Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ аналогов иофеноковой кислоты в малых индийских mongoose (Herpestes Auropunctatus) Сера для использования в качестве устного бешенства Вакцинация Биологического маркера

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

Мы предложили плен мангусты плацебо пероральной вакцины против бешенства вакцины с этил или метиловой иофеноковой кислоты в качестве биомаркера и проверенные поглощения приманки с помощью новой жидкой хроматографии с тандемной масс-спектрометрии (LC-MS /MS) метод.

Abstract

Небольшой индийский мангуст(Herpestes auropunctatus) является резервуаром вируса бешенства (RABV) в Пуэрто-Рико и составляет более 70% случаев бешенства животных, зарегистрированных ежегодно. Контроль циркуляции RABV в резервуарах дикой природы, как правило, осуществляется стратегией вакцинации против оральных бешенств (ORV). В настоящее время в Пуэрто-Рико не существует программы дикой природы ORV. Исследования пероральных вакцин против бешенства и различных типов приманки для мангустов были проведены с многообещающими результатами. Мониторинг успеха ORV опирается на оценку поглощения приманки целевыми видами, которая обычно включает в себя оценку изменения в RABV нейтрализующих антител (RVNA) после вакцинации. Эту стратегию может быть трудно интерпретировать в районах с активной программой ORV дикой природы или в районах, где RABV является энзоотическим и фоновые уровни РВНА присутствуют в водохранилищах видов. В таких ситуациях может быть полезным биомаркер, включенный в вакцину или матрицу приманки. Мы предложили 16 плен мангусты плацебо ORV приманки, содержащие этил-иофеноксовую кислоту (et-IPA) в концентрациях 0,4% и 1% внутри приманки и 0,14% во внешней матрице приманки. Мы также предложили 12 пленных мангуст ORV приманки, содержащие метил-iophenoxic кислоты (ме-IPA) в концентрациях 0,035%, 0,07% и 0,14% во внешней матрице приманки. Мы собрали образец сыворотки до приманки предлагая, а затем еженедельно на срок до восьми недель после предложения. Мы извлекли иофенковедные кислоты из сыкты в ацетонитрил и количественно с помощью жидкой хроматографии / масс-спектрометрии. Мы проанализировали серу для et-IPA или me-IPA с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии. Мы нашли адекватную способность маркировки, по крайней мере восемь и четыре недели для и так овечий и i-IPA, соответственно. Оба производных IPA могут быть пригодны для оценки ORV приманки поглощения в мангустах. Из-за долговечности маркера в мангуста сера, следует проявлять осторожность, чтобы не смущовать результаты с помощью той же производной IPA во время последовательных оценок.

Introduction

Вирус бешенства (RABV) является отрицательным чувством одного мель лиссавирус, и циркулирует среди различных видов диких животных водохранилища в рамках заказов Carnivora и Chiroptera. Несколько видов мангуста являются резервуарами RABV, и небольшой индийский мангуст (Herpestes auropunctatus) является единственным резервуаром в Пуэрто-Рико и других Карибских островов в Западном полушарии1,2,3 . Контроль циркуляции RABV в резервуарах дикой природы, как правило, осуществляется в рамках стратегии вакцинации против оральных бешенства (ORV). В Соединенных Штатах (США), эта деятельность по управлению координируется USDA / APHIS / Дикой службы Национальной программы по борьбе с бешенством (NRMP)4. В настоящее время в Пуэрто-Рико не существует программы дикой природы ORV. Исследования в вакцинах против бешенства и различных типов приманки для мангустов было проведенос многообещающими результатами предлагая ORV программа для мангустов возможно 5,6,7,8.

Мониторинг воздействия ORV опирается на оценку поглощения приманки целевыми видами, которая обычно включает в себя оценку изменения серораспространенности противотел R. Тем не менее, эта стратегия может быть сложной задачей в районах с активной дикой природы ORV программ или в районах, где Р. является энзоотическим и фоновые уровни RABV нейтрализующих антител (RVNA) присутствуют в водохранилище видов. В таких ситуациях может быть полезным биомаркер, включенный в приманку или внешнюю матрицу приманки.

Различные биологические маркеры были использованы для мониторинга поглощения приманки в многочисленных видов, в том числе енотов (Procyon лотор)9,10, stoats (Mustela горностай)11,12, Европейские барсуки ( Мелес Мелес) 13, дикие кабаны (Sus scrofa)14, небольшие индийские мангусты15 и прерии собак (Cynomysludovicianus)16,17, среди других. В США, операционные приманки ORV часто включают 1% тетрациклина биомаркер в матрице приманки для мониторинга поглощения приманки18,19. Тем не менее, недостатки использования тетрациклина включают растущую озабоченность по поводу распределения антибиотиков в окружающую среду и что обнаружение тетрациклина, как правило, инвазивные, требующие удаления зубов или уничтожения животного для получения кости образцы20. Родамин B был оценен в качестве маркера в различных тканях и может быть обнаружен с помощью ультрафиолетового (УФ) света и флуоресценции в волосах и усы10,21.

Иофеноковая кислота (IPA) является белый, кристаллический порошок, который был использован для оценки потребления приманки в койотов (Canis latrans)22, арктическая лиса (Vulpes lagopus)23, красная лиса (Vulpes vulpes)24, еноты 9 До 9 , 25, дикий кабан14, красный олень (Cervus elaphus scoticus)26, Европейские барсуки12 и хорьки (M. furo)27, среди нескольких других видов млекопитающих. Время удержания IPA варьируется в зависимости от вида от менее чем двух недель в некоторых сумчатых28,29, по крайней мере 26 недель в книжающих26 и более 52 недель в домашних собак (Canis lupus familiaris)30. Время удержания также может быть зависимым от дозы31. Иофеноковая кислота сильно связывается с альбумином в сыворотке крови и исторически была обнаружена путем измерения уровня йода в крови32. Этот косвенный подход был вытеснен высокопроизводительными методами жидкой хроматографии (HPLC) для непосредственного измерения концентраций иофеноковой кислоты с УФ-детектором33,и в конечном итоге с жидкой хроматографией и масс-спектрометрией (LCMS) 34,35. Для этого исследования была разработана высокочувствительная и селективная жидкая хроматография с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS), которая использует многократный мониторинг реакции (MRM) для количественной оценки двух аналогов иофеноксиновой кислоты. Наша цель состояла в том, чтобы использовать этот метод LC-MS/MS для оценки способности маркировки 2-(3-гидрокси-2,4,6-триоодобензил) пропаниной кислоты (метил-IPA или me-IPA) и 2-(3-гидрокси-2,4,6-triiodobenzyl) бутаноиновой кислоты (ethyl-IPA или et-IPA) при доставке в приманка для пленных мангустов.

Мангусты были живы ею, захваченными в ловушках в клетках, заманиваемых коммерчески доступными копчеными сосисками и рыбьим жиром. Мангусты размещались в отдельных клетках из 60 см х 60 см х 40 см из нержавеющей стали и кормили ежедневным рационом в размере 50 г коммерческого сухого кошачьего корма, дополняемого два раза в неделю коммерчески доступным куриным бедренным... Вода была доступна объявление libitum. Мы поставили два производных IPA, этил-IPA и метил-IPA, в плен мангусты в плацебо ORV приманки. Все приманки состояли из 28 мм х 20 мм х 9 мм фольги волдырь пакет с внешним покрытием (в дальнейшем "приманка матрицы"), содержащий порошкообразное куриное яйцо и желатин (Таблица материалов). Приманки содержали 0,7 мл воды или производной IPA и весили около 3 г, из которых 2 г были внешней матрицей приманки.

Мы предложили 16 пленных мангустов и МПА в трех концентрациях: 0,14% (2,8 мг и МПА в матрице приманки 2 г; 3 самца, 3 самки, 0,4% (2,8 мг и МГ АПИ в объеме упаковки 0,7 мл волдыря; 3 м, 3f) и 1,0% (7,0 мг этил-IPA в 0,7 мл блистерного пакета; 2 м , 2f). Общая доза 2,8 мг соответствует дозе 5 мг/кг27,36 и основана на среднем весе мангуста 560 г в Пуэрто-Рико. Мы выбрали 1% в качестве самой высокой концентрации, как исследования показывают, отвращение вкуса кнекоторым биомаркеров может произойти в концентрациях Мы только предложили 1% дозы в волдырь пакет, как флоккуляция предотвратить растворение от растворения в растворителе достаточно, чтобы быть равномерно включены в матрицу приманки. Одна контрольная группа (2м, 1f) получила приманки, наполненные стерильной водой и без АПИ. Мы предлагали приманки мангустам утром (8 утра) во время или до кормления их ежедневного рациона обслуживания. Остатки приманки были удалены примерно через 24 часа. Мы собрали образцы крови до лечения, один день после лечения, а затем еженедельно до 8 недель после лечения. Мы обезопасили мангусты путем вдыхания изофлурана газа и собрали до 1,0 мл цельной крови путем венипанктуры черепной полы вены, как описано для хорьков38. Мы центрифугированные образцы цельной крови, перенесли серту в криовиалы и хранили их при -80 градусах Цельсия до анализа. Не все животные были отобраны в течение всех периодов времени, чтобы свести к минимуму воздействие повторных черпает крови на здоровье животных. Контроль животных были отобраны на день 0, а затем еженедельно в течение 8 недель после лечения.

Мы доставили мне-IPA в трех концентрациях: 0,035% (0,7 мг), 0,07% (1,4 мг) и 0,14% (2,8 мг), все включены в матрицу приманки, с 2 мужчин и 2 женщин на группу лечения. Два самца и две самки получили приманки, наполненные стерильной водой, и не АПИ. Приманка предлагая раз и мангуста анестезии описаны выше. Мы собрали образцы крови до начала лечения на 1-й день, а затем еженедельно до 4 недель после лечения.

Мы проверили данные о концентрации сыворотки на нормальность и предполагаемые средства для концентрации iPA в сыворотке сыворотки различных групп лечения. Мы использовали линейную смешанную модель для сравнения средних концентраций сыворотки и IPA, объединенных между отдельными лицами. Тип приманки (матрица/волдырь пакет) был фиксированный эффект в дополнение к экспериментальной день, в то время как животное ID был случайный эффект. Все процедуры были запущены с использованием общего статистического программного обеспечения(Таблицаматериалов), и значение было оценено на уровне 0,05 евро.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были одобрены институциональным Комитетом по уходу и использованию животных Национального исследовательского центра дикой природы Министерства сельского хозяйства США в соответствии с утвержденным протоколом исследований «A-2597».

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает процедуру анализа для обнаружения метил-иофеноксиевой кислоты в сыворотке мангуста. Этот метод является окончательной версией итеративного процесса, который начался с анализа этил-иофеноковой кислоты в сыворотке мангуста. В ходе первоначальной оценки этил-иофеноковой кислоты были внесены незначительные изменения в методы, в результате чего окончательный протокол представлен ниже. Представитель результаты включают те, полученные во время обеих итераций.

1. Подготовка решений и стандартов

  1. Купить me-IPA и et-IPA.
  2. Для мобильной фазы А подготовьте 1 л из 0,1% (v/v) форм-кислоты в воде, объединив 1 мл формической кислоты с 1 л ультрачистой воды (18 МЗ). Для мобильной фазы B, подготовить 1 л 0,1% (v/v) формическая кислота в ацетонитриле (ACN) путем объединения 1 мл formic кислоты с 1 L ACN.
  3. Для разбавителя, подготовить 200 мл 0,5% (v/v) трифтороацетической кислоты (TFA) в ACN путем объединения 1 мл TFA с 200 мл ACN.
  4. Подготовьте концентрированные пассовные растворы IPA me-IPA и IPA в ACN в концентрациях около 1000 мкг/мл.
    1. Взвешивание примерно 10 мг меня-IPA на микробаланс е и записывать массу до 0,0001 мг. Количественно передать me-IPA в 10 мл класса А объемная колба с использованием 45 мл ACN. Sonicate 1 мин, чтобы растворить все твердые вещества, а затем довести до объема с ACN.
    2. Передача 8 мл каждого бульона в стеклянные флаконы янтаря 8 мл с поли-тетрафторэтиленом (PTFE) подкладками колпачков. Хранить при комнатной температуре (RT). Передача оставшегося запаса в опасные отходы.
  5. Для 25x-7 me-IPA акции (Таблица 1), подготовить запас me-IPA в ACN примерно на 200 мкг /мл. Пример: Передача 1 мл концентрированного запаса me-IPA от шага 1.4.2 до 5 мл класса А объемной колбы с использованием стеклянного шприца объемом 1000 л. Разбавить до объема с ACN. Перенесите бульон на стеклянный флакон янтаря 8 мл с крышкой, облицованной PTFE. Хранить в RT.
  6. Подготовьте шесть дополнительных 25x me-IPA Акции описаны в таблице 1. Для каждого запаса, объединить объемы, указанные с помощью повторного пипетка в янтаре 8 мл янтарного стекла флакон с PTFE подкладкой крышкой. Храните каждый запас на RT.
  7. Для 25x суррогатного фонда, подготовить суррогатный запас me-IPA в ACN примерно на 10 мкг /мл из концентрированного запаса подготовлены в шаге 1.4.2. Передача 0,100 мл концентрированного запаса me-IPA в объемную колбу класса А 100 мл с использованием стеклянного шприца объемом 100 л, а затем разбавить объемом с помощью ACN.
    1. Передача 8 мл на янтарный 8-мл стеклянный флакон с PTFE подкладкой крышкой. Хранить на RT. Перенесите оставшийся запас на опасные отходы.
  8. Подготовка 4x запасов, содержащих оба анализирует в 2 мл винт-топ стеклянные аутоссий, как описано в таблице 2.
    1. Например, чтобы подготовить запас 4x-7, к флакону 2 мл, добавьте 0,20 мл запаса 25x-7 me-IPA со ступени 1.5 с помощью повторного пипетки с наконечником емкости 0,5 мл. Добавьте 0,20 мл 25-х суррогатного и IPA с ступени 1.7 с помощью повторного пипетатора с наконечником емкости 0,5 мл.
    2. Добавьте 0,85 мл ACN с помощью повторного пипетки с наконечником емкости 1 мл. Cap флакон надежно и инвертировать 5x для смешивания.
  9. Подготовьте стандартную кривую в 2 мл винт-топ автосимер флаконы, как описано в таблице 3.
    1. Например, чтобы подготовить стандартный 7 (Std 7), к флакону объемом 2 мл, добавьте 0,20 мл запаса 4x-7 с ступени 1.8.2 с помощью повторного пипетатора с наконечником емкости 0,5 мл. Добавьте 0,60 мл ультрачистой воды DI с помощью повторного пипетатора с наконечником емкости 1 мл. Cap флакон надежно и инвертировать 5x для смешивания.

2. Подготовка образцов

ВНИМАНИЕ: Персонал, выполняющий эту процедуру, должен был получить полную серию предэкспозиционной профилактики бешенства и иметь документированный титр антител бешенства выше 0,5 МЕ из Федерального медицинского учреждения по охране здоровья. Персонал должен носить лабораторные пальто и защиту глаз в любое время при выполнении извлечения. ВНИМАНИЕ: Выполните шаги 2.3'2.6 в шкафе биобезопасности класса II.

  1. Для каждого образца подготовьте микроцентрифугную трубку размером 1,5 мл, содержащую 200–300 мг NaCl.Arrange трубки в пластиковой стойке на 80 позиций. Отложите для использования в шаге 2.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: микро совок (или другое небольшое измерительное устройство) рекомендуется для большого количества образцов.
  2. Для каждого образца пометьте две микроцентрифуги мощностью 1,5 мл: одну как "А", а другую - "B". Расположите трубки в 80-позиционной пластиковой стойке.
  3. Поместите следующие материалы и оборудование, необходимые для извлечения сыворотки в шкаф у биобезопасности класса II: микроцентрифугные трубки (в стеллажах), подготовленные в шагах 2.1 и 2.2, вихревой смеситель, повторный пипеттор с 0,5 мл и 5 мл наконечников емкости, 100-1000 л водоизмещения пипетка с 1000 наконечниками, контейнеры примерно 100 мл каждая из разбавительной и ультрачистой воды DI, а также контейнер для биоопасных отходов.
  4. Удалите образцы сыворотки из замороженного хранения и подогрейте до RT в шкафу для биобезопасности. Vortex смешивают каждый образец сыворотки перед отбором проб.
  5. Используя повторный пипетктор с наконечником емкости 0,5 мл, разделите 0,050 мл сыворотки мангуста в трубку "А" и добавьте 0,050 мл 25-х суррогатного запаса. Затем добавьте 0,950 мл разбавителя в трубку "А" с помощью повторного пипетки с наконечником емкости 5 мл. Крышка надежно и вихревой смеси для 10'15 s.
  6. Распределите предварительно взвешенный NaCl со ступени 2.1 в трубку "A" и вихревую смесь 3x для 8'12 с. Протрите внешние поверхности флакона, содержащего трубку "А", используя 70% (v/v) изопропанол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стойка образцов теперь может быть удалена из шкафа биобезопасности класса II.
  7. Центрифуга трубки "А" на 12000 х г в течение 1 мин, чтобы отделить вацовых и ACN фаз. Пипетка 0,80 мл верхней фазы ACN к трубке "B" с помощью пипетки водоизмещением воздуха объемом 100-1000 л. Перенесите оставшийся раствор в трубку "А" в опасные отходы и выбросите пустую трубку в контейнер для биоопасных отходов.
  8. Удалите ACN и TFA из трубки "B" с нежным потоком газа N2 в водяной бане 45 градусов по Цельсию.
  9. Добавьте 0,250 мл ACN в трубку "B" с помощью повторного пипетки, вихревой смеси для 4'5 s, а затем центрифуги кратко (2'4 s) на 12000 х г, чтобы собрать жидкость в нижней части трубки.
  10. Добавьте 0,750 мл ультрачистой воды DI в трубку "B", используя повторный пипетктор с наконечником емкости 5 мл, вихревой смесью на 4х5 с, а затем центрифугу в течение 1 мин при 12 000 х г, чтобы прояснить образец.
  11. Передача 0,75 мл супернатанта на флакон автосэмпера с помощью пипетки для водоизмещения воздуха в 1000 л. Отбросьте пипетки советы в контейнере биоопасных отходов.
  12. Cap autosampler флаконы надежно и анализировать по LC-MS/MS (раздел 4). Перенесите оставшийся раствор в трубку "В" на опасные отходы и выбросите пустую трубку в контейнер для биоопасных отходов. Утилизировать все биоопасные отходы путем автоматического сжигания или сжигания.

3. Образцы контроля качества

ВНИМАНИЕ: Следуйте предостережениям, описанным в разделе 2.

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура описывает минимальное количество образцов контроля качества (КК), необходимых для анализа. Реплики на каждом уровне рекомендуется, если достаточно контроля мангуста сыворотки.

  1. Приготовьте четыре микроцентрифуговых трубки мощностью 1,5 мл, содержащих 200-300 мг NaCl. Расположите трубки в 80-позиционной пластиковой стойке.
  2. Для каждого образца КК пометьте две микроцентрифуги мощностью 1,5 мл: одну как "А", а другую - "B". Расположите трубки в 80-позиционной пластиковой стойке.
  3. Повторите шаг 2.3.
  4. Удалить контроль мурашки мангуста из замороженных хранения и тепло й RT в шкафу биобезопасности. Vortex смешивают контрольную сыворотку перед отбором проб.
  5. Распределите 0,050 мл контрольной сыворотки мангуста в четыре 1,5-мл "А" трубки с помощью повторного пипетки с наконечником емкости 0,5 мл.
  6. Убежьте каждый из четырех образцов КК, указанных в таблице 4, используя повторный пипетктор с наконечником емкости 0,5 мл. Cap каждый образец КК надежно и вихревой смеси для 10'15 s.
  7. Выполните процедуру извлечения, описанную в шагах 2.6–2.12.

4. Анализ LC-MS/MS

  1. Налажить LC-MS/MS со всеми параметрами, описанными в таблице 5. Питание на LC-MS/MS и позволяет столбцу достичь 70 градусов по Цельсию, прежде чем установить скорость потока до 0,800 мл/мин.
  2. Настройка последовательности в программном обеспечении для сбора данных(Таблицаматериалов), чтобы ввести стандартную кривую до и после каждой партии, состоящей из образцов контроля качества и неизвестных образцов.
  3. Впрысните все стандарты и образцы и приобретите хроматограммы MRM иона, используя параметры, перечисленные в таблице5.
  4. После завершения последовательности выключите LC-MS/MS и утилизируйте все флаконы автосэмпера в качестве опасных отходов.

5. Количественная оценка

  1. Используйте программное обеспечение для анализа данных для создания кривой калибровки относительных ответов по сравнению с относительными концентрациями для меня-IPA, используя et-IPA в качестве внутреннего стандарта. Рассчитайте относительные ответы от перехода quantifier MRM для me-IPA (556.6 и 428.7), разделенных переходом MRM для et-IPA (570.7 и 442.7). Постройте 7-уровневую кривую калибровки, используя квадратную функцию второго порядка, которая взвешивается 1/x и игнорирует происхождение.
  2. Рассчитайте концентрацию сыворотки (Cсыворотки)me-IPA с помощью следующего уравнения:
    Equation 1
    где cинструмент омованием будет концентрация обусловленная аппаратурой от кривой калибровки в Equation 2 блоках мкг/мл, 1.25 фактор разбавления, Vвыпускной будет окончательным томом образца (1.0 ml), и сывороткой V будет том сыворотки в mL ( 0,050 мл номинальная).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представитель ионных хроматограмм из анализа me-IPA представлены на рисунке 1. Контроль мурашки мангуста(рисунок 1A) иллюстрирует время удержания et-IPA (суррогатный аналитик) и отсутствие меня-IPA в указанное время удержания. Образец контроля качества(рисунок 1B) иллюстрирует базовое разделение me-IPA от et-IPA, а также квантификатор и квалификационные переходы для me-IPA. На рисунке 1С показанретельный образец исследования с наблюдаемой концентрацией сыворотки 33,5 мкг/мл м/МЛ м-IPA.

Репрезентативная кривая калибровки из анализа me-IPA представлена на рисунке 2. Стандартная кривая 7-уровня и 14 пунктов колеблется от 0,00202 до 8,27 мкг/мл мл м/МЛ м-IPA с коэффициентом корреляции (r2) 0,9998. Коэффициенты корреляции варьировались от 0,9998 до 0,99997 для пяти анализов МЭИ. Концентрация суррогатного аналита и АПИ по всем стандартам составила 0,502 мкг/мл.

В таблице 6 представлены результаты точности и точности для контроля мангуста сыворотки укреплены с 0, 1,3, 31, и 82 мкг /мл меня-IPA (n no 10 на каждом уровне). Результаты были собраны на пяти отдельных анализах. Процент возмещения варьировался от 96,9% до 109%. Процентное относительное стандартное отклонение (% RSD) на трех уровнях укрепления составило 3,4%, 1,7% и 2,3% соответственно.

Соотношение сигнала к шуму (S/N), наблюдаемое в образцах контроля качества (n no 10 отрицательных элементов управления; n No 10 при 1,3 мкг/мл мл м/IPA) использовалось для определения предела обнаружения (DL; 3 x S/N) и ограничения количественной оценки (ЗЛ; 10 х S/N). DL и Зл для меня-IPA в сыворотке мангуста были 0,012 мкг/мл и 0,042 мкг/мл, соответственно.

Пиковые реакции области перехода квалификатора MRMEquation 3 разделены переходом quantifier MRM (был рассчитан для всех стандартов и образцов. Это соотношение для каждой выборки было затем разделено на среднее соотношение, наблюдаемое в стандартах калибровки, чтобы определить соответствие квалификаторного процента. Коэффициент квалификатора для выборки, показанной на рисунке 1C, составил 0,439, сравнив 96,3%.

Восстановление суррогатного аналита et-IPA было рассчитано для всех образцов КК и неизвестных образцов путем деления реакции на пиковую область et-IPA на средний пиковый ответ в области пиковой зоны, наблюдаемый в стандартах калибровки. Средний показатель суррогатного аналита составил 91,0% (отрицательный контроль), 91,4% (1,3 мкг/мл), 92,8% (31 мкг/мл) и 95,4% (82 мкг/мл).

Нет помех пики для квантификатора или квалификационных переходов me-IPA не наблюдались в контроле мангуста сыворотки(рисунок 1A).

Процедура извлечения и инструментальные условия, используемые для определения et-IPA в сыворотке мурахов(рисунок 3 и таблица 7) были идентичны методу me-IPA, но со следующими изменениями. Пропил-иофеноковая кислота (pr-IPA) использовалась в качестве суррогатного аналита и использовалась более старая, менее чувствительная LC-MS/MS. Температура исходного сушки газа составляла 350 градусов с потоком 12 л/мин и давлением небулайзера 35 пси. Напряжение капилляров составило -2500 В. Источник не имел оболочки газа или средств для регулировки напряжения сопла. Переход квантификатора MRM для et-IPA составил 570,7 и 442,8 (584,7 и 456,8 для pr-IPA). Фрагментатор был 80 V и энергия столкновения была 10 V для обоих analytes. Квалификатор MRM для et-IPA составил 570,7 и 126,8 с энергией столкновения 40 В.

Тестирование всех образцов сыворотки мангуста для et-IPA было проведено в течение восьми анализов. 7-уровневая кривая калибровки колебалась от 0,00207 до 8,48мкг/мл с корреляционными коэффициентами (r 2) в диапазоне от 0,9990 до 0,9999. Концентрация суррогатного аналита PR-IPA составила 0,512 мкг/мл. В таблице 7 представлены результаты точности и точности для контроля мангуста сыворотки, укрепленные 0, 1,3, 13, 32, 85 и 170 мкг/мл me-IPA. Результаты были собраны на восьми отдельных анализах. Процент возмещения варьировался от 89,5% до 115%. % RSD на пяти уровнях фортификации составил 4,3%, 1,5%, 2,3%, 5,6% и 1,1% соответственно. S/N наблюдаемые в образцах контроля качества (n no 21 отрицательный контроль; n No 21 на 1.3 мкг/мЛ me-IPA) был использован для определения DL и Зл. DL и Зл для меня-IPA в сыворотке мангуста были 0,12 мкг/мл и 0,42 мкг/мл, соответственно. Средний суррогатный аналит восстановления из образцов контроля качества составил 86,8% (n 75). В контрольной сыворотке мангуста не наблюдалось никаких пиков помех ни для квантификатора, ни для квалификационных переходов et-IPA.

Все мангусты предложили et-IPA приманки потребляется 25% от приманки в течение 24 часов ограничения времени и были количественные уровни et-IPA в их sera (Таблица 8). Из анализа смешанной модели, общие средние концентрации IPA сыворотки были незначительно выше от приманок с 2,8 мг биомаркера в матрице приманки (17,5 мкг/мл, 95% ДИ 11,7-23,3 мкг/мл) по сравнению с волдыремной упаковкой (9,8 мкг/мл, 95% ДИ 4.0-15,6 г/м/м) , P 0,07). Концентрации для обоих типов приманки гложили с экспериментальным днем (- -0.15 й 0.04, F 14.4, P й 0.0005). Наблюдалась индивидуальная изменчивость уровня в концентрациях IPA в сыворотке матки (оценка параметра ковариантности животного ID - 46,6 и 20,7). Все мангусты потребляется 100% контрольных приманок только с пустой фольги волдырь пакет оставшихся. Средняя концентрация остатков ET-IPA в сыворотке была переменной по времени и, как представляется, не уменьшалась последовательно с течением времени(рисунок 3).

Все мангусты предложили мне-IPA приманки потребляется 25% от приманки в течение 24 часов срок и были количественные уровни меня-IPA в их sera (Таблица 9). Средняя серологическая концентрация и т.д. и me-IPA в мангусте сера появились в зависимости от концентрации АПИ в приманке. Более высокие концентрации АПИ в приманке привели к более высоким остаткам сыворотки даже в тех случаях, когда общая доза (2,8 мг в случае и т.д. ИПА) осталась прежней. Интересно, что мне-IPA, как представляется, производят более равномерной модели деградации с течением времени с первоначальным всплеском в день 1, а затем устойчивое снижение до дня 14, где концентрации, как представляется, плато (Рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1 : Представительина ионных хроматограмм. (A) Представитель МРМ ионная хроматограмма контрольной сыворотки мангуста, укрепленной суррогатной аналитовой этил-иофеноковой кислотой (et-IPA). Стрелка указывает время удержания метил-иофеноксиновой кислоты (me-IPA). (B) Представитель MRM ионная хроматограмма контроля мангуста сыворотки укреплены с 31 мкг /мЛ меня-IPA. Показаны относительные интенсивности квантификаторных (квантовых) и квалификационных (квалификаторных) переходов для me-IPA. (C) Представитель MRM ионная хроматограмма образца сыворотки мангуста с наблюдаемой концентрацией me-IPA 33.5 мкг/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Кривая калибровки представителя. Оригинальная кривая калибровки, генерируемая программным обеспечением для анализа данных для метил-иофеноковой кислоты (me-IPA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Средняя концентрация этилового сыворотки IPA (et-IPA) по типу приманки и концентрации с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Средняя концентрация метила сыворотки (me-IPA) концентрацией концентрации приманки с течением времени. Все концентрации ME-IPA были включены во внешнюю матрицу приманки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

me-IPA Концентрация (мкг/мл)
Id
25x-7 Ссылка на шаг 1.6 200 г.
25x-6 Комбинат 1.000 мл 25x-7 запас с 3.000 мл ACN 50 лет
25x-5 Комбинат 1.000 мл 25x-6 запас с 3.000 мл ACN 13 Год
25x-4 Комбинат 1.000 мл 25x-5 запас с 3.000 мл ACN 3.1
25x-3 Комбинат 1.000 мл 25x-4 запас с 3.000 мл ACN 0,78
25x-2 Комбинат 1.000 мл 25x-3 акции с 3.000 мл ACN 0,2
25x-1 Комбинат 1.000 мл 25x-2 акции с 3.000 мл ACN 0,049

Таблица 1: Приготовление 25x me-IPA запасов в ACN (в 8-мл янтарного стекла флаконы).

Концентрация (мкг/мл)
Id me-IPA et-IPA
4x-7 0,200 мл 25x-7 0,200 мл 25x суррогатная мать 0,850 мл ACN 32 год 1,6
4x-6 0,200 мл 25x-6 0,200 мл 25x суррогатная мать 0,850 мл ACN 8 1,6
4x-5 0,200 мл 25x-5 0,200 мл 25x суррогатная мать 0,850 мл ACN 2 1,6
4x-4 0,200 мл 25х-4 0,200 мл 25x суррогатная мать 0,850 мл ACN 0,5 1,6
4x-3 0,200 мл 25x-3 0,200 мл 25x суррогатная мать 0,850 мл ACN 0,12 1,6
4x-2 0,200 мл 25x-2 0,200 мл 25x суррогатная мать 0,850 мл ACN 0,031 1,6
4x-1 0,200 мл 25x-1 0,200 мл 25x суррогатная мать 0,850 мл ACN 0,008 1,6
4x-0 0,200 мл 25x Суррогатная ю 1,050 мл ACN 0.00 1,6

Таблица 2: Подготовка 4x запасов АПИ в ACN (в 2-мл автосэмпере флаконов).

Концентрация (мкг/мл)
Id me-IPA et-IPA
Std 7 0,200 мл 4x-7 и 0,600 мл DI воды 8 0,4
Std 6 0,200 мл 4x-6 и 0,600 мл DI воды 2 0,4
Std 5 0,200 мл 4x-5 и 0,600 мл DI воды 0,5 0,4
Std 4 0,200 мл 4x-4 и 0,600 мл DI воды 0,13 0,4
Std 3 0,200 мл 4x-3 и 0,600 мл DI воды 0,03 0,4
Std 2 0,200 мл 4x-2 и 0,600 мл DI воды 0,0078 0,4
Std 1 0,200 мл 4x-1 и 0,600 мл DI воды 0,002 0,4
Std 0 0,200 мл 4x-0 и 0,600 мл DI воды 0.00 0,4
Пустой 0,200 мл ACN 0.600 мл DI воды 0.00 0.00

Таблица 3: Подготовка стандартов ME-IPA в воде 75/25/ACN (в 2-мл автосэмпере флаконов).

Концентрация (мкг/мл) в сыворотке
Id me-IPA et-IPA
Отрицательный контроль 0,050 мл 25x Суррогатная ю 0,950 мл Диуль 0.00 10 Лет
Низкое укрепление 0,050 мл 25x Суррогатная ю 0,020 мл 25х-4 0,930 мл Диуль 1,2 10 Лет
Среднее фортификационное сооружение 0,050 мл 25x Суррогатная ю 0,030 мл 25х-6 0,920 мл Диуль 30 год 10 Лет
Высокое фортификационное сооружение 0,050 мл 25x Суррогатная ю 0,020 мл 25х-7 0,930 мл Диуль 80 10 Лет

Таблица 4: Укрепление образца контроля качества (подготовка в микроцентрифуговых трубках мощностью 1,5 мл).

Хроматография жидкости:
Столбца: C18, 2,1 x 50 мм, размер частиц 2,5 мкм
Температура столбца: 70 кв. c
Объем инъекций: 5 зл
Расход: 0,800 мл/мин
Мобильный этап: Солвент A: 0,1% для модной кислоты в воде
Солунт Б: 0,1% для меновой кислоты в ACN
Градиентная программа:
Время (мин): 0.00 0,25 2.25 20.25 2.26 3.4 3.41 4,75
% B: 40 г. 40 г. 55 лет 100 100 40 г. 40 г.
Игла мыть: ACN, 3 с
MS/MS Источник: ESI (отрицательный режим)
Температура газа: 300 кв. c
Поток газа: 5 л/мин
Ингалятор: 45 пси
Капиллярной: -4000 V
Напряжение сопла: -500 V
Температура газа оболочки: 250 кв.
Поток газа оболочки: 7 л/мин
MRM Переходы:
Аналит Предшественник Ион (м/z) Продукт Ион (м/z) Фрагментор (V) Энергия столкновения (V) Время в ежей (ms) Сегмент времени
Me-IPA 556,6 428,7 74 12 Лет 60 лет 2
126,9 65 60 лет
126,8 61 год 60 лет
Et-IPA 570,7 442,7 87 16 Год 60 лет
Сегменты времени:
Сегмента Начало (мин) Конец (мин) Тип Переключатель Дельта EMV Полярности Сохраненные данные
1 0.00 0,6 MS2 Сканирование Отходы 0.00 Отрицательные Нет
2 0,6 2 Mrm Для MS -100 Отрицательные Да
3 2 4,75 Сканирование MS2 Отходы 0.00 Положительные Нет
Квантификаторные переходы являются смелыми.

Таблица 5: параметры LC-MS/MS. Ионы продукта количественного иона являются смелыми.

Целевой Наблюдается Процентов
Id День me-IPA me-IPA Восстановления
КК-1 1 0.00 Nd N/A
КК-2 1 0.00 Nd N/A
КК-11 2 0.00 Nd N/A
КК-12 2 0.00 Nd N/A
КК-21 3 0.00 Nd N/A
КК-22 3 0.00 Nd N/A
КК-31 4 0.00 Nd N/A
КК-32 4 0.00 Nd N/A
КК-3 5 0.00 Nd N/A
КК-4 5 0.00 Nd N/A
КК-13 1 1,25 1.26 101% Аве (10) 102%
КК-14 1 1,25 1.23 98.40% SD (sD) 3,50%
КК-23 2 1,25 1.26 101% % RSD 3,40%
КК-24 2 1,25 1.28 102%
КК-33 3 1.29 1,3 101%
КК-34 3 1.29 1,25 96.90%
КК-5 4 1.29 1,37 106%
КК-6 4 1.29 1.41 109%
КК-15 5 1.29 1,3 101%
КК-16 5 1.29 1.34 104%
КК-25 1 30.1 30.2.2.2.2. 100% Аве (10) 103%
КК-26 1 30.1 31.2 104% SD (sD) 1,80%
КК-35 2 30.1 31.1 103% % RSD 1,70%
КК-36 2 30.1 31.1 103%
КК-7 3 31 год 31.6 Для 102%
КК-8 3 31 год 31.4 101%
КК-17 4 31 год 32,5 105%
КК-18 4 31 год 32.8 Для 106%
КК-27 5 31 год 31,7 102%
КК-28 5 31 год 32.1 104%
КК-37 1 80.2 77,8 97.00% Аве (10) 101%
КК-38 1 80.2 78,9 98.40% SD (sD) 2,30%
КК-9 2 80.2 81,8 102% % RSD 2,30%
КК-10 2 80.2 79,8 99.50%
КК-19 3 82,7 83,5 101%
КК-20 3 82,7 84 102%
КК-29 4 82,7 84,7 102%
КК-30 4 82,7 87.2 105%
КК-39 5 82,7 83 100%
КК-40 5 82,7 84.1 102%

Таблица 6: Результаты КК для меня-IPA в сыворотке мангуста (мкг/мл).

Целевая и мЛ (мкг/мл) N Средние (%) SD (%) % RSD
0.00 21 год
1,3 12 Лет 103 г. 4,5 4,3
13 Год 9 До 9 91,7 1.4 1,5
32 год 12 Лет 106 г. 2.4 2,3
85 12 Лет 105 5,8 5.6
170 г. 9 До 9 106 г. 1.1 1.1

Таблица 7: Результаты КК по ит-мап в сыворотке муравьев (мкг/мл).

Тип приманки и концентрация этилового iPA приманки (мкг/мл)
Период времени 0,4% - Блистер 1.0% - Блистер 0,14% - Матрица Управления
Средний (SD) N Средний (SD) N Средний (SD) N Средний (SD) N
День 0 Nd 5 Nd 4 Nd 6 Nd 3
День 1 13.7 (10.9) 2 11.2 (10.4) 4 20.6 (17.3) 2 Na Na
День 7 11.5 (6.3) 6 9.9 (9.6) 4 21.4 (10.9) 6 Nd 3
День 14 10.2 (5.2) 6 5.7 (2.5) 3 17.8 (10.2) 6 Nd 3
День 21 8.9 (4.1) 4 10.0 (9.5) 4 23.8 (5.3) 3 Nd 2
День 28 8.5 (3.9) 5 11.1 (10.6) 3 17.7 (9.3) 4 Nd 3
День 35 17.0 (Na) 1 9.1 (9.0) 4 21.7 (9.3) 2 Nd 1
День 42 Na 0.00 8.4 (8.5) 4 16.5 (Na) 1 Nd 2
День 49 10.2 (5.8) 2 8.1 (8.4) 4 17.5 (4.7) 2 Nd 2
День 56 10.9 (5.4) 2 3.8 (1.1) 3 17.6 (6.1) 2 Nd 2

Таблица 8: Среднее (отклонение стенда (SD) концентрация этилово-IPA сыворотки по типу приманки. ND - не обнаружено, NA - не применимо.

Концентрация дозы и метилового iPA (мкг/мл)
Период времени 0,04% 0,07% 0,14% Управления
Средний (SD) N Средний (SD) N Средний (SD) N Средний (SD) N
День 0 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4
День 1 7.8 (7.1) 4 22.2 (9.2) 4 29.1 (16.0) 4 ND (NA) 4
День 7 4.4 (4.8) 4 14.4 (4.6) 4 21.3 (12.0) 4 ND (NA) 4
День 14 5.7 (5.9) 4 12.0 (3.5) 4 19.6 (10.6) 4 ND (NA) 4
День 21 4.9 (4.5) 4 12.0 (0.8) 3 18.3 (9.9) 4 ND (NA) 4
День 28 5.4 (5.0) 4 9.8 (2.4) 4 16.4 (8.1) 4 ND (NA) 4

Таблица 9: Средняя (SD) концентрация метил-IPA сыворотки в дозе. ND - Не обнаружено, NA - не применимо. Все концентрации метила IPA были включены во внешнюю матрицу приманки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод LC-MS/MS, разработанный для исследований, использовал селективность мониторинга нескольких реакций для точной количественной оценки me-IPA и et-IPA в сыворотке мангуста. Избирательность обнаружения MS/MS также позволила провести простой протокол очистки, опирающийся исключительно на ацетонитрил для осаждения белков из сыворотки до анализа.

Иофенковедные кислоты растворимы в ACN, но практически нерастворимы в воде. Чтобы исключить воду из извлечения ACN, хлорид натрия был добавлен, чтобы заставить чистую воду: ACN фазы разделения за счет увеличения ионной прочности водной (сыворотки) фазы. Летучие кислотные трифторацетарные кислоты (TFA) был также добавлен для обеспечения того, чтобы иофеноксиновые кислоты были протонированы во время извлечения и будет более легко растворяется в фазе ACN. TFA удаляется во время засушливого шага до анализа LC-MS/MS.

Кровь черпает из мангуста было около 1 мл, что дает 0,5 мл или меньше серы. Для проведения репликационных анализов каждого образца требовалась процедура подготовки образцов микромасштаба, в ходе которого использовались микроцентрифугные трубки, а не типичные аналитические лабораторные стеклянные изделия, такие как объемные пипетки класса А и фляги. Для достижения точных и точных результатов необходимо, чтобы аналитики были опытны в использовании стеклянных микролитровых шприцев и положительных-смещенных повторных трубометров с наконечниками размером с микролитр.

Ограничение этого метода заключается в том, что он требует дорогостоящих приборов LC-MS/MS и аналитиков, обученных его использованию и обслуживанию. Однако, поскольку me-IPA и et-IPA являются базовыми решены с использованием условий HPLC описано, метод потенциально может быть адаптирован атлетический к одночетырехборец LCMS или HPLC с УФ-детектором при условии, что никаких помех не наблюдалось.

Разница в средней концентрации сыворотки между мангустами, которые потребляли приманки с et-IPA в волдырь пакет и приманки матрицы на 2,8 мг дозы предполагает разлива, когда маркер содержится в волдырь пакет, а не включены в приманку матрицы. Это может иметь последствия для целей оценки вакцины, а не приманки поглощения. Например, включение маркера во внешнюю матрицу приманки может раздуть оценку охвата вакциной, если животное ест матрицу, но вакцина выплескивается. Тем не менее, нормативные ограничения могут исключить возможность смешивания биологического маркера непосредственно с вакциной в волдырь пакет. В тех случаях, когда было зарегистрировано потребление в 100%, в волдырях было зарегистрировано три случая приманок, содержащих и -АПИ, два из которых были выше 1% концентрации. Это говорит о потенциальном неприятии вкуса, когда et-IPA находится в более высоких концентрациях. Когда приманки, содержащие 1% (20,0 мг) и IPA включены в приманку матрицы были предложены мангусты, все животные отказались от приманки.

Средние концентрации АПИ для и так называемого и мэ-АПИ на 14-й день составляли примерно 17 и 19 мкг/мл, соответственно. Аналогичные исследования, проведенные в Институте investigacion ан Recursos Cineg'ticos, Сьюдад-Реаль, Испания, используя бутил и пентил-IPA обнаружили день 14 концентрации примерно 45 и 10 мкг /мл в мангуста сера при доставке в той же концентрации и приманки формулировки, как в нашем исследовании. Эти различия свидетельствуют о том, что различные производные АПИ могут усваиваться с разной скоростью в мангустах, что может быть полезно, когда удержание маркера (краткосрочное или долгосрочное удержание) вызывает озабоченность.

Различия в физиологии желудочно-кишечного тракта могут повлиять на поглощение и выделение АПИ у различных видов. Плазма ликвидации период полураспада АПИ у домашних кошек(Felis catus) при доставке на 1,5 мг/кг составил 107 дней, в то время как скорость в щеткой опоссумов при той же дозе ставка была примерно один день28. Когда АПИ было уделено внутренних коз(Capra aegagrus hircus) в дозе 1,5 мг/кг терминальной ликвидации период полураспада АПИ был 81 дней, хотя следователи продолжали находить повышенные концентрации йода до 160 дней после введения 39. Желудочно-кишечная система членов Vivveridae (семья, к которой мангусты ранее были назначены40) описывается как аналогичные, что из домашних кошек41, которые могут объяснить время удержания IPA в мангусты. Исследования также показывают, IPA может быть метаболизируется по-разному в сумчатых, что позволяет более быстрое выделение, чем у эвтерийских видов29.

Оба производных АПИ, оцененные в данном исследовании, обеспечили долгосрочную (4–8 недель) способность маркировки у мангустов. Использование АПИ в качестве биологического маркера в мангустах должно учитывать цели исследования и желаемую продолжительность маркировки. В тех случаях, когда животные должны быть отмечены с одних и тех же мест исследования в течение последовательных периодов времени, различные производные IPA могут быть использованы для обеспечения результатов одного события маркировки не путают маркировки во время предыдущих событий. В рамках оперативной ORV для дикой природы в США, отбор проб целевых видов и тестирование на наличие RVNA и биомаркера, как правило, проводится 4-6 недель после распределения ORV42. С практической точки зрения, как представляется, либо и- или меня-IPA могут быть легко обнаружены в течение этого периода времени. Будущие исследования для оценки функции распада остатков в мангустах предлагали различные концентрации обоих сородичи АПИ, оцениваемых в данном исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы AV и SO являются штатными сотрудниками производителя пероральной вакцины против бешенства.

Acknowledgments

Это исследование было частично поддержано программой интрамуральных исследований Министерства сельского хозяйства США, Службы инспекций здоровья животных и растений, Службы охраны дикой природы, Национальной программы по борьбе с бешенством и IDT Biologika (Дессау-Росслау, Германия).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
  2. Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
  3. Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
  4. Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
  5. Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
  6. Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
  7. Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
  8. Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
  9. Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
  10. Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
  11. Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
  12. de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
  13. Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
  14. Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
  15. Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
  16. Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
  17. Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
  18. Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
  19. Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
  20. Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
  21. Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  22. Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. Shumake, S. A., Bullard, R. W. , American Society for Testing and Materials. Philadelphia. 5th Volume. STP 974 141-147 (1987).
  23. Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
  24. Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
  25. Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
  26. Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
  27. Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
  28. Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
  29. Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
  30. Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
  31. Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
  32. Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
  33. Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
  34. Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
  35. Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
  36. Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
  37. Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
  38. Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
  39. Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
  40. Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. Mongooses: their natural history. , Oliver and Boyd. Edinburgh and London. (1967).
  41. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
  42. National Rabies Management Program (NRMP). Oral rabies vaccination draft operations manual. , USDA APHIS Wildlife Services. (2009).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 147 биологический маркер Herpestes auropunctatus иофеноковая кислота бешенство небольшой индийский мангуст LC-MS/MS
Анализ аналогов иофеноковой кислоты в малых индийских mongoose (<em>Herpestes Auropunctatus</em>) Сера для использования в качестве устного бешенства Вакцинация Биологического маркера
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T.,… More

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter