Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analisi degli analoghi dell'acido iofenostico nella piccola mangusta indiana (Herpestes Auropunctatus) Sera per l'uso come marcatore biologico di vaccinazione della rabbia orale

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

Abbiamo offerto esche da vaccino per la rabbia placebo delle manguste in cetticone con acido iofenico etilico o metilico come biomarcatore e l'assorbimento verificato delle esche utilizzando una nuova cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem (metodo LC-MS/MS).

Abstract

La piccola mangusta indiana(Herpestes auropunctatus) è un serbatoio di virus della rabbia (RABV) a Porto Rico e comprende oltre il 70% dei casi di rabbia animale segnalati annualmente. Il controllo della circolazione RABV nei serbatoi di fauna selvatica è in genere realizzato da una strategia di vaccinazione orale alla rabbia (ORV). Attualmente non esiste alcun programma ORV di fauna selvatica a Porto Rico. È stata condotta una ricerca sui vaccini per la rabbia orale e vari tipi di esche per le manguste con risultati promettenti. Il monitoraggio del successo dell'ORV si basa sulla stima dell'assorbimento delle esche da parte delle specie bersaglio, che in genere comporta la valutazione di un cambiamento negli anticorpi di neutralizzazione RABV (RVNA) dopo la vaccinazione. Questa strategia può essere difficile da interpretare in aree con un programma attivo ORV di fauna selvatica o in aree in cui RABV è enzootico e i livelli di fondo di RVNA sono presenti nelle specie di bacino. In tali situazioni, un biomarcatore incorporato con il vaccino o la matrice di esche può essere utile. Abbiamo offerto 16 manguste in cattività esche placebo ORV contenenti acido etilico-iofenico (et-IPA) in concentrazioni dello 0,4% e 1% all'interno dell'esca e dello 0,14% nella matrice esterna dell'esca. Abbiamo anche offerto 12 manguste in cattività esche ORV contenenti acido metilico-fenossia (me-IPA) in concentrazioni di 0,035%, 0,07% e 0,14% nella matrice di esca esterna. Abbiamo raccolto un campione di siero prima dell'offerta di esche e poi settimanalmente per un massimo di otto settimane dopo l'offerta. Abbiamo estratto gli acidi iofenossia dalla sera in acetonitrile e quantificato usando cromatografia liquida/spettrometria di massa. Abbiamo analizzato sera per et-IPA o me-IPA da spettrometria di cromatografia-massa liquida. Abbiamo trovato un'adeguata capacità di marcatura per almeno otto e quattro settimane rispettivamente per et- e me-IPA. Entrambi i derivati IPA potrebbero essere adatti per la valutazione sul campo dell'assorbimento delle esche ORV nelle manguste. A causa della longevità del marcatore in mangusta sera, bisogna fare attenzione a non confondere i risultati utilizzando lo stesso derivato IPA durante le valutazioni consecutive.

Introduction

Il virus della rabbia (RABV) è un lyssavirus singolo spiaggiato e circola tra diverse specie di bacini naturali all'interno degli ordini Carnivora e Chiroptera. Molteplici specie di manguste sono serbatoi di RABV, e la piccola mangusta indiana (Herpestes auropunctatus) è l'unico serbatoio in Porto Rico e altre isole caraibiche nell'emisfero occidentale1,2,3 . Il controllo della circolazione RABV nei serbatoi di fauna selvatica è in genere realizzato attraverso una strategia di vaccinazione orale della rabbia (ORV). Negli Stati Uniti (STATI Uniti), questa attività di gestione è coordinata dal USDA/APHIS/Wildlife Services National Rabies Management Program (NRMP)4. Attualmente non esiste alcun programma ORV di fauna selvatica a Porto Rico. La ricerca sui vaccini sulla rabbia e vari tipi di esche per le manguste è stata condotta con risultati promettenti suggerendo un programma ORV per le manguste è possibile5,6,7,8.

Il monitoraggio dell'impatto dell'ORV si basa sulla stima dell'assorbimento delle esche da parte delle specie bersaglio, che in genere comporta la valutazione di un cambiamento nella sieroprevalenza dell'anticorpo RV. Tuttavia, questa strategia può essere difficile nelle aree con programmi ORV di fauna selvatica attivi o in aree in cui la rV è enzootica e i livelli di fondo degli anticorpi di neutralizzazione RABV (RVNA) sono presenti nelle specie di bacino. In tali situazioni, un biomarcatore incluso nell'esca o nella matrice esterna dell'esca può essere utile.

Vari marcatori biologici sono stati utilizzati per monitorare l'assorbimento di esche in numerose specie, tra cui procioni ( lottoProcyon)9,10,stoats (Mustela ermina)11,12, tassi europei ( Meles meles) 13, cinghiali (Sus scrofa)14, piccole manguste indiane15 e cani della prateria (Cynomysludovicianus)16,17, tra gli altri. Negli Stati Uniti, le esche ORV operative spesso includono un biomarcatore tetraciclino dell'1% nella matrice delle esche per monitorare l'assorbimento delle esche18,19. Tuttavia, gli inconvenienti all'uso della tetraciclina includono una crescente preoccupazione per la distribuzione di antibiotici nell'ambiente e che l'individuazione della tetraciclina è tipicamente invasiva, richiedendo l'estrazione dei denti o la distruzione dell'animale per ottenere l'osso campioni20. La rhodamina B è stata valutata come marcatore in una varietà di tessuti e può essere rilevata utilizzando la luce ultravioletta (UV) e la fluorescenza nei capelli e nei baffi10,21.

L'acido iofenosssia (IPA) è una polvere cristallina bianca che è stata utilizzata per valutare il consumo di esche nei coyote (Canis latrans)22, volpe artica (Vulpes lagopus)23, volpe rossa (Vulpes vulpes)24, procioni 9 (in vie , 25, cinghiale14, cervo rosso (Cervus elaphus scoticus)26, tassi europei12 e furetti (M. furo)27, tra diverse altre specie di mammiferi. I tempi di ritenzione dell'IPA variano a seconda delle specie da meno di due settimane in alcuni marsupiali28,29, ad almeno 26 settimane in ungulates26 e oltre 52 settimane in cani domestici (Canis lupus familiaris)30. Tempi di ritenzione possono anche essere dose-dipendente31. L'acido iofenostico si lega fortemente all'albumina del siero ed è stato storicamente rilevato misurando i livelli di iodio nel sangue32. Questo approccio indiretto è stato soppiantato da metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per misurare direttamente le concentrazioni di acido iofenossia con rilevamento UV33, e alla fine con cromatografia liquida e spettrometria di massa (LCMS) 34,35. Per questo studio, è stata sviluppata una cromatografia liquida altamente sensibile e selettiva con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) che utilizza il monitoraggio della reazione multipla (MRM) per quantificare due analoghi di acido iofenosco. Il nostro obiettivo era quello di utilizzare questo metodo LC-MS/MS per valutare la capacità di marcatura di 2-(3-idrossi-2,4,6-triiodobenzyl)acido propanoico (metil-IPA o me (3-idrossi-2,4,6-triiodobenzyl)acido butanoico (ethyl-IPA o et-IPA) e quando consegnato in un ORV esca alle manguste in cattività.

Le manguste sono state catturate dal vivo in trappole a gabbia esche con salsicce affumicate e olio di pesce disponibili in commercio. Le manguste erano alloggiate in gabbie in acciaio inossidabile da 60 cm x 60 cm x 40 cm e alimentate con una razione giornaliera di cibo per gatti secchi commerciali da 50 g, completate due volte a settimana con una coscia di pollo disponibile in commercio. L'acqua era disponibile ad libitum. Abbiamo consegnato due derivati di IPA, ethyl-IPA e metil-IPA, alle manguste in cattività nelle esche ORV placebo. Tutte le esche erano composte da una confezione di blister di 28 mm x 20 mm x 9 mm con un rivestimento esterno (qui dopo "matrice di esca") contenente uova di gallina in polvere e gelatina (Tabella deimateriali). Le esche contenevano 0,7 mL di acqua o derivato IPA e pesavano circa 3 g, di cui 2 g era la matrice di esche esterne.

Abbiamo offerto 16 manguste in cattività et-IPA in tre concentrazioni: 0.14% (2.8 mg et-IPA in matrice di esche da 2 g; 3 maschi [m], 3 femmine [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA in 0,7 ml di volume blister; 3m, 3f) e 1,0% (7,0 mg ethyl-IPA in 0,7 ml volume blister; 2m , 2f). La dose complessiva di 2,8 mg corrisponde a un tasso di dose di 5 mg/kg27,36 e si basa su un peso medio mangusta di 560 g a Porto Rico. Abbiamo selezionato l'1% come la concentrazione più alta come la ricerca suggerisce avversione al gusto per alcuni biomarcatori può verificarsi a concentrazioni >1% in alcune specie37. Abbiamo offerto solo la dose dell'1% nella confezione del blister come flocculazione ha impedito al soluto di sciogliersi nel solvente sufficientemente da essere incorporato uniformemente nella matrice dell'esca. Un gruppo di controllo (2m, 1f) ha ricevuto esche piene di acqua sterile e senza IPA. Abbiamo offerto esche alle manguste al mattino (8 a.m.) durante o prima dell'alimentazione della loro razione di mantenimento giornaliero. I resti di esca sono stati rimossi dopo circa 24 ore. Abbiamo raccolto campioni di sangue prima del trattamento, un giorno dopo il trattamento e poi settimanalmente fino a 8 settimane dopo il trattamento. Abbiamo anetizzato manguste per inalazione di gas isoflurano e raccolto fino a 1,0 mL di sangue intero da venipuncture della vena cava cranica come descritto per i furetti38. Abbiamo centrifugato campioni interi di sangue, trasferito sera ai crioviali e li abbiamo conservati a -80 gradi fino all'analisi. Non tutti gli animali sono stati campionati durante tutti i periodi di tempo per ridurre al minimo l'impatto del sangue ripetuto attinge alla salute degli animali. Gli animali di controllo sono stati campionati il giorno 0, poi settimanalmente per un massimo di 8 settimane dopo il trattamento.

Abbiamo consegnato me-IPA in tre concentrazioni: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) e 0.14% (2.8 mg), tutti incorporati nella matrice esca, con 2 maschi e 2 femmine per gruppo di trattamento. Due maschi e due femmine hanno ricevuto esche piene di acqua sterile e senza IPA. Esca che offre tempi e anestesia mangusta sono descritti sopra. Abbiamo raccolto campioni di sangue prima del trattamento il giorno 1, e poi settimanalmente fino a 4 settimane dopo il trattamento.

Abbiamo testato i dati sulla concentrazione del siero per verificare la normalità e i mezzi stimati per le concentrazioni di IPA del siero di diversi gruppi di trattamento. Abbiamo usato un modello misto lineare per confrontare le concentrazioni medie di siero et-IPA raggruppate tra gli individui. Il tipo di esca (matrice/blister pack) era un effetto fisso oltre al giorno sperimentale, mentre l'ID animale era un effetto casuale. Tutte le procedure sono state eseguite utilizzando un software statistico comune (Tabella dei materiali) e la significatività è stata valutata a 0,05 USD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'USDA National Wildlife Research Center nell'ambito del protocollo di ricerca QA-2597.

NOTA: Il seguente protocollo descrive la procedura di analisi per rilevare l'acido metilico-fenossia nel siero di mangusta. Questo metodo è la versione finale di un processo iterativo che ha avuto inizio con l'analisi dell'acido etilico-fenofenico nel siero mangusta. Durante la valutazione iniziale dell'acido etilico-iofenico sono state apportate piccole modifiche ai metodi, con conseguente protocollo finale presentato di seguito. I risultati rappresentativi includono quelli ottenuti durante entrambe le iterazioni.

1. Preparazione di soluzioni e standard

  1. Acquista me-IPA ed et-IPA.
  2. Per la fase mobile A, preparare 1 L di 0,1% (v/v) acido formica in acqua combinando 1 mL di acido formico con 1 L di acqua ultrapura (a 18 M. Per la fase mobile B, preparare 1 L dello 0,1% (v/v) acido formico in acetonitrile (ACN) combinando 1 mL di acido formica con 1 L di ACN.
  3. Per diluenti, preparare 200 mL di 0,5% (v/v) acido trifluoroacetico (TFA) in ACN combinando 1 mL di TFA con 200 mL di ACN.
  4. Preparare le soluzioni concentrate per le scorte IPA di me-IPA ed et-IPA in ACN a concentrazioni di circa 1.000 g/mL.
    1. Pesare circa 10 mg di me-IPA su un microequilibrio e registrare la massa a 0.0001 mg. Quantitatively trasferire il me-IPA a un flascco volumetrico di classe 10 mL utilizzando 45 mL ACN. Sonicare 1 min per sciogliere tutti i solidi, e poi portare a volume con ACN.
    2. Trasferire 8 mL di ogni brodo su fiale di vetro ambrate da 8 mL con tappi rivestiti in poli-tetrafluoreetilene (PTFE). Conservare a temperatura ambiente (RT). Trasferire lo stock rimanente ai rifiuti pericolosi.
  5. Per il titolo 25x-7 me-IPA (Tabella 1), preparare uno stock di me-IPA in ACN a circa 200 g/mL. Esempio: Trasferire 1 mL dello stock concentrato me-IPA dal passaggio 1,4.2 a un flacone volumetrico di classe 5 mL utilizzando una siringa di vetro da 1.000 . Diluire al volume con ACN. Trasferire il brodo su una fiala di vetro ambra da 8 mL con tappo rivestito IN PTFE. Store presso RT.
  6. Preparare i sei stock aggiuntivi 25x me-IPA descritti nella Tabella 1. Per ogni stock, combinare i volumi indicati utilizzando un pipettor a ripetizione in una fiala di vetro ambrato ambrato 8 mL con tappo rivestito IN PTFE. Conservare ogni azione in RT.
  7. Per il brodo surrogato 25x, preparare uno stock surrogato di me-IPA in ACN a circa 10 g/mL dal brodo concentrato preparato al punto 1.4.2. Trasferire 0,100 mL del brodo concentrato me-IPA in un flacone volumetrico di classe A da 10 mL utilizzando una siringa di vetro da 100 L, quindi didiulare al volume con ACN.
    1. Trasferire 8 mL in una fiala di vetro ambra da 8 mL con tappo rivestito in PTFE. Conservare presso RT. Trasferire il materiale rimanente ai rifiuti pericolosi.
  8. Preparare 4 volte le scorte contenenti entrambi gli analiti in fiale di vetro a vite da 2 mL, come descritto nella tabella 2.
    1. Ad esempio, per preparare il magazzino 4x-7, a una fiala da 2 mL, aggiungere 0,20 mL del magazzino 25x-7 me-IPA dal passaggio 1,5 utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 mL. Aggiungere 0,20 mL del brodo 25x surrogato et-IPA del passaggio 1,7 utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 mL.
    2. Aggiungere 0,85 mL di ACN utilizzando un pipettor ripetuto con 1 mL di capacità. Chiudere la fiala in modo sicuro e invertire 5x per mescolare.
  9. Preparare la curva standard in fiale autocampionatori a vite da 2 mL, come descritto nella Tabella 3.
    1. Ad esempio, per preparare lo standard 7 (Std 7), a una fiala da 2 mL, aggiungere 0,20 mL del magazzino 4x-7 dal passaggio 1.8.2 utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 mL. Aggiungere 0,60 mL di acqua di diuso ultrapura utilizzando un pipettor di ripetizione con 1 mL di capacità. Chiudere la fiala in modo sicuro e invertire 5x per mescolare.

2. Preparazione del campione

AVVISO: il personale che esegue questa procedura deve aver ricevuto l'intera serie di profilassi pre-esposizione della rabbia e avere un titolo documentato antirabbico superiore a 0,5 IU da una struttura medica designata per la salute professionale federale. Il personale deve indossare sempre i camici da laboratorio e la protezione degli occhi durante l'esecuzione dell'estrazione. DESTRA: eseguire i passi 2.3.2.6 in un mobile di biosicurezza di classe II.

  1. Per ogni campione, preparate un tubo di microcentrismo da 1,5 mL contenente 200-300 mg di NaCl.Disporre i tubi in un rack di plastica a 80 posizioni. Mettere da parte per l'uso nel passaggio 2.6.
    NOTA: Per un numero elevato di campioni è consigliato un micro misurino (o un altro piccolo dispositivo di misura).
  2. Per ogni campione, etichettare due tubi di microcentrifuga da 1,5 mL: uno come "A" e l'altro come "B". Disporre i tubi in una griglia di plastica a 80 posizioni.
  3. Collocare i seguenti materiali e attrezzature necessari per l'estrazione del siero in un armadietto di biosicurezza di classe II: tubi di microcentrifuga (in rack) preparati nei passaggi 2.1 e 2.2, un mixer vortice, pipettor ripetuto con punte di capacità di 0,5 mL e 5 mL, 100-1.000 postidi spostamento dell'aria con 1.000 punte, contenitori con circa 100 mL ciascuno di acqua DI diluente e ultrapura, e un contenitore di rifiuti biorischi.
  4. Rimuovere i campioni di siero dal deposito congelato e riscaldare a RT nell'armadietto della biosicurezza. Il vortice mescola ogni campione di siero prima del campionamento.
  5. Utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 0,5 mL, erogare 0,050 mL di siero di mangusta nel tubo "A" e aggiungere 0,050 mL di 25x brodo surrogato. Quindi aggiungere 0,950 mL di diluente al tubo "A" utilizzando un pipettor ripetuto con una punta di capacità di 5 mL. Cappuccio in modo sicuro e vortice mix per 10-15 s.
  6. Distribuisci il NaCl prepesato dal passo 2.1 al tubo "A" e il mix di vortice 3x per 8s12 s. Pulire le superfici esterne del tubo contenente fiala contenente "A" utilizzando il 70% (v/v) isopropanol.
    NOTA: il rack di campioni può ora essere rimosso dall'armadietto di biosicurezza di classe II.
  7. Tubo di centrifuga "A" a 12.000 x g per 1 min per separare le fasi acquose e ACN. Pipetta 0,80 mL della fase Superiore ACN al tubo "B" utilizzando una pipetta di spostamento dell'aria da 100 a 1.000. Trasferire la soluzione rimanente nel tubo "A" ai rifiuti pericolosi e scartare il tubo vuoto in un contenitore di rifiuti biopericolosi.
  8. Rimuovere ACN e TFA dal tubo "B" con un flusso delicato di gas N2 in un bagno d'acqua a 45 gradi centigradi.
  9. Aggiungete 0,250 mL di ACN al tubo "B" usando un pipettor di ripetizione, un mix di vortice per 4 s e poi centrificatere brevemente (2-4 s) a 12.000 x g per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo.
  10. Aggiungete 0,750 mL di acqua ULTRApura DI al tubo "B" utilizzando un pipettor di ripetizione con punta di capacità di 5 mL, la miscela di vortice per 4s5 s, quindi centrificatevi per 1 min a 12.000 x g per chiarire il campione.
  11. Trasferire 0,75 mL del supernatante in una fiala autocampionatore utilizzando una pipetta di spostamento dell'aria da 1.000 . Scartare le punte delle pipette nel contenitore dei rifiuti di pericolo biologico.
  12. Cap autosampler fiale in modo sicuro e analizzare da LC-MS/MS (sezione 4). Trasferire la soluzione rimanente nel tubo "B" ai rifiuti pericolosi e scartare il tubo vuoto in un contenitore di rifiuti biopericolosi. Smaltire tutti i rifiuti biopericolosi mediante autoclaving o incenerimento.

3. Campioni di controllo qualità

INFORMATIVA: Seguire le istruzioni di avvertenza descritte nella sezione 2.

NOTA:La procedura seguente descrive il numero minimo di campioni di controllo qualità (QC) necessari per un'analisi. Le repliche ad ogni livello sono raccomandate se è disponibile un siero di mangusta di controllo sufficiente.

  1. Preparare quattro tubi di microcentrismo da 1,5 ml contenenti 200-300 mg di NaCl. Disporre i tubi in una griglia di plastica a 80 posizioni.
  2. Per ogni campione di QC, etichettare due tubi di microcentrifuga da 1,5 mL: uno come "A" e l'altro come "B". Disporre i tubi in una griglia di plastica a 80 posizioni.
  3. Ripetere il passaggio 2.3.
  4. Rimuovere il siero di mangusta di controllo dal deposito congelato e riscaldare a RT nell'armadio di biosicurezza. Vortex mescolare il siero di controllo prima del campionamento.
  5. Distribuisce 0,050 mL di siero di mangusta di controllo nei quattro tubi "A" da 1,5 ml utilizzando un pipettor di ripetizione con una punta di capacità di 0,5 mL.
  6. Fortificare ciascuno dei quattro campioni QC come specificato nella tabella 4 utilizzando un pipettor di ripetizione con una mancia di capacità di 0,5 mL. Capovolgi ogni campione QC in modo sicuro e mescolare vortice per 10-15 s.
  7. Eseguire la procedura di estrazione come descritto nei passaggi 2.6.2.12.

4. Analisi LC-MS/MS

  1. Configurare LC-MS/MS con tutti i parametri descritti nella tabella 5. Accendere l'LC-MS/MS e consentire alla colonna di raggiungere i 70 gradi centigradi prima di impostare la portata su 0,800 mL/min.
  2. Impostare una sequenza nel software di acquisizione dei dati (Tabella dei materiali) per iniettare la curva standard prima e dopo ogni lotto costituito da campioni di controllo qualità e campioni sconosciuti.
  3. Iniettare tutti gli standard e i campioni e acquisire i cromatogrammi ioni di MRM utilizzando i parametri elencati nella tabella 5.
  4. Dopo il completamento della sequenza, spegnere l'LC-MS/MS e smaltire tutte le fiale autocampionatore come rifiuti pericolosi.

5. Quantificazione

  1. Utilizzare il software di analisi dei dati per generare una curva di calibrazione delle risposte relative rispetto alle concentrazioni relative per me-IPA utilizzando et-IPA come standard interno. Calcolare le risposte relative dalla transizione di MRM quantificatore per me-IPA (556,6 x 428,7) diviso per la transizione DI gestione record di messaggistica per et-IPA (570.7 . Costruire una curva di calibrazione a 7 livelli utilizzando una funzione quadratica di secondo ordine ponderata 1/x e che ignora l'origine.
  2. Calcolare la concentrazione di siero(sieroC ) di me-IPA utilizzando la seguente equazione:
    Equation 1
    dove lostrumento c è la concentrazione determinata dallo strumento dalla curva di calibrazione in unità Equation 2 di g/mL, 1,25 è il fattore di diluizione, Vfinale è il volume del campione finale (1,0 mL), e Vsiero è il volume del siero in mL ( 0,050 mL nominale).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I cromatogrammi ionici rappresentativi da un'analisi me-IPA sono presentati nella Figura 1. Il siero di manguste di controllo (Figura 1A) illustra il tempo di conservazione di et-IPA (analitico surrogato) e l'assenza di me-IPA al tempo di conservazione indicato. L'esempio di controllo qualità (Figura 1B) illustra la separazione di base di me-IPA da et-IPA, nonché le transizioni di quantificatore e qualificatore per me-IPA. La figura 1C mostra un campione rappresentativo dello studio con una concentrazione osservata di siero di 33,5 g/mL me-IPA.

Una curva di calibrazione rappresentativa da un'analisi me-IPA è presentata nella Figura 2. La curva standard a 7 livelli e 14 punti varia da 0,00202 a 8,27 g/mL me-IPA con un coefficiente di correlazione (r2)di 0,9998. I coefficienti di correlazione variavano da 0,9998 a 0,99997 per le cinque analisi me-IPA. La concentrazione di analita surrogata et-IPA è stata di 0,502 g/mL in tutti gli standard.

La tabella 6 presenta l'accuratezza e la precisione dei risultati per il siero della mangusta di controllo fortificati con 0, 1,3, 31 e 82 sg/mL me-IPA (n - 10 ad ogni livello). I risultati sono stati raccolti da cinque analisi distinte. I recuperi percentuali variavano dal 96,9% al 109%. La deviazione standard relativa percentuale (% RSD) ai tre livelli di fortificazione è stata rispettivamente del 3,4%, 1,7% e 2,3%.

Per determinare il limite di rilevamento (DL; 3 x S/N) e il limite di quantificazione (QL; 10 x S/N) è stato utilizzato il rapporto segnale-rumore (S/N) osservato nei campioni di controllo qualità (n - 10 - 10 a 1,3 g/mL me-IPA). Il DL e il QL per me-IPA nel siero di mangusta erano rispettivamente di 0,012 g/mL e 0,042 g/mL.

Le risposte dell'area di picco della transizione MRM qualificatoEquation 3 diviso per la transizione MRM quantificatore (è stato calcolato per tutti gli standard e campioni. Questo rapporto per ogni campione è stato poi diviso per il rapporto medio osservato negli standard di calibrazione per determinare la corrispondenza percentuale di qualificazione. Il rapporto di qualificazione per il campione illustrato nella figura 1C è stato 0,439, con una corrispondenza del 96,3%.

Il recupero dell'analita surrogato et-IPA è stato calcolato per tutti i campioni QC e campioni sconosciuti dividendo la risposta dell'area di picco et-IPA per la risposta media dell'area di picco et-IPA osservata negli standard di calibrazione. I recuperi medi di analiti surrogati sono stati del 91,0% (controlli negativi), del 91,4% (1,3 g/mL), del 92,8% (31 g/mL) e del 95,4% (82 g/mL).

Nel siero di mangusta di mangusta di controllo (Figura 1A) non sono stati osservati picchi di interferenza per le transizioni di quantificatore o qualificatore di me-IPA .

La procedura di estrazione e le condizioni strumentali utilizzate per determinare l'et-IPA nel siero di mangusta (Figura 3 e Tabella 7) erano identiche al metodo me-IPA, ma con le seguenti modifiche. L'acido propile-iofenosssia (pr-IPA) è stato utilizzato come l'analita surrogato e un l'lC-MS/MS più vecchio e meno sensibile. La temperatura del gas di essiccazione della sorgente era di 350 gradi centigradi con un flusso di 12 L/min e una pressione del nebulizzatore di 35 psi. La tensione capillare era -2.500 V. La sorgente non aveva gas guaina o mezzi per regolare la tensione dell'ugello. La transizione di MRM quantificatore per et-IPA è stata 570.7 x 442.8 (584.7 : 456.8 per pr-IPA). Il frammentatore era di 80 V e l'energia di collisione era di 10 V per entrambi gli analiti. Il qualificato MRM per et-IPA era 570.7 : 126.8 con un'energia di collisione di 40 V.

Il test di tutti i campioni di siero di manguste per et-IPA è stato eseguito su otto analisi. La curva di calibrazione a 7 livelli variava da 0,00207 a 8,48g/mL con coefficienti di correlazione (r 2) che andavano da 0,9990 a 0,9999. La concentrazione di pr-IPA di analita surrogata è stata di 0,512 g/mL. La tabella 7 presenta l'accuratezza e la precisione dei risultati per il siero di mangusta di controllo fortificati con 0, 1,3, 13, 32, 85 e 170 me-IPA. I risultati sono stati raccolti da otto analisi distinte. I recuperi percentuali variavano dall'89,5% al 115%. La RSD % ai cinque livelli di fortificazione è stata rispettivamente del 4,3%, dell'1,5%, del 2,3%, del 5,6% e dell'1,1%. Per determinare la DL e la QL, è stato utilizzato il S/N osservato nei campioni di controllo qualità (n - 21 controlli negativi; n - 21 a 1,3 s/mL me-IPA). Il DL e il QL per me-IPA nel siero di mangusta erano rispettivamente di 0,12 g/mL e 0,42 g/mL. Il recupero medio dell'analita surrogato dai campioni di controllo qualità è stato dell'86,8% (n - 75). Nel siero di mangusta di controllo non sono stati osservati picchi di interferenza né per il quantificatore o le transizioni di qualificazione di et-IPA.

Tutte le manguste offerte et-IPA esche consumato il 25% dell'esca entro il vincolo di tempo di 24 ore e aveva livelli quantificabili di et-IPA nella loro sera (Tabella 8). Dall'analisi del modello misto, le concentrazioni complessive di IPA media erano marginalmente più elevate rispetto alle esche con 2,8 mg di biomarcatore nella matrice delle esche (17,5 g/mL, 95% CI 11,7,3 g/mL) in confronto alla confezione di blister (9,8 g/mL, 95% CI 4,0,6 g/mL) in confronto alla confezione di blister (9,8 g/mL) , P - 0,07). Le concentrazioni per entrambi i tipi di esche sono decadute con il giorno sperimentale (-0,15 USD per 0,04, F - 14,4, P - 0,0005). È stata osservata la variabilità a livello individuale nelle concentrazioni di IPA del siero (stima del parametro di covarianza dell'ID animale : 46,6 x 20,7). Tutte le manguste consumavano il 100% di esche di controllo con solo il pacchetto di blister di lamina vuota rimanente. La concentrazione media dei residui di et-IPA nel siero era variabile per periodo di tempo e non sembrava diminuire costantemente nel tempo (Figura 3).

Tutte le manguste mi hanno offerto esche IPA consumate il 25% dell'esca entro il limite di tempo di 24 ore e aveva livelli quantificabili di me-IPA nella loro sera (Tabella 9). La concentrazione sierologica media di et- e me-IPA in mangusta sera è apparso dipendente dalla concentrazione di IPA nell'esca. Concentrazioni più elevate di IPA nell'esca hanno provocato residui di siero più elevati anche nei casi in cui la dose complessiva (2,8 mg nel caso di et-IPA) è rimasta la stessa. È interessante notare che, me-IPA sembrava produrre un modello di degradazione più uniforme nel corso del tempo con un picco iniziale al giorno 1, seguito da un calo costante fino al giorno 14 dove le concentrazioni sembravano altopiano (Figura 4).

Figure 1
Figura 1 : cromatogrammi a ioni rappresentativi. (A) Rappresentante MRM ion chromatogram del siero di mangusta di controllo fortificato con acido etiolico etiolico etiolico-iofenossia (et-IPA) di analita surrogato. La freccia indica il tempo di ritenzione per l'acido metilico-fenofenossia (me-IPA). (B) Rappresentante del cromatogramma MRM ion del siero di mangucio di controllo fortificato con 31 sg/mL me-IPA. Vengono visualizzate le intensità relative delle transizioni di quantificatore (Quant) e qualificatore (Qual) per me-IPA. (C) Rappresentante del cromatogramma a ioni MRM di un campione di siero di mangusta con una concentrazione me-IPA osservata di 33,5 g/mL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : curva di calibrazione rappresentativa. Una curva di calibrazione originale generata dal software di analisi dei dati per l'acido metilico-fenofenossia (me-IPA). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Concentrazione media di siero etilo IPA (et-IPA) per tipo di esca e concentrazione nel tempo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Concentrazione media di IPA metile (me-IPA) del siero concentrazione di esche nel tempo. Tutte le concentrazioni me-IPA sono state incorporate nella matrice esterna delle esche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Concentrazione me-IPA (g/mL)
id m
25x-7 Fare riferimento al passaggio 1.6 200 anni
25x-6 Combinare 1.000 mL 25x-7 Stock con 3.000 mL ACN 50 anni
25x-5 Combinare 1.000 mL 25x-6 Stock con 3.000 mL ACN 13 del sistema
25x-4 Combinare 1.000 mL 25x-5 Stock con 3.000 mL ACN 3.1
25x-3 (3) Combinare 1.000 mL 25x-4 Stock con 3.000 mL ACN 0,78 (in questo 0,00)
25x-2 (in modo Combinare 1.000 mL 25x-3 Stock con 3.000 mL ACN 0,2 0,2
25x-1 Combinare 1.000 mL 25x-2 Stock con 3.000 mL ACN 0,049 (in questo 09).

Tabella 1: Preparazione di 25 x me-IPA in ACN (in fiale di vetro ambrato da 8 mL).

Concentrazione (g/mL)
id m me-IPA et-IPA
4x-7 0,200 mL 25x-7 - 0,200 mL 25x Surrogato - 0,850 mL ACN 32 Milia risse 1.6 (in inglese)
4x-6 0,200 mL 25x-6 - 0,200 mL 25x Surrogato - 0,850 mL ACN 8 (IN vio 1.6 (in inglese)
4x-5 0,200 mL 25x-5 - 0,200 mL 25x Surrogato - 0,850 mL ACN 2 Il nome del sistema 1.6 (in inglese)
4x-4 0,200 mL 25x-4 - 0,200 mL 25x Surrogato - 0,850 mL ACN 0,5 0,5 1.6 (in inglese)
4x-3 0,200 mL 25x-3 - 0,200 mL 25x Surrogato - 0,850 mL ACN 0.12 1.6 (in inglese)
4x-2 0,200 mL 25x-2 - 0,200 mL 25x Surrogato - 0,850 mL ACN 0,031 (in linguaggio 03) 1.6 (in inglese)
4x-1 0,200 mL 25x-1 - 0,200 mL 25x Surrogato - 0,850 mL ACN 0,008 (in vie talloni di clam 1.6 (in inglese)
4x-0 0.200 mL 25x Surrogate 1.050 mL ACN 0 (in vie 1.6 (in inglese)

Tabella 2: Preparazione degli stock 4x IPA in ACN (in fiale autocampionatore da 2 mL).

Concentrazione (g/mL)
id m me-IPA et-IPA
Std 7 0,200 mL 4x-7 - 0,600 mL di acqua DI 8 (IN vio 0,4 0
Std 6 0,200 mL 4x-6 - 0,600 mL di acqua DI 2 Il nome del sistema 0,4 0
Std 5 0,200 mL 4x-5 - 0,600 mL di acqua DI 0,5 0,5 0,4 0
Std 4 0,200 mL 4x-4 : 0,600 mL di acqua DI 0.13 0,4 0
Std 3 0,200 mL 4x-3 - 0,600 mL di acqua DI 0,03 (in vi estati) 0,4 0
Std 2 0,200 mL 4x-2 - 0,600 mL di acqua 0.0078 (invia in stato di inademazione) 0,4 0
Std 1 0,200 mL 4x-1 - 0,600 mL di acqua DI 0.002 (in 3:0) 0,4 0
Std 0 0,200 mL 4x-0 - 0,600 mL di acqua DI 0 (in vie 0,4 0
Vuoto 0,200 mL Di ACN - 0,600 mL di acqua DI 0 (in vie 0 (in vie

Tabella 3: Preparazione degli standard me-IPA in 75/25 water/ACN (in fiale autocampionatore da 2 mL).

Concentrazione (g/mL) nel siero
id m me-IPA et-IPA
Controllo negativo 0,050 mL 25x Surrogato - 0,950 mL Diluente 0 (in vie 10 del sistema
Bassa Fortificazione 0,050 mL 25x Surrogato : 0,020 mL 25x-4 x 0,930 mL Diluente 1.2 (in questo modo) 10 del sistema
Fortificazione media 0,050 mL 25x Surrogato : 0,030 mL 25x-6 - 0,920 mL Diluente 30 milio 10 del sistema
Alta Fortificazione 0,050 mL 25x Surrogato : 0,020 mL 25x-7 - 0,930 mL Diluente 80 10 del sistema

Tabella 4: Fortificazione del campione di controllo qualità (preparazione in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL).

Cromatografia Liquida:
colonna: C18, 2,1 x 50 mm, 2,5 m di dimensione delle particelle
Temperatura colonna: 70 gradi centigradi
Volume di iniezione: 5 ll
Portata: 0,800 mL/min
Fase mobile: Solvente A: 0,1% acido formico nell'acqua
Solvente B: 0,1% acido formico in ACN
Programma gradiente:
Tempo (min): 0 (in vie 0,25 2.25 2.26 3.4 (in questo stato del documento) 3.41 4.75 (in questo stato del documento)
% B: 40 anni ( 40 anni ( 55 (di cinità" 100 del sistema 100 del sistema 40 anni ( 40 anni (
Lavaggio aghi: ACN, 3 s
MS/MS Fonte: ESI (modalità negativa)
Temperatura del gas: 300 gradi centigradi
Flusso di gas: 5 L/min
Nebulizzatore: 45 psi
Capillare: -4000 V
Tensione del ugello: -500 V
Temperatura del gas di guaina: 250 gradi centigradi
Flusso di gas in guaina: 7 L/min
Transizioni DI Gestione record di messaggistica:
Analita Ione precursore (m/z) Ione del prodotto (m/z) Frammentatore (V) Energia collisione (V) Tempo di dwell (ms) Segmento temporale
Me-IPA 556,6 428,7 74 Del sistema 12 mila 60 del sistema 2 Il nome del sistema
126,9 65 ( : il nome del 60 del sistema
126,8 61 o 60 del sistema
Et-IPA 570,7 442,7 87 Il 16 60 del sistema
Segmenti di tempo:
segmentare Inizio (min) Fine (min) digitare Deviatore Delta EMV polarità f inv Dati archiviati
1 : il nome del 0 (in vie 0,6 (in inglese) Scansione MS2 Allo spreco 0 (in vie negativo No
2 Il nome del sistema 0,6 (in inglese) 2 Il nome del sistema Mrm A MS -100 negativo sì
3 (COM del nome 2 Il nome del sistema 4.75 (in questo stato del documento) Scansione MS2 Allo spreco 0 (in vie costruttivo No
Le transizioni del quantificatore sono in grassetto.

Tabella 5: parametri LC-MS/MS. Gli ioni di prodotto del quantificatore sono in grassetto.

bersaglio Osservato percento
id m giorno me-IPA me-IPA guarigione
QC-1 1 : il nome del 0 (in vie Nd non pertinente
QC-2 1 : il nome del 0 (in vie Nd non pertinente
QC-11 2 Il nome del sistema 0 (in vie Nd non pertinente
QC-12 2 Il nome del sistema 0 (in vie Nd non pertinente
QC-21 3 (COM del nome 0 (in vie Nd non pertinente
QC-22 3 (COM del nome 0 (in vie Nd non pertinente
QC-31 4 DEL psu' 0 (in vie Nd non pertinente
QC-32 4 DEL psu' 0 (in vie Nd non pertinente
QC-3 5 Del numero 3( 0 (in vie Nd non pertinente
QC-4 5 Del numero 3( 0 (in vie Nd non pertinente
QC-13 1 : il nome del 1.25 (in vie del 12) 1.26 (in inglese) 101% Ave (10) 102%
QC-14 1 : il nome del 1.25 (in vie del 12) 1.23 (in vie del documento di sin fa 98,40% Proprietà SD . 3,50%
QC-23 2 Il nome del sistema 1.25 (in vie del 12) 1.26 (in inglese) 101% % RSD 3,40%
QC-24 2 Il nome del sistema 1.25 (in vie del 12) 1.28 (in vie del 12) 102%
QC-33 3 (COM del nome 1.29 (in tito lo dei min 1.3 (in questo modo) 101%
QC-34 3 (COM del nome 1.29 (in tito lo dei min 1.25 (in vie del 12) 96,90%
QC-5 4 DEL psu' 1.29 (in tito lo dei min 1.37 (in questo da 1,1> ) 106%
QC-6 4 DEL psu' 1.29 (in tito lo dei min 1.41 (in linguaggio 1.41) 109%
QC-15 5 Del numero 3( 1.29 (in tito lo dei min 1.3 (in questo modo) 101%
QC-16 5 Del numero 3( 1.29 (in tito lo dei min 1.34 (in questo da 14) 104%
QC-25 1 : il nome del 30.1 30.2 100% Ave (10) 103%
QC-26 1 : il nome del 30.1 31.2 104% Proprietà SD . 1,80%
QC-35 2 Il nome del sistema 30.1 31.1 103% % RSD 1,70%
QC-36 2 Il nome del sistema 30.1 31.1 103%
QC-7 3 (COM del nome 31 Milia 31,6 102%
QC-8 3 (COM del nome 31 Milia 31.4 34 101%
QC-17 4 DEL psu' 31 Milia 32,5 105%
QC-18 4 DEL psu' 31 Milia 32,8 106%
QC-27 5 Del numero 3( 31 Milia 31,7 102%
QC-28 5 Del numero 3( 31 Milia 32.1 104%
QC-37 1 : il nome del 80.2 77,8 97,00% Ave (10) 101%
QC-38 1 : il nome del 80.2 78,9 98,40% Proprietà SD . 2,30%
QC-9 2 Il nome del sistema 80.2 81,8 102% % RSD 2,30%
QC-10 2 Il nome del sistema 80.2 79,8 99,50%
QC-19 3 (COM del nome 82,7 83,5 101%
QC-20 3 (COM del nome 82,7 84 (in questo stato del sistema 102%
QC-29 4 DEL psu' 82,7 84,7 102%
QC-30 4 DEL psu' 82,7 87,2 105%
QC-39 5 Del numero 3( 82,7 83 Il 100%
QC-40 5 Del numero 3( 82,7 84.1 102%

Tabella 6: Risultati QC per me-IPA nel siero di mangusta (g/mL).

Destinazione et-IPA (zg/mL) N Media (%) SD (%) % RSD
0 (in vie 21 Mieto
1.3 (in questo modo) 12 mila 103 4.5 45 4.3 (in questo stato del documento in stato
13 del sistema 9 (in vie 91,7 1.4 (in questo stato del documento in stato 1.5 1.
32 Milia risse 12 mila 106 (in inglese) 2.4 (in questo stato del documento in questo 2.3 3 La sua
85 (in questo stato del sistema 12 mila 105 Del sistema 5.8 (in linguaggio dei com>) 5.6 (in inglese)
170 del sistema di 9 (in vie 106 (in inglese) 1.1 (inquesto> 1.1 (inquesto>

Tabella 7: Risultati QC per et-IPA nel siero di mangusta (g/mL).

Tipo di esca e concentrazione di esche etiliche IPA (g/mL)
Periodo di tempo 0.4% - Blister 1,0% - Blister 0.14% - Matrice controllo
Media (SD) N Media (SD) N Media (SD) N Media (SD) N
Giorno 0 Nd 5 Del numero 3( Nd 4 DEL psu' Nd 6 È possibile: Nd 3 (COM del nome
Giorno 1 13,7 (10,9) 2 Il nome del sistema 11.2 (10,4) 4 DEL psu' 20.6 (17.3) 2 Il nome del sistema Na Na
Giorno 7 11,5 (6,3) 6 È possibile: 9.9 (9.6) 4 DEL psu' 21.4 (10,9) 6 È possibile: Nd 3 (COM del nome
Giorno 14 10.2 (5.2) 6 È possibile: 5,7 (2,5) 3 (COM del nome 17,8 (10,2) 6 È possibile: Nd 3 (COM del nome
Giorno 21 8.9 (4.1) 4 DEL psu' 10.0 (9.5) 4 DEL psu' 23.8 (5.3) 3 (COM del nome Nd 2 Il nome del sistema
Giorno 28 8.5 (3,9) 5 Del numero 3( 11.1 (10,6) 3 (COM del nome 17.7 (9.3) 4 DEL psu' Nd 3 (COM del nome
Giorno 35 17.0 (NA) 1 : il nome del 9.1 (9.0) 4 DEL psu' 21,7 (9.3) 2 Il nome del sistema Nd 1 : il nome del
Giorno 42 Na 0 (in vie 8.4 (8.5) 4 DEL psu' 16.5 (NA) 1 : il nome del Nd 2 Il nome del sistema
Giorno 49 10.2 (5,8) 2 Il nome del sistema 8.1 (8.4) 4 DEL psu' 17,5 (4,7) 2 Il nome del sistema Nd 2 Il nome del sistema
Giorno 56 10.9 (5.4) 2 Il nome del sistema 3.8 (1.1) 3 (COM del nome 17,6 (6,1) 2 Il nome del sistema Nd 2 Il nome del sistema

Tabella 8: Media (spicca (sputa tura [SD]) concentrazione di siero etil-IPA per tipo di esca. ND - non rilevato, NA - Non applicabile.

Dose e concentrazione di IPA metile (g/mL)
Periodo di tempo 0,04% 0,07% 0,14% controllo
Media (SD) N Media (SD) N Media (SD) N Media (SD) N
Giorno 0 ND (NA) 4 DEL psu' ND (NA) 4 DEL psu' ND (NA) 4 DEL psu' ND (NA) 4 DEL psu'
Giorno 1 7.8 (7.1) 4 DEL psu' 22.2 (9,2) 4 DEL psu' 29.1 (16,0) 4 DEL psu' ND (NA) 4 DEL psu'
Giorno 7 4.4 (4.8) 4 DEL psu' 14.4 (4.6) 4 DEL psu' 21.3 (12,0) 4 DEL psu' ND (NA) 4 DEL psu'
Giorno 14 5,7 (5,9) 4 DEL psu' 12,0 (3,5) 4 DEL psu' 19.6 (10.6) 4 DEL psu' ND (NA) 4 DEL psu'
Giorno 21 4.9 (4.5) 4 DEL psu' 12,0 (0,8) 3 (COM del nome 18.3 (9.9) 4 DEL psu' ND (NA) 4 DEL psu'
Giorno 28 5.4 (5.0) 4 DEL psu' 9.8 (2.4) 4 DEL psu' 16.4 (8.1) 4 DEL psu' ND (NA) 4 DEL psu'

Tabella 9: Concentrazione media di siero di metile-IPA per dose. ND - Non rilevato, NA - Non applicabile. Tutte le concentrazioni di IPA metile sono state incorporate nella matrice esterna delle esche.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il metodo LC-MS/MS sviluppato per gli studi ha utilizzato la selettività del monitoraggio della reazione multipla per quantificare con precisione me-IPA ed et-IPA nel siero di mangusta. La selettività del rilevamento MS/MS ha anche permesso un semplice protocollo di pulizia basato esclusivamente sull'acetonitrile per far precipitare le proteine dal siero prima dell'analisi.

Gli acidi ifenossia sono solubili in ACN ma sono praticamente insolubili in acqua. Per escludere l'acqua dall'estrazione ACN, è stato aggiunto cloruro di sodio per forzare una separazione di fase acqua limpida:ACN aumentando la forza ionica della fase acquosa (siero). L'acido trifluoracetico volatile (TFA) è stato aggiunto anche per garantire che gli acidi iofenossia fossero protonizzati durante l'estrazione e sarebbero più facilmente solubilizzati nella fase ACN. Il TFA viene rimosso durante la fase di dry-down prima dell'analisi LC-MS/MS.

Le estrazioni di sangue da mangusta erano di circa 1 mL, producendo 0,5 mL o meno di sera. Per eseguire analisi replicate di ogni campione, è stata necessaria una procedura di preparazione del campione su microscala che utilizzava tubi di microcentrifuga piuttosto che bicchieri di laboratorio analitici tipici come pipette volumetrici di classe A e flaconi. Per ottenere risultati precisi e precisi è necessario che gli analisti siano abili nell'uso di siringhe di microlitro di vetro e pipettori di ripetizione a spostamento positivo con punte di dimensioni microlitro.

Una limitazione di questo metodo è che richiede costosi strumenti LC-MS/MS e analisti addestrati nel suo utilizzo e manutenzione. Tuttavia, poiché me-IPA ed et-IPA sono rese di base risolte utilizzando le condizioni HPLC descritte, il metodo potrebbe essere potenzialmente adattato a un LCMS a quadrianteriore singolo o HPLC con rilevatore UV a condizione che non siano state osservate interferenze.

La differenza nelle concentrazioni medie di siero tra le manguste che hanno consumato esche con et-IPA nel blister pack e matrice esca alla dose di 2,8 mg suggerisce la fuoriuscita quando il marcatore è contenuto nel blister pack, piuttosto che incorporato nella matrice esca. Questo può avere implicazioni allo scopo di stimare il vaccino in contrapposizione all'assorbimento delle esche. Ad esempio, l'incorporazione del marcatore nella matrice esterna delle esche può gonfiare la stima della copertura del vaccino se l'animale mangia la matrice ma il vaccino fuoriesce. Tuttavia, le restrizioni normative possono impedire la capacità di mescolare un marcatore biologico direttamente con un vaccino all'interno del blister pack. Nei casi in cui è stato registrato il consumo del <100%, tre casi riguardavano esche contenenti et-IPA nel blister pack, due dei quali erano la maggiore concentrazione dell'1%. Ciò suggerisce una potenziale avversione al gusto quando et-IPA è a concentrazioni più elevate. Quando le esche contenenti 1% (20,0 mg) et-IPA incorporate nella matrice delle esche sono state offerte alle manguste, tutti gli animali hanno rifiutato l'esca.

Le concentrazioni medie di IPA per et- e me-IPA al giorno 14 erano rispettivamente di circa 17 e 19 g/mL. Ricerche simili condotte presso l'Instituto de Investigaciàn en Recursos Cinegéticos, Ciudad Real, Spagna, utilizzando butile e pentilo-IPA ha trovato giorno 14 concentrazioni di circa 45 e 10g/mL in mangusta sera quando consegnato alla stessa concentrazione ed esca formulazione come nel nostro studio. Queste differenze suggeriscono che diversi derivati di IPA possono metabolizzare a tassi diversi nelle manguste, che può essere utile quando la ritenzione dei marcatori (ritenzione a breve o lungo termine) è una preoccupazione.

Le differenze nella fisiologia del sistema gastrointestinale possono influenzare l'assorbimento e l'escrezione di IPA in diverse specie. L'emivita di eliminazione del plasma dell'IPA nei gatti domestici (Felis catus) quando viene consegnata a 1,5 mg/kg era di 107 giorni, mentre il tasso di opossum a coda di pennello allo stesso tasso di dose era di circa un giornoe 28. Quando l'IPA è stato somministrato alle capre domestiche (Capra aegagrus hircus) ad un tasso di dose di 1,5 mg/kg l'emivita terminale di eliminazione dell'IPA era di 81 giorni, anche se gli investigatori hanno continuato a trovare elevate concentrazioni di iodio fino a 160 giorni dopo la somministrazione 39.Il sistema gastrointestinale dei membri dei Vivveridae (la famiglia a cui erano state precedentemente assegnate40delle manguste ) è descritto come simile a quello del gatto domestico41, il che può spiegare il tempo di ritenzione dell'IPA in Manguste. La ricerca suggerisce anche che l'IPA può essere metabolizzato in modo diverso nei marsupiali, consentendo un'escrezione più rapida rispetto alle specie euteriche29.

Entrambi i derivati dell'IPA valutati in questo studio hanno fornito capacità di marcatura a lungo termine (4-8 settimane) nelle manguste. L'uso dell'IPA come marcatore biologico nelle manguste dovrebbe prendere in considerazione gli obiettivi dello studio e la durata desiderata della marcatura. Nei casi in cui gli animali devono essere contrassegnati dagli stessi siti di studio per periodi di tempo consecutivi, diversi derivati dell'IPA potrebbero essere utilizzati per garantire che i risultati di un evento di marcatura non siano confusi marcando durante gli eventi precedenti. Come parte dell'ORV operativo per la fauna selvatica negli Stati Uniti, il campionamento delle specie bersaglio e i test per la presenza di RVNA e biomarcatore sono in genere condotti 4-6 settimane dopo la distribuzione ORV42. Da un punto di vista pratico, sembra che sia et- o me-IPA può essere facilmente rilevato durante questo periodo di tempo. La ricerca futura per valutare la funzione di decadimento dei residui nelle manguste ha offerto varie concentrazioni di entrambi i congeneri di IPA valutati in questo studio sarebbe utile.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori AV e SO sono dipendenti a tempo pieno di un produttore di esche vaccino rabbia orale.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, servizio di ispezione della salute animale e vegetale, servizi naturali, programma nazionale di gestione della rabbia e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Germania).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
  2. Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
  3. Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
  4. Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
  5. Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
  6. Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
  7. Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
  8. Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
  9. Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
  10. Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
  11. Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
  12. de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
  13. Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
  14. Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
  15. Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
  16. Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
  17. Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
  18. Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
  19. Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
  20. Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
  21. Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  22. Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. Shumake, S. A., Bullard, R. W. , American Society for Testing and Materials. Philadelphia. 5th Volume. STP 974 141-147 (1987).
  23. Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
  24. Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
  25. Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
  26. Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
  27. Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
  28. Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
  29. Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
  30. Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
  31. Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
  32. Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
  33. Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
  34. Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
  35. Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
  36. Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
  37. Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
  38. Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
  39. Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
  40. Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. Mongooses: their natural history. , Oliver and Boyd. Edinburgh and London. (1967).
  41. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
  42. National Rabies Management Program (NRMP). Oral rabies vaccination draft operations manual. , USDA APHIS Wildlife Services. (2009).

Tags

Immunologia e infezione Numero 147 Marcatore biologico Herpestes uropopunctatus acido iofenostico rabbia piccola mangusta indiana LC-MS/MS
Analisi degli analoghi dell'acido iofenostico nella piccola mangusta indiana (<em>Herpestes Auropunctatus</em>) Sera per l'uso come marcatore biologico di vaccinazione della rabbia orale
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T.,… More

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter