QC-27 | 5 | 31歳 | 31.7歳 | 102パーセント | ||
| QC-28 | 5 | 31歳 | 32.1歳 | 104パーセント | ||
| QC-37 | 1 | 80.2歳 | 77.8歳 | 97.00パーセント | アベニュー (10) = | 101パーセント |
| QC-38 | 1 | 80.2歳 | 78.9歳 | 98.40パーセント | SD = | 2.30パーセント |
| QC-9 | 2 | 80.2歳 | 81.8歳 | 102パーセント | % RSD = | 2.30パーセント |
| QC-10 | 2 | 80.2歳 | 79.8歳 | 99.50パーセント | ||
| QC-19 | 3 | 82.7歳 | 83.5歳 | 101パーセント | ||
| QC-20 | 3 | 82.7歳 | 84歳 | 102パーセント | ||
| QC-29 | 4 | 82.7歳 | 84.7歳 | 102パーセント | ||
| QC-30 | 4 | 82.7歳 | 87.2歳 | 105パーセント | ||
| QC-39 | 5 | 82.7歳 | 83歳 | 100パーセント | ||
| QC-40 | 5 | 82.7歳 | 84.1歳 | 102パーセント |
表6:マングース血清(μg/mL)におけるme-IPAのQC結果。
| ターゲット et-IPA (μg/mL) | N | 平均 (%) | SD (%) | % RSD |
| 0 | 21歳 | |||
| 1.3年 | 12歳 | 103の | 4.5年 | 4.3年 |
| 13歳 | 9 | 91.7年 | 1.4年 | 1.5年 |
| 32歳 | 12歳 | 106の | 2.4年 | 2.3年 |
| 85名 | 12歳 | 105名 | 5.8件 | 5.6年 |
| 170人 | 9 | 106の | 1.1年 | 1.1年 |
表7:マングース血清中のet-IPA(μg/mL)のQC結果。
| 餌型およびエチルIPA餌濃度(μg/mL) | ||||||||
| 期間 | 0.4% - ブリスター | 1.0% - ブリスター | 0.14% - マトリックス | コントロール | ||||
| 平均値 (SD) | N | 平均値 (SD) | N | 平均値 (SD) | N | 平均値 (SD) | N | |
| 0 日目 | Nd | 5 | Nd | 4 | Nd | 6 | Nd | 3 |
| 1日目 | 13.7件(10.9年) | 2 | 11.2 (10.4) | 4 | 20.6(17.3) | 2 | Na | Na |
| 7日目 | 11.5(6.3) | 6 | 9.9件(9.6) | 4 | 21.4件(10.9件) | 6 | Nd | 3 |
| 14日目 | 10.2(5.2) | 6 | 5.7(2.5) | 3 | 17.8件(10.2年) | 6 | Nd | 3 |
| 21日目 | 8.9(4.1) | 4 | 10.0(9.5) | 4 | 23.8件(5.3) | 3 | Nd | 2 |
| 28日目 | 8.5件(3.9) | 5 | 11.1 (10.6) | 3 | 17.7件(9.3) | 4 | Nd | 3 |
| 35日目 | 17.0 (NA) | 1 | 9.1(9.0) | 4 | 21.7(9.3) | 2 | Nd | 1 |
| 42日目 | Na | 0 | 8.4件(8.5) | 4 | 16.5 (NA) | 1 | Nd | 2 |
| 49日目 | 10.2(5.8) | 2 | 8.1(8.4) | 4 | 17.5(4.7) | 2 | Nd | 2 |
| 56日目 | 10.9(5.4) | 2 | 3.8件(1.1) | 3 | 17.6(6.1) | 2 | Nd | 2 |
表8:餌型による平均(スタンド偏差[SD])エチル-IPA血清濃度。ND = 検出されず、NA = 適用できません。
| 用量およびメチルIPA濃度(μg/mL) | ||||||||
| 期間 | 0.04パーセント | 0.07パーセント | 0.14パーセント | コントロール | ||||
| 平均値 (SD) | N | 平均値 (SD) | N | 平均値 (SD) | N | 平均値 (SD) | N | |
| 0 日目 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 |
| 1日目 | 7.8件(7.1) | 4 | 22.2件(9.2) | 4 | 29.1(16.0) | 4 | ND (NA) | 4 |
| 7日目 | 4.4 (4.8) | 4 | 14.4(4.6) | 4 | 21.3(12.0) | 4 | ND (NA) | 4 |
| 14日目 | 5.7件(5.9) | 4 | 12.0(3.5) | 4 | 19.6件(10.6年) | 4 | ND (NA) | 4 |
| 21日目 | 4.9件(4.5) | 4 | 12.0 (0.8) | 3 | 18.3件(9.9) | 4 | ND (NA) | 4 |
| 28日目 | 5.4(5.0) | 4 | 9.8件(2.4) | 4 | 16.4件(8.1) | 4 | ND (NA) | 4 |
表9:用量による平均(SD)メチル-IPA血清濃度。ND = 検出されず、NA = 適用できません。全てのメチルIPA濃度を外部餌マトリックスに組み込んだ。
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Discussion
研究のために開発されたLC-MS/MS法は、マングース血清中のme-IPAおよびet-IPAを正確に定量するために、多重反応モニタリングの選択性を利用した。MS/MS検出の選択性はまた、分析前に血清からタンパク質を沈殿させるアセトニトリルのみに依存する簡単なクリーンアッププロトコルを可能にしました。
イオフェノキ酸はACNに溶け込みますが、実質的に水中に不溶性です。ACN抽出から水を除外するために、塩化ナトリウムを添加し、水性(血清)相のイオン強度を高めることにより透明な水:ACN相分離を強制した。揮発性酸トリフルオレゲ酸(TFA)も添加し、抽出中にイオフェノク酸がプロトン化され、ACN相でより容易に可溶化されることを保証しました。TFAは、LC-MS/MS分析の前にドライダウンステップ中に除去されます。
マングースからの血液採取量は約1mLで、0.5mL以下のセラが得られた。各サンプルの複製分析を行うには、クラスA容積ピペットやフラスコなどの典型的な分析実験室ガラス製品ではなく、マイクロ遠心管を使用したマイクロスケールのサンプル調製手順が必要でした。正確で正確な結果を達成するためには、アナリストがマイクロリットルサイズの先端を備えたガラスマイクロリットルシリンジと正変位反復ピペトルの使用に熟練している必要があります。
この方法の限界は、高価なLC-MS/MS計測器と、その使用とメンテナンスの訓練を受けたアナリストが必要な場合です。しかし、me-IPAおよびet-IPAは記載のHPLC条件を用いてベースライン解決されるため、干渉が観察されない限り、この方法はUV検出器を用いた単四重極LCMSまたはHPLCに適合する可能性がある。
2.8mgの用量でet-IPAで餌を消費したマングースと餌マトリックスとの平均血清濃度の違いは、マーカーが餌マトリックスに組み込まれるのではなく、ブリスターパックに含まれている場合のこぼれを示唆している。これは、餌の取り込みではなく、ワクチンを推定する目的に影響を与える可能性があります。例えば、外餌マトリックスにマーカーを組み込むことは、動物がマトリックスを食べるが、ワクチンがこぼれる場合、ワクチンのカバレッジの推定を膨らませる可能性があります。しかし、規制上の制限により、生物学的マーカーをブリスターパック内のワクチンと直接混合する能力が妨げになる可能性があります。<100%の消費が記録された場合、3例はブリスターパックにet-IPAを含む餌を有し、そのうちの2例は高い1%濃度であった。これは、et-IPAがより高い濃度である場合の潜在的な味の嫌悪を示唆しています。餌マトリックスに組み込まれた1%(20.0mg)et-IPAを含む餌がマングースに提供された場合、すべての動物は餌を拒絶した。
14日目のet-およびme-IPAの平均IPA濃度は、それぞれ約17および19 μg/mLであった。インスティトゥート・デ・インスティガシオンで行われた同様の研究は、同じ濃度と餌で送達された場合、マングース・セラで約45と10 μg/mLのブチルとペンチル-IPAを使用して、シウダー・レアル、シウダード・レアル、スペインのRecursosシネゲティコスで行われました。我々の研究のように製剤。これらの違いは、IPAの異なる誘導体がマングースの異なる速度で代謝する可能性があることを示唆しており、これはマーカー保持(短期または長期保持)が懸念される場合に有用であり得る。
消化器系の生理学の違いは、異なる種におけるIPAの吸収および排泄に影響を与える可能性がある。1.5mg/kgで送達した家畜猫(フェリス・カタス)におけるIPAの血漿除去半減期は107日であったのに対し、同じ用量率でのブラシテールポッサムの速度は約1日28日であった。IPAが国内ヤギ(カプラ・エーガルルス・ヒルカス)に1.5mg/kgの投与速度で与えられた時、IPAの末端除去半減期は81日であったが、研究者は投与後160日までヨウ素濃度の上昇を見つけ続けた。39. Vivveridaeのメンバーの消化管システム(マングースが以前に割り当てられていた家族40)は、IPAの保持時間を説明するかもしれない家畜猫41のそれと同様に記述されています。マングース。研究はまた、IPAが火星種29よりも迅速な排泄を可能にする、マルシャルで異なる代謝を可能にすることを示唆している。
本研究で評価したIPAの両誘導体は、マングースにおける長期(4−8週間)マーキング能を提供した。マングースの生物学的マーカーとしてのIPAの使用は、研究目的とマーキングの所望の持続時間を考慮に入れるべきである。連続した期間中に同じ研究サイトから動物をマークする場合、IPAの異なる誘導体を使用して、1つのマーキングイベントの結果が以前のイベント中にマーキングによって混同されないようにすることができます。米国における野生生物の運用ORVの一環として、標的種のサンプリングおよびRVNAおよびバイオマーカーの存在の試験は、通常、ORV分布42の4~6週間後に行われる。実用的な観点からは、この期間中にet-またはme-IPAのいずれかが容易に検出することができるようです。マングース中の残留崩壊機能を評価する今後の研究は、本研究で評価されたIPAの両同生の様々な濃度を提供し、有用であろう。
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Disclosures
著者AVとSOは、口腔狂犬病ワクチン餌メーカーの正社員です。
Acknowledgments
この研究は、米国農畜動植物衛生検査局、野生生物サービス、国立狂犬病管理プログラム、IDTビオロジカ(ドイツ・デッサウ・ロスラウ)の内部研究プログラムの一部によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
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