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Immunology and Infection

छोटे भारतीय मंगोलों में आयोफेनोक्क्सिक एसिड एनालॉग का विश्लेषण (हर्पेस्ट्स ऑरोपंचेक्टस) सेरा को ओरल रेबीज टीकाकरण जैविक मार्कर के रूप में उपयोग के लिए

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

हम एक biomarker और सत्यापित चारा एक उपन्यास तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ एक उपन्यास तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर के रूप में एथिल या मिथाइल iophenoxic एसिड के साथ बंदी मंगोलplacebo मौखिक रेबीज टीका baits की पेशकश की (एलसी-एमएस /

Abstract

छोटे भारतीय मंगोल (हर्पेस्ट ऑरोपंचेक्टस) पर्टो रिको में रेबीज वायरस (आरएबीवी) का एक भंडार है और इसमें प्रतिवर्ष सूचित किए जाने वाले 70% से अधिक पशु रेबीज के मामले शामिल हैं. वन्यजीव जलाशयों में RABV परिसंचरण का नियंत्रण आम तौर पर मौखिक रेबीज टीकाकरण (ORV) की एक रणनीति द्वारा पूरा किया जाता है. वर्तमान में कोई वन्यजीव ORV कार्यक्रम प्यूर्टो रिको में मौजूद है. मौखिक रेबीज टीकों और मंगोलों के लिए विभिन्न चारा प्रकार में अनुसंधान आशाजनक परिणामों के साथ आयोजित किया गया है. ORV की सफलता की निगरानी लक्ष्य प्रजातियों, जो आम तौर पर टीकाकरण के बाद RABV तटस्थ एंटीबॉडी (RVNA) में परिवर्तन का मूल्यांकन शामिल है द्वारा चारा तेज का आकलन करने पर निर्भर करता है. इस रणनीति के लिए एक सक्रिय वन्य जीवन ORV कार्यक्रम के साथ या क्षेत्रों में जहां RABV enzootic है और RVNA की पृष्ठभूमि स्तर जलाशय प्रजातियों में मौजूद हैं के साथ क्षेत्रों में व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो सकता है. ऐसी स्थितियों में, एक biomarker टीका या चारा मैट्रिक्स के साथ शामिल उपयोगी हो सकता है. हम की पेशकश की 16 बंदी mongooses placebo ORV baits युक्त एथिल-iophenoxic एसिड (एट-IPA) की सांद्रता में 0.4% और 1% चारा के अंदर और 0.14% बाहरी चारा मैट्रिक्स में. हम भी 12 बंदी mongooses ORV बाहरी चारा मैट्रिक्स में 0.035%, 0.07% और 0.14% की सांद्रता में मिथाइल-iophenoxic एसिड (me-IPA) युक्त चारा की पेशकश की. हम चारा की पेशकश करने से पहले एक सीरम नमूना एकत्र और फिर आठ सप्ताह के बाद की पेशकश के लिए साप्ताहिक. हमने सीरा से एसीटोनिट्रिल में आयोफेनॉक्सिक एसिड निकाला और तरल क्रोमैटोग्राफी/मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की। हम एट-आईपीए या मुझे-आईपीए के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सेरा का विश्लेषण किया। हम एट के लिए कम से कम आठ और चार सप्ताह के लिए पर्याप्त अंकन क्षमता पाया- और मुझे-IPA, क्रमशः. दोनों आईपीए डेरिवेटिव मंगोलों में ORV चारा तेज के क्षेत्र मूल्यांकन के लिए उपयुक्त हो सकता है. मंगोल सेरा में मार्कर की लंबी उम्र के कारण, ध्यान लगातार मूल्यांकन के दौरान एक ही आईपीए व्युत्पन्न का उपयोग करके परिणामों को भ्रमित नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए.

Introduction

रेबीज वायरस (RABV) एक नकारात्मक भावना एकल फंसे lyssavirus है, और आदेश Carnivora और Chiroptera के भीतर विविध वन्य जीवन जलाशय प्रजातियों के बीच प्रसारित. मंगोलों की कई प्रजातियां RABV के जलाशय हैं , और छोटे भारतीय मंगोल (Herpestes auropunctatus) पश्चिमी गोलार्ध में प्यूर्टो रिको और अन्य कैरेबियन द्वीपों में केवल जलाशय है ,2,3 . वन्यजीव जलाशयों में RABV परिसंचरण का नियंत्रण आम तौर पर मौखिक रेबीज टीकाकरण (ORV) की एक रणनीति के माध्यम से पूरा किया है. संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) में, इस प्रबंधन गतिविधि USDA/APHIS/Wildlife Services राष्ट्रीय रेबीज प्रबंधन कार्यक्रम (NRMP)4द्वारा समन्वित है. वर्तमान में कोई वन्यजीव ORV कार्यक्रम प्यूर्टो रिको में मौजूद है. रेबीज टीकों और मंगोलों के लिए विभिन्न प्रकार के चारा प्रकार के अनुसंधान का आयोजन किया गया है जिसमें आशाजनक परिणामदिए गए हैं कि मंगोलों के लिए ORV कार्यक्रम संभव है5,6,7,8.

ORV के प्रभाव की निगरानी लक्ष्य प्रजातियों, जो आम तौर पर आरवी एंटीबॉडी seroprevalence में परिवर्तन का मूल्यांकन शामिल है द्वारा चारा तेज का आकलन पर निर्भर करता है. हालांकि, इस रणनीति को एक सक्रिय वन्य जीवन ORV कार्यक्रमों के साथ या क्षेत्रों में जहां आरवी enzootic और RABV तटस्थ एंटीबॉडी (RVNA) की पृष्ठभूमि स्तर जलाशय प्रजातियों में मौजूद हैं के साथ क्षेत्रों में चुनौतीपूर्ण हो सकता है. ऐसी स्थितियों में, एक biomarker चारा या बाहरी चारा मैट्रिक्स में शामिल उपयोगी हो सकता है.

विभिन्न जैविक मार्करों का उपयोग कई प्रजातियों में चारा तेज करने की निगरानी करने के लिए किया गया है , जिसमें रैकून (प्रोसिऑन लॉटर)9,10,स्टोट्स (मुस्टेला एरमीन)11,12, यूरोपीय बिज्जू ( मेल्स मेल्स) 13, जंगली सूअर (सस स्क्रोफा)14, छोटे भारतीय मंगोलों15 और प्रेरी कुत्तों (सिनोमिसुडोविओविकियस)16,17अन्य के बीच . अमेरिका में , परिचालन ORV चारा अक्सर चारा uptake18,19पर नजर रखने के लिए चारा मैट्रिक्स में एक 1% टेट्रासाइक्लिन बायोमार्कर शामिल हैं . हालांकि, टेट्रासाइक्लिन के उपयोग के लिए कमियां पर्यावरण में एंटीबायोटिक दवाओं के वितरण पर बढ़ती चिंता में शामिल हैं और टेट्रासाइक्लिन का पता लगाना आम तौर पर आक्रामक है, हड्डी प्राप्त करने के लिए दांत निष्कर्षण या पशु के विनाश की आवश्यकता होती है नमूने20| रोडामाइन बी का विभिन्न ऊतकों में एक मार्कर के रूप में मूल्यांकन किया गया है और बालों और मूंछों में पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश और फ्लोरोसेंट का उपयोग करके इसका पता लगाया जा सकता है10,21.

Iophenoxic एसिड (आईपीए) एक सफेद, क्रिस्टलीय पाउडर है कि coyotes में चारा खपत का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (कैनिस latrans)22, आर्कटिक लोमड़ी (Vulpes lagopus)23, लाल लोमड़ी (Vulpes vulpes)24, raccoons 9 , 25, जंगली सूअर14, लाल हिरण (सेर्वस एलाफुस स्कॉटिकस)26, यूरोपीय बिज्जू12 और फेरेट (एम . फ्रो)27, कई अन्य स्तनधारी प्रजातियों में से . आईपीए का अवधारण समय कुछ मार्सूपियल्स28,29में दो सप्ताह से कम से कम प्रजातियों के अनुसार भिन्न होता है , जो घरेलू कुत्तों में26 और घरेलू कुत्तों (कैनिस ल्यूपस परिचित)30में कम से कम 26 सप्ताह तक होता है . अवधारण समय भी खुराक पर निर्भर हो सकताहै 31. आयोफेनॉकिक अम्ल सीरम एल्बुमिन को दृढ़ता से बांधता है और रक्त आयोडीन के स्तरकोमापने के द्वारा ऐतिहासिक रूप से पता लगाया गया था . इस अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) तरीकों द्वारा सीधे यूवी का पता लगाने के साथ iophenoxic एसिड सांद्रता को मापने के लिए लगाया गया था33, और अंत में तरल क्रोमैटोग्राफी और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ (LCMS) 34,35. इस अध्ययन के लिए, अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) विधि के साथ एक अत्यधिक संवेदनशील और चयनात्मक तरल क्रोमैटोग्राफी विकसित की गई थी जो आयोफेक्सेक एसिड के दो अनुरूपों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (एमआरएम) का उपयोग करती है। हमारा उद्देश्य इस LC-MS/MS विधि का उपयोग करने के लिए अंकन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl) propanoic एसिड (मेथिल-IPA या मुझे-IPA) और 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl) butanoic एसिड (-IPA या एट-IPA) और एक ethyl में वितरित जब एक ethyl बंदी mongooses के लिए चारा.

Mongooses व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्मोक्ड सॉसेज और मछली के तेल के साथ चारा पिंजरे जाल में कब्जा कर लिया रहते थे. Mongooses व्यक्तिगत 60 सेमी x 60 सेमी x 40 सेमी स्टेनलेस स्टील पिंजरों में रखे गए थे और $ 50 जी वाणिज्यिक सूखी बिल्ली भोजन के एक दैनिक राशन खिलाया, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चिकन जांघ के साथ प्रति सप्ताह दो बार पूरक. पानी उपलब्ध था एड लिमिटम. हम आईपीए, एथिल-आईपीए और मिथाइल-आईपीए के दो डेरिवेटिव दिया, placebo ORV baits में बंदी mongooses के लिए. सभी चारा एक 28 मिमी x 20 मिमी x 9 मिमी पन्नी फफोला पैक से बना रहे थे एक बाहरी कोटिंग के साथ (इसके बाद "बैट मैट्रिक्स") पाउडर चिकन अंडे और जिलेटिन युक्त (सामग्रीकीतालिका).। बैविट्स में 0.7 एमएल पानी या आईपीए व्युत्पन्न होता है और इसका वजन लगभग 3 ग्राम होता है, जिसमें से 2 ग्राम बाहरी चारा मैट्रिक्स था।

हमने तीन सांद्रता में 16 कैप्टिव मंगोलों एट-आईपीए की पेशकश की: 0.14% (2.8 मिलीग्राम एट-आईपीए में $2 जी चारा मैट्रिक्स; 3 पुरुष [m], 3 महिलाओं [f]), 0.4% (2.8 मिलीग्राम एट-आईपीए में 0.7 एमएल ब्लिस्टर पैक मात्रा; 3 m, ब्लिस्टर, 3f), और 1.0% (7.0 मिलीग्राम-IPA मात्रा में) 0.7 , 2f). 2.8 मिलीग्राम की समग्र खुराक 5 मिलीग्राम/किग्रा27,36 की खुराक दर से मेल खाती है और प्यूर्टो रिको में 560 ग्राम के औसत मंगोल वजन पर आधारित है। हमने 1% का चयन उच्चतम सांद्रता के रूप में किया क्योंकि अनुसंधान से पता चलता हैकि कुछ बायोमार्करों के स्वाद को घृणा कुछ प्रजातियों में हो सकती है . हम केवल फफोला पैक में 1% खुराक की पेशकश के रूप में flocculation विलायक में भंग करने से विलेय पर्याप्त रूप से चारा मैट्रिक्स में समान रूप से शामिल किया जा करने के लिए रोका. एक नियंत्रण समूह (2m, 1f) बाँझ पानी और कोई आईपीए से भरा baits प्राप्त किया. हम सुबह में मंगोलों के लिए चारा की पेशकश की ($8 a.m.) के दौरान या उनके दैनिक रखरखाव राशन के भोजन से पहले. चारा अवशेष लगभग 24 घंटे के बाद हटा दिया गया. हम उपचार से पहले रक्त के नमूने एकत्र, एक दिन के बाद उपचार और फिर साप्ताहिक अप करने के लिए 8 सप्ताह के बाद उपचार. हमने आइसोफ्लुरेन गैस के इनहेलेशन द्वारा मंगोलों का एनेस्थेटाइज किया और फेरेट्स38के लिए वर्णित कपाल वेना कैवा के विषाणु द्वारा पूरे रक्त के 1.0 एमएल तक एकत्र किए . हमने पूरे रक्त के नमूनों को केंद्रित किया, सीरा को क्रायोविएल्स में स्थानांतरित कर दिया और विश्लेषण तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया। सभी समय अवधि के दौरान सभी जानवरों के नमूने नहीं थे बार-बार रक्त के प्रभावों को कम करने के लिए जानवरों के स्वास्थ्य पर खींचता है. नियंत्रण जानवरों 0 दिन पर नमूना थे, तो अप करने के लिए साप्ताहिक 8 सप्ताह के बाद उपचार.

हम तीन सांद्रता में मुझे आईपीए दिया: 0.035% (0.7 मिलीग्राम), 0.07% (1.4 mg) और 0.14% (2.8 mg), सभी चारा मैट्रिक्स में शामिल, उपचार समूह के अनुसार 2 पुरुषों और 2 महिलाओं के साथ. दो पुरुषों और दो महिलाओं बाँझ पानी और कोई आईपीए से भरा चारा प्राप्त किया. चारा की पेशकश बार और मंगोल संज्ञाहरण ऊपर वर्णित हैं. हम 1 दिन पर उपचार से पहले रक्त के नमूने एकत्र, और फिर साप्ताहिक अप करने के लिए 4 सप्ताह के बाद उपचार.

हम सामान्यता के लिए सीरम एकाग्रता डेटा का परीक्षण किया और विभिन्न उपचार समूहों के सीरम आईपीए सांद्रता के लिए अनुमानित साधन. हम एक रैखिक मिश्रित मॉडल का इस्तेमाल किया मतलब सीरम एट-IPA सांद्रता व्यक्तियों भर में जमा की तुलना करने के लिए. चारा प्रकार (मैट्रिक्स/ब्लिस्टर पैक) प्रयोगात्मक दिन के अलावा एक निश्चित प्रभाव था, जबकि पशु आईडी एक यादृच्छिक प्रभाव था। सभी प्रक्रियाएँ सामान्य सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका) का उपयोग करके चलाई गई थीं और महत्व का मूल्यांकन $ 0.05 पर किया गया था।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को अनुमोदित अनुसंधान प्रोटोकॉल क्यूए-2597 के तहत यूएसडीए राष्ट्रीय वन्यजीव अनुसंधान केंद्र की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल मंगोल सीरम में मिथाइल-iophenoxic एसिड का पता लगाने के लिए विश्लेषण प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस विधि एक पुनरावर्ती प्रक्रिया है कि मंगोल सीरम में एथिल-iophenoxic एसिड के विश्लेषण के साथ शुरू हुआ के अंतिम संस्करण है. एथिल-iophenoxic एसिड के प्रारंभिक मूल्यांकन के दौरान तरीकों में मामूली संशोधन किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप नीचे प्रस्तुत अंतिम प्रोटोकॉल में. प्रतिनिधि परिणाम ों में दोनों पुनरावृत्तियों के दौरान प्राप्त किए गए परिणाम शामिल हैं।

1. समाधान और मानकों की तैयारी

  1. मुझे-आईपीए और एट-आईपीए खरीद।
  2. मोबाइल प्रावस्था क के लिए, 1 ल् 0ण्1% (v/v) formic acid को जल में 1 एमएल फोरमिक अम्ल को 1 ल् के साथ अल्ट्राप्यूर जल ($ 18 म]) के संयोजन से तैयार की है। मोबाइल फेज बी के लिए, एसीटोनिट्रिल (एसीएन) में 0.1% (v/v) फोरमिक एसिड के 1 L को 1 L ACN के साथ फोरमिक एसिड के 1 एमएल को मिलाकर तैयार करें।
  3. diluent के लिए, ACN में 0.5% (v/v) trifluoracetic एसिड (TFA) के 200 एमएल के साथ TFA के 200 एमएल के संयोजन के द्वारा तैयार.
  4. लगभग 1,000 ग्राम/एमएल की सांद्रता पर ACN में मुझे-IPA और एट-IPA के केंद्रित आईपीए स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. एक माइक्रोबैलेंस पर लगभग 10 मिलीग्राम मी-आईपीए का वजन करें और द्रव्यमान को रिकॉर्ड करें $ 0.0001 मिलीग्राम। मात्रात्मक रूप से मुझे-IPA को 45 एमएल ए सी एन का उपयोग करके 10 एमएल क्लास ए वॉल्यूमिक फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया जाता है। Sonicate 1 मिनट सभी ठोस भंग करने के लिए, और फिर एसीएन के साथ मात्रा में लाने के लिए।
    2. पाली-टेट्राफ्लोरोएथिलीन (PTFE)-लाइन्ड कैप के साथ एम्बर 8 एमएल कांच की शीशियों में प्रत्येक स्टॉक के 8 एमएल को स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर। शेष स्टॉक को खतरनाक अपशिष्ट में स्थानांतरित करें।
  5. 25x-7 me-IPA स्टॉक के लिए (तालिका1), ACN में मुझे-IPA का स्टॉक लगभग 200 ग्राम/ उदाहरण: 1,000 डिग्री सेल्सियस कांच सिरिंज का उपयोग करके 5 एमएल क्लास ए वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में से 1 एमएल को मेरा-IPA केंद्रित स्टॉक में स्थानांतरित करें। ए.सी.एन. के साथ मात्रा को कम करें. PTFE-लाइन्ड कैप के साथ एक एम्बर 8 एमएल ग्लास शीशी के लिए स्टॉक स्थानांतरण। आरटी पर स्टोर करें.
  6. तालिका 1में वर्णित छह अतिरिक्त 25x मी-आईपीए स्टॉक तैयार करें। प्रत्येक स्टॉक के लिए, PTFE-लाइन्ड कैप के साथ एक एम्बर 8 एमएल एम्बर ग्लास शीशी में एक दोहराने पाइपेटर का उपयोग करके इंगित वॉल्यूम को संयोजित करें। आरटी पर प्रत्येक स्टॉक संग्रहीत करें।
  7. 25x सरोगेट स्टॉक के लिए, चरण 1.4.2 में तैयार केंद्रित स्टॉक से लगभग 10 डिग्री ग्राम/एमएल पर मुझे-IPA का एक सरोगेट स्टॉक तैयार करें। एक 10 एमएल कक्षा एक volumetric फ्लास्क के लिए केंद्रित मुझे-IPA स्टॉक के 0.100 एमएल स्थानांतरण एक 100 $L ग्लास सिरिंज का उपयोग कर, और फिर ए सी एन के साथ मात्रा को पतला.
    1. PTFE-लाइन्ड कैप के साथ एक एम्बर 8-एमएल ग्लास शीशी में 8 एमएल स्थानांतरण करें। आरटी पर स्टोर. खतरनाक कचरे के लिए शेष स्टॉक स्थानांतरण.
  8. तालिका 2में वर्णित के रूप में 2 एमएल पेंच-टॉप ग्लास autosampler शीशियों में दोनों analytes युक्त 4x स्टॉक तैयार करें।
    1. उदाहरण के लिए, स्टॉक 4x-7 तैयार करने के लिए, 2 एमएल शीशी के लिए, 0.5 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने पाइपेटर का उपयोग करके चरण 1.5 से 25x-7 me-IPA स्टॉक के 0.20 एमएल जोड़ें। कदम से 25x सरोगेट एट-आईपीए स्टॉक के 0.20 एमएल जोड़ें 1.7 0.5 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने pipettor का उपयोग कर.
    2. 1 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने pipettor का उपयोग कर ACN के 0.85 एमएल जोड़ें. शीशी को सुरक्षित रूप से कैप करें और मिश्रण करने के लिए 5x को उलटें।
  9. मानक वक्र को सारणी 3में वर्णित 2 एमएल पेंच-टॉप ऑटोप्रतिदर्शी शीशियों में तैयार कीजिए।
    1. उदाहरण के लिए, मानक 7 (Std 7) को 2-एमएल शीशी में तैयार करने के लिए, 0.5 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने पाइपेटर का उपयोग करके चरण 1.8.2 से 4x-7 स्टॉक का 0.20 एमएल जोड़ें. 1 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने pipettor का उपयोग कर ultrapure DI पानी के 0.60 एमएल जोड़ें। शीशी को सुरक्षित रूप से कैप करें और मिश्रण करने के लिए 5x को उलटें।

2. नमूना तैयारी

चेतावनी: इस प्रक्रिया का प्रदर्शन कर रहे कर्मियों रेबीज पूर्व जोखिम प्रोफिलैक्सिस की पूरी श्रृंखला प्राप्त किया है और एक संघीय व्यावसायिक स्वास्थ्य नामित चिकित्सा सुविधा से 0.5 IU ऊपर एक प्रलेखित रेबीज एंटीबॉडी titer है चाहिए. कर्मियों को निष्कर्षण करते समय हर समय प्रयोगशाला कोट और आंखों की सुरक्षा पहनना चाहिए। चेतावनी: एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में कदम 2.3 $2.6 प्रदर्शन.

  1. प्रत्येक नमूने के लिए, एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब युक्त तैयार 200-300 NaCl.Arrange एक 80 स्थिति प्लास्टिक रैक में ट्यूबों. चरण 2.6 में उपयोग के लिए अलग सेट करें.
    नोट: एक माइक्रो स्कूप (या अन्य छोटे मापने डिवाइस) नमूने की बड़ी संख्या के लिए सिफारिश की है.
  2. प्रत्येक नमूने के लिए, लेबल दो 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब: एक के रूप में "ए" और अन्य के रूप में "बी". एक 80 स्थिति प्लास्टिक रैक में ट्यूबों की व्यवस्था.
  3. निम्नलिखित सामग्री और एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में सीरम निष्कर्षण के लिए आवश्यक उपकरण रखें: microcentrifuge ट्यूबों (रैक में) कदम में तैयार 2.1 और 2.2, एक भंवर मिक्सर, 0.5 एमएल और 5 एमएल क्षमता युक्तियाँ, 100 के साथ दोहराने pipettor, 100-1,000 $L हवा विस्थापन 1,000 $L युक्तियों के साथ पिपेट, लगभग 100 एमएल के साथ कंटेनर प्रत्येक diluent और ultrapure DI पानी, और एक biohazard अपशिष्ट कंटेनर.
  4. जमे हुए भंडारण से सीरम नमूने निकालें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में आरटी के लिए गर्म. भंवर नमूना करने से पहले प्रत्येक सीरम नमूना मिश्रण.
  5. 0.5 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने pipettor का उपयोग करना, ट्यूब में मंगोल सीरम के 0.050 एमएल वितरित "एक" और 25x सरोगेट स्टॉक के 0.050 एमएल जोड़ें. फिर 5 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने pipettor का उपयोग कर ट्यूब "ए" के लिए diluent के 0.950 एमएल जोड़ें। कैप सुरक्षित रूप से और 10 डिग्री 15 एस के लिए भंवर मिश्रण।
  6. पहले वजन वाले NaCl कदम से ट्यूब में 2.1 वितरित "ए" और भंवर मिश्रण 3x के लिए 8 $12 s. ट्यूब युक्त शीशी रैक के बाहर सतहों नीचे पोंछो "ए" 70% का उपयोग कर (v/v) आइसोप्रोपेनोल.
    नोट: नमूनों की रैक अब द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट से हटाया जा सकता है.
  7. जलीय और ACN चरणों को अलग करने के लिए 1 मिनट के लिए 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब "A"। पिपेट 0.80 एमएल ऊपरी ACN चरण ट्यूब करने के लिए "बी" एक 100 डिग्री 1,000 $L हवा विस्थापन pipette का उपयोग कर. ट्यूब में शेष समाधान स्थानांतरण "एक" खतरनाक कचरे के लिए और एक bioHazardous अपशिष्ट कंटेनर में खाली ट्यूब त्याग दें.
  8. एक 45 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एन2 गैस के एक कोमल प्रवाह के साथ ट्यूब "बी" से ACN और TFA निकालें।
  9. ट्यूब के लिए ACN के 0.250 एमएल जोड़ें "बी" एक दोहराने pipettor का उपयोग कर, भंवर मिश्रण के लिए 4 $5 s, और फिर centrifuge संक्षेप में (2 डिग्री 4 s) पर 12,000 x g ट्यूब के नीचे तरल इकट्ठा करने के लिए.
  10. 5 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने पाइपेटर का उपयोग कर के लिए ultrapure DI पानी के 0.750 एमएल जोड़ें, 4 डिग्री 5 s के लिए भंवर मिश्रण, और फिर नमूना स्पष्ट करने के लिए 12,000 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  11. एक 1,000 एल हवा विस्थापन पिपेट का उपयोग कर एक autosampler शीशी के लिए supernatant के 0.75 एमएल स्थानांतरण। biohazard अपशिष्ट कंटेनर में पिपेट युक्तियाँ छोड़ें.
  12. कैप autosampler शीशियों सुरक्षित रूप से और LC-MS/MS (अनुभाग 4) द्वारा विश्लेषण. ट्यूब में शेष समाधान स्थानांतरण "बी" खतरनाक कचरे के लिए और एक bioHazardous अपशिष्ट कंटेनर के लिए खाली ट्यूब त्याग दें. ऑटोक्लेविंग या भस्मीकरण द्वारा सभी जैव खतरनाक अपशिष्ट का निपटान करें।

3. गुणवत्ता नियंत्रण नमूने

चेतावनी: अनुभाग 2 में वर्णित चेतावनी कथन का पालन करें।

नोट:: निम्न कार्यविधि किसी विश्लेषण के लिए आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) नमूनों की न्यूनतम संख्या का वर्णन करता है। प्रत्येक स्तर पर प्रतिकृतियां सिफारिश कर रहे हैं अगर पर्याप्त नियंत्रण मंगोल सीरम उपलब्ध है.

  1. चार 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार कीजिए जिनमें 200 डिग्री 300 मिलीग्राम नाक्कर है। एक 80 स्थिति प्लास्टिक रैक में ट्यूबों की व्यवस्था.
  2. प्रत्येक QC नमूने के लिए, लेबल दो 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब: एक के रूप में "एक" और अन्य के रूप में "बी". एक 80 स्थिति प्लास्टिक रैक में ट्यूबों की व्यवस्था.
  3. चरण 2.3 दोहराएँ.
  4. जमे हुए भंडारण से नियंत्रण मंगोल सीरम निकालें और जैव सुरक्षा कैबिनेट में आरटी के लिए गर्म. भंवर नमूना करने से पहले नियंत्रण सीरम मिश्रण.
  5. 0.5 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने pipettor का उपयोग कर चार 1.5-एमएल "ए" ट्यूबों में नियंत्रण मंगोल सीरम के 0.050 एमएल वितरित करें।
  6. 0.5 एमएल क्षमता टिप के साथ एक दोहराने pipettor का उपयोग कर तालिका 4 में निर्दिष्ट के रूप में चार QC नमूनों में से प्रत्येक को मजबूत। प्रत्येक QC नमूना सुरक्षित रूप से कैप और 10 के लिए भंवर मिश्रण 10 "15 s.
  7. चरण 2.6 $2.12 में वर्णित के रूप में निष्कर्षण प्रक्रिया निष्पादित करें।

4. एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण

  1. LC-MS/MS को तालिका 5में वर्णित सभी पैरामीटरों के साथ कॉन्फ़िगर करें. LC-MS/MS पर पावर और 0.800 mL/min करने के लिए प्रवाह दर सेट करने से पहले 70 डिग्री सेल्सियस तक पहुँचने के लिए स्तंभ की अनुमति दें।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण नमूने और अज्ञात नमूनों से मिलकर प्रत्येक बैच से पहले और बाद में मानक वक्र इंजेक्ट करने के लिए डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (सामग्री कीतालिका) में एक अनुक्रम सेट करें।
  3. सभी मानकों और नमूनों को इंजेक्ट करें और तालिका 5में सूचीबद्ध पैरामीटरों का उपयोग करके एमआरएम आयन क्रोमैटोग्राम प्राप्त करें।
  4. अनुक्रम पूरा होने के बाद, एलसी-एमएस/एमएस को बंद कर देते हैं और सभी ऑटो-नमूना शीशियों को खतरनाक अपशिष्ट के रूप में निपटान करते हैं।

5. क्वांटिकेशन

  1. आंतरिक मानक के रूप में एट-IPA का उपयोग कर मुझे-IPA के लिए सापेक्ष सांद्रता बनाम सापेक्ष प्रतिक्रियाओं की एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। एट-आईपीए (570.7 ] 442.7 के लिए एमआरएम संक्रमण द्वारा विभाजित मुझे-IPA (556.6 ] 428.7) के लिए परिमाणक एमआरएम संक्रमण से सापेक्ष प्रतिक्रियाओं की गणना करें। एक 7-स्तर अंशांकन वक्र का निर्माण एक दूसरे क्रम द्विघात समारोह है कि भारित है और मूल पर ध्यान नहीं देता का उपयोग कर.
  2. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कर मुझे-IPA के सीरम एकाग्रता (सीसीरम)की गणना करें:
    Equation 1
    जहाँ गउपकरण की इकाइयों में अंशांकन वक्र से साधन द्वारा निर्धारित सांद्रता है, 1ण्25 कमजोर पड़ने का कारक Equation 2 है, टअंतिम अंतिम नमूना मात्रा (1.0 एमएल) है, और वीसीरम एमएल में सीरम की मात्रा है ( 0.050 एमएल नाममात्र).

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Representative Results

एक me-IPA विश्लेषण से प्रतिनिधि आयन क्रोमैटोग्राम चित्र 1में प्रस्तुत कर रहे हैं. नियंत्रण मंगोल सीरम (चित्र 1क) एट-आईपीए (सरोगेट एनेलाइट) का प्रतिधारण समय और इंगित अवधारण समय पर मुझे-IPA की अनुपस्थिति को दर्शाता है। गुणवत्ता नियंत्रण नमूना (चित्र 1ख) मुझे-आईपीए से आधाररेखा पृथक्करण के साथ-साथ मुझे-IPA के लिए परिमाणक और क्वालीफायर संक्रमण को दर्शाता है। चित्र 1C अध्ययन से एक प्रतिनिधि नमूने को दर्शाता है जिसमें 33.5 ग्राम/एमएल मी-आईपीए की एक प्रेक्षित सीरम सांद्रता होती है।

एक me-IPA विश्लेषण से एक प्रतिनिधि अंशांकन वक्र चित्र 2में प्रस्तुत किया गया है. 7-स्तर, 14-बिंदु मानक वक्र 0.00202 से 8.27 ग्राम/एमएल मी-आईपीए को 0.9998 के सहसंबंध गुणांक (त2 )के साथ 0.00202 से लेकर। सहसंबंध गुणांक पांच मी-आईपीए विश्लेषण ों के लिए 0.9998 से 0.99997 तक थे। सरोगेट एनेलाइट एट-आईपीए सांद्रता सभी मानकों में 0.502 ग्राम/

तालिका 6 नियंत्रण mongoose सीरम के लिए सटीकता और सटीक परिणाम प्रस्तुत करता है 0, 1.3, 31, और 82 g/mL me-IPA के साथ दृढ़ (एन $ 10 प्रत्येक स्तर पर). परिणाम पांच अलग-अलग विश्लेषणों से एकत्र किए गए थे। प्रतिशत वसूली 96.9% से 109% तक थी। तीन किलेबंदी के स्तर पर प्रतिशत सापेक्ष मानक विचलन (% आरएसडी) क्रमशः 3.4%, 1.7%, और 2.3% था।

गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों में अभिल्पित संकेत-से-शोर अनुपात (एस/एन) (द 10 ऋणात्मक नियंत्रण; द 10 1ण्3 ग्राम/एमएल मी-आईपीए) का उपयोग पता लगाने की सीमा (डीएल; 3 x S/N) और परिमाणसीमा (QL; 10 x S/N) निर्धारित करने के लिए किया गया था। मेरे लिए डीएल और क्यूएल-आईपीए मंगोल सीरम में क्रमशः 0.012 ग्राम/एमएल और 0.042 ग्राम/

क्वालिफायर MRM संक्रमण के शिखर क्षेत्र प्रतिक्रियाओं परिमाणक MRM संक्रमण द्वारा विभाजित (सभीEquation 3 मानकों और नमूनों के लिए गणना की गई थी. प्रत्येक नमूने के लिए यह अनुपात तब क्वालीफायर प्रतिशत मिलान निर्धारित करने के लिए अंशांकन मानकों में मनाया औसत अनुपात से विभाजित किया गया था। चित्र 1C में दिखाए गए नमूने के लिए क्वालीफायर अनुपात 0.439 था, एक 96.3% मैच के साथ.

एट-IPA सरोगेट analyte की वसूली सभी QC नमूने और अज्ञात नमूनों के लिए औसत एट-IPA शिखर क्षेत्र प्रतिक्रिया द्वारा एट-IPA पीक क्षेत्र प्रतिक्रिया विभाजित करके गणना की गई थी अंशांकन मानकों में मनाया. औसत सरोगेट एनालाइट वसूली 91.0% (नकारात्मक नियंत्रण), 91.4% (1.3 डिग्री/एमएल), 92.8% (31 ग्राम/एमएल), और 95.4% (82 डिग्री/एमएल) थी।

मी-आईपीए के परिमाणक या क्वालीफायर संक्रमण के लिए कोई हस्तक्षेप चोटियों को नियंत्रण में मनाया गया (चित्र 1क)।

निष्कर्षण प्रक्रिया और वाद्य शर्तों मंगोल सीरम में आदि-IPA निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया (चित्र 3 और तालिका 7) मुझे-IPA विधि के समान था, लेकिन निम्नलिखित परिवर्तनों के साथ. प्रोपिल-iophenoxic एसिड (pr. ) स्रोत सुखाने गैस तापमान 12 L/min के प्रवाह और 35 साई के एक nebulizer दबाव के साथ 350 डिग्री सेल्सियस था। केशिका वोल्टता -2,500 वी थी। स्रोत कोई म्यान गैस या नोजल वोल्टेज को समायोजित करने का मतलब था. एट-आईपीए के लिए परिमाणक ीय एमआरएम संक्रमण 570.7 - 442.8 (584.7 ] 456.8 जनसंपर्क-आईपीए के लिए था। विखंडनकर्ता 80 ट था और टक्कर ऊर्जा दोनों एनालाइट्स के लिए 10 ट थी। एट-आईपीए के लिए क्वालीफायर एमआरएम 40 ट की टक्कर ऊर्जा के साथ 570.7 $ 126.8 था।

एट-IPA के लिए सभी मंगोल सीरम नमूनों का परीक्षण आठ विश्लेषण पर किया गया था. 7-स्तर अंशांकन वक्र 0.00207 से 8.48 ग्राम/एमएल तक सहसंबंध गुणांकों (r2) से लेकर 0.9990 से 0.9999 तक था। सरोगेट एनेलाइट जनसंपर्क-आईपीए सांद्रता 0.512 ग्राम/ तालिका 7 0, 1.3, 13, 32, 85, और 170 g/mL मुझे-IPA के साथ दृढ़ नियंत्रण मंगोल सीरम के लिए सटीकता और सटीक परिणाम प्रस्तुत करता है। परिणाम आठ अलग-अलग विश्लेषणों से एकत्र किए गए थे। प्रतिशत वसूली 89.5% से 115% तक थी। पांच किलेबंदी के स्तर पर % आरएसडी क्रमशः 4.3%, 1.5%, 2.3%, 5.6%, और 1.1% था। S/N गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों में मनाया गया (द ] 21 ऋणात्मक नियंत्रण; द $ 21 पर 1ण्3 g/mL me-IPA) का उपयोग डीएल और QL निर्धारित करने के लिए किया गया था। मेरे लिए डीएल और क्यूएल-आईपीए में मंगोल सीरम क्रमशः 0.12 ग्राम/एमएल और 0.42 ग्राम/ गुणवत्ता नियंत्रण नमूनों से औसत सरोगेट एनेलाइट वसूली 86.8% (एन $ 75) थी। एट-आईपीए के परिमाणक या क्वालीफायर संक्रमण के लिए कोई हस्तक्षेप चोटियों नियंत्रण mongoose सीरम में मनाया गया.

सभी मंगोलों ने एट-आईपीए चारा की पेशकश की जो 24 घंटे के समय की कमी के भीतर चारा का $25% था और उनके सीरा में एट-आईपीए का परिमाणात्मक स्तर था (सारणी 8)। मिश्रित मॉडल विश्लेषण से, समग्र मतलब सीरम आईपीए सांद्रता चारा मैट्रिक्स में biomarker के 2.8 मिलीग्राम के साथ मामूली रूप से अधिक थे (17.5 डिग्री ग्राम/एमएल, 95% CI 11.7"23.3g/mL) ब्लिस्टर पैक की तुलना में (9.8 g/mL, 95% CI.0 ]15.6g /mL (3] , P $ 0.07). दोनों चारा प्रकार के लिए सांद्रता प्रयोगात्मक दिन के साथ क्षय ($ $ -0.15 - 0.04, F ] 14.4, P $ 0.0005). सीरम आईपीए सांद्रता में व्यक्तिगत स्तर परिवर्तनशीलता मनाया गया (पशु आईडी सहप्रसरण पैरामीटर अनुमान ] 46.6 ] 20.7). सभी मंगोलों केवल खाली पन्नी फफोला पैक शेष के साथ नियंत्रण चारा के 100% भस्म. सीरम में आदि-आईपीए अवशेषों की माध्य सांद्रता समय अवधि केअनुसार परिवर्तनीय थी और समय के साथ-साथ लगातार घटने के लिए प्रकट नहीं हुई थी (चित्र 3)।

सभी मंगोलों ने मुझे-आईपीए चारा की पेशकश की जो 24 घंटे की समय सीमा के भीतर चारा का 25% है और उनके सीरा में मुझे-आईपीए का परिमाणात्मक स्तर था (तालिका 9)। मतलब एट की सेरोलॉजिक एकाग्रता- और मैं-IPA में मंगोल सीरा चारा में आईपीए की एकाग्रता पर निर्भर दिखाई दिया. चारा में आईपीए की उच्च सांद्रता के परिणामस्वरूप उच्च सीरम अवशेषों के परिणामस्वरूप भी मामलों में जहां समग्र खुराक (2.8 मिलीग्राम एट-आईपीए के मामले में) एक ही बनी रही। दिलचस्प बात यह है कि मुझे-आईपीए दिन 1 में एक प्रारंभिक कील के साथ समय के साथ एक और भी गिरावट पैटर्न का उत्पादन करने के लिए दिखाई दिया, दिन 14 तक एक स्थिर गिरावट के बाद जहां सांद्रता पठार के लिए दिखाई दिया (चित्र 4).।

Figure 1
चित्र 1 : प्रतिनिधि आयन क्रोमैटोग्राम. (ए) प्रतिनिधि एमआरएम आयन क्रोमैटोग्राम नियंत्रण के मंगोल सीरम सरोगेट एथिल-आइओफेनोक्सिक एसिड (एट-आईपीए) के साथ दृढ़। तीर मिथाइल-iophenoxic एसिड (me-IPA) के लिए प्रतिधारण समय इंगित करता है. (ख) प्रतिनिधि MRM आयन क्रोमैटोग्राम नियंत्रण mongoose सीरम के साथ दृढ़ 31 g/ मी-आईपीए के लिए परिमाणक (क्वांट) और क्वालीफायर (क्वाल) संक्रमण के सापेक्ष तीव्रता दिखाए जाते हैं। (ग) एक अनुमंडल सीरम नमूने के प्रतिनिधि एमआरएम आयन क्रोमैटोग्राम, जिसमें एक मनाया गया मी-आईपीए सांद्रता 33.5 ग्राम/एमएल है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : प्रतिनिधि अंशांकन वक्र. मिथाइल-iophenoxic एसिड (me-IPA) के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न एक मूल अंशांकन वक्र. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : मतलब सीरम एथिल आईपीए (एट-आईपीए) समय के साथ चारा प्रकार और एकाग्रता से एकाग्रता. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : मतलब सीरम मिथाइल आईपीए (एम-आईपीए) समय के साथ चारा एकाग्रता द्वारा एकाग्रता. सभी मुझे आईपीए सांद्रता बाहरी चारा मैट्रिक्स में शामिल किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मी-आईपीए एकाग्रता (जेडजी/
Id
25x-7 चरण 1.6 देखें 200
25x-6 3.000 एमएल एसीएन के साथ 1.000 एमएल 25x-7 स्टॉक का मिश्रण 50
25x-5 3.000 एमएल एसीएन के साथ 1.000 एमएल 25x-6 स्टॉक का मिश्रण 13
25x-4 3.000 एमएल एसीएन के साथ 1.000 एमएल 25x-5 स्टॉक का मिश्रण 3.1
25x-3 3.000 एमएल एसीएन के साथ 1.000 एमएल 25x-4 स्टॉक का मिश्रण 0.78
25x-2 3.000 एमएल एसीएन के साथ 1.000 एमएल 25x-3 स्टॉक का मिश्रण 0.2
25x-1 3.000 एमएल एसीएन के साथ 1.000 एमएल 25x-2 स्टॉक का मिश्रण 0.049

तालिका 1: ACN में 25x me-IPA शेयरों की तैयारी (8-एमएल एम्बर ग्लास शीशियों में).

एकाग्रता (जेडजी/
Id मी-आईपीए एट-आईपीए
4x-7 0.200 एमएल 25x-7 + 0.200 एमएल 25x सरोगेट + 0.850 एमएल एसीएन 32 1.6
4x-6 0.200 एमएल 25x-6 + 0.200 एमएल 25x सरोगेट + 0.850 एमएल एसीएन 8 1.6
4x-5 0.200 एमएल 25x-5 + 0.200 एमएल 25x सरोगेट + 0.850 एमएल एसीएन २ 1.6
4x-4 0.200 एमएल 25x-4 + 0.200 एमएल 25x सरोगेट + 0.850 एमएल ए सी एन 0.5 1.6
4x-3 0.200 एमएल 25x-3 + 0.200 एमएल 25x सरोगेट + 0.850 एमएल ए सी एन 0.12 1.6
4x-2 0.200 एमएल 25x-2 + 0.200 एमएल 25x सरोगेट + 0.850 एमएल एसीएन 0.031 1.6
4x-1 0.200 एमएल 25x-1 + 0.200 एमएल 25x सरोगेट + 0.850 एमएल ए सी एन 0.008 1.6
4x-0 0.200 एमएल 25x सरोगेट + 1.050 एमएल ए सी एन 0 1.6

तालिका 2: एसीएन में 4x आईपीए शेयरों की तैयारी (2-एमएल ऑटोप्रतिपिलर शीशियों में)।

एकाग्रता (जेडजी/
Id मी-आईपीए एट-आईपीए
एसटीडी 7 0.200 एमएल 4x-7 + 0.600 एमएल डि वाटर 8 0.4
Std 6 0.200 एमएल 4x-6 + 0.600 एमएल डि वाटर २ 0.4
Std 5 0.200 एमएल 4x-5 + 0.600 एमएल डि वाटर 0.5 0.4
एसटीडी 4 0.200 एमएल 4x-4 + 0.600 एमएल डि वाटर 0.13 0.4
Std 3 0.200 एमएल 4x-3 + 0.600 एमएल डि वाटर 0.03 0.4
Std 2 0.200 एमएल 4x-2 + 0.600 एमएल डि वाटर 0.0078 0.4
Std 1 0.200 एमएल 4x-1 + 0.600 एमएल डि वाटर 0.002 0.4
एसटीडी 0 0.200 एमएल 4x-0 + 0.600 एमएल डि वाटर 0 0.4
रिक्त 0.200 एमएल एसीएन + 0.600 एमएल डि वाटर 0 0

तालिका 3: 75/25 पानी में मुझे आईपीए मानकों की तैयारी /

सीरम में एकाग्रता ($g/
Id मी-आईपीए एट-आईपीए
नकारात्मक नियंत्रण 0.050 एमएल 25x सरोगेट + 0.950 एमएल डिल्यूंट 0 10
कम किलेबंदी 0.050 एमएल 25x सरोगेट + 0.020 एमएल 25x-4 + 0.930 एमएल डिल्यूंट १.२ 10
मिड किलेबंदी 0.050 एमएल 25x सरोगेट + 0.030 एमएल 25x-6 + 0.920 एमएल डिल्यूंट 30 10
उच्च किलेबंदी 0.050 एमएल 25x सरोगेट + 0.020 एमएल 25x-7 + 0.930 एमएल डिल्यूंट 80 10

तालिका 4: गुणवत्ता नियंत्रण नमूना किलेबंदी (1.5-एमएल microcentrifuge ट्यूबों में तैयार).

तरल क्रोमैटोग्राफी:
स्तंभ: C18, 2.1 x 50 मिमी, 2.5 डिग्री मीटर कण आकार
स्तंभ तापमान: 70 डिग्री सेल्सियस
इंजेक्शन मात्रा: 5 $L
प्रवाह दर: 0.800 एमएल/
मोबाइल चरण: सॉल्वेंट ए: पानी में 0.1% फोरमिक एसिड
विलायक बी: ए.सी.एन. में 0.1% फोरमिक एसिड
ग्रेडिएंट प्रोग्राम:
समय (मिनट): 0 0.25 2.25 2.26 3.4 3.41 4.75
% B: 40 40 55 100 100 40 40
सुई धो: ए.सी.एन., 3 एस
MS/MS स्रोत: ईएसआई (ऋणात्मक मोड)
गैस का तापमान: 300 डिग्री सेल्सियस
गैस प्रवाह: 5 L/मिनट
छिटकानेवाला: 45 साई
केशिका: -4000 वी
नोज़ल वोल्टेज: -500 वी
शेथ गैस तापमान: 250 डिग्री सेल्सियस
शीथ गैस प्रवाह: 7 L/मिनट
MRM संक्रमण:
एनालाइट पूर्वाधार आयन (m/ उत्पाद आयन (m/ खंडक (V) टकराव ऊर्जा (वी) निवास समय (ms) समय खंड
मैं-आईपीए 556.6 428.7 74 12 60 २
126.9 65 60
126.8 61 60
एट-आईपीए 570.7 442.7 87 16 60
समय सेगमेंट:
खंड प्रारंभ करें (न्यूनतम) अंत (मिनट) प्रकार डाइवर्टर डेल्टा ईएमवी Polarity डेटा संग्रहीत
1 0 0.6 MS2 स्कैन बर्बाद करने के लिए 0 नकारात्मक नहीं
२ 0.6 २ Mrm एमएस के लिए -100 नकारात्मक हाँ
3 २ 4.75 MS2 स्कैन बर्बाद करने के लिए 0 सकारात्मक नहीं
* परिमाणक संक्रमण बोल्डकर रहे हैं।

तालिका 5: LC-MS/MS पैरामीटर। परिमाणक उत्पाद आयनों बोल्ड कर रहे हैं.

लक्ष्य मनाया प्रतिशत
Id दिन मी-आईपीए मी-आईपीए पुनर्प्राप्ति
क्यूसी-1 1 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-2 1 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-11 २ 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-12 २ 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-21 3 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-22 3 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-31 4 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-32 4 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-3 5 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-4 5 0 एन डी एन/ए
क्यूसी-13 1 1.25 1.26 101% Ave (10) | 102%
क्यूसी-14 1 1.25 1.23 98.40% एसडी जेड 3.50%
क्यूसी-23 २ 1.25 1.26 101% % RSD ] 3.40%
क्यूसी-24 २ 1.25 1.28 102%
क्यूसी-33 3 1.29 1.3 101%
क्यूसी-34 3 1.29 1.25 96.90%
क्यूसी-5 4 1.29 1.37 106%
क्यूसी-6 4 1.29 1.41 109%
क्यूसी-15 5 1.29 1.3 101%
क्यूसी-16 5 1.29 1.34 104%
क्यूसी-25 1 30.1 30.2 100% Ave (10) | 103%
क्यूसी-26 1 30.1 31.2 104% एसडी जेड 1.80%
क्यूसी-35 २ 30.1 31.1 103% % RSD ] 1.70%
क्यूसी-36 २ 30.1 31.1 103%
क्यूसी-7 3 31 31.6 102%
क्यूसी-8 3 31 31.4 101%
क्यूसी-17 4 31 32.5 105%
क्यूसी-18 4 31 32.8 106%
क्यूसी-27 5 31 31.7 102%
क्यूसी-28 5 31 32.1 104%
क्यूसी-37 1 80.2 77.8 97.00% Ave (10) | 101%
क्यूसी-38 1 80.2 78.9 98.40% एसडी जेड 2.30%
क्यूसी-9 २ 80.2 81.8 102% % RSD ] 2.30%
क्यूसी-10 २ 80.2 79.8 99.50%
क्यूसी-19 3 82.7 83.5 101%
क्यूसी-20 3 82.7 84 102%
क्यूसी-29 4 82.7 84.7 102%
क्यूसी-30 4 82.7 87.2 105%
क्यूसी-39 5 82.7 83 100%
क्यूसी-40 5 82.7 84.1 102%

तालिका 6: मुझे के लिए QC परिणाम-IPA में मंगोल सीरम ($g/

लक्ष्य एट-आईपीए (जेडजी/ एन मतलब (%) एसडी (%) % आरएसडी
0 21
1.3 12 103 4.5 4.3
13 9 91.7 1.4 1.5
32 12 106 2.4 2.3
85 12 105 5.8 5.6
170 9 106 1.1 1.1

तालिका 7: mongoose सीरम में एट-IPA के लिए QC परिणाम ($g/

चारा प्रकार और एथिल आईपीए चारा एकाग्रता (जेडजी /
समय अवधि 0.4% - ब्लिस्टर 1.0% - ब्लिस्टर 0.14% - मैट्रिक्स नियंत्रण
मीन (एसडी) एन मीन (एसडी) एन मीन (एसडी) एन मीन (एसडी) एन
दिन 0 एन डी 5 एन डी 4 एन डी 6 एन डी 3
1 दिन 13.7 (10.9) २ 11.2 (10.4) 4 20.6 (17.3) २ ना ना
7 दिन 11.5 (6.3) 6 9.9 (9.6) 4 21.4 (10.9) 6 एन डी 3
दिन 14 10.2 (5.2) 6 5.7 (2.5) 3 17.8 (10.2) 6 एन डी 3
दिन 21 8.9 (4.1) 4 10.0 (9.5) 4 23.8 (5.3) 3 एन डी २
दिन 28 8.5 (3.9) 5 11.1 (10.6) 3 17.7 (9.3) 4 एन डी 3
दिन 35 17.0 (एनए) 1 9.1 (9.0) 4 21.7 (9.3) २ एन डी 1
दिन 42 ना 0 8.4 (8.5) 4 16.5 (एनए) 1 एन डी २
दिन 49 10.2 (5.8) २ 8.1 (8.4) 4 17.5 (4.7) २ एन डी २
दिन 56 10.9 (5.4) २ 3.8 (1.1) 3 17.6 (6.1) २ एन डी २

तालिका 8: मतलब (स्टैंड विचलन [एसडी]) एथिल-आईपीए सीरम एकाग्रता चारा प्रकार से। ND - नहीं पाया गया, NA - लागू नहीं है.

खुराक और मिथाइल आईपीए एकाग्रता (जेडजी /
समय अवधि 0.04% 0.07% 0.14% नियंत्रण
मीन (एसडी) एन मीन (एसडी) एन मीन (एसडी) एन मीन (एसडी) एन
दिन 0 एनडी (एनए) 4 एनडी (एनए) 4 एनडी (एनए) 4 एनडी (एनए) 4
1 दिन 7.8 (7.1) 4 22.2 (9.2) 4 29.1 (16.0) 4 एनडी (एनए) 4
7 दिन 4.4 (4.8) 4 14.4 (4.6) 4 21.3 (12.0) 4 एनडी (एनए) 4
दिन 14 5.7 (5.9) 4 12.0 (3.5) 4 19.6 (10.6) 4 एनडी (एनए) 4
दिन 21 4.9 (4.5) 4 12.0 (0.8) 3 18.3 (9.9) 4 एनडी (एनए) 4
दिन 28 5.4 (5.0) 4 9.8 (2.4) 4 16.4 (8.1) 4 एनडी (एनए) 4

तालिका 9: मतलब (एसडी) मिथाइल-आईपीए सीरम एकाग्रता खुराक द्वारा। ND - नहीं पता चला, NA - लागू नहीं है. सभी मिथाइल आईपीए सांद्रता बाहरी चारा मैट्रिक्स में शामिल किए गए थे.

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Discussion

अध्ययन के लिए विकसित LC-MS/MS विधि ने कई प्रतिक्रिया निगरानीों की चयनात्मकता का उपयोग करते हुए मुझे-आईपीए और एट-आईपीए को मंगोल सीरम में सही मात्रा में निर्धारित किया। MS/MS का पता लगाने की चयनात्मकता भी एक सरल साफ अप प्रोटोकॉल के लिए अनुमति दी पूरी तरह से acetonitrile पर निर्भर करने के लिए सीरम से प्रोटीन वेग विश्लेषण से पहले.

Iophenoxic एसिड ACN में घुलनशील हैं, लेकिन पानी में व्यावहारिक रूप से अघुलनशील हैं. ACN निष्कर्षण से पानी को बाहर करने के लिए, सोडियम क्लोराइड एक साफ पानी मजबूर करने के लिए जोड़ा गया था: ACN चरण जुदाई जलीय (सीरम) चरण की आयनिक शक्ति में वृद्धि से. अस्थिर एसिड trifluoracetic एसिड (TFA) भी यह सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा गया था कि iophenoxic एसिड निष्कर्षण के दौरान protonated थे और अधिक आसानी से ACN चरण में solubilized होगा. TFA LC-MS/MS विश्लेषण करने से पहले ड्राई-डाउन चरण के दौरान निकाल दिया जाता है।

मंगोलों से रक्त खींचता लगभग 1 एमएल था, जो 0.5 एमएल या सीरा से कम उपज था। प्रत्येक नमूने के विश्लेषण को दोहराने के लिए, एक सूक्ष्म पैमाने पर नमूना तैयारी प्रक्रिया की आवश्यकता थी कि माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग विशिष्ट विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला कांच के बर्तनों जैसे कक्षा एक वॉल्यूम्ट्रिक पिपेट और फ्लास्क के रूप में किया जाता है। सटीक और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए यह आवश्यक है कि विश्लेषकों को कांच microliter सिरिंजों और माइक्रोलीटर आकार सुझावों के साथ सकारात्मक विस्थापन दोहराने pipettors के उपयोग में कुशल हो.

इस विधि की एक सीमा यह है कि इसके उपयोग और रखरखाव में प्रशिक्षित महंगा एलसी-एमएस/एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन और विश्लेषकों की आवश्यकता होती है। हालांकि, क्योंकि मुझे-IPA और एट-IPA आधारभूत वर्णित HPLC शर्तों का उपयोग कर हल कर रहे हैं, विधि संभावित रूप से यूवी डिटेक्टर के साथ एक एकल-क्वार्उपोल LCMS या HPLC के लिए अनुकूलित किया जा सकता है प्रदान की कोई हस्तक्षेप मनाया गया.

2.8 मिलीग्राम खुराक पर ब्लिस्टर पैक और चारा मैट्रिक्स में एट-आईपीए के साथ चारा का सेवन करने वाले मंगोलों के बीच मतलब सीरम सांद्रता में अंतर से पता चलता है कि मार्कर ब्लिस्टर पैक में निहित है, बजाय चारा मैट्रिक्स में शामिल किया गया है। इसके निहितार्थ चारा तेज के विरोध में टीके का आकलन करने के उद्देश्य से हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, बाहरी चारा मैट्रिक्स में मार्कर को शामिल करने से टीका कवरेज का अनुमान बढ़ सकता है यदि जानवर मैट्रिक्स खाता है लेकिन टीका बाहर फैल जाता है। हालांकि, नियामक प्रतिबंध एक जैविक मार्कर सीधे ब्लिस्टर पैक के भीतर एक टीका के साथ मिश्रण की क्षमता को रोक सकते हैं. जिन मामलों में और 100% खपत दर्ज की गई थी, उनमें तीन मामले ब्लिस्टर पैक में एट-आईपीए वाले चारा के साथ थे, जिनमें से दो उच्च 1% एकाग्रता थे। यह संभावित स्वाद घृणा पता चलता है जब एट-IPA उच्च सांद्रता में है. जब 1% (20.0 मिलीग्राम) एट-आईपीए युक्त चारा-आईपीए को मंगोलों के लिए पेश किया गया, तो सभी जानवरों ने चारा अस्वीकार कर दिया।

14 दिन में एट के लिए मतलब आईपीए सांद्रता- और मुझे-आईपीए क्रमशः लगभग 17 और 19 ग्राम/ इसी तरह के अनुसंधान Instituto de Investigaci-n en Recursos Cinegticos, Ciudad Real, स्पेन में प्रदर्शन किया, butyl और pentyl-IPA का उपयोग कर दिन पाया 14 सांद्रता के लगभग 45 और 10 g / हमारे अध्ययन में के रूप में तैयार करना. इन मतभेदों का सुझाव है कि आईपीए के विभिन्न डेरिवेटिव mongooses में विभिन्न दरों पर metabolize हो सकता है, जो उपयोगी हो सकता है जब मार्कर प्रतिधारण (या तो लघु या लंबी अवधि के प्रतिधारण) एक चिंता का विषय है.

जठरांत्र प्रणाली के शरीर क्रिया विज्ञान में अंतर विभिन्न प्रजातियों में आईपीए के अवशोषण और उत्सर्जन को प्रभावित कर सकते हैं. घरेलू बिल्लियों में आईपीए का प्लाज्मा उन्मूलन आधा जीवन (फेलिस कैटस) जब 1.5 मिलीग्राम/किलोग्राम पर दिया जाता है तो 107 दिन का समय था जबकि उसी खुराक दर पर ब्रशटेल पॉसम की दर लगभग एक दिन28थी . जब आईपीए घरेलू बकरियों को दिया गया था (Capra aegagrus hircus) 1.5 mg/kg की खुराक दर पर आईपीए के टर्मिनल उन्मूलन आधा जीवन 81 दिन था, हालांकि जांचकर्ताओं को प्रशासन के बाद 160 दिनों तक ऊंचा आयोडीन सांद्रता खोजने के लिए जारी रखा 39. विववेरिडी के सदस्यों की गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल प्रणाली ( जिस परिवार को पहले40) सौंपा गया था , उसे घरेलू बिल्ली41के समान बताया गया है , जो आईपीए के प्रतिधारण समय की व्याख्या कर सकता है . मंगोलियाँ। अनुसंधान यह भी पता चलता है आईपीए marsupials में अलग ढंग से metabolized किया जा सकता है, eutherian प्रजातियों29की तुलना में अधिक तेजी से उत्सर्जन के लिए अनुमति देता है.

इस अध्ययन में मूल्यांकन आईपीए के दोनों डेरिवेटिव लंबे समय तक प्रदान की (4 "8 सप्ताह) mongooses में क्षमता अंकन. मंगोलों में एक जैविक मार्कर के रूप में आईपीए के उपयोग को अध्ययन के उद्देश्यों और अंकन की वांछित अवधि को ध्यान में रखना चाहिए। मामलों में जहां पशुओं को लगातार समय अवधि के दौरान एक ही अध्ययन साइटों से चिह्नित किया जा रहे हैं, आईपीए के विभिन्न डेरिवेटिव एक अंकन घटना से परिणाम सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पिछले घटनाओं के दौरान अंकन द्वारा उलझन में नहीं हैं. अमेरिका में वन्य जीवन के लिए परिचालन ORV के भाग के रूप में, लक्ष्य प्रजातियों और RVNA और biomarker की उपस्थिति के लिए परीक्षण नमूना आम तौर पर ORV वितरण42के बाद 4 "6 सप्ताह आयोजित किया जाता है. एक व्यावहारिक दृष्टिकोण से, यह या तो आदि प्रतीत होता है या मुझे-IPA आसानी से इस समय अवधि के दौरान पता लगाया जा सकता है. भविष्य के अनुसंधान mongooses में अवशेष क्षय समारोह का मूल्यांकन करने के लिए इस अध्ययन में मूल्यांकन आईपीए के दोनों congeners के विभिन्न सांद्रता की पेशकश की उपयोगी होगा.

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Disclosures

लेखक ए वी और एसओ एक मौखिक रेबीज टीका चारा निर्माता के पूर्णकालिक कर्मचारी हैं.

Acknowledgments

इस शोध के भाग में कृषि, पशु और संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षण सेवा, वन्यजीव सेवा, राष्ट्रीय रेबीज प्रबंधन कार्यक्रम और IDT Biologika (Desau-Rosslau, जर्मनी) के अमेरिकी विभाग के intramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 147 जैविक मार्कर हर्पेस्ट्स ऑरोपंचेक्टस,आयोफेनॉक एसिड रेबीज छोटे भारतीय मंगोल एलसी-एमएस/
छोटे भारतीय मंगोलों में आयोफेनोक्क्सिक एसिड एनालॉग का विश्लेषण (<em>हर्पेस्ट्स ऑरोपंचेक्टस</em>) सेरा को ओरल रेबीज टीकाकरण जैविक मार्कर के रूप में उपयोग के लिए
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Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

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