Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse av Iophenoxic acid analoger i Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for bruk som en oral rabies vaksinasjon biologisk markør

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

Vi tilbød fange mongooses placebo muntlig Rabiat vaccine agn med etanol eller metyl iophenoxic syren som biomarkør og bekreftet agn opptak ved hjelp av en roman flytende kromatografi med tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS) metoden.

Abstract

Det liten indisk Mongoose (Herpestes auropunctatus) er en reservoar av rabiat virus (RABV) inne Barnslig Rico og omfatter over 70% av dyr rabiat sakene rapportere årlig. Kontroll av RABV sirkulasjon i dyreliv reservoarer er vanligvis oppnås ved en strategi for oral rabies vaksinasjon (ORV). For tiden ingen dyreliv ORV program finnes i Puerto Rico. Forskning på oral Rabies vaksiner og ulike agn typer for mongooses har blitt gjennomført med lovende resultater. Overvåking suksessen ORV er avhengig av estimering agn opptak av målet arter, som vanligvis innebærer å evaluere en endring i RABV nøytralisere antistoffer (RVNA) post vaksinasjon. Denne strategien kan være vanskelig å tolke i områder med et aktivt dyreliv ORV program eller i områder hvor RABV er enzootic og bakgrunn nivåer av RVNA er til stede i reservoar arter. I slike situasjoner, en biomarkør innarbeidet med vaksinen eller agn matrise kan være nyttig. Vi tilbød 16 fange mongooses placebo ORV agn inneholder etanol-iophenoxic acid (et-IPA) i konsentrasjoner av 0,4% og 1% inne i agn og 0,14% i den eksterne agn matrise. Vi har også tilbudt 12 fange mongooses ORV agn inneholder metyl-iophenoxic acid (Me-IPA) i konsentrasjoner av 0,035%, 0,07% og 0,14% i den eksterne agn matrise. Vi samlet en serum prøve før agn tilbud og deretter ukentlig i opptil åtte uker etter tilbud. Vi hentet Iophenoxic syrer fra Sera i acetonitril og kvantifisert ved hjelp av flytende kromatografi/masse massespektrometri. Vi analyserte Sera for et-IPA eller Me-IPA av flytende kromatografi-masse massespektrometri. Vi fant tilstrekkelig merking evne i minst åtte og fire uker for et-og Me-IPA, henholdsvis. Begge IPA-derivater kan være egnet for felt evaluering av ORV agn opptak i mongooses. På grunn av levetiden av markøren i Mongoose Sera, må forsiktighet tas for å ikke forvirre resultater ved å bruke samme IPA derivat under påfølgende evalueringer.

Introduction

Rabiat virus (RABV) er en negativ fornemme enkelt strandet lyssavirus, og sirkulerer blant Miscellaneous Wildlife reservoar Art innen ordrene rovdyr og Chiroptera. Flere arter av Mongoose er reservoarer av RABV, og den lille indiske Mongoose (Herpestes auropunctatus) er det eneste reservoaret i Puerto Rico og andre karibiske øyer i den vestlige halvkule1,2,3 . Kontroll av RABV sirkulasjon i dyreliv reservoarer er vanligvis oppnås gjennom en strategi for oral rabies vaksinasjon (ORV). Inne det Amerika (oss), denne ledelse aktivitet er koordinert av USDA/APHIS/Wildlife tjenestene nasjonal rabiat ledelse program (NRMP)4. For tiden ingen dyreliv ORV program finnes i Puerto Rico. Forskning i Rabies vaksiner og ulike agn typer for mongooses har blitt gjennomført med lovende resultater antyder en ORV program for mongooses er mulig5,6,7,8.

Overvåking virkningen av ORV er avhengig av estimering agn opptak av målet arter, som vanligvis innebærer å evaluere en endring i RV antistoff seroprevalensdata. Imidlertid kan denne strategien være utfordrende i områder med et aktivt dyreliv ORV programmer eller i områder hvor RV er enzootic og bakgrunn nivåer av RABV nøytralisere antistoffer (RVNA) er til stede i reservoar arter. I slike situasjoner, en biomarkør inkludert i agn eller eksterne agn matrise kan være nyttig.

Ulike biologiske markører har blitt brukt til å overvåke agn opptak i mange arter, inkludert vaskebjørn(Procyon lotor)9,10, stoats (Mustela hermelin)11,12, European Badgers ( Meles Meles) 13, villsvin (SUS Scrofa)14, små indiske mongooses15 og Prairie Dogs (Cynomysludovicianus)16,17, blant andre. I USA, operative ORV agn inkluderer ofte en 1% Tetracycline biomarkør i agn Matrix å overvåke agn opptak18,19. Men ulempene med bruk av Tetracycline inkludere en økende bekymring over fordelingen av antibiotika i miljøet og at påvisning av Tetracycline er vanligvis invasiv, krever tann trekking eller ødeleggelse av dyret for å få bein prøvene20. Rhodamine B har blitt evaluert som en markør i en rekke vev og kan oppdages ved hjelp av ultrafiolett (UV) lys og fluorescens i hår og kinnskjegg10,21.

Iophenoxic acid (IPA) er et hvitt, krystallinsk pulver som har blitt brukt til å evaluere agn forbruket i Coyotes (Canis latrans)22, Arctic Fox(små lagopus)23, Red Fox (små små)24, vaskebjørn 9 andre priser , 25, villsvin14, hjort (Cervus elaphus scoticus)26, europeiske Badgers12 og oppspore (M. Furo)27, blant flere andre pattedyrarter. Oppbevaring ganger av IPA varierer etter arter fra mindre enn to uker i noen marsupials28,29, til minst 26 uker i hjortevilt26 og over 52 uker i innenlandske hunder (Canis lupus familiaris)30. Oppbevaringstiden kan også være dose avhengig31. Iophenoxic acid binder sterkt til serum albumin og ble historisk oppdaget ved å måle blod jod nivåer32. Denne indirekte tilnærmingen ble fortrengt av høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) metoder for å direkte måle iophenoxic syre konsentrasjoner med UV-deteksjon33, og til slutt med flytende kromatografi og masse MASSESPEKTROMETRI (LCMS) 34,35. For denne studien, en svært følsom og selektiv væske kromatografi med tandem masse massespektrometri (LC-MS/MS) metoden ble utviklet som utnytter flere reaksjons overvåking (MRM) å kvantifisere to analoger av iophenoxic syre. Vårt mål var å bruke denne LC-MS/MS metode for å evaluere merkingen evne til 2-(3-AHA-2, 4, 6-triiodobenzyl) propanoic acid (metyl-IPA eller Me-IPA) og 2-(3-AHA-2, 4, 6-triiodobenzyl) butanoic acid (etanol-IPA eller et-IPA) og når den leveres i en ORV agn til fange mongooses.

Mongooses ble levende fanget i bur feller agnet med kommersielt tilgjengelige røkt pølser og fiskeolje. Mongooses ble plassert i individuelle 60 cm x 60 cm x 40 cm rustfritt stål bur og matet en daglig rasjon av ~ 50 g kommersiell tørr kattemat, supplert to ganger per uke med en kommersielt tilgjengelig kylling lår. Vann var tilgjengelig Ad lib. Vi leverte to derivater av IPA, etanol-IPA og metyl-IPA, til fange mongooses i placebo ORV agn. Alle agn var sammensatt av en 28 mm x 20 mm x 9 mm folie blisteren pakke med et eksternt belegg (heretter "agn Matrix") som inneholder pulverisert kylling egg og gelatin (tabell over materialer). Agn inneholdt 0,7 mL vann eller IPA derivat og veide ca 3 g, hvorav ~ 2 g var den eksterne agn matrise.

Vi tilbød 16 fange mongooses et-IPA i tre konsentrasjoner: 0,14% (2,8 mg et-IPA i ~ 2 g agn matrise; 3 hanner [m], 3 kvinner [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA i 0,7 mL pakkevolum; 3m, 3F) og 1,0% (7,0 mg etanol-IPA i 0,7 mL pakkevolum; 2m , 2F). Den totale dosen på 2,8 mg tilsvarer en dose rate på 5 mg/kg27,36 og er basert på en gjennomsnittlig Mongoose vekt på 560 g i Puerto Rico. Vi valgte 1% som den høyeste konsentrasjonen som forskning antyder smak aversjon mot noen biomarkører kan forekomme ved konsentrasjoner > 1% i enkelte arter37. Vi tilbød kun 1% dose i pakningen da flokk ule Rings forhindret stoff fra å oppløses i væsken som var tilstrekkelig innlemmet i agn matrisen. En kontrollgruppe (2m, 1F) fikk agn fylt med sterilt vann og ingen IPA. Vi tilbød agn til mongooses i morgen (~ 8 am) under eller før fôring av deres daglige vedlikehold rasjon. Agn rester ble fjernet etter ca 24 timer. Vi samlet blodprøver før behandling, en dag etter behandling og ukentlig opp til 8 uker etter behandling. Vi anesthetized mongooses ved innånding av isoflurane gass og samlet opp til 1,0 mL av hele blodet ved venepunksjon av skallen vena cava som beskrevet for oppspore38. Vi sentrifugert hele blodprøver, overført Sera til cryovials og lagret dem ved-80 ° c til analyse. Ikke alle dyrene ble samplet under alle tidsperioder for å minimere virkningene av gjentatte blodprøver på helsen til dyrene. Kontroll dyr ble samplet på dag 0, deretter ukentlig i opptil 8 uker etter behandling.

Vi leverte Me-IPA i tre konsentrasjoner: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) og 0,14% (2,8 mg), alle innlemmet i agn matrise, med 2 hanner og 2 kvinner per behandling gruppe. To menn og to kvinner fikk agn fylt med sterilt vann og ingen IPA. Agn tilbyr ganger og Mongoose anestesi er beskrevet ovenfor. Vi samlet blodprøver før behandling på dag 1, og deretter ukentlig opptil 4 uker etter behandling.

Vi testet serumkonsentrasjon data for normalitet og estimert middel for serum IPA konsentrasjoner av ulike behandlingsgrupper. Vi brukte en lineær blandet modell for å sammenligne bety serum et-IPA konsentrasjoner samlet på tvers av individer. Agn type (Matrix/bli Ste pakning) var en fast effekt i tillegg til eksperimentell dag, mens dyr ID var en tilfeldig effekt. Alle prosedyrer ble kjørt med vanlig statistisk programvare (tabell av materialer) og betydning ble evaluert ved α = 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av USDA National Wildlife Research Center institusjonelle Animal Care og use Committee under godkjent forskning protokollen QA-2597.

Merk: følgende protokoll beskriver analyse prosedyren for å oppdage metyl-iophenoxic syre i Mongoose serum. Denne metoden er den endelige versjonen av en gjentakende prosess som begynte med analyse av etanol-iophenoxic syre i Mongoose serum. Under den første evalueringen av etanol-iophenoxic yre mindre modifikasjoner ble gjort til metodene, noe som resulterer i den endelige protokollen som presenteres nedenfor. Representative resultater inkluderer de som ble innhentet i begge gjentakelser.

1. utarbeidelse av løsninger og standarder

  1. Kjøp Me-IPA og et-IPA.
  2. For mobil fase A klargjør du 1 L av 0,1% (v/v) maursyre syre i vann ved å kombinere 1 mL maursyre syre med 1 L ultrarent vann (≥ 18 MΩ). For mobil fase B klargjør du 1 L av 0,1% (v/v) maursyre yre i acetonitril (ACN) ved å kombinere 1 mL maursyre syre med 1 L av ACN.
  3. For fortynningsmiddel klargjør du 200 mL 0,5% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA) i ACN ved å kombinere 1 mL TFA med 200 mL av ACN.
  4. Forbered konsentrerte IPA lager løsninger av Me-IPA og et-IPA i ACN ved konsentrasjoner på ca 1 000 μg/mL.
    1. Veie ca 10 mg Me-IPA på en mikrovekt og ta opp massen til ± 0,0001 mg. kvantitativt overfører Me-IPA til en 10 mL klasse A volum kolbe med 45 mL ACN. Sonikere 1 min for å oppløse alle faste stoffer, og deretter bringe til volum med ACN.
    2. Overføring ~ 8 mL av hver aksje til gult 8 mL hetteglass med tetrafluoroethylene (PTFE)-foret caps. Oppbevares ved romtemperatur (RT). Overfør gjenværende lager til farlig avfall.
  5. For 25x-7 Me-IPA-lager (tabell 1), klargjør du et lager av Me-IPA i ACN på ca. 200 μg/ml. Eksempel: Overfør 1 mL av Me-IPA konsentrert lager fra trinn 1.4.2 til 5 mL klasse A volum kolbe ved hjelp av en 1 000 μL glass sprøyte. Fortynne til volum med ACN. Overfør aksjen til et gult 8 mL hetteglass med PTFE-deksel. Oppbevares på RT.
  6. Forbered de seks ekstra 25x Me-IPA-aksjene som er beskrevet i tabell 1. For hver aksje kombineres volumene som indikeres ved bruk av en gjentakelses pipettehjelper i et gult 8 mL gult hetteglass med PTFE-lokk. Lagre hver aksje på RT.
  7. For 25x surrogat lager, klargjør du et surrogat lager av Me-IPA i ACN på ca. 10 μg/mL fra konsentrert lager fremstilt i trinn 1.4.2. Overfør 0,100 mL av den konsentrerte Me-IPA-aksjen til en 10 mL klasse A volum kolbe ved hjelp av en 100 μL glass sprøyte, og deretter fortynnes til volum med ACN.
    1. Overføring ~ 8 mL til et gult 8-mL hetteglass med PTFE cap. Oppbevares på RT. Overfør gjenværende beholdning til farlig avfall.
  8. Forbered 4X-aksjer som inneholder begge analytter i 2 mL autosampler hetteglass, som beskrevet i tabell 2.
    1. Hvis du for eksempel vil klargjøre lager 4X-7, til et 2 mL hetteglass, legger du til 0,20 mL av 25x-7 Me-IPA-aksjen fra trinn 1,5 ved hjelp av en gjentatt pipettehjelper med 0,5 mL kapasitets spiss. Tilsett 0,20 mL av 25x surrogat et-IPA-lager fra trinn 1,7 ved hjelp av en gjentatt pipettehjelper med 0,5 mL kapasitets spiss.
    2. Legg til 0,85 mL av ACN ved å bruke en gjentakelses pipettehjelper med 1 mL kapasitets spiss. Hetteglasset trygt og Inverter 5x for å mikse.
  9. Klargjør standardkurven i 2 mL skrue-autosampler hetteglass som beskrevet i tabell 3.
    1. Hvis du for eksempel vil klargjøre standard 7 (std. 7), til et hetteglass på 2 mL, legger du til 0,20 mL av 4X-7 Stock fra trinn 1.8.2 ved hjelp av en gjentatt pipettehjelper med 0,5 mL kapasitets spiss. Tilsett 0,60 mL ultrarent DI vann ved hjelp av en gjentakelses pipettehjelper med 1 mL kapasitets spiss. Hetteglasset trygt og Inverter 5x for å mikse.

2. prøve forberedelser

Advarsel: personell som utfører denne prosedyren, må ha mottatt hele serien med en før eksponerings forebygging, og har et dokumentert rabies antistoff titer over 0,5 IU fra en føderal yrkesmessig helse utpekt medisinsk innretning. Personell må bruke laboratorie frakker og øyebeskyttelse til enhver tid under ekstraksjon. FORSIKTIG: Utfør trinn 2.3 − 2.6 i et klasse II biosafety kabinett.

  1. For hver prøve klargjør du et 1,5 mL mikrosentrifugen rør som inneholder 200 − 300 mg NaCl. ordne rørene i en 80-posisjons plast rack. Sett til side for bruk i trinn 2,6.
    Merk: en mikro scoop (eller en annen liten måle anordning) anbefales for et stort antall prøver.
  2. For hver prøve, etikett to 1,5 mL mikrosentrifugen rør: en som "A" og den andre som "B". Ordne rørene i en 80-posisjon plast rack.
  3. Plasser følgende materialer og utstyr som trengs for serum ekstraksjon i en klasse II biosafety kabinett: mikrosentrifugen rør (i stativer) fremstilt i trinn 2,1 og 2,2, en Vortex mikser, gjenta pipettehjelper med 0,5 mL og 5 mL kapasitets Tupper, 100 − 1000 μL luft forskyvning Pipetter med 1 000 μL-spisser, beholdere med ca. 100 mL hver av fortynnings-og ultrarent DI-vann og en beholder for farlig biologisk avfall.
  4. Fjern serumprøver fra frossen lagring og varm til RT i biosafety skapet. Vortex Mix hvert serum prøve før prøvetaking.
  5. Ved hjelp av en gjentakelses pipettehjelper med 0,5 mL kapasitets spiss, dispensere 0,050 mL Mongoose serum i rør "A" og tilsett 0,050 mL 25x surrogat lager. Legg deretter til 0,950 mL fortynningsvæske til rør "A" ved hjelp av en gjentatt pipettehjelper med 5 mL kapasitets spiss. Cap sikkert og Vortex mix for 10 − 15 s.
  6. Dispensere den pre-veide NaCl fra trinn 2,1 inn i rør "A" og Vortex Mix 3x for 8 − 12 s. Tørk av de utvendige overflatene på hetteglass stativet som inneholder rør "A" med 70% (v/v) isopropanol.
    Merk: stativet av prøvene kan nå fjernes fra klasse II biosafety kabinett.
  7. Sentrifugerør "A" ved 12 000 x g for 1 min for å skille de VANDIGE og ACN-fasene. Pipetter 0,80 mL av den øvre ACN-fasen til rør "B" ved hjelp av en 100 − 1000 μL luftvolum pipette. Overfør den resterende løsningen i rør "A" til farlig avfall og kast det tomme røret i en biologisk farlige avfallsbeholder.
  8. Fjern ACN og TFA fra rør "B" med en svak strøm av N2 gass i et vannbad på 45 ° c.
  9. Tilsett 0,250 mL av ACN til rør "B" ved hjelp av en gjentakelses pipettehjelper, Vortex mix for 4 − 5 s, og deretter sentrifuger kort (2 − 4 s) ved 12 000 x g for å samle væsken i bunnen av røret.
  10. Tilsett 0,750 mL ultrarent DI vann til rør "B" ved hjelp av en gjentatt pipettehjelper med 5 mL kapasitets spiss, Vortex mix for 4 − 5 s, og deretter sentrifuge i 1 min ved 12 000 x g for å avklare prøven.
  11. Overfør 0,75 mL av supernatanten til et autosampler hetteglass med en 1 000 μL luftvolum pipette. Kast pipette-spisser i beholderen for farlig avfall.
  12. Cap autosampler hetteglass sikkert og analysere ved LC-MS/MS (del 4). Overfør den resterende løsningen i rør "B" til farlig avfall og kast den tomme slangen til en biologisk farlige avfallsbeholder. Kast alt biologisk farlige avfall ved autoklavering eller forbrenning.

3. kvalitetskontroll prøver

FORSIKTIG: Følg advarsels erklæringene som er beskrevet i avsnitt 2.

Merk: følgende fremgangsmåte beskriver det minste antallet kvalitetskontroll prøver som kreves for en analyse. Replikerer på hvert nivå anbefales hvis tilstrekkelig kontroll Mongoose serum er tilgjengelig.

  1. Klargjør fire 1,5 mL mikrosentrifugen rør som inneholder 200 − 300 mg NaCl. Ordne rørene i en 80-posisjon plast rack.
  2. For hvert QC-utvalg, etikett to 1,5 mL mikrosentrifugen rør: en som "A" og den andre som "B". Ordne rørene i en 80-posisjon plast rack.
  3. Gjenta trinn 2,3.
  4. Fjernkontroll Mongoose serum fra frossen lagring og varm til RT i biosafety skapet. Vortex blander kontroll serum før prøvetaking.
  5. Dispensere 0,050 mL kontroll Mongoose serum i de fire 1,5-mL "A"-rørene ved hjelp av en gjentakelses pipettehjelper med 0,5 mL kapasitets spiss.
  6. Forsterk hver av de fire QC-prøvene som er spesifisert i Tabell 4 med en gjentakelses pipettehjelper med 0,5 ml kapasitets spiss. Cap hver QC prøve sikkert og Vortex mix for 10 − 15 s.
  7. Utfør avsugs prosedyren som beskrevet i trinn 2.6 − 2.12.

4. LC-MS/MS-analyse

  1. Konfigurer LC-MS/MS med alle parametere som er beskrevet i tabell 5. Slå på LC-MS/MS og la kolonnen nå 70 ° c før du setter strømningshastigheten til 0,800 mL/min.
  2. Sett opp en sekvens i datainnsamlingsprogram varen (tabell med materialer) for å injisere standardkurven før og etter hver bunke som består av kvalitetskontroll prøver og ukjente prøver.
  3. Injiser alle standarder og prøver og Skaff deg MRM ion kromatogrammene ved hjelp av parametre listet opp i tabell 5.
  4. Etter at sekvensen er ferdig, slå av LC-MS/MS og kast alle autosampler hetteglass som farlig avfall.

5. kvantifisering

  1. Bruk dataanalyse programvare for å generere en kalibrering kurve av relative responser versus relative konsentrasjoner for Me-IPA bruker et-IPA som den interne standarden. Beregn de relative svarene fra Kvantifikatoren MRM-overgang for Me-IPA (556,6 → 428,7) dividert med MRM-overgangen for et-IPA (570,7 → 442,7). Lag en 7-nivå kalibrerings kurve ved hjelp av en annen ordre kvadratisk funksjon som er vektet 1/x og ignorerer opprinnelsen.
  2. Beregn serumkonsentrasjon (Cserum) av Me-IPA ved hjelp av følgende ligning:
    Equation 1
    der cinstrument er konsentrasjonen bestemmes av instrumentet fra kalibreringskurven i enheter av μg/mL, 1,25 er fortynningsfaktoren Equation 2 , vFinal er det endelige prøvevolumet (1,0 ml), og Vserum er serum volumet i ml ( 0,050 mL nominell).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative ion-kromatogrammene fra en Me-IPA-analyse presenteres i figur 1. Kontrollen Mongoose serum (figur 1a) illustrerer Oppbevaringstiden til et-IPA (surrogat analytt) og fraværet av Me-IPA på angitt oppbevaringstid. Utvalget av kvalitetskontroll (fig. 1b) illustrerer den Baseline separasjon av Me-IPA fra et-IPA, samt Kvantifikatoren og kvalifiserings overganger for Me-IPA. Figur 1C viser et representativt utvalg fra studien med en observert serumkonsentrasjon på 33,5 μg/ml Me-IPA.

En representativ kalibrerings kurve fra en Me-IPA-analyse presenteres i figur 2. Den 7-nivå, 14-punkts standardkurven varierer fra 0,00202 til 8,27 μg/mL Me-IPA med en korrelasjonskoeffisient (r2) av 0,9998. Korrelasjonskoeffisienter varierte fra 0,9998 til 0,99997 for de fem Me-IPA-analysene. Den surrogat analytt et-IPA-konsentrasjonen var 0,502 μg/mL i alle standarder.

Tabell 6 viser nøyaktigheten og presisjons resultatene for kontroll Mongoose serum forsterket med 0, 1,3, 31 og 82 μg/ml Me-IPA (n = 10 på hvert nivå). Resultatene ble samlet inn fra fem separate analyser. Prosent gjenoppretting varierte fra 96,9% til 109%. Prosent relative standardavviket (% RSD) på de tre festnings nivåene var henholdsvis 3,4%, 1,7% og 2,3%.

Signal-til-støy-forholdet (S/N) observert i kvalitetskontroll prøver (n = 10 negative kontroller; n = 10 ved 1,3 μg/mL Me-IPA) ble brukt til å bestemme deteksjons grensen (DL; 3 x S/N) og kvantifisering grense (QL; 10 x S/N). DL og QL for Me-IPA i Mongoose serum var henholdsvis 0,012 μg/mL og 0,042 μg/mL.

Topp området svar av kvalifiseringen MRM overgangen delt på Kvantifikatoren MRM overgang (Equation 3 ble beregnet for alle standarder og prøver. Dette forholdet for hver prøve ble deretter delt av gjennomsnittlig ratio observert i kalibrering standarder for å bestemme kvalifisering prosent match. Kvalifiserings raten for prøven vist i figur 1C var 0,439, med en 96,3% match.

Utvinningen av et-IPA surrogat analytt ble beregnet for alle QC-prøver og ukjente prøver ved å dele et-IPA topp område respons av gjennomsnittlig et-IPA topp område respons observert i kalibrerings standardene. Gjennomsnittlige surrogat analytt gjenoppretting var 91,0% (negative kontroller), 91,4% (1,3 μg/mL), 92,8% (31 μg/mL) og 95,4% (82 μg/mL).

Ingen forstyrrelser topper for enten Kvantifikatoren eller kvalifisering overganger av Me-IPA ble observert i kontroll Mongoose serum (figur 1a).

Utvinningsprosessen og instrumentale tilstander som brukes til å bestemme et-IPA i Mongoose serum (Figur 3 og Tabell 7) var IDENTISK med Me-IPA-metoden, men med følgende endringer. Propyl-iophenoxic acid (pr-IPA) ble brukt som surrogat analytt og en eldre, mindre følsom LC-MS/MS ble brukt. Kilden tørking gass temperaturen var 350 ° c med en strøm av 12 L/min og et forstøveren Trykk på 35 PSI. Kapillær spenningen var-2 500 V. Kilden hadde ingen skjede gass eller midler til å justere dyse spenning. Den Kvantifikatoren MRM overgang for et-IPA var 570,7 → 442,8 (584,7 → 456,8 for pr-IPA). Fragmentor var 80 V og kollisjonsenergien var 10 V for begge analytter. Kvalifiseringen MRM for et-IPA var 570,7 → 126,8 med en kollisjon energi på 40 V.

Testingen av alle Mongoose serumprøver for et-IPA ble utført over åtte analyser. Den 7-nivå kalibreringskurven varierte fra 0,00207 til 8,48 μg/mL med korrelasjonskoeffisienter (r2) som spenner fra 0,9990 til 0,9999. Den surrogat analytt pr-IPA-konsentrasjonen var 0,512 μg/mL. Tabell 7 viser nøyaktigheten og presisjons resultatene for kontroll Mongoose serum forsterket med 0, 1,3, 13, 32, 85 og 170 μg/ml Me-IPA. Resultatene ble samlet inn fra åtte separate analyser. Prosent gjenoppretting varierte fra 89,5% til 115%. Den% RSD på de fem festningsverk nivåene var 4,3%, 1,5%, 2,3%, 5,6%, og 1,1%, henholdsvis. S/N observert i kvalitetskontroll prøver (n = 21 negative kontroller; N = 21 ved 1,3 μg/mL Me-IPA) ble brukt til å bestemme DL og QL. DL og QL for Me-IPA i Mongoose serum var henholdsvis 0,12 μg/mL og 0,42 μg/mL. Den gjennomsnittlige surrogat analytt gjenopprettingen fra kvalitetskontroll prøvene var 86,8% (n = 75). Ingen forstyrrelser topper for enten Kvantifikatoren eller kvalifisering overganger av et-IPA ble observert i kontroll Mongoose serum.

Alle mongooses tilbudt et-IPA agn konsumert ≥ 25% av agnet innen 24 timers tidsbegrensning og hadde målbare nivåer av et-IPA i sin Sera (tabell 8). Fra den blandede modell analysen var generelle gjennomsnitts konsentrasjoner av serum IPA-konsentrasjonene marginalt høyere fra agn med 2,8 mg biomarkør i agn matrisen (17,5 μg/mL, 95% CI 11.7 − 23.3 μg/mL) sammenlignet med pakningen (9,8 μg/ml, 95% CI 4.0 − 15,6 μg/mL) (F = 3,6 , P = 0,07). Konsentrasjoner for begge agn typer forfalt med eksperimentell dag (β =-0,15 ± 0,04, F = 14,4, P = 0,0005). Individuelle nivå variasjon i serum IPA-konsentrasjoner ble observert (dyre-ID-kovariansen parameter estimat = 46,6 ± 20,7). Alle mongooses forbrukes 100% av kontroll agn med kun den tomme folien som gjenstår. Mean konsentrasjon av et-IPA rester i serum var variabel etter tidsperiode og ikke ut til å avta konsekvent over tid (Figur 3).

Alle mongooses tilbød meg-IPA agn konsumert ≥ 25% av agnet innen 24 timers frist og hadde målbare nivåer av Me-IPA i sin Sera (tabell 9). Mean serologisk konsentrasjon av et-og Me-IPA i Mongoose Sera dukket avhengig av konsentrasjonen av IPA i agnet. Høyere konsentrasjoner av IPA i agnet resulterte i høyere serum rester selv i tilfeller der den totale dosen (2,8 mg i tilfelle av et-IPA) forble den samme. Interessant, Me-IPA ut til å produsere en jevnere fornedrelse mønster over tid med en innledende topp på dag 1, etterfulgt av en jevn nedgang til dag 14 hvor konsentrasjonene syntes å platå (Figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Representative ion-kromatogrammene. (A) representative MRM ion kromatogram av kontroll Mongoose serum befestet med surrogat analytt etanol-iophenoxic acid (et-IPA). Pilen angir Oppbevaringstiden for metyl-iophenoxic acid (Me-IPA). (B) representativ MRM ion kromatogram av kontroll Mongoose serum befestet med 31 μg/ml Me-IPA. Den relative intensiteten av Kvantifikatoren (Quant) og kvalifisering (Qual) overganger for Me-IPA vises. (C) representative MRM ion-kromatogram av en Mongoose serum prøve med en observert Me-IPA-konsentrasjon på 33,5 mikrogram/ml. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representativ kalibrerings kurve. En original kalibrerings kurve generert av dataanalyse programvaren for metyl-iophenoxic acid (Me-IPA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Mean serum etanol (et-IPA) konsentrasjon av agn type og konsentrasjon over tid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Mean serum METYL IPA (Me-IPA) konsentrasjon av agn konsentrasjon over tid. Alle Me-IPA konsentrasjoner ble innlemmet i den eksterne agn matrise. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Me-IPA-konsentrasjon (μg/mL)
Id
25x-7 Se trinn 1,6 200
25x-6 Kombiner 1,000 mL 25x-7 Stock med 3,000 mL ACN 50
25x-5 Kombiner 1,000 mL 25x-6 på lager med 3,000 mL ACN 13
25x-4 Kombiner 1,000 mL 25x-5 på lager med 3,000 mL ACN 3,1
25x-3 Kombiner 1,000 mL 25x-4 aksjer med 3,000 mL ACN 0,78
25x-2 Kombiner 1,000 mL 25x-3 lager med 3,000 mL ACN 0,2
25x-1 Kombiner 1,000 mL 25x-2 Stock med 3,000 mL ACN 0,049

Tabell 1: utarbeidelse av 25x Me-IPA-aksjer i ACN (i 8-mL gult hetteglass).

Konsentrasjon (μg/mL)
Id Me-IPA et-IPA
4X-7 0,200 mL 25x-7 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 32 1,6
4X-6 0,200 mL 25x-6 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 8 1,6
4X-5 0,200 mL 25x-5 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 2 1,6
4X-4 0,200 mL 25x-4 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 0,5 1,6
4X-3 0,200 mL 25x-3 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 0,12 1,6
4X-2 0,200 mL 25x-2 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 0,031 1,6
4X-1 0,200 mL 25x-1 + 0,200 mL 25x surrogat + 0,850 mL ACN 0,008 1,6
4X-0 0,200 mL 25x surrogat + 1,050 mL ACN 0 1,6

Tabell 2: utarbeidelse av 4X IPA-aksjer i ACN (i 2-mL autosampler hetteglass).

Konsentrasjon (μg/mL)
Id Me-IPA et-IPA
STD 7 0,200 mL 4X-7 + 0,600 mL DI vann 8 0,4
STD 6 0,200 mL 4X-6 + 0,600 mL DI vann 2 0,4
STD 5 0,200 mL 4X-5 + 0,600 mL DI vann 0,5 0,4
STD 4 0,200 mL 4X-4 + 0,600 mL DI vann 0,13 0,4
STD 3 0,200 mL 4X-3 + 0,600 mL DI vann 0,03 0,4
STD 2 0,200 mL 4X-2 + 0,600 mL DI vann 0,0078 0,4
STD 1 0,200 mL 4X-1 + 0,600 mL DI vann 0,002 0,4
STD 0 0,200 mL 4X-0 + 0,600 mL DI vann 0 0,4
Tom 0,200 mL ACN + 0,600 mL DI vann 0 0

Tabell 3: utarbeidelse av Me-IPA-standarder i 75/25 vann/ACN (i 2 mL autosampler hetteglass).

Konsentrasjon (μg/mL) i serum
Id Me-IPA et-IPA
Negativ kontroll 0,050 mL 25x surrogat + 0,950 mL fortynningsvæske 0 10
Lav festningsverk 0,050 mL 25x surrogat + 0,020 mL 25x-4 + 0,930 mL fortynningsvæske 1,2 10
Midt festningsverk 0,050 mL 25x surrogat + 0,030 mL 25x + 0,920 mL fortynningsvæske 30 10
Høy festning 0,050 mL 25x surrogat + 0,020 mL 25x-7 + 0,930 mL fortynningsvæske 80 10

Tabell 4: kvalitetskontroll prøve festningsverk (Forbered i 1,5 mL mikrosentrifugen rør).

Flytende kromatografi:
Kolonnen: C18, 2,1 x 50 mm, 2,5 μm partikkelstørrelse
Søyle temperatur: 70 ° c
Injeksjon volum: 5 μL
Strømningshastighet: 0,800 mL/min
Mobil fase: Løsemiddel A: 0,1% maursyre syre i vann
Løsemiddel B: 0,1% maursyre syre i ACN
Gradient program:
Klokkeslett (min): 0 0,25 2,25 2,26 3,4 3,41 4,75
B 40 40 55 100 100 40 40
Nål vask: ACN, 3 s
MS/MS kilde: ESI (negativ modus)
Gass temperatur: 300 ° c
Gass strøm: 5 L/min
Forstøveren 45 av PSI
Kapillær: -4000 V
Dyse spenning: -500 V
Skjede gass temperatur: 250 ° c
Skjede gass flyt: 7 L/min
MRM-overganger:
Analytt Forløperen ion (m/z) Produkt ion (m/z) * Fragmentor (V) Kollisjon energi (V) Levetid (MS) Tids segment
Me-IPA 556,6 428,7 74 12 60 2
126,9 65 60
126,8 61 60
Et-IPA 570,7 442,7 87 16 60
Tidssegmenter:
Segmentet Start (min) Slutt (min) Type Omkasteren Delta EMV Polaritet Data lagret
1 0 0,6 MS2 skanning Til avfall 0 Negative nei
2 0,6 2 Mrm Til MS -100 til en Negative ja
3 2 4,75 MS2 skanning Til avfall 0 Positive nei
* Kvantifikatoren overganger er uthevet.

Tabell 5: LC-MS/MS-parametere. Kvantifikatoren produkt ioner er uthevet.

Målet Observert Prosent
Id Dag Me-IPA Me-IPA Utvinning
QC-1 1 0 Nd N/a
QC-2 1 0 Nd N/a
QC-11 2 0 Nd N/a
QC-12 2 0 Nd N/a
QC-21 3 0 Nd N/a
QC-22 3 0 Nd N/a
QC-31 4 0 Nd N/a
QC-32 4 0 Nd N/a
QC-3 5 0 Nd N/a
QC-4 5 0 Nd N/a
QC-13 1 1,25 1,26 101 prosent Ave (10) = 102 prosent
QC-14 1 1,25 1,23 98,40 prosent SD = 3,50 prosent
QC-23 2 1,25 1,26 101 prosent % RSD = 3,40 prosent
QC-24 2 1,25 1,28 102 prosent
QC-33 3 1,29 1,3 101 prosent
QC-34 3 1,29 1,25 96,90 prosent
QC-5 4 1,29 1,37 106 prosent
QC-6 4 1,29 1,41 109 prosent
QC-15 5 1,29 1,3 101 prosent
QC-16 5 1,29 1,34 104 prosent
QC-25 1 30,1 30,2 100 prosent Ave (10) = 103 prosent
QC-26 1 30,1 31,2 104 prosent SD = 1,80 prosent
QC-35 2 30,1 31,1 103 prosent % RSD = 1,70 prosent
QC-36 2 30,1 31,1 103 prosent
QC-7 3 31 31,6 102 prosent
QC-8 3 31 31,4 101 prosent
QC-17 4 31 32,5 105 prosent
QC-18 4 31 32,8 106 prosent
QC-27 5 31 31,7 102 prosent
QC-28 5 31 32,1 104 prosent
QC-37 1 80,2 77,8 97,00 prosent Ave (10) = 101 prosent
QC-38 1 80,2 78,9 98,40 prosent SD = 2,30 prosent
QC-9 2 80,2 81,8 102 prosent % RSD = 2,30 prosent
QC-10 2 80,2 79,8 99,50 prosent
QC-19 3 82,7 83,5 101 prosent
QC-20 3 82,7 84 102 prosent
QC-29 4 82,7 84,7 102 prosent
QC-30 4 82,7 87,2 105 prosent
QC-39 5 82,7 83 100 prosent
QC-40 5 82,7 84,1 102 prosent

Tabell 6: QC-resultater for meg-IPA i Mongoose serum (μg/mL).

Mål et-IPA (μg/mL) N Gjennomsnitt (%) SD (%) % RSD
0 21
1,3 12 103 4,5 4,3
13 9 91,7 1,4 1,5
32 12 106 2,4 2,3
85 12 105 5,8 5,6
170 9 106 1,1 1,1

Tabell 7: QC-resultater for et-IPA i Mongoose serum (μg/mL).

Agn type og etanol-agn konsentrasjon (μg/mL)
Tidsrom 0,4%-blisteren 1,0%-blisteren 0,14%-matrise Kontroll
Gjennomsnitt (SD) N Gjennomsnitt (SD) N Gjennomsnitt (SD) N Gjennomsnitt (SD) N
Dag 0 Nd 5 Nd 4 Nd 6 Nd 3
Dag 1 13,7 (10,9) 2 11,2 (10,4) 4 20,6 (17,3) 2 Na Na
Dag 7 11,5 (6,3) 6 9,9 (9,6) 4 21,4 (10,9) 6 Nd 3
Dag 14 10,2 (5,2) 6 5,7 (2,5) 3 17,8 (10,2) 6 Nd 3
Dag 21 8,9 (4,1) 4 10,0 (9,5) 4 23,8 (5,3) 3 Nd 2
Dag 28 8,5 (3,9) 5 11,1 (10,6) 3 17,7 (9,3) 4 Nd 3
Dag 35 17,0 (NA) 1 9,1 (9,0) 4 21,7 (9,3) 2 Nd 1
Dag 42 Na 0 8,4 (8,5) 4 16,5 (NA) 1 Nd 2
Dag 49 10,2 (5,8) 2 8,1 (8,4) 4 17,5 (4,7) 2 Nd 2
Dag 56 10,9 (5,4) 2 3,8 (1,1) 3 17,6 (6,1) 2 Nd 2

Tabell 8: Mean (stand avvik [SD]) etanol-IPA serumkonsentrasjon av agn type. ND = ikke oppdaget, NA = ikke aktuelt.

Dose og metyl IPA-konsentrasjon (μg/mL)
Tidsrom 0,04 prosent 0,07 prosent 0,14 prosent Kontroll
Gjennomsnitt (SD) N Gjennomsnitt (SD) N Gjennomsnitt (SD) N Gjennomsnitt (SD) N
Dag 0 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4
Dag 1 7,8 (7,1) 4 22,2 (9,2) 4 29,1 (16,0) 4 ND (NA) 4
Dag 7 4,4 (4,8) 4 14,4 (4,6) 4 21,3 (12,0) 4 ND (NA) 4
Dag 14 5,7 (5,9) 4 12,0 (3,5) 4 19,6 (10,6) 4 ND (NA) 4
Dag 21 4,9 (4,5) 4 12,0 (0,8) 3 18,3 (9,9) 4 ND (NA) 4
Dag 28 5,4 (5,0) 4 9,8 (2,4) 4 16,4 (8,1) 4 ND (NA) 4

Tabell 9: gjennomsnittlig (SD) metyl-IPA serumkonsentrasjon etter dose. ND = ikke oppdaget, NA = ikke aktuelt. Alle metyl IPA konsentrasjoner ble innlemmet i den eksterne agn matrise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den LC-MS/MS metoden utviklet for studiene benyttet selektivitet av flere reaksjons overvåkning å nøyaktig kvantifisere Me-IPA og et-IPA i Mongoose serum. Selektivitet av MS/MS deteksjon også tillatt for en enkel oppryddings-up protokoll stole utelukkende på acetonitril å utløse proteiner fra serum før analyse.

Iophenoxic syrer er løselig i ACN, men er praktisk talt uløselig i vann. For å utelukke vann fra ACN-ekstraksjon ble natriumklorid tilsatt for å fremtvinge et klart vann: ACN-fase separasjon ved å øke den joniske styrken i den vandige (serum) fasen. Den flyktige syre trifluoracetic syre (TFA) ble også tilsatt for å sikre at iophenoxic syrer ble protonerte under ekstraksjon og ville bli lettere solubilized i ACN-fasen. TFA fjernes under tørke-ned-trinnet før LC-MS/MS-analyse.

Blodprøver fra Mongoose var ca 1 mL, noe som gir 0,5 mL eller mindre av Sera. For å utføre replikere analyser av hvert utvalg, var en mikro-skala prøve Forberedelses prosedyre nødvendig som brukte mikrosentrifugen rør i stedet for typiske analytiske laboratorie glass som klasse A volum Pipetter og flasker. For å oppnå nøyaktige og presise resultater er det nødvendig at analytikere er dyktige i bruk av glass mikroliter sprøyter og repetisjonspipetter med positiv forskyvning med mikroliter-spisser.

En begrensning av denne metoden er at det krever kostbare LC-MS/MS instrumentering og analytikere opplært i bruk og vedlikehold. Men fordi Me-IPA og et-IPA er Baseline løst ved hjelp av HPLC forholdene beskrevet, kan metoden potensielt være tilpasset en enkelt-quadrupole LCMS eller HPLC med UV-detektor forutsatt ingen forstyrrelser ble observert.

Forskjellen i gjennomsnittlig konsentrasjoner av serum mellom mongooses som brukte agn med et-IPA i pakningen og agn matrisen ved 2,8 mg dose antyder søl når markøren er i pakningen, i stedet for innlemmet i agn matrisen. Dette kan ha implikasjoner for det formål å estimere vaksinen i motsetning til agn opptak. For eksempel, innlemme markøren inn i eksterne agn matrise kan blåse estimering av vaksine dekning hvis dyret spiser matrisen, men vaksinen søl ut. Imidlertid kan regulatoriske restriksjoner utelukke evnen til å blande en biologisk markør direkte med en vaksine i pakningen. I tilfeller der < 100% forbruk ble registrert, var tre tilfeller med agn inneholdende et-IPA i pakningen, hvorav to var høyere 1% konsentrasjon. Dette tyder på potensiell smak aversjon når et-IPA er ved høyere konsentrasjoner. Når agn som inneholder 1% (20,0 mg) et-IPA innlemmet i agn matrisen ble tilbudt å mongooses, avviste alle dyrene agnet.

Gjennomsnittlig IPA-konsentrasjoner for et-og Me-IPA på dag 14 var henholdsvis ca. 17 og 19 μg/mL. Lignende forskning utført ved Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos, Ciudad Real, Spania, ved hjelp av butyl og pentyl-IPA fant dag 14 konsentrasjoner på ca 45 og 10 μg/mL i Mongoose Sera når den leveres på samme konsentrasjon og agn formulering som i vår studie. Disse forskjellene tyder på at ulike derivater av IPA kan forbrenne på ulike priser i mongooses, som kan være nyttig når markør oppbevaring (enten kort eller langtidsoppbevaring) er en bekymring.

Forskjeller i fysiologi av fordøyelsessystemet kan påvirke absorpsjon og utskillelse av IPA i ulike arter. Plasma eliminering halveringstiden av IPA i innenlandske katter (Felis catus) når levert på 1,5 mg/kg var 107 dager mens satsen i Brushtail besitte på samme dose rate var omtrent en dag28. Når IPA ble gitt til innenlandske geiter (Capra aegagrus hircus) ved en dose rate på 1,5 mg/kg terminalen eliminering halveringstiden av IPA var 81 dager, selv om etterforskerne fortsatte å finne forhøyede jod konsentrasjoner opp til 160 dager etter administrasjon 39. den Gastrointestinal system av medlemmer av Vivveridae (familien som mongooses hadde tidligere blitt tildelt40) er beskrevet som ligner på den innenlandske Cat41, som kan forklare oppbevaring tid IPA i mongooses. Forskning antyder også IPA kan være metaboliseres annerledes i marsupials, slik at for raskere utskillelse enn i eutherian arter29.

Begge derivater av IPA evaluert i denne studien ga langsiktige (4 − 8 uker) markere evne i mongooses. Bruken av IPA som en biologisk markør i mongooses bør ta hensyn til studiet mål og ønsket varighet av merking. I tilfeller hvor dyr skal merkes fra samme studie nettsteder i løpet av påfølgende tidsperioder, kan ulike derivater av IPA brukes til å sikre resultater fra en merking hendelse ikke er forbløffet ved merking under tidligere hendelser. Som en del av operasjonell ORV for dyrelivet i USA, prøvetaking målet arter og testing for tilstedeværelsen av RVNA og biomarkør er vanligvis gjennomført 4 − 6 uker etter ORV distribusjon42. Fra et praktisk synspunkt, ser det enten et-eller Me-IPA kan lett oppdages i løpet av denne tidsperioden. Fremtidig forskning for å evaluere rester forfall funksjon i mongooses tilbys ulike konsentrasjoner av både kongenere av IPA evaluert i denne studien vil være nyttig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere av og SO er ansatt ansatte i en oral rabies vaksine agn produsenten.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet delvis av intramural forskningsprogram for det amerikanske Landbruksdepartementet, Animal and Plant Health inspeksjon service, Wildlife Services, National rabies Management program og IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Tyskland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
  2. Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
  3. Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
  4. Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
  5. Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
  6. Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
  7. Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
  8. Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
  9. Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
  10. Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
  11. Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
  12. de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
  13. Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
  14. Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
  15. Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
  16. Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
  17. Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
  18. Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
  19. Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
  20. Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
  21. Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  22. Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. Shumake, S. A., Bullard, R. W. , American Society for Testing and Materials. Philadelphia. 5th Volume. STP 974 141-147 (1987).
  23. Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
  24. Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
  25. Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
  26. Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
  27. Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
  28. Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
  29. Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
  30. Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
  31. Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
  32. Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
  33. Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
  34. Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
  35. Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
  36. Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
  37. Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
  38. Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
  39. Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
  40. Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. Mongooses: their natural history. , Oliver and Boyd. Edinburgh and London. (1967).
  41. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
  42. National Rabies Management Program (NRMP). Oral rabies vaccination draft operations manual. , USDA APHIS Wildlife Services. (2009).

Tags

Immunologi og infeksjon biologisk markør Herpestes auropunctatus iophenoxic syre rabies små indiske MONGOOSE LC-MS/MS
Analyse av Iophenoxic acid analoger i Small Indian Mongoose (<em>Herpestes Auropunctatus</em>) Sera for bruk som en oral rabies vaksinasjon biologisk markør
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T.,… More

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter