Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Küçük Hint firavunları (Herpestes Auropunctatus) sera bir oral kuduz aşılama biyolojik Marker olarak kullanım Için Iophenoxic asit analogları Analizi

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

Biz bir biyomarker olarak etil veya metil iophenoxic asit ile esir Mongooses plasebo oral kuduz aşı yemleri teklif ve tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yöntemi ile yeni bir sıvı kromatografi kullanılarak doğrulanmış yem alım.

Abstract

Küçük Hint firavunkaz (Herpestes auropunctatus) Porto Riko kuduz VIRÜSÜ (rabv) bir rezervuar ve hayvan kuduz olguların% 70 üzerinde oluşur yıllık bildirdi. Yaban hayatı rezervuarında RABV sirkülasyonunun kontrolü genellikle oral kuduz aşısı (ORV) stratejisiyle gerçekleştirilir. Şu anda hiçbir yaban hayatı ORV programı Porto Riko bulunmaktadır. Sözlü kuduz aşıları ve Mongooses için çeşitli yem türleri içine araştırma umut verici sonuçlar ile yapılmıştır. ORV başarısı izleme genellikle RABV nötralize antikorlar (RVNA) sonrası aşılama bir değişiklik değerlendirmek içerir hedef türler tarafından yem alımı tahmin dayanır. Bu strateji aktif bir yaban hayatı ORV programı veya rabv enzootik ve rvna arka plan seviyeleri rezervuar türlerinde mevcut olan alanlarda yorumlamak zor olabilir. Bu gibi durumlarda, aşıyla veya yem matrisine dahil edilen bir biyomarker yararlı olabilir. Biz 16 esir Mongooses plasebo ORV yemler içeren etil-iophenoxic asit (et-IPA) konsantrasyonlarda 0,4% ve 1% yem içinde ve 0,14% dış yem matrisinde. Ayrıca, dış yem matrisinde% 0,035,% 0,07 ve% 0,14 konsantrasyonlarda metil-iophenoxik asit (Me-IPA) içeren 12 esir Mongooses ORV yemler teklif ettik. Biz yem teklif önce bir serum örnek toplanan ve daha sonra haftada sekiz hafta sonrası teklif için. Sera 'dan Asetonitril içine ve sıvı kromatografi/kütle spektrometresi kullanılarak ölçülmüş ıophenoxic asitleri ayıklandık. Et-IPA veya Me-ıPA için sera sıvı kromatografi-kütle spektrometresi ile incelendi. Sırasıyla et ve Me-IPA için en az sekiz ve dört hafta yeterli işaretleme yeteneği bulduk. Her iki ıPA türevleri Mongooses ORV yem alımı alan değerlendirilmesi için uygun olabilir. Mongoose serumunda işaretçinin uzun ömürlü olması nedeniyle, ardışık değerlendirmeler sırasında aynı ıPA türevlerini kullanarak dikkat çekmelidir.

Introduction

Kuduz virüsü (RABV) bir negatif anlamda tek telli Lyssavirus, ve siparişler Carnivora ve Chiroptera içinde çeşitli yaban hayatı rezervuar türler arasında dolaşır. Firavun birden çok türü RABV rezervuar ve küçük Hint Firavun (Herpestes auropunctatus) Porto Riko ve Batı yarımküredeki diğer Karayip Adaları tek rezervuar1,2,3 . Yaban hayatı rezervuarında RABV sirkülasyonunun kontrolü genellikle oral kuduz aşısı (ORV) stratejisiyle gerçekleştirilir. ABD 'de (ABD), bu yönetim etkinliği USDA/APHIS/yaban hayatı Hizmetleri Ulusal Rabies yönetim programı (NRMP)4tarafından koordine edilir. Şu anda hiçbir yaban hayatı ORV programı Porto Riko bulunmaktadır. Kuduz aşıları ve Mongooses için çeşitli yem türleri içine araştırma Mongooses için bir ORV programı düşündürmektedir umut verici sonuçlar ile gerçekleştirilmiştir mümkündür5,6,7,8.

ORV etkisini izleme genellikle RV antikor seroprevalasyonu bir değişiklik değerlendirmek içerir hedef türler tarafından yem alımı tahmin dayanır. Ancak, bu strateji aktif bir yaban hayatı ORV programları veya RV enzootik ve arka plan seviyeleri rabv nötralize antikorlar (rvna) rezervuar türlerinde mevcut olan alanlarda zorlu olabilir. Bu gibi durumlarda, yem veya dış yem matrisinde yer alan bir biyomarker yararlı olabilir.

Çeşitli biyolojik belirteçleri rakunlar (Procyon rakun)9,10, stoats (Mustela Ermin)11,12, Avrupa porsuk (dahil olmak üzere çok sayıda türler, yem alımı izlemek için kullanılmıştır Meles meles) 13, Wild yaban domuzu (sus Scrofa)14, küçük Hint Mongooses15 ve çayır köpekleri (cynomysludovicianus)16,17, diğerleri arasında. ABD 'de, operasyonel ORV yemler genellikle yem Matrix üzerinde% 1 tetrasiklin biyomarker içerir, Bait alımını izlemek için18,19. Ancak, tetrasiklin kullanımı dezavantajları çevreye antibiyotik dağılımı üzerinde büyüyen bir endişe ve tetrasiklin tespiti genellikle invazif olduğunu, diş çıkarma veya hayvan imha gerektiren kemik elde etmek için örnekleri20. Rhodamine B çeşitli dokularda bir marker olarak değerlendirildi ve saç ve bıyık,10,21ultraviyole (UV) ışık ve floresans kullanılarak tespit edilebilir.

Iophenoxic asit (IPA), Coyotes (Canis Latrans)22, Arctic Fox (Vulpes Kar kekliği)23, Red Fox (Vulpes vulpes)24, rakunlar yem tüketimi değerlendirmek için kullanılan bir beyaz, kristalin tozu 9 , 25, yaban domuzu14, kırmızı geyik (Cervus elaphus scoticus)26, Avrupa porsuk12 ve yaban gelinciği (M. furosu)27, diğer birçok memeli türler arasında. IPA saklama süreleri bazı Keseliler28,29, en az 26 hafta içinde toynaklı26 ve üzerinde 52 hafta içi köpekler (Canis lupus familiaris)30daha az iki haftadan türler tarafından değişir. Bekletme süreleri de doza bağımlı31olabilir. İophenoxic asit serum albümin güçlü bağlar ve tarihsel kan iyot seviyeleri32ölçümü ile tespit edildi. Bu dolaylı yaklaşım yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) yöntemleri ile UV algılama33ile iophenoxic asit konsantrasyonlarını doğrudan ölçmek için, ve sonunda sıvı kromatografi ve kütle spektrometresi (LCMS) ile tespit edildi 34,35. Bu çalışmada, iophenoxic asidin iki analogunu ölçmek için birden fazla reaksiyon izleme (MRM) kullanan, tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yöntemi ile son derece hassas ve seçici bir sıvı kromatografi geliştirilmiştir. Amacımız bu LC-MS/MS yöntemini 2-(3-hidroksi-2 ' nin işaretleme yeteneğini değerlendirmek için kullanmak 4, 6-triiodobenzyl) propanoik asit (metil-IPA veya Me-ıPA) ve 2-(3-hidroksi-2, 4, 6-triiodobenzyl) butanoik asit (etil-IPA veya et-ıPA) ve bir ORV içinde teslim edildiğinde esir Mongooses için yem.

Mongooses, ticari olarak kullanılabilir füme sosis ve balık yağı ile kaplandı kafes tuzakları yakalanan canlı. Mongooses bireysel 60 cm x 60 cm x 40 cm paslanmaz çelik kafeslerde yer aldı ve bir günlük rasyon besleniyor ~ 50 g ticari kuru kedi maması, ticari olarak kullanılabilir Tavuk uyluk ile haftada iki kez tamamlayıcı. Su mevcut reklam Isteğe bağlıoldu. Biz iki türevleri IPA, etil-ipa ve metil-IPA, plasebo ORV baits içinde esir Mongooses teslim. Tüm yemler, toz tavuk yumurtası ve jelatin (malzeme tablosu) içeren bir dış kaplama (bundan sonra "yem matris") ile bir 28 mm x 20 mm x 9 mm folyo blister paketinden oluşmuştur. Baits içeren 0,7 mL su veya ıPA türevi ve ağırlığı yaklaşık 3 g, hangi ~ 2 g dış yem matris oldu.

Biz üç konsantrasyonda 16 esir Mongooses et-IPA teklif:% 0,14 (2,8 mg et-ıPA ~ 2 gr yem matrisinde; 3 erkek [m], 3 kadın [f]),% 0,4 (2,8 mg et-ıPA, 0,7 mL blister paket hacminde; 3M, 3F) ve% 1,0 (7,0 mL blister paket hacminde 0,7 mg etil-ıPA; 2m , 2F). Toplam doz 2,8 mg bir doz oranına karşılık gelir 5 mg/kg27,36 ve bir ortalama Firavun ağırlığı dayanmaktadır 560 g Porto Riko. Biz seçilmiş 1% en yüksek konsantrasyon olarak araştırma bazı Biyomarkörler için tat kaçınma ortaya çıkabilir konsantrasyonlarda > 1% bazı türler37. Biz sadece% 1 doz blister paketi olarak flokülasyon yeterli çözücü içinde çözünmesi çözünen engelledi eşit yem matrisine dahil edilecek. Bir kontrol grubu (2m, 1F) steril su ve hiçbir ıPA ile dolu yemler aldı. Günlük bakım rasyonlarının beslenmesini sırasında veya öncesinde sabah (~ 8 a.m.) Mongooses için yemler teklif ettik. Yem kalıntıları yaklaşık 24 saat sonra çıkarıldı. Biz tedavi öncesi kan örnekleri toplanan, bir gün sonrası tedavi ve daha sonra haftalık 8 hafta sonrası tedavi. Biz Isoflurane gaz inhalasyon tarafından anestezize Mongooses ve kadar toplanan 1,0 tüm kan ml kranial Vena Cava damara tarafından, yaban gelinciği38için açıklandığı gibi. Tüm kan örneklerini santrifüvlüyor, sera 'yı kriyovilere aktardık ve analiz olana kadar-80 °C ' de saklıyoruz. Tüm hayvanlar, tekrarlanan kanın etkilerini en aza indirmek için tüm zaman dilimlerinde örneklenmiş hayvanların sağlığını çeker. Kontrol hayvanları 0 gün, daha sonra haftada 8 hafta sonrası tedavi için örneklenen.

Bana-IPA üç konsantrasyonda teslim: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) ve 0,14% (2,8 mg), tüm yem matrisine dahil, 2 erkek ve 2 kadın tedavi grubu başına. İki erkek ve iki kadın steril su ve hiçbir ıPA dolu yemler aldı. Yem teklif süreleri ve Firavun anestezi yukarıda açıklanmıştır. Biz 1 gün tedavi öncesi kan örnekleri toplanan ve sonra haftalık 4 hafta sonrası tedavi.

Serum ıPA konsantrasyonlarının farklı tedavi grupları için normallik ve tahmini araçlar için test ettik. Bir doğrusal karma modeli, bireyler arasında havuza alınan ortalama serum et-ıPA konsantrasyonlarını karşılaştırmak için kullandık. Yem türü (matris/blister paketi) deneysel gün ek olarak sabit bir etkiye sahip, hayvan KIMLIĞI rastgele bir etkisi iken. Tüm prosedürler ortak istatistiksel yazılım (malzeme tablosu) kullanılarak çalıştırılmıştı ve önemi α = 0,05 olarak değerlendirildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm prosedürler onaylı araştırma Protokolü QA-2597 altında USDA Ulusal Yaban hayatı araştırma merkezi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

Not: aşağıdaki protokol, Mongoose serumda metil-iophenoxik asit tespit etmek için analiz prosedürü açıklanmaktadır. Bu yöntem, Mongoose serumda etil-iophenoxik asit analiziyle başlayan yinelemeli bir sürecin son sürümüdür. Etil-iophenoxik asidin ilk değerlendirilmesi sırasında yöntemlere küçük değişiklikler yapılmıştır, aşağıda sunulan son protokol ile sonuçlanır. Temsili sonuçlar her iki yineleme sırasında elde edilen içerir.

1. çözüm ve standartların hazırlanması

  1. Satın Me-ıPA ve et-ıPA.
  2. Mobil faz A, hazırlamak 1 l 0,1% (v/v) formülik asit su ile birleştirerek 1 ml formik asit 1 L ultra saf su (≥ 18 MΩ). Mobil faz B için hazırlamak 1 l 0,1% (v/v) Asetonitril içinde formik asit (ACN) 1 ml formik asit ile birleştirerek 1 l ACN.
  3. Seyreltilme için, 200 mL% 0,5 (v/v) trifluoasetik asit (TFA), 1 mL TFA ile 200 mL ACN birleştirerek ACN 'de hazırlayın.
  4. Yaklaşık 1.000 μg/mL konsantrasyonlarda ACN 'de Me-IPA ve et-ıPA 'nın konsantre ıPA stok çözümlerini hazırlayın.
    1. Bir mikrodenge yaklaşık 10 mg Me-ıPA ağırlığında ve ± 0,0001 mg kütle kayıt. nicel Me-ıPA 'yı 10 mL sınıf A Volumetrik Flask 45 mL ACN kullanarak transfer. Tüm katılar çözülür ve sonra ACN ile hacim getirmek için 1 dakika sonikat.
    2. Poli-tetrafloroetilen (PTFE)-astarlı kapaklar ile kehribar 8 mL Cam şişeler her stok ~ 8 mL transfer. Oda sıcaklığında saklayın (RT). Kalan stokları tehlikeli atıklarla aktarın.
  5. 25x-7 Me-ıPA hisse senedi (Tablo 1) için, yaklaşık 200 μg/ml 'de ACN 'de Me-IPA stokları hazırlayın. Örnek: Me-ıPA ' d a k i 1 mL 'ye, 1.000 μL cam şırıngayı kullanan 5 mL sınıf A Volumetrik Flask ile adım 1.4.2 'den transfer edilir. ACN ile hacmine seyreltin. Stok bir Amber 8 mL Cam şişe PTFE-astarlı kap ile aktarın. RT 'de saklayın.
  6. Tablo 1' de açıklanan altı ek 25x Me-IPA stoklarını hazırlayın. Her hisse senedi için, bir tekrar pipetör kullanılarak belirtilen hacimleri bir kehribar 8 ml Sarı cam şişede PTFE astarlı kap ile birleştirin. Her stokları RT 'de saklayın.
  7. 25x vekil stok için, adım 1.4.2 ' de hazırlanan konsantre stoktaki yaklaşık 10 μg/mL 'de ACN 'de Me-ıPA 'nın vekil stokları hazırlayın. 0,100 mL 'ye yoğunlaşmış Me-ıPA stokunun 100 μL cam Şırıngayı kullanarak 10 mL sınıf A Volumetrik Flask 'a transferini ve ardından ACN ile hacmine kadar seyreltilmeli.
    1. Bir Amber 8 ml cam şişe PTFE astarlı kapağı ile ~ 8 mL aktarın. RT 'de saklayın. kalan stokları tehlikeli atıklarla aktarın.
  8. Tablo 2' de açıklandığı gibi 2 ml vidalı cam otomatik çözünürlüler şişeleri içinde hem analitleri içeren 4X stokları hazırlayın.
    1. Örneğin, stok 4X-7, 2 ml şişeye hazırlamak için, 0,20 ml 25x-7 Me-IPA stok adım 1,5 ile bir Repeat pipetör 0,5 ml kapasiteli ucu kullanarak ekleyin. 0,5 ml kapasite ucu ile bir tekrar pipetör kullanarak adım 1,7 25x vekil et-IPA stok 0,20 ml ekleyin.
    2. 1 ml kapasiteli uç ile Repeat pipetör kullanarak 0,85 ml ACN ekleyin. Şişeyi güvenli bir şekilde kap ve karıştırmak için 5x 'i ters çevir.
  9. Standart eğrisi, Tablo 3' te açıklandığı gibi 2 ml vida-top Otomatik Örnekleyici şişeleri içinde hazırlayın.
    1. Örneğin, 2 ml 'lik bir şişeye standart 7 (STD 7) hazırlamak için, 0,5 ml kapasiteli uç ile Repeat pipetör kullanarak, adım 1.8.2 ' den 4X-7 stokta 0,20 ml ekleyin. 1 ml kapasiteli uç ile tekrar pipetör kullanarak 0,60 ml Ultra saf dı suyu ekleyin. Şişeyi güvenli bir şekilde kap ve karıştırmak için 5x 'i ters çevir.

2. numune hazırlama

Dikkat: Bu prosedürü gerçekleştiren personel kuduz öncesi pozlama profilaksisi tam serisi almış ve Federal iş sağlığı belirtilen tıbbi tesis 0,5 IU üzerinde belgelenmiş bir Kuduz antikor titresi var olmalıdır. Personel, ekstraksiyon yaparken her zaman laboratuar kat ve göz koruması takmalıdır. DIKKAT: Sınıf II Biyogüvenlik kabininde 2.3 − 2.6 adımlarını gerçekleştirin.

  1. Her örnek için, 200 − 300 mg NaCl içeren bir 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpü hazırlayın. tüpleri 80 pozisyonlu plastik rafa yerleştirin. 2,6 adımda kullanmak için kenara koyun.
    Not: çok sayıda numune için mikro Kepçe (veya diğer küçük ölçüm cihazı) önerilir.
  2. Her örnek için, etiket iki 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpler: biri "A" ve diğeri "B" olarak. Bir 80-pozisyon plastik raf tüpler düzenleyin.
  3. Bir sınıf II Biyogüvenlik kabininde serum ekstraksiyonu için gerekli olan aşağıdaki malzemeleri ve ekipmanları yerleştirin: 2,1 ve 2,2 adımda hazırlanan mikrosantrifüjler (raflar içinde), bir Vortex karıştırıcı, 0,5 mL ve 5 mL kapasiteli tekrar pipettör, 100 − 1000 μL hava deplasmanlı 1.000 μL uçları ile pipet, yaklaşık 100 ml 'lik her biri seyreltilmeli ve ultra saf dı suyu ve biyotehlike Atık kabı ile kaplar.
  4. Biyolojik Güvenlik kabininde serum örneklerini dondurulmuş depodan ve RT 'ye sıcak olarak çıkarın. Vortex, numune almadan önce her serum örneğini karıştırın.
  5. 0,5 ml kapasite ucu ile bir tekrarlama pipetör kullanarak, "a" tüp içine Mongoose serum 0,050 ml dağıtmak ve 25x vekil stok 0,050 ml ekleyin. Sonra 5 ml kapasiteli ucu ile bir tekrar pipetör kullanarak tüp "a" seyreltici 0,950 ml ekleyin. 10 − 15 s için kapak güvenli ve Vortex karışımı.
  6. 8 − 12 s için "A" ve Vortex Mix 3x içine adım 2,1 öncesi tartılmış NaCl dağıtmak. tüp içeren şişe raf dış yüzeyleri silin "A" kullanarak 70% (v/v) isopropanol.
    Not: numunelerin raf artık Sınıf II biyoemniyet kabininden kaldırılabilir.
  7. Santrifüjlü tüp "A" at 12.000 x g 1 dak için sulu ve ACN aşamalarını ayırmak için. 100 − 1000 μL hava deplasman pipeti kullanılarak "B" tüpüne üst ACN fazı 0,80 mL pipet. "A" tüpünde kalan solüsyonu tehlikeli atıklarla aktarın ve biyotehlikeli atık kabında boş tüpü atın.
  8. ACN ve TFA 'dan, 45 °C ' lik su banyosunda N2 gazının nazik akışına sahip "B" den çıkarın.
  9. Bir tekrar pipettor, 4 − 5 s için Vortex karışımı kullanarak "B" tüpüne ACN 0,250 mL ekleyin ve sonra, tüpün alt kısmındaki sıvıyı toplamak için 12.000 x g 'de kısa (2 − 4 s) santrifüj yapın.
  10. 5 ml kapasite ucu, 4 − 5 s için Vortex karışımı ile bir tekrar pipetör kullanarak "B" tüpüne 0,750 ml Ultra saf dı suyu ekleyin ve ardından numuneyi açıklığa kavuşturmak için 12.000 x g 'de 1 dakika santrifüjün.
  11. Bir 1.000 μL hava deplasman pipet kullanarak bir Otomatik Örnekleyici şişe süpernatant 0,75 ml aktarın. Biyotehlike atık kabında pipet uçları atın.
  12. Cap Otomatik Örnekleyici şişeler güvenli ve LC-MS/MS (Bölüm 4) tarafından analiz. "B" tüpünün kalan çözümünü tehlikeli atıklarla aktarın ve boş tüpü biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına atın. Tüm biyotehlikeli atıkların otoklavlama veya yakma ile bertaraf edilmesi.

3. kalite kontrol örnekleri

DIKKAT: Bölüm 2 ' de açıklanan uyarlanabilir ifadeleri Izleyin.

Not: aşağıdaki yordamda, analiz için gereken minimum kalite kontrolü (QC) örnekleri açıklanmaktadır. Yeterli kontrol Mongoose serum varsa her seviyede çoğaltır önerilir.

  1. 200 − 300 mg NaCl içeren dört 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpleri hazırlayın. Bir 80-pozisyon plastik raf tüpler düzenleyin.
  2. Her QC örneği için, etiket iki 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpler: biri "A" ve diğeri "B" olarak. Bir 80-pozisyon plastik raf tüpler düzenleyin.
  3. 2,3 adımı yineleyin.
  4. Dondurulmuş depodan kontrol Mongoose serumu çıkarın ve biyogüvenlik kabine RT sıcak. Vortex, numune almadan önce kontrol serumu karıştırın.
  5. 0,050 ml kontrol Mongoose serumu, 0,5 ml kapasiteli ucu ile tekrar pipetör kullanan dört 1,5-ml "A" tüplerine dağıtır.
  6. 0,5 ml kapasite ucu ile Repeat pipetör kullanarak Tablo 4 ' te belirtildiği gibi dört QC örneğinin her birini güçlendirin. Her QC örneği güvenli ve Vortex karışımı 10 − 15 s için kap.
  7. Ayıklama yordamını 2.6 − 2.12 adımda açıklandığı şekilde gerçekleştirin.

4. LC-MS/MS Analizi

  1. LC-MS/MS ' i Tablo 5' te açıklanan tüm parametrelerle yapılandırın. LC-MS/MS 'ye güç verin ve akış hızını 0,800 mL/dak 'a ayarlamadan önce sütunun 70 °C ' ye ulaşmasını sağlar.
  2. Kalite kontrol örneklerinden ve bilinmeyen örneklerden oluşan her bir toplu iş öncesi ve sonrası standart eğrisi enjekte etmek için veri edinme yazılımında (malzeme tablosu) bir dizi ayarlayın.
  3. Tablo 5' te listelenen parametreleri kullanarak tüm standartları ve örnekleri enjekte edip MRM iyon kromatogramları kazanın.
  4. Sıralı tamamlama işleminden sonra LC-MS/MS ' i kapatın ve tüm Otomatik Örnekleyici şişeleri tehlikeli atık olarak atın.

5. miktar ölçümü

  1. İç standart olarak et-ıPA kullanarak Me-IPA için bağıl konsantrasyonlara karşı göreli yanıtların kalibrasyon eğrisi oluşturmak için veri çözümleme yazılımını kullanın. Me-ıPA (556,6 → 428,7) için nicelik belirteci MRM geçiş gelen göreli yanıtları hesaplamak et-ıPA için MRM geçişi (570,7 → 442,7) bölünmüştür. 1/x ağırlıklı ve orijini yoksayar ikinci sipariş dört derece işlev kullanarak 7 düzeyli kalibrasyon eğrisi oluşturun.
  2. Aşağıdaki denklemi kullanarak Me-ıPA Serum konsantrasyonu (Cserum) hesaplayın:
    Equation 1
    censtrüman μg/ml ünitelerinde kalibrasyon eğrisinden enstrüman tarafından belirlenen konsantrasyon olduğu, 1,25 seyreltme faktörü Equation 2 , vfinal son numune hacmi (1,0 mL), ve vserum ml serum hacmi ( 0,050 mL nominal).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Me-ıPA analizinden temsil iyon kromatogram Şekil 1' de sunulmaktadır. Kontrol Mongoose serum (Şekil 1a) et-IPA (vekil analit) ve Me-IPA yokluğunda belirtilen bekletme süresi tutma süresini gösterir. Kalite kontrol örneği (Şekil 1B), Me-IPA ' l e l i-ipa temel ayrımı ve Me-IPA için nicelik belirteci ve niteleyici geçişleri gösterir. Şekil 1C , 33,5 μg/ml Me-IPA olarak gözlenen Serum konsantrasyonu ile çalışmanın temsili bir örneğini gösterir.

Me-ıPA analizinden temsili bir kalibrasyon eğrisi Şekil 2' de sunulmuştur. 7 düzeyli 14 noktalı standart eğrisi 0,00202 ile 8,27 μg/mL Me-ıPA arasında bir korelasyon katsayısı (r2) ile 0,9998 arasındadır. Korelasyon katsayıları, beş Me-ıPA analizi için 0,9998 ila 0,99997 arasında değişmektedir. Vekil analit et-ıPA konsantrasyonu tüm standartlarda 0,502 μg/mL 'Dir.

Tablo 6 , 0, 1,3, 31 ve 82 μg/ml Me-IPA (her seviyede n = 10) ile güçlendirilmiş kontrol Mongoose serum için doğruluk ve hassasiyet sonuçlarını sunar. Sonuçlar beş ayrı analizden toplandı. Yüzde kurtarma% 96,9% 109% arasında değişmektedir. Yüzde%, 1,7% ve% 2,3, üç kuvvetin düzeylerinde göreli standart sapma (% RSD) sırasıyla 3,4 oldu.

Kalite kontrol örneklerinde gözlenen sinyal-gürültü oranı (S/N) (n = 10 negatif kontroller; n = 10 at 1,3 μg/mL Me-ıPA) algılama sınırını (DL; 3 x S/N) ve nicelizasyon sınırını (QL; 10 x S/N) belirlemek için kullanılmıştır. Mongoose serumda Me-ıPA için DL ve QL, sırasıyla 0,012 μg/mL ve 0,042 μg/mL idi.

Niteleyici MRM geçişin en yüksek alan yanıtları nicelik belirteci MRM geçişi ile bölünmüştür (Equation 3 tüm standartlar ve örnekler için hesaplanır. Her örnek için bu oran daha sonra eleme yüzdesi eşleşmesi belirlemek için kalibrasyon standartlarındaki gözlenen ortalama oranı ile bölünmüştür. Şekil 1C 'de gösterilen örnek için niteleyici oranı 0,439,% 96,3 eşleştirmeli.

Et-IPA vekil analit kurtarma tüm QC örnekleri ve bilinmeyen örnekler için Ortalama et-ıPA zirve alan yanıtı kalibrasyon standartlarda gözlenen tarafından et-ıPA zirve alan yanıtı bölerek hesaplanır. Ortalama vekil analit kurtarma% 91,0 (negatif kontroller), 91,4% (1,3 μg/mL),% 92,8 (31 μg/mL) ve% 95,4 (82 μg/mL) idi.

Kontrol Mongoose serumda (Şekil 1a), Me-IPA ' nın nicelik veya eleme geçişleri için müdahale zirveleri görülmemiştir.

Et-ıPA 'yı Mongoose serumda (Şekil 3 ve Tablo 7) belirlemek için kullanılan ekstraksiyon prosedürü ve enstrümantal koşullar, Me-IPA yöntemiyle aynıdır, ancak aşağıdaki değişikliklerle aynıdır. Taşıyıcı analit olarak kullanılan Pro/ıophenoxic asit (PR-ıPA) ve daha eski, daha az hassas LC-MS/MS kullanılmıştır. Kaynak kurutma gazı sıcaklığı, 12 L/dak debisi ve 35 psi Nebulizatör basıncı ile 350 °C idi. Kapiller gerilimi-2.500 V. Kaynağın hiçbir kılıf gazı veya meme voltajı ayarlamak için anlamına gelir vardı. Et-ıPA için nicelik belirteci MRM geçişi 570,7 → 442,8 (584,7 → 456,8 PR-ıPA için) oldu. Fragmentor oldu 80 V ve çarpışma enerjisi her iki analitler için 10 V oldu. Et-ıPA için eleme MRM 570,7 oldu → 126,8 bir çarpışma enerjisi ile 40 V.

Et-ıPA için tüm Mongoose serum numunelerinin test edilmesi sekiz analiz üzerine yapılmıştır. 7 düzeyli kalibrasyon eğrisi 0,00207 ile 8,48 μg/mL arası korelasyon katsayıları (r2) ile 0,9990 ila 0,9999 arasında değişmektedir. Vekil analit PR-ıPA konsantrasyonu 0,512 μg/mL idi. Tablo 7 , 0, 1,3, 13, 32, 85 ve 170 μg/ml Me-IPA ile güçlendirilmiş kontrol Mongoose serum için doğruluk ve hassasiyet sonuçlarını sunar. Sonuçlar sekiz ayrı analizden toplandı. Yüzde kurtarma% 89,5% 115% arasında değişmektedir. Beş sur düzeyinde% RSD sırasıyla% 4,3,% 1,5,% 2,3,% 5,6 ve% 1,1 idi. Kalite kontrol örneklerinde gözlenen S/N (n = 21 negatif kontroller; n = 21 at 1,3 μg/mL Me-ıPA) DL ve QL 'yi belirlemek için kullanılmıştır. Mongoose serumda Me-ıPA için DL ve QL, sırasıyla 0,12 μg/mL ve 0,42 μg/mL idi. Kalite kontrol örneklerinden ortalama vekil analit kurtarma% 86,8 oldu (n = 75). Kontrol Mongoose serumunda et-ıPA ' nın nicelik veya eleme geçişleri için parazit zirveleri görülmemiştir.

Tüm Mongooses teklif et-IPA yemler tüketilen ≥ 25% yem içinde 24 saat kısıtlama ve onların sera içinde et-IPA ölçülebilir seviyeleri vardı (Tablo 8). Karma model analizinden, toplam ortalama serum ıPA konsantrasyonları, blister paketi (9,8 μg/ml, 95% CI 4.0 − 15,6 μg/ml) ile karşılaştırıldığında, yem matrisinde 2,8 mg biyomarker (17,5 μg/mL,% 95 CI 11.7 − 23.3 μg/mL) ile yemlerinden marjinal bir şekilde daha yüksektir (F = 3,6 , P = 0,07). Her iki yem türü için konsantrasyon deneysel gün (β =-0,15 ± 0,04, F = 14,4, P = 0,0005) ile çürüyor. Serum ıPA konsantrasyonlarda bireysel seviye değişkenliği gözlendi (hayvan KIMLIĞI Kovaryans parametre tahmini = 46,6 ± 20,7). Tüm Mongooses sadece boş folyo blister paketi kalan kontrol yemleri% 100 tüketilen. Serum et-IPA kalıntı yoğunluğu zaman aralığında değişkendir ve zamanla sürekli olarak azalmadı (Şekil 3).

Tüm Mongooses bana-IPA yemleri 24 saat sınırı içinde yem ≥ 25% tüketilen ve onların sera (Tablo 9) Me-ipa ölçülebilir seviyeleri vardı sundu. Mongoose sera 'da et-ve Me-IPA ' ı r serolojik konsantrasyonu, yem olarak ıPA konsantrasyonuna bağlı olarak ortaya çıktı. Yem içinde ıPA yüksek konsantrasyonları, genel doz (2,8 et-ıPA durumunda mg) aynı kaldığı durumlarda bile daha yüksek serum kalıntılarının sonuçlandı. İlginçtir, Me-ıPA gün 1 ' de bir ilk başak ile zaman içinde daha da bozulma deseni üretmek için ortaya çıktı, gün kadar sürekli bir düşüş izledi 14 konsantrasyonlarda Plato göründü (Şekil 4).

Figure 1
Şekil 1 : Temsilci iyon kromatogrları. (A) vekil analit etil-iophenoxic asit (et-IPA) ile güçlendirilmiş kontrol Mongoose serum temsilcisi MRM iyon kromatogram. Ok metil-iophenoxic asit (Me-ıPA) için bekletme süresini gösterir. (B) 31 μg/ml Me-IPA ile güçlendirilmiş kontrol Mongoose serumun temsılcısı MRM iyon kromatogram. Me-ıPA için nicelik belirteci (Quant) ve eleme (eleme) geçişleri göreli yoğunlukları gösterilir. (C) 33,5 μg/ml olarak gözlenen Me-IPA konsantrasyonuna sahip bir Firavun serumu numunesi olan MRM iyon kromatogram. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Temsilci kalibrasyon eğrisi. Metil-iophenoxic asit (Me-ıPA) için veri analizi yazılımı tarafından oluşturulan orijinal kalibrasyon eğrisi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Ortalama serum etil IPA (et-IPA) konsantrasyonu zaman içinde yem türü ve konsantrasyonu ile. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Zaman içinde yem konsantrasyonu Ile ortalama serum metil IPA (Me-IPA) konsantrasyonu. Tüm Me-ıPA konsantrasyonları dış yem matrisine dahil edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Me-IPA konsantrasyonu (μg/mL)
Kimliği
25x-7 Bkz. Adım 1,6 200
25x-6 1,000 mL 25x-7 stok 3,000 mL ACN ile birleştirin 50
25x-5 3,000 mL ACN ile 1,000 mL 25x-6 stokları birleştirin 13
25x-4 1,000 mL 25x-5 stokları 3,000 mL ACN ile birleştirin 3,1
25x-3 Birleştirmek 1,000 mL 25x-4 stok ile 3,000 mL ACN 0,78
25x-2 1,000 mL 25x-3 stok 3,000 mL ACN ile birleştirin 0,2
25x-1 1,000 mL 25x-2 stokları 3,000 mL ACN ile birleştirin 0,049

Tablo 1: ACN 'de 25x Me-IPA stoklarının hazırlanması (8-mL Amber cam şişeleri).

Konsantrasyon (μg/mL)
Kimliği Me-ıPA et-ıPA
4X-7 0,200 mL 25x-7 + 0,200 mL 25x Surrogate + 0,850 mL ACN 32 1,6
4X-6 0,200 mL 25x-6 + 0,200 mL 25x Surrogate + 0,850 mL ACN 8 1,6
4X-5 0,200 mL 25x-5 + 0,200 mL 25x Surrogate + 0,850 mL ACN 2 1,6
4X-4 0,200 mL 25x-4 + 0,200 mL 25x Surrogate + 0,850 mL ACN 0,5 1,6
4X-3 0,200 mL 25x-3 + 0,200 mL 25x Surrogate + 0,850 mL ACN 0,12 1,6
4X-2 0,200 mL 25x-2 + 0,200 mL 25x Surrogate + 0,850 mL ACN 0,031 1,6
4X-1 0,200 mL 25x-1 + 0,200 mL 25x Surrogate + 0,850 mL ACN 0,008 1,6
4X-0 0,200 mL 25x Surrogate + 1,050 mL ACN 0 1,6

Tablo 2: ACN 'de 4X IPA stoklarının hazırlanması (2-ml Otomatik Örnekleyici şişeleri).

Konsantrasyon (μg/mL)
Kimliği Me-ıPA et-ıPA
STD 7 0,200 mL 4X-7 + 0,600 mL dı su 8 0,4
STD 6 0,200 mL 4X-6 + 0,600 mL dı su 2 0,4
STD 5 0,200 mL 4X-5 + 0,600 mL dı su 0,5 0,4
STD 4 0,200 mL 4X-4 + 0,600 mL dı su 0,13 0,4
STD 3 0,200 mL 4X-3 + 0,600 mL dı su 0,03 0,4
STD 2 0,200 mL 4X-2 + 0,600 mL dı su 0,0078 0,4
Std 1 0,200 mL 4X-1 + 0,600 mL dı su 0,002 0,4
STD 0 0,200 mL 4X-0 + 0,600 mL dı suyu 0 0,4
Boş 0,200 mL ACN + 0,600 mL dı suyu 0 0

Tablo 3:75/25 yılında Me-IPA standartlarının hazırlanması su/ACN (2 ml Otomatik Örnekleyici şişeleri).

Serum konsantrasyonu (μg/mL)
Kimliği Me-ıPA et-ıPA
Negatif kontrol 0,050 mL 25x Surrogate + 0,950 mL Diluent 0 10
Düşük güçlendirme 0,050 mL 25x Surrogate + 0,020 mL 25x-4 + 0,930 mL Seyreltilici 1,2 10
Orta güçlendirme 0,050 mL 25x Surrogate + 0,030 mL 25x-6 + 0,920 mL Seyreltilici 30 10
Yüksek güçlendirme 0,050 mL 25x Surrogate + 0,020 mL 25x-7 + 0,930 mL Diluent 80 10

Tablo 4: kalite kontrol numune sur (1,5-ml mikrosantrifüjü tüplerde hazırlayın).

Sıvı Kromatografi:
Sütun: C18, 2,1 x 50 mm, 2,5 μm parçacık boyutu
Sütun sıcaklığı: 70 °C derece
Enjeksiyon hacmi: 5 μL
Akış oranı: 0,800 mL/dak
Mobil faz: Solvent A: 0,1 su içinde% formik asit
Solvent B: 0,1 ACN 'de% formik asit
Degrade programı:
Zaman (min): 0 0,25 2,25 2,26 3,4 3,41 4,75
B 40 40 55 100 100 40 40
Iğne yıkama: ACN, 3 s
MS/MS kaynak: ESı (negatif mod)
Gaz sıcaklığı: 300 °C derece
Gaz akışı: 5 L/dak
Nebülizör: 45 psi
Kılcal: -4000 V
Nozul gerilimi: -500 V
Kılıf gaz sıcaklığı: 250 °C derece
Kılıf gaz akışı: 7 L/dak
MRM geçişleri:
Analit Precursor Iyon (m/z) Ürün Iyon (m/z) * Fragmentor (V) Çarpışma enerjisi (V) Bekleme süresi (MS) Zaman segmenti
Me-ıPA 556,6 428,7 74 12 60 2
126,9 65 60
126,8 61 60
Et-ıPA 570,7 442,7 87 16 60
Zaman segmentleri:
Segment Başlangıç (min) Bitiş (dak) Türü Yönlendirici Delta EMV Po -larite Saklanan veriler
1 0 0,6 MS2 tarama Atık için 0 Negatif No
2 0,6 2 Mrm MS için -100 Negatif Evet
3 2 4,75 MS2 tarama Atık için 0 Pozitif No
* Nicelik belirteci geçişleri kalın.

Tablo 5: LC-MS/MS parametreleri. Nicelik belirteci ürün iyonlarının cıvatalı.

Hedef Gözlenen Yüzde
Kimliği Gün Me-ıPA Me-ıPA Kurtarma
QC-1 1 0 Nd Yok
QC-2 1 0 Nd Yok
QC-11 2 0 Nd Yok
QC-12 2 0 Nd Yok
QC-21 3 0 Nd Yok
QC-22 3 0 Nd Yok
QC-31 4 0 Nd Yok
QC-32 4 0 Nd Yok
QC-3 5 0 Nd Yok
QC-4 5 0 Nd Yok
QC-13 1 1,25 1,26 101% Ave (10) = 102%
QC-14 1 1,25 1,23 98,40% SD = 3,50%
QC-23 2 1,25 1,26 101% % RSD = 3,40%
QC-24 2 1,25 1,28 102%
QC-33 3 1,29 1,3 101%
QC-34 3 1,29 1,25 96,90%
QC-5 4 1,29 1,37 106%
QC-6 4 1,29 1,41 109%
QC-15 5 1,29 1,3 101%
QC-16 5 1,29 1,34 104%
QC-25 1 30,1 30,2 100% Ave (10) = 103%
QC-26 1 30,1 31,2 104% SD = 1,80%
QC-35 2 30,1 31,1 103% % RSD = 1,70%
QC-36 2 30,1 31,1 103%
QC-7 3 31 31,6 102%
QC-8 3 31 31,4 101%
QC-17 4 31 32,5 105%
QC-18 4 31 32,8 106%
QC-27 5 31 31,7 102%
QC-28 5 31 32,1 104%
QC-37 1 80,2 77,8 97,00% Ave (10) = 101%
QC-38 1 80,2 78,9 98,40% SD = 2,30%
QC-9 2 80,2 81,8 102% % RSD = 2,30%
QC-10 2 80,2 79,8 99,50%
QC-19 3 82,7 83,5 101%
QC-20 3 82,7 84 102%
QC-29 4 82,7 84,7 102%
QC-30 4 82,7 87,2 105%
QC-39 5 82,7 83 100%
QC-40 5 82,7 84,1 102%

Tablo 6: benim için QC sonuçları-IPA Mongoose serum (μg/mL).

Hedef et-ıPA (μg/mL) N Ortalama (%) SD (%) % RSD
0 21
1,3 12 103 4,5 4,3
13 9 91,7 1,4 1,5
32 12 106 2,4 2,3
85 12 105 5,8 5,6
170 9 106 1,1 1,1

Tablo 7: Mongoose serumda et-ıPA için QC sonuçları (μg/mL).

Yem tipi ve etil IPA yem konsantrasyonu (μg/mL)
Zaman dilimi 0,4%-blister 1,0%-blister 0,14%-matris Denetim
Ortalama (SD) N Ortalama (SD) N Ortalama (SD) N Ortalama (SD) N
Gün 0 Nd 5 Nd 4 Nd 6 Nd 3
1. gün 13,7 (10,9) 2 11,2 (10,4) 4 20,6 (17,3) 2 Na Na
7. gün 11,5 (6,3) 6 9,9 (9,6) 4 21,4 (10,9) 6 Nd 3
14. gün 10,2 (5,2) 6 5,7 (2,5) 3 17,8 (10,2) 6 Nd 3
21. gün 8,9 (4,1) 4 10,0 (9,5) 4 23,8 (5,3) 3 Nd 2
28. gün 8,5 (3,9) 5 11,1 (10,6) 3 17,7 (9,3) 4 Nd 3
Gün 35 17,0 (NA) 1 9,1 (9,0) 4 21,7 (9,3) 2 Nd 1
Gün 42 Na 0 8,4 (8,5) 4 16,5 (NA) 1 Nd 2
Gün 49 10,2 (5,8) 2 8,1 (8,4) 4 17,5 (4,7) 2 Nd 2
Gün 56 10,9 (5,4) 2 3,8 (1,1) 3 17,6 (6,1) 2 Nd 2

Tablo 8: ortalama (stand sapma [SD]) etil-IPA Serum konsantrasyonu yem tipine göre. ND = algılanmadı, NA = uygulanamaz.

Doz ve metil ıPA konsantrasyonu (μg/mL)
Zaman dilimi 0,04% 0,07% 0,14% Denetim
Ortalama (SD) N Ortalama (SD) N Ortalama (SD) N Ortalama (SD) N
Gün 0 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4
1. gün 7,8 (7,1) 4 22,2 (9,2) 4 29,1 (16,0) 4 ND (NA) 4
7. gün 4,4 (4,8) 4 14,4 (4,6) 4 21,3 (12,0) 4 ND (NA) 4
14. gün 5,7 (5,9) 4 12,0 (3,5) 4 19,6 (10,6) 4 ND (NA) 4
21. gün 4,9 (4,5) 4 12,0 (0,8) 3 18,3 (9,9) 4 ND (NA) 4
28. gün 5,4 (5,0) 4 9,8 (2,4) 4 16,4 (8,1) 4 ND (NA) 4

Tablo 9: doz Ile ortalama (SD) metil-IPA Serum konsantrasyonu. ND = algılanmadı, NA = uygulanamaz. Tüm metil ıPA konsantrasyonları dış yem matrisine dahil edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LC-MS/MS yöntemi, Mongoose serumda Me-IPA ve et-ıPA doğru ölçmek için birden fazla reaksiyon izleme seçicilik kullanılan çalışmalar için geliştirilmiştir. MS/MS algılamanın seçiciliği Ayrıca, analizinden önce serum proteinleri çökeltmek için sadece Asetonitril bağlı basit bir temizleme protokolü için izin.

İophenoxic asitleri ACN içinde çözünür ama neredeyse suda çözünmez. ACN ekstraksiyon su dışlamak için, sodyum klorür açık bir su zorlamak için eklendi: sulu (serum) faz iyonik gücünü artırarak ACN faz ayrımı. Uçucu asit trifluoracetic asit (TFA) da ıophenoxic asitler ekstraksiyon sırasında touristy ve daha kolay ACN aşamasında çözünecek olacağını sağlamak için eklenmiştir. TFA, LC-MS/MS analizinden önce kuru aşağı adım sırasında kaldırılır.

Kan firavundan berabere yaklaşık oldu 1 mL, verimli 0,5 mL veya daha az sera. Her numunenin çoğaltır analizlerini gerçekleştirmek için, A sınıfı Volumetrik Pipetler ve flsorlar gibi tipik Analitik Laboratuar camlarından ziyade mikrosantrifüj tüpleri kullanılan bir mikro ölçekli numune hazırlama prosedürü gereklidir. Doğru ve hassas sonuçlar elde etmek için, analistler cam mikrolitre şırıngalar ve pozitif deplasman tekrarlama pipetörler mikroliter-boyut ipuçları kullanımı konusunda yetkin olması gerekir.

Bu yöntemin bir sınırlama, onun kullanım ve bakım eğitimli pahalı LC-MS/MS enstrümantasyon ve analistler gerektirir olmasıdır. Ancak, Me-ıPA ve et-ıPA temel olarak açıklanan HPLC koşulları kullanılarak çözülür çünkü, yöntem potansiyel olarak tek dört ayaklı LCMS veya HPLC UV dedektörü ile adapte edilebilir hiçbir müdahale gözlemlendi sağladı.

Blister paketi ve yem matrisinde et-ıPA ile yutulan Mongooses arasındaki ortalama serum konsantrasyonunda fark 2,8 mg dozunda, Marker blister pakette yer alan, yem matrisine dahil edilmektense dökülme olduğunu gösterir. Bu yem alımı aksine aşı tahmin amacı için etkileri olabilir. Örneğin, dış yem matrisine Marker ekleyerek hayvan matris yiyor ama aşı dökülmeleri Eğer aşı kapsama tahmini şişirmek olabilir. Ancak, düzenleyici kısıtlamalar, bir biyolojik Marker doğrudan blister paketi içinde bir aşı ile karıştırma yeteneğini önleyen olabilir. <% 100 tüketiminin kaydedildiği durumlarda, blister paketinde et-ıPA içeren üç olgu, ikisi de% 1 daha yüksek olan konsantrasyonlardı. Bu et-IPA yüksek konsantrasyonlarda olduğunda potansiyel tat kaçınma önerir. Yem matrisine dahil% 1 (20,0 mg) et-ıPA içeren yemler Mongooses 'e sunulduğunda, tüm hayvanlar yemi reddetti.

14 gün içinde et-ve Me-ıPA için Ortalama ıPA konsantrasyonları sırasıyla yaklaşık 17 ve 19 μg/mL idi. Benzer araştırmalar Instituto de soruşturma en recursos cinegéticos, Ciudad Real, İspanya, butil ve pentyl-IPA kullanarak günde 14 konsantrasyonları yaklaşık 45 ve 10 μg/ml Mongoose sera içinde aynı konsantrasyon ve yem teslim sırasında gerçekleştirilen Bizim çalışma olarak formülasyon. Bu farklar ıPA farklı türevleri Mongooses farklı oranlarda metabolize olabilir, hangi zaman Marker tutma (ya kısa veya uzun vadeli saklama) bir endişe yararlı olabilir düşündürmektedir.

Gastrointestinal sistemin fizyolojisindeki farklar farklı türlerde ıPA emilimini ve atılımını etkileyebilir. İç kediler (Felis Catus) içinde teslim edildiğinde plazma eliminasyon yarı ömrü 1,5 mg/kg oldu 107 gün ise aynı doz hızında brushtail Possum oranı yaklaşık bir gün28oldu. Ne zaman IPA yerli keçi (Capra aegagrus keçiler) bir doz hızında verildi 1,5 mg/kg Terminal eliminasyon Half-Life IPA 81 gün oldu, araştırmacılar kadar yükseltilmiş iyot konsantrasyonları bulmaya devam ederken 160 gün yönetim takip 39. vivveridae üyelerinin gastrointestinal sistemi (mongoozların daha önce40atanmış olduğu aile), iç kedi41' ye benzer şekilde tarif edilir, bu da IPA 'nın saklama süresini Mongooses. Araştırma da ıPA farklı marsupials metabolize olabilir öneriyor, eutherian türler daha hızlı atılımı için izin29.

Bu çalışmada değerlendirilen ıPA türevleri, Mongooses içinde uzun vadeli (4 − 8 hafta) işaretleme yeteneği sağladı. Mongooses bir biyolojik Marker olarak ıPA kullanımı dikkate çalışma hedefleri ve işaretleme istenen süresini almak gerekir. Hayvanların ardışık zaman dilimlerinde aynı çalışma sitelerinden işaretleneceği durumlarda, bir işaretleme olayından gelen sonuçların önceki olaylar sırasında işaretlenerek karıştırılmamış olması için farklı ıPA türevleri kullanılabilir. ABD 'de yaban hayatı için operasyonel ORV 'nin bir parçası olarak, hedef türlerin örnekleme ve RVNA ve biyomarker varlığı için test genellikle 4 − 6 hafta ORV dağıtım42takip gerçekleştirilir. Pratik bir açıdan bakıldığında, bu zaman aralığında et-ya da Me-ıPA kolayca tespit edilebilir. Mongooses kalıntı çürüme fonksiyonunu değerlendirmek için gelecekteki araştırma bu çalışmada değerlendirilen IPA her iki Atropinin çeşitli konsantrasyonlarda sunulan yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar AV ve SO oral kuduz aşı yem üreticisi fulltime çalışanları vardır.

Acknowledgments

Bu araştırma, ABD Tarım Bakanlığı, hayvan ve bitki sağlığı gözetim hizmeti, yaban hayatı Hizmetleri, Ulusal Rabies yönetim programı ve ıDT Biologika (DESSAU-ROSSLAU, Almanya) ' nın intramural araştırma programı tarafından kısmen destekleniyordu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
  2. Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
  3. Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
  4. Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
  5. Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
  6. Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
  7. Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
  8. Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
  9. Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
  10. Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
  11. Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
  12. de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
  13. Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
  14. Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
  15. Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
  16. Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
  17. Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
  18. Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
  19. Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
  20. Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
  21. Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
  22. Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. Shumake, S. A., Bullard, R. W. , American Society for Testing and Materials. Philadelphia. 5th Volume. STP 974 141-147 (1987).
  23. Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
  24. Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
  25. Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
  26. Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
  27. Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
  28. Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
  29. Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
  30. Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
  31. Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
  32. Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
  33. Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
  34. Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
  35. Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
  36. Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
  37. Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
  38. Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
  39. Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
  40. Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. Mongooses: their natural history. , Oliver and Boyd. Edinburgh and London. (1967).
  41. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , Cambridge University Press. Cambridge. (1995).
  42. National Rabies Management Program (NRMP). Oral rabies vaccination draft operations manual. , USDA APHIS Wildlife Services. (2009).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı 147 biyolojik Marker Herpestes auropunctatus iophenoxic asit kuduz küçük Hint FIRAVUN LC-MS/MS
Küçük Hint firavunları (<em>Herpestes Auropunctatus</em>) sera bir oral kuduz aşılama biyolojik Marker olarak kullanım Için Iophenoxic asit analogları Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T.,… More

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter