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Immunology and Infection

Analyse von Iophenoxic Acid Analoga in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera zur Verwendung als orale Tollwut-Impfung Biologischer Marker

Published: May 31, 2019 doi: 10.3791/59373
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Wildlife Research Center, 2IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark

Summary

Wir boten in Gefangenschaft Mongooses Placebo orale Tollwut-ImpfstoffKöder mit Ethyl- oder Methyl-Iophenoxsäure als Biomarker und verifizierte Köderaufnahme mit einer neuartigen Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Methode an.

Abstract

Die kleine indische Gänse (Herpestes auropunctatus) ist ein Reservoir des Tollwutvirus (RABV) in Puerto Rico und umfasst über 70% der jährlich gemeldeten Tollwutfälle. Die Kontrolle des RABV-Kreislaufs in Wildtierreservoirs erfolgt in der Regel durch eine Strategie der oralen Tollwutimpfung (ORV). Derzeit gibt es kein OrV-Programm für Wildtiere in Puerto Rico. Die Forschung an oralen Tollwut-Impfstoffen und verschiedenen Ködertypen für Gänse wurde mit vielversprechenden Ergebnissen durchgeführt. Die Überwachung des Erfolgs von ORV beruht auf der Schätzung der Köderaufnahme durch Zielarten, was in der Regel die Bewertung einer Änderung der RABV-Neutralisierungsantikörper (RVNA) nach der Impfung beinhaltet. Diese Strategie kann in Gebieten mit einem aktiven ORV-Programm für Wildtiere oder in Gebieten, in denen RABV enzootisch ist und die Hintergrundniveaus von RVNA bei Reservoirarten vorhanden sind, schwierig sein. In solchen Situationen kann ein Biomarker, der mit dem Impfstoff oder der Ködermatrix aufgenommen wurde, nützlich sein. Wir boten 16 gefangene Mongos Placebo ORV Köder mit Ethyl-Iophenoxsäure (et-IPA) in Konzentrationen von 0,4% und 1% innerhalb des Köders und 0,14% in der externen Ködermatrix an. Wir boten auch 12 in Gefangenschaft gehaltene Mongos ORV Köder an, die Methyl-Iophenoxsäure (me-IPA) in Konzentrationen von 0,035%, 0,07% und 0,14% in der externen Ködermatrix enthalten. Wir sammelten eine Serumprobe vor dem Köder-Angebot und dann wöchentlich für bis zu acht Wochen Post-Angebot. Wir extrahierten Iophenoxic Säuren aus Seren in Acetonitril und quantifizierten mit flüssiger Chromatographie/Massenspektrometrie. Wir analysierten sera für et-IPA oder me-IPA mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie. Wir fanden eine ausreichende Markierungsfähigkeit für mindestens acht bzw. vier Wochen für et- bzw. me-IPA. Beide IPA-Derivate könnten für die Feldbewertung der ORV-Köderaufnahme in Mongos geeignet sein. Aufgrund der Langlebigkeit des Markers in mongoose sera ist darauf zu achten, dass die Ergebnisse nicht durch die Verwendung desselben IPA-Derivats während aufeinander folgender Auswertungen verwirrt werden.

Introduction

Das Tollwutvirus (RABV) ist ein einsträngiges Lyssavirus mit negativem Sinn und zirkuliert zwischen verschiedenen Tierreservoirarten innerhalb der Ordnungen Carnivora und Chiroptera. Mehrere Arten von Mongoose sind Reservoirs von RABV, und die kleine indische Mongoose (Herpestes auropunctatus) ist das einzige Reservoir in Puerto Rico und anderen karibischen Inseln in der westlichen Hemisphäre1,2,3 . Die Kontrolle der RABV-Zirkulation in Wildtierreservoirs erfolgt in der Regel durch eine Strategie der oralen Tollwutimpfung (ORV). In den Vereinigten Staaten (USA) wird diese Management-Aktivität vom USDA/APHIS/Wildlife Services National Tollwut Management Program (NRMP)4koordiniert. Derzeit gibt es kein OrV-Programm für Wildtiere in Puerto Rico. Die Forschung an Tollwut-Impfstoffen und verschiedenen Ködertypen für Gänse wurde mit vielversprechenden Ergebnissen durchgeführt, die darauf hindeuten, dass ein ORV-Programm für Gänse möglich ist5,6,7,8.

Die Überwachung der Auswirkungen von ORV beruht auf der Schätzung der Köderaufnahme durch Zielarten, was in der Regel die Bewertung einer Veränderung der RV-Antikörperseroprävalenz beinhaltet. Diese Strategie kann jedoch in Gebieten mit aktiven ORV-Programmen für Wildtiere oder in Gebieten, in denen RV enzootisch ist und die Hintergrundniveaus von RABV-neutralisierenden Antikörpern (RVNA) in Reservoir-Arten vorhanden sind, eine Herausforderung darstellen. In solchen Situationen kann ein Biomarker, der im Köder oder in der externen Ködermatrix enthalten ist, nützlich sein.

Verschiedene biologische Marker wurden verwendet, um die Aufnahme von Ködern bei zahlreichen Arten zu überwachen, einschließlich Waschbären (Procyon Lotor)9,10, Stoats (Mustela ermine)11,12, Europäische Dachse ( Meles meles) 13, Wildschweine (Sus scrofa)14, kleine indische Gänse15 und Präriehunde (Cynomysludovicianus)16,17, u.a. In den USA enthalten operative ORV-Köder oft einen 1% Tetracyclin-Biomarker in der Ködermatrix, um die Köderaufnahme18,19zu überwachen. Zu den Nachteilen bei der Verwendung von Tetracyclin gehört jedoch die wachsende Sorge über die Verteilung von Antibiotika in die Umwelt und dass der Nachweis von Tetracyclin typischerweise invasiv ist, was eine Zahnextraktion oder -zerstörung des Tieres erfordert, um Knochen zu erhalten. Proben20. Rhodamine B wurde als Marker in einer Vielzahl von Geweben bewertet und kann mit ultraviolettem (UV) Licht und Fluoreszenz in Haaren und Schnurrhaaren10,21nachgewiesen werden.

Iophenoxsäure (IPA) ist ein weißes, kristallines Pulver, das verwendet wurde, um köderlichen Verbrauch in Kojoten zu bewerten (Canis latrans)22, polarer Fuchs (Vulpes lagopus)23, Rotfuchs (Vulpes vulpes)24, Waschbären 9 , 25, Wildschwein14, Rotwild (Cervus elaphus scoticus)26, Europäische Dachse12 und Frettchen (M. furo)27, unter mehreren anderen Säugetierarten. Retentionszeiten von IPA variiert nach Arten von weniger als zwei Wochen in einigen Beuteltieren28,29, bis mindestens 26 Wochen in Huftieren26 und über 52 Wochen bei Haushunden (Canis lupus familiaris)30. Retentionszeiten können auch dosisabhängigsein 31. Iophenoxsäure bindet stark an Serumalbumin und wurde historisch durch Messung des Jodspiegels im Blut32nachgewiesen. Dieser indirekte Ansatz wurde durch Hochleistungsmethoden zur Flüssigchromatographie (HPLC) zur direkten Messung der Iophenoxsäurekonzentrationen mit UV-Detektion33und schließlich mit Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie (LCMS) ersetzt. 34,35. Für diese Studie wurde eine hochempfindliche und selektive Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Methode entwickelt, die multiple Reaction Monitoring (MRM) nutzt, um zwei Analoga von Iophenoxsäure zu quantifizieren. Unser Ziel war es, mit dieser LC-MS/MS-Methode die Markierungsfähigkeit von 2-(3-Hydroxy-2,4,6-Triiodobenzyl)Propansäure (Methyl-IPA oder me-IPA) und 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl)butansäure (ethyl-IPA oder et-IPA) und Köder an gefangene Gänse.

Die Gänse wurden in Käfigfallen, die mit handelsüblichen Räucherwürsten und Fischöl geködert wurden, live gefangen. Die Gänse wurden in einzelnen 60 cm x 60 cm x 40 cm Edelstahlkäfigen untergebracht und mit einer täglichen Ration von 50 g gewerblichem Trockenkatzenfutter von 50 g gefüttert, zweimal pro Woche mit einem handelsüblichen Hühnerschenkel ergänzt. Wasser war verfügbar ad libitum. Wir lieferten zwei Derivate von IPA, Ethyl-IPA und Methyl-IPA, an gefangene Mongos in Placebo-ORV-Ködern. Alle Köder setzten sich aus einer 28 mm x 20 mm x 9 mm Folienblisterpackung mit einer externen Beschichtung(nachfolgend "Ködermatrix") mit pulverisiertem Hühnerei und Gelatine (Materialtabelle) zusammen. Köder enthielten 0,7 ml Wasser oder IPA-Derivat und wogen etwa 3 g, von denen 2 g die externe Ködermatrix war.

Wir boten 16 in Gefangenschaft gehaltene Mongooses et-IPA in drei Konzentrationen an: 0,14% (2,8 mg et-IPA in 2 g Ködermatrix; 3 Männchen [m], 3 Weibchen [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA in 0,7 ml Blisterpackungvolumen; 3m, 3f) und 1,0% (7,0 mg Ethyl-IPA in 0,7 ml Blisterpackung; 2 , 2f). Die Gesamtdosis von 2,8 mg entspricht einer Dosis von 5 mg/kg27,36 und basiert auf einem durchschnittlichen Gänsegewicht von 560 g in Puerto Rico. Wir wählten 1% als höchste Konzentration, da die Forschung darauf hindeutet, dass Geschmacksaversion zu einigen Biomarkern in Konzentrationen von >1% bei einigen Arten auftreten kann37. Wir boten nur die 1%-Dosis in der Blisterpackung an, da die Flockung verhinderte, dass sich die Lösung im Lösungsmittel ausreichend auflöste, um gleichmäßig in die Ködermatrix eingearbeitet zu werden. Eine Kontrollgruppe (2m, 1f) erhielt Köder, die mit sterilem Wasser und ohne IPA gefüllt waren. Wir boten Den Gänsen morgens (ca. 8 Uhr) während oder vor der Fütterung ihrer täglichen Pflegeration Köder an. Köderreste wurden nach etwa 24 Stunden entfernt. Wir sammelten Blutproben vor der Behandlung, einen Tag nach der Behandlung und dann wöchentlich bis zu 8 Wochen nach der Behandlung. Wir anästhetisierten Mongooses durch Einatmen von Isoflurangas und sammelten bis zu 1,0 ml Vollblut durch Venipunktion der Schädelvenenhöhle, wie für Frettchen beschrieben38. Wir zentrifugierten Vollblutproben, übertrugen Seren auf Kryovials und lagerten sie bis zur Analyse bei -80 °C. Nicht alle Tiere wurden in allen Zeiträumen beprobt, um die Auswirkungen wiederholter Blutentnahmen auf die Gesundheit der Tiere zu minimieren. Kontrolltiere wurden am Tag 0, dann wöchentlich für bis zu 8 Wochen nach der Behandlung beprobt.

Wir lieferten me-IPA in drei Konzentrationen: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) und 0,14% (2,8 mg), alle in die Ködermatrix integriert, mit 2 Männern und 2 Frauen pro Behandlungsgruppe. Zwei Männchen und zwei Weibchen erhielten Köder, die mit sterilem Wasser und ohne IPA gefüllt waren. Köder, die Zeiten und Mongooseanästhesie anbieten, werden oben beschrieben. Wir sammelten Blutproben vor der Behandlung am ersten Tag, und dann wöchentlich bis zu 4 Wochen nach der Behandlung.

Wir haben Serumkonzentrationsdaten auf Normalität und geschätzte Mittel für Serum-IPA-Konzentrationen verschiedener Behandlungsgruppen getestet. Wir verwendeten ein lineares gemischtes Modell, um mittlere Serum- und IPA-Konzentrationen zu vergleichen, die über Individuen gepoolt wurden. Der Ködertyp (Matrix/Blisterpackung) war neben dem Versuchstag ein fester Effekt, während die tierische ID ein Zufallseffekt war. Alle Prozeduren wurden mit einer gemeinsamen statistischen Software (Tabelle der Materialien) durchgeführt und die Signifikanz wurde mit 0,05 bewertet.

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Protocol

Alle Verfahren wurden vom institutionellen Animal Care and Use Committee des USDA National Wildlife Research Center gemäß dem genehmigten Forschungsprotokoll QA-2597 genehmigt.

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt das Analyseverfahren zum Nachweis von Methyl-Iophenoxsäure im Mongooseserum. Diese Methode ist die endgültige Version eines iterativen Prozesses, der mit der Analyse von Ethyl-Iophenoxsäure in Mongooseserum begann. Bei der ersten Bewertung von Ethyl-Iophenoxsäure wurden geringfügige Änderungen an den Methoden vorgenommen, was zu dem nachstehend vorgestellten endgültigen Protokoll führte. Repräsentative Ergebnisse umfassen die Ergebnisse, die während beider Iterationen erzielt wurden.

1. Erstellung von Lösungen und Standards

  1. Kaufen Sie me-IPA und et-IPA.
  2. Für die mobile Phase A 1 L 0,1% (v/v) Ameisensäure in Wasser vorbereiten, indem 1 ml Ameisensäure mit 1 L Reinstwasser (ca. 18 Mio. USD) kombiniert werden. Für die mobile Phase B 1 L 0,1% (v/v) Ameisensäure in Acetonitril (ACN) vorbereiten, indem 1 ml Ameisensäure mit 1 L ACN kombiniert werden.
  3. Für Verdünnungsmittel 200 ml 0,5% (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) in ACN vorbereiten, indem 1 ml TFA mit 200 ml ACN kombiniert werden.
  4. Bereiten Sie konzentrierte IPA-Lagerlösungen von me-IPA und et-IPA in ACN in Konzentrationen von ca. 1.000 g/ml vor.
    1. Wiegen Sie ca. 10 mg me-IPA auf einer Mikrowaage und erfassen Sie die Masse auf 0,0001 mg. Übertragen Sie den me-IPA mit 45 ml ACN quantitativ auf einen 10 ml-Volumenkolben der Klasse A. 1 min beschallen, um alle Feststoffe aufzulösen, und dann mit ACN auf Volumen bringen.
    2. Übertragen Sie 8 ml pro Vorrat auf Bernstein 8 ml Glasfläschchen mit Poly-Tetrafluorethylen (PTFE)-gefütterten Kappen. Bei Raumtemperatur (RT) lagern. Den Restbestand in gefährliche Abfälle übertragen.
  5. Für den 25x-7 me-IPA Bestand (Tabelle 1) einen Bestand von me-IPA in ACN bei ca. 200 g/ml vorbereiten. Beispiel: Übertragen Sie 1 ml des me-IPA-Konzentrierten Lagerbestands von Schritt 1.4.2 auf einen 5 ml Volumenkolben der Klasse A mit einer 1.000 l Glasspritze. Mit ACN auf Volumen verdünnen. Übertragen Sie den Vorrat auf eine bernsteinfarbene 8 ml Glasdurchstechflasche mit PTFE-gefütterter Kappe. Bei RT aufbewahren.
  6. Bereiten Sie die sechs zusätzlichen 25x me-IPA-Bestände vor, die in Tabelle 1beschrieben sind. Kombinieren Sie für jeden Vorrat die angegebenen Volumina mit einem Repeat Pipettor in einer bernsteinfarbenen 8 ml Bernsteinglasdurchstechflasche mit PTFE-gefütterter Kappe. Bewahren Sie jeden Bestand bei RT auf.
  7. Für den 25-fachen Ersatzbestand einen Ersatzbestand von me-IPA in ACN zu ca. 10 g/ml aus dem in Schritt 1.4.2 hergestellten konzentrierten Bestand zubereiten. 0,100 ml des konzentrierten me-IPA-Bestands mit einer 100-L-Glasspritze auf einen 10 ml-Volumenkolben der Klasse A übertragen und dann mit ACN zu Volumen verdünnen.
    1. Übertragen Sie 8 ml auf eine bernsteinfarbene 8-ml-Glasdurchstechflasche mit PTFE-gefütterter Kappe. Lagern Sie bei RT. Übertragen Sie den Restbestand in gefährliche Abfälle.
  8. 4x Bestände mit beiden Analyten in 2 ml Schraubglas-Autosampler-Fläschchen vorbereiten, wie in Tabelle 2beschrieben.
    1. Um beispielsweise den Lagerbestand 4x-7 auf eine 2 ml Durchstechflasche vorzubereiten, fügen Sie 0,20 ml des 25x-7 me-IPA-Lagers ab Schritt 1.5 mit einem Repeat Pipettor mit 0,5 ml Fassungsweite hinzu. Fügen Sie 0,20 ml des 25-fachen Ersatz-et-IPA-Bestands aus Schritt 1.7 mit einem Repeat Pipettor mit 0,5 ml Kapazitätsspitze hinzu.
    2. Fügen Sie 0,85 ml ACN mit einem Repeat Pipettor mit 1 ml Kapazitätsspitze hinzu. Die Durchstechflasche sicher und 5x invertieren, um sie zu mischen.
  9. Bereiten Sie die Standardkurve in 2 ml Schraub-Top-Autosampler-Fläschchen wie in Tabelle 3beschrieben vor.
    1. Um beispielsweise Standard 7 (Std 7) auf eine 2-ml-Durchstechflasche vorzubereiten, fügen Sie 0,20 ml des 4x-7 Stocks ab Schritt 1.8.2 mit einem Wiederholtpipettor mit 0,5 ml Fassungsgeld hinzu. Fügen Sie 0,60 ml reines DI-Wasser mit einem Repeat Pipettor mit 1 ml Tragfähigkeitsspitze hinzu. Die Durchstechflasche sicher und 5x invertieren, um sie zu mischen.

2. Probenvorbereitung

VORSICHT: Das Personal, das dieses Verfahren durchführt, muss die vollständige Serie von Tollwut-Präexpositionsprophylaxe erhalten haben und einen dokumentierten Tollwut-Antikörper-Titer über 0,5 IE von einer vom Bundesamt für Arbeitsmedizin benannten medizinischen Einrichtung erhalten haben. Das Personal muss bei der Extraktion jederzeit Labormäntel und Augenschutz tragen. VORSICHT: Führen Sie die Schritte 2.3-2.6 in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II aus.

  1. Für jede Probe ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 200 bis 300 mg NaCl vorbereiten. Zur Verwendung in Schritt 2.6 beiseite stellen.
    HINWEIS: Für eine große Anzahl von Proben wird ein Mikroschaufel (oder ein anderes kleines Messgerät) empfohlen.
  2. Etikettieren Sie für jede Probe zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre: eine als "A" und die andere als "B". Ordnen Sie die Rohre in einem 80-Positionen-Kunststoff-Rack an.
  3. Stellen Sie die folgenden Materialien und Ausrüstungen für die Serumextraktion in einen Biosicherheitsschrank der Klasse II: Mikrozentrifugenrohre (in Racks) in den Schritten 2.1 und 2.2, einen Wirbelmischer, Repeat Pipettiergerät mit 0,5 ml und 5 ml Tragfähigkeitsspitzen, 100 x 1.000 l Luftverschiebung Pipetten mit 1.000 L-Spitzen, Behältern mit je ca. 100 ml Verdünnungs- und Ultrarinluden-DI-Wasser und einem Biogefährdungsbehälter.
  4. Serumproben aus der Tiefkühllagerung entfernen und im Biosicherheitsschrank auf RT warm erwärmen. Wirbel mischen Sie jede Serumprobe vor der Probenahme.
  5. Mit einem Repeat Pipettor mit 0,5 ml Tragfähigkeitsspitze 0,050 ml Mongoserum in Rohr "A" geben und 0,050 ml 25x Ersatzmaterial hinzufügen. Dann 0,950 ml Verdünnungsmittel in Rohr "A" mit einem Repeat Pipettor mit 5 ml Tragfähigkeit Spitze hinzufügen. Kappe sicher und Wirbel-Mix für 10-15 s.
  6. Geben Sie den vorgewogenen NaCl von Schritt 2.1 in das Rohr "A" und Wirbelmischung 3x für 8-12 s. Wischen Sie die Außenflächen des Durchstechflascher mit Rohr "A" mit 70% (v/v) Isopropanol nach unten.
    HINWEIS: Das Musterregal kann nun aus dem Biosicherheitsschrank der Klasse II entfernt werden.
  7. Zentrifugenrohr "A" bei 12.000 x g für 1 min, um die wässrige und ACN-Phase zu trennen. Pipette 0,80 ml der oberen ACN-Phase zu Rohr "B" mit einer Luftverschiebungspipette von 100 x 1.000 l. Die restliche Lösung in Rohr "A" in gefährliche Abfälle geben und das leere Rohr in einem biogefährlichen Abfallbehälter entsorgen.
  8. Entfernen Sie ACN und TFA aus Rohr "B" mit einem sanften Fluss von N2-Gas in einem 45 °C Wasserbad.
  9. Fügen Sie 0,250 ml ACN in das Rohr "B" mit einem Repeat Pipettor, Wirbelmischung für 4 x 5 s, und dann Zentrifugieren sie kurz (2 x 4 s) bei 12.000 x g, um die Flüssigkeit im Boden des Rohres zu sammeln.
  10. Fügen Sie 0,750 ml reines DI-Wasser in das Rohr "B" mit einem Repeat Pipettor mit 5 ml Fassungsgeld, Wirbelmischung für 4 x 5 s und dann Zentrifuge für 1 min bei 12.000 x g zur Klärung der Probe hinzu.
  11. Übertragen Sie 0,75 ml des Überstandes mit einer Luftverdrängungspipette von 1.000 l auf eine Autosampler-Durchstechflasche. Pipettenspitzen in Biohazard-Abfallbehältern entsorgen.
  12. Cap Autosampler Fläschchen sicher und analysieren durch LC-MS/MS (Abschnitt 4). Die restliche Lösung in Rohr "B" in gefährliche Abfälle geben und das leere Rohr in einen Bio-Abfallbehälter entsorgen. Entsorgen Sie alle biogefährlichen Abfälle durch Autoklavieren oder Verbrennung.

3. Qualitätskontrollproben

VORSICHT: Befolgen Sie die in Abschnitt 2 beschriebenen Vorsichtshinweise.

ANMERKUNG:Das folgende Verfahren beschreibt die Mindestanzahl von QC-Proben (Quality Control), die für eine Analyse erforderlich sind. Replikationen auf jeder Ebene werden empfohlen, wenn ausreichend Kontrollmongooseserum verfügbar ist.

  1. Bereiten Sie vier 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 200 bis 300 mg NaCl enthalten. Ordnen Sie die Rohre in einem 80-Positionen-Kunststoff-Rack an.
  2. Etikettieren Sie für jede QC-Probe zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre: eine als "A" und die andere als "B". Ordnen Sie die Rohre in einem 80-Positionen-Kunststoff-Rack an.
  3. Wiederholen Sie Schritt 2.3.
  4. Entfernen Sie das Kontrollmangustonserum aus der gefrorenen Lagerung und wärmen Sie sich im Biosicherheitsschrank auf RT. Vortex mischen das Steuerserum vor der Probenahme.
  5. Geben Sie 0,050 ml Kontrollmangustenserum in die vier 1,5-ml-"A"-Rohre mit einem Repeat Pipettor mit 0,5 ml Fassungshöhe.
  6. Befestigen Sie jede der vier QC-Proben gemäß Tabelle 4 mit einem Repeat Pipettor mit 0,5 ml Kapazitätsspitze. Jede QC-Probe sicher und Wirbelmischung für 10-15 s.
  7. Führen Sie das Extraktionsverfahren wie in den Schritten 2.6-2.12 beschrieben aus.

4. LC-MS/MS-Analyse

  1. Konfigurieren Sie den LC-MS/MS mit allen in Tabelle 5beschriebenen Parametern. Schalten Sie den LC-MS/MS ein und lassen Sie die Säule 70 °C erreichen, bevor Sie den Durchfluss auf 0,800 ml/min einstellen.
  2. Richten Sie eine Sequenz in der Datenerfassungssoftware (Materialtabelle) ein, um die Standardkurve vor und nach jeder Charge zu injizieren, die aus Qualitätskontrollproben und unbekannten Proben besteht.
  3. Injizieren Sie alle Normen und Proben und erfassen Sie MRM-Ionenchromatogramme anhand der in Tabelle 5aufgeführten Parameter.
  4. Schalten Sie nach Abschluss der Sequenz den LC-MS/MS aus und entsorgen Sie alle Autosampler-Fläschchen als Sondermüll.

5. Quantifizierung

  1. Verwenden Sie die Datenanalyse-Software, um eine Kalibrierungskurve relativer Antworten im Vergleich zu relativen Konzentrationen für me-IPA zu generieren, die et-IPA als internen Standard verwendet. Berechnen Sie die relativen Antworten aus dem MrM-Übergang des Quantifiers für me-IPA (556,6 x 428,7) geteilt durch den MRM-Übergang für et-IPA (570,7 x 442,7). Erstellen Sie eine 7-stufige Kalibrierkurve mit einer quadratischen Funktion zweiter Ordnung, die 1/x gewichtet ist und den Ursprung ignoriert.
  2. Berechnen Sie die Serumkonzentration(C-Serum) von me-IPA mit der folgenden Gleichung:
    Equation 1
    wobeic-Instrument die vom Gerät aus der Kalibrierkurve ermittelte Konzentration in Einheiten von g/ml Equation 2 ist, 1,25 der Verdünnungsfaktor, V-Endwert das endgültige Probenvolumen (1,0 ml) und VSerum das Serumvolumen in ml ( 0,050 ml nominal).

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Representative Results

Repräsentative Ionenchromatogramme aus einer Me-IPA-Analyse sind in Abbildung 1dargestellt. Das Kontrollmongooseserum (Abbildung 1A) zeigt die Retentionszeit von et-IPA (Ersatzanalyt) und das Fehlen von me-IPA zur angegebenen Retentionszeit. Die Qualitätskontrollstichprobe (Abbildung 1B) veranschaulicht die basislinienliche Trennung von me-IPA von et-IPA sowie die Quantifizierer- und Qualifiziererübergänge für me-IPA. Abbildung 1C zeigt eine repräsentative Stichprobe aus der Studie mit einer beobachteten Serumkonzentration von 33,5 g/ml me-IPA.

Eine repräsentative Kalibrierkurve aus einer me-IPA-Analyse ist in Abbildung 2dargestellt. Die 7-stufige, 14-Punkte-Standardkurve reicht von 0,00202 bis 8,27 g/ml me-IPA mit einem Korrelationskoeffizienten (r2) von 0,9998. Die Korrelationskoeffizienten lagen für die fünf me-IPA-Analysen zwischen 0,9998 und 0,99997. Die Ersatzanalyt-et-IPA-Konzentration betrug in allen Normen 0,502 g/ml.

Tabelle 6 zeigt die Genauigkeits- und Präzisionsergebnisse für Kontrollmangustenserum, das mit 0, 1,3, 31 und 82 g/ml me-IPA angereichert ist (n = 10 auf jeder Ebene). Die Ergebnisse wurden aus fünf getrennten Analysen zusammengetragen. Die prozentualeErholung lag zwischen 96,9 % und 109 %. Die relative Standardabweichung (% RSD) in den drei Befestigungsstufen betrug 3,4 %, 1,7 % bzw. 2,3 %.

Das in Qualitätskontrollproben beobachtete Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) (n = 10 Negativkontrollen; n = 10 bei 1,3 g/ml me-IPA) wurde zur Bestimmung der Nachweisgrenze (DL; 3 x S/N) und der Quantitationsgrenze (QL; 10 x S/N) verwendet. Die DL und QL für me-IPA im Mongoose-Serum betrugen 0,012 g/ml bzw. 0,042 g/ml.

Die Spitzenflächenantworten des Qualifizierer-MRM-Übergangs geteilt durchEquation 3 den Quantifizierer MRM-Übergang (wurde für alle Standards und Stichproben berechnet. Dieses Verhältnis für jede Probe wurde dann durch das in den Kalibrierstandards beobachtete Durchschnittsverhältnis geteilt, um die Übereinstimmung mit dem Qualifizierer-Prozent zu bestimmen. Das Qualifiziererverhältnis für die in Abbildung 1C dargestellte Stichprobe betrug 0,439, wobei eine Übereinstimmung von 96,3 % erreicht wurde.

Die Wiederherstellung von et-IPA-Ersatzanalyten wurde für alle QC-Proben und unbekannten Proben berechnet, indem die Et-IPA-Spitzenflächenantwort durch die durchschnittliche et-IPA-Spitzenflächenantwort dividiert wurde, die in den Kalibrierstandards beobachtet wurde. Die durchschnittlichen Ersatzanalytenrückgewinnungen betrugen 91,0 % (negative Kontrollen), 91,4 % (1,3 g/ml), 92,8 % (31 g/ml) und 95,4 % (82 g/ml).

Im Kontrollmongooseserum wurden weder für die Quantifizierer- noch für die Qualifiziererübergänge von me-IPA Interferenzspitzen beobachtet (Abbildung 1A).

Das Extraktionsverfahren und die instrumentellen Bedingungen, die zur Bestimmung von et-IPA im Mongooseserum verwendet wurden (Abbildung 3 und Tabelle 7), waren identisch mit der me-IPA-Methode, jedoch mit den folgenden Änderungen. Propyl-Iophenoxsäure (pr-IPA) wurde als Ersatzanalyt und ein älteres, weniger empfindliches LC-MS/MS verwendet. Die Quelltrocknungsgastemperatur betrug 350 °C bei einem Durchfluss von 12 l/min und einem Verneblerdruck von 35 psi. Die Kapillarspannung betrug -2.500 V. Die Quelle hatte kein Mantelgas oder Mittel, um die Düsenspannung einzustellen. Der MrM-Übergang des Quantifikats für et-IPA betrug 570,7 bis 442,8 (584,7 x 456,8 für pr-IPA). Der Fragmentor war 80 V und die Kollisionsenergie betrug 10 V für beide Analyten. Der Qualifizierer MRM für et-IPA betrug 570,7 bei 126,8 bei einer Kollisionsenergie von 40 V.

Die Prüfung aller Mongoose-Serumproben auf et-IPA wurde über acht Analysen durchgeführt. Die 7-stufige Kalibrierkurve reichte von 0,00207 bis 8,48 g/ml mit Korrelationskoeffizienten (r2) zwischen 0,9990 und 0,9999. Die Ersatzanalyt-Pr-IPA-Konzentration betrug 0,512 g/ml. Tabelle 7 zeigt die Genauigkeits- und Präzisionsergebnisse für Kontrollmangustenserum, das mit 0, 1,3, 13, 32, 85 und 170 g/ml me-IPA angereichert ist. Die Ergebnisse wurden aus acht separaten Analysen zusammengetragen. Die prozentualeErholung lag zwischen 89,5 % und 115 %. Die RSD in % auf den fünf Befestigungsstufen betrug 4,3 %, 1,5 %, 2,3 %, 5,6 % bzw. 1,1 %. Die in Qualitätskontrollproben beobachteten S/N (n = 21 Negativkontrollen; n = 21 bei 1,3 g/ml me-IPA) wurden zur Bestimmung der DL und QL verwendet. Die DL und QL für me-IPA im Mongoose-Serum betrugen 0,12 g/ml bzw. 0,42 g/ml. Die durchschnittliche Ersatzanalytrückgewinnung aus Qualitätskontrollproben betrug 86,8 % (n = 75). Im Kontrollmongooseserum wurden weder für die Quantifizierer- noch für die Qualifiziererübergänge von et-IPA Interferenzspitzen beobachtet.

Alle angebotenen et-IPA-Köder verbrauchten innerhalb der 24-Stunden-Zeitbeschränkung 25 % des Köders und wiesen quantifizierbare et-IPA-Werte in ihren Seren auf (Tabelle 8). Aus der Analyse des gemischten Modells waren die mittleren IPA-Konzentrationen im Gesamtdurchschnitt mit Ködern mit 2,8 mg Biomarker in der Ködermatrix (17,5 g/ml, 95 % CI 11,7 bis 23,3 g/ml) geringfügig höher als bei der Blisterpackung (9,8 mg/ml, 95 % CI 4,0 ,15,6 g/ml) (F = 3,6 , P = 0,07). Die Konzentrationen für beide Ködertypen zerfielen mit dem Experimentellen Tag (n = -0,15 x 0,04, F = 14,4, P = 0,0005). Es wurde eine individuelle Variabilität der IPA-Konzentrationen im Serum beobachtet (Schätzung der Tierischen ID-Kovarianzparameter = 46,6 x 20,7). Alle Gänse verbrauchten 100% der Kontrollköder, wobei nur die leere Folienblisterpackung übrig blieb. Die mittlere Konzentration von Et-IPA-Rückständen im Serum war variabel nach Zeitraum und schien im Laufe der Zeit nicht konstant zu sinken (Abbildung 3).

Alle Gänse boten mir-IPA-Ködern an, die innerhalb der 24-Stunden-Frist 25 % des Köders verbraucht wurden, und hatten quantifizierbare Me-IPA-Werte in ihren Seren (Tabelle 9). Die mittlere serologische Konzentration von et- und me-IPA in mongoose sera erschien abhängig von der Konzentration von IPA im Köder. Höhere Konzentrationen von IPA im Köder führten selbst in Fällen, in denen die Gesamtdosis (2,8 mg bei et-IPA) gleich blieb, zu höheren Serumrückständen. Interessanterweise schien me-IPA im Laufe der Zeit ein gleichmäßigeres Abbaumuster zu erzeugen, mit einer anfänglichen Spitze am ersten Tag, gefolgt von einem stetigen Rückgang bis zum 14. Tag, an dem die Konzentrationen auf dem Plateau zu liegen schienen (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1 : Repräsentative Ionenchromatogramme. (A) Repräsentatives MRM-Ionenchromatogramm des Kontrollmongooseserums, angereichert mit Ersatzanalyt ethyl-iophenoxic säure (et-IPA). Der Pfeil gibt die Retentionszeit für Methyl-Iophenoxsäure (me-IPA) an. (B) Repräsentatives MRM-Ionenchromatogramm des Kontrollmongooseserums, das mit 31 g/ml me-IPA angereichert ist. Die relativen Intensitäten der Quantifiziererübergänge (Quant) und Qualifizierer (Qual) für me-IPA werden angezeigt. (C) Repräsentatives MRM-Ionenchromatogramm einer Mongoose-Serumprobe mit einer beobachteten Me-IPA-Konzentration von 33,5 g/ml. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative Kalibrierkurve. Eine ursprüngliche Kalibrierkurve, die von der Datenanalysesoftware für Methyl-Iophenoxsäure (me-IPA) generiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Mittlere Serumethyl-IPA-Konzentration (et-IPA) nach Ködertyp und -konzentration im Zeitverlauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Mittlere Serummethyl-IPA-Konzentration (me-IPA) durch Köderkonzentration im Zeitverlauf. Alle me-IPA-Konzentrationen wurden in die externe Ködermatrix integriert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

me-IPA-Konzentration (g/ml)
Id
25x-7 Siehe Schritt 1.6 200
25x-6 Kombinieren Sie 1.000 mL 25x-7 Lager mit 3.000 mL ACN 50
25x-5 Kombinieren Sie 1.000 mL 25x-6 Lager mit 3.000 mL ACN 13
25x-4 Kombinieren Sie 1.000 mL 25x-5 Lager mit 3.000 mL ACN 3.1
25x-3 Kombinieren Sie 1.000 mL 25x-4 Lager mit 3.000 mL ACN 0,78
25x-2 Kombinieren Sie 1.000 mL 25x-3 Lagerbestand mit 3.000 mL ACN 0,2
25x-1 Kombinieren Sie 1.000 mL 25x-2 Lager mit 3.000 mL ACN 0,049

Tabelle 1: Herstellung von 25x me-IPA-Beständen in ACN (in 8-ml-Bernsteinglasfläschchen).

Konzentration (g/ml)
Id me-IPA et-IPA
4x-7 0,200 ml 25x-7 + 0,200 mL 25x Ersatz + 0,850 ml ACN 32 1.6
4x-6 0,200 ml 25x-6 + 0,200 mL 25x Ersatz + 0,850 ml ACN 8 1.6
4x-5 0,200 ml 25x-5 + 0,200 mL 25x Ersatz + 0,850 ml ACN 2 1.6
4x-4 0,200 ml 25x-4 + 0,200 mL 25x Ersatz + 0,850 ml ACN 0,5 1.6
4x-3 0,200 ml 25x-3 + 0,200 mL 25x Ersatz + 0,850 ml ACN 0,12 1.6
4x-2 0,200 ml 25x-2 + 0,200 mL 25x Ersatz + 0,850 ml ACN 0,031 1.6
4x-1 0,200 ml 25x-1 + 0,200 mL 25x Ersatz + 0,850 ml ACN 0,008 1.6
4x-0 0,200 ml 25x Ersatz + 1.050 ml ACN 0 1.6

Tabelle 2: Herstellung von 4x IPA-Beständen in ACN (in 2-ml-Autosampler-Fläschchen).

Konzentration (g/ml)
Id me-IPA et-IPA
Std 7 0,200 ml 4x-7 + 0,600 ml DI Wasser 8 0,4
Std 6 0,200 ml 4x-6 + 0,600 ml DI Wasser 2 0,4
Std 5 0,200 ml 4x-5 + 0,600 ml DI Wasser 0,5 0,4
Std 4 0,200 ml 4x-4 + 0,600 ml DI Wasser 0,13 0,4
Std 3 0,200 ml 4x-3 + 0,600 ml DI Wasser 0,03 0,4
Std 2 0,200 ml 4x-2 + 0,600 ml DI Wasser 0,0078 0,4
Std 1 0,200 ml 4x-1 + 0,600 ml DI Wasser 0,002 0,4
Std 0 0,200 ml 4x-0 + 0,600 ml DI Wasser 0 0,4
leer 0,200 ml ACN + 0,600 ml DI-Wasser 0 0

Tabelle 3: Vorbereitung der me-IPA-Normen in 75/25 Wasser/ACN (in 2-ml-Autosampler-Durchstechflaschen).

Konzentration (g/ml) im Serum
Id me-IPA et-IPA
Negative Kontrolle 0,050 mL 25x Ersatz + 0,950 ml Verdünnungsstoff 0 10
Niedrige Befestigung 0,050 mL 25x Ersatz + 0,020 mL 25x-4 + 0,930 mL Verdünnungsstoff 1.2 10
Mid Fortification 0,050 mL 25x Ersatz + 0,030 mL 25x-6 + 0,920 mL Verdünnungsstoff 30 10
Hohe Befestigung 0,050 mL 25x Ersatz + 0,020 mL 25x-7 + 0,930 mL Verdünnungsstoff 80 10

Tabelle 4: Qualitätskontrolle Probenbefestigung (in 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohren vorbereiten).

Flüssige Chromatographie:
säule: C18, 2,1 x 50 mm, Partikelgröße von 2,5 mm
Spaltentemperatur: 70 °C
Injektionsvolumen: 5 l
Durchflussrate: 0,800 ml/min
Mobile Phase: Lösungsmittel A: 0,1% Ameisensäure in Wasser
Lösungsmittel B: 0,1% Ameisensäure in ACN
Gradient-Programm:
Zeit (min): 0 0,25 2.25 2.26 3.4 3,41 4,75
% B: 40 40 55 100 100 40 40
Nadelwäsche: ACN, 3 s
MS/MS Quelle: ESI (negativer Modus)
Gastemperatur: 300 °C
Gasdurchfluss: 5 L/min
Vernebler: 45 psi
kapillargefäß: -4000 V
Düsenspannung: -500 V
Mantelgastemperatur: 250 °C
Mantelgasdurchfluss: 7 L/min
MRM-Übergänge:
Analyten Vorläufer Ion (m/z) Produkt Ionen (m/z) * Fragmentor (V) Kollisionsenergie (V) Verweilzeit (ms) Zeitsegment
Me-IPA 556,6 428,7 74 12 60 2
126,9 65 60
126,8 61 60
Et-IPA 570,7 442,7 87 16 60
Zeitsegmente:
teil Start (min) Ende (min) drucktype Umstellung Delta EMV Polarität Gespeicherte Daten
1 0 0,6 MS2-Scan Zur Verschwendung 0 ablehnend Nein
2 0,6 2 Mrm Zu MS -100 ablehnend ja
3 2 4,75 MS2-Scan Zur Verschwendung 0 positiv Nein
* Quantifierübergänge werden fett formatiert.

Tabelle 5: PARAMETER LC-MS/MS. Quantifier-Produktionen sind fett.

zielscheibe Beobachtet Prozent
Id tag me-IPA me-IPA Genesung
QC-1 1 0 Nd N/A
QC-2 1 0 Nd N/A
QC-11 2 0 Nd N/A
QC-12 2 0 Nd N/A
QC-21 3 0 Nd N/A
QC-22 3 0 Nd N/A
QC-31 4 0 Nd N/A
QC-32 4 0 Nd N/A
QC-3 5 0 Nd N/A
QC-4 5 0 Nd N/A
QC-13 1 1.25 1.26 101% Ave (10) = 102%
QC-14 1 1.25 1.23 98,40% SD = 3,50%
QC-23 2 1.25 1.26 101% % RSD = 3,40%
QC-24 2 1.25 1.28 102%
QC-33 3 1.29 1.3 101%
QC-34 3 1.29 1.25 96,90%
QC-5 4 1.29 1.37 106%
QC-6 4 1.29 1.41 109%
QC-15 5 1.29 1.3 101%
QC-16 5 1.29 1.34 104%
QC-25 1 30,1 30,2 100% Ave (10) = 103%
QC-26 1 30,1 31,2 104% SD = 1,80%
QC-35 2 30,1 31,1 103% % RSD = 1,70%
QC-36 2 30,1 31,1 103%
QC-7 3 31 31,6 102%
QC-8 3 31 31,4 101%
QC-17 4 31 32,5 105%
QC-18 4 31 32,8 106%
QC-27 5 31 31,7 102%
QC-28 5 31 32,1 104%
QC-37 1 80,2 77,8 97,00% Ave (10) = 101%
QC-38 1 80,2 78,9 98,40% SD = 2,30%
QC-9 2 80,2 81,8 102% % RSD = 2,30%
QC-10 2 80,2 79,8 99,50%
QC-19 3 82,7 83,5 101%
QC-20 3 82,7 84 102%
QC-29 4 82,7 84,7 102%
QC-30 4 82,7 87,2 105%
QC-39 5 82,7 83 100%
QC-40 5 82,7 84,1 102%

Tabelle 6: QC-Ergebnisse für me-IPA im Mongoose-Serum (g/ml).

Target et-IPA (g/ml) N Mittelwert (%) SD (%) % RSD
0 21
1.3 12 103 4,5 4.3
13 9 91,7 1.4 1.5
32 12 106 2.4 2,3
85 12 105 5,8 5,6
170 9 106 1.1 1.1

Tabelle 7: QC-Ergebnisse für et-IPA in Mongooseserum (g/ml).

Ködertyp und Ethyl-IPA-Köderkonzentration (g/ml)
Zeitraum 0.4% - Blister 1.0% - Blister 0.14% - Matrix Steuerung
Mittelwert (SD) N Mittelwert (SD) N Mittelwert (SD) N Mittelwert (SD) N
Tag 0 Nd 5 Nd 4 Nd 6 Nd 3
Tag 1 13,7 (10,9) 2 11,2 (10,4) 4 20,6 (17,3) 2 Na Na
Tag 7 11,5 (6,3) 6 9,9 (9,6) 4 21,4 (10,9) 6 Nd 3
Tag 14 10,2 (5,2) 6 5.7 (2.5) 3 17,8 (10,2) 6 Nd 3
Tag 21 8,9 (4,1) 4 10,0 (9,5) 4 23,8 (5,3) 3 Nd 2
Tag 28 8,5 (3,9) 5 11.1 (10.6) 3 17,7 (9,3) 4 Nd 3
Tag 35 17,0 (NA) 1 9,1 (9,0) 4 21,7 (9,3) 2 Nd 1
Tag 42 Na 0 8,4 (8,5) 4 16.5 (NA) 1 Nd 2
Tag 49 10,2 (5,8) 2 8.1 (8.4) 4 17,5 (4,7) 2 Nd 2
Tag 56 10,9 (5,4) 2 3,8 (1,1) 3 17,6 (6,1) 2 Nd 2

Tabelle 8: Mittlere (Standabweichung [SD]) Ethyl-IPA-Serumkonzentration nach Ködertyp. ND = nicht erkannt, NA = Nicht anwendbar.

Dosis- und Methyl-IPA-Konzentration (g/ml)
Zeitraum 0,04% 0,07% 0,14% Steuerung
Mittelwert (SD) N Mittelwert (SD) N Mittelwert (SD) N Mittelwert (SD) N
Tag 0 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4 ND (NA) 4
Tag 1 7,8 (7,1) 4 22,2 (9,2) 4 29,1 (16,0) 4 ND (NA) 4
Tag 7 4.4 (4.8) 4 14,4 (4,6) 4 21,3 (12,0) 4 ND (NA) 4
Tag 14 5,7 (5,9) 4 12,0 (3,5) 4 19,6 (10,6) 4 ND (NA) 4
Tag 21 4,9 (4,5) 4 12,0 (0,8) 3 18,3 (9,9) 4 ND (NA) 4
Tag 28 5,4 (5,0) 4 9,8 (2,4) 4 16,4 (8,1) 4 ND (NA) 4

Tabelle 9: Mittlere (SD) Methyl-IPA-Serumkonzentration nach Dosis. ND = Nicht erkannt, NA = Nicht anwendbar. Alle Methyl-IPA-Konzentrationen wurden in die externe Ködermatrix integriert.

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Discussion

Die für die Studien entwickelte LC-MS/MS-Methode nutzte die Selektivität der Mehrfachreaktionsüberwachung, um me-IPA und et-IPA im Mongooseserum genau zu quantifizieren. Die Selektivität der MS/MS-Erkennung ermöglichte auch ein einfaches Bereinigungsprotokoll, das sich ausschließlich auf Acetonitril stützt, um Proteine aus Demerum vor der Analyse zu fällen.

Iophenoxsäuren sind in ACN löslich, aber praktisch unlöslich in Wasser. Um Wasser aus der ACN-Extraktion auszuschließen, wurde Natriumchlorid zugesetzt, um eine klare Wasser-:ACN-Phasentrennung durch Erhöhung der Ionenstärke der wässrigen (Serum-)Phase zu erzwingen. Die flüchtige Säure Trifluoressigsäure (TFA) wurde auch hinzugefügt, um sicherzustellen, dass Iophenoxsäuren während der Extraktion protoniert wurden und in der ACN-Phase leichter zu lupbefreien würden. TFA wird während des Trockenschritts vor der LC-MS/MS-Analyse entfernt.

Die Blutentnahmen aus Mongoose beliefen sich auf ca. 1 ml und ergaben 0,5 ml oder weniger Seren. Für die Durchführung von Replikationsanalysen für jede Probe war ein Mikrostichprobenvorbereitungsverfahren erforderlich, bei dem Mikrozentrifugenrohre anstelle typischer analytischer Laborglaswaren wie volumetrische Pipetten und Kolben der Klasse A verwendet wurden. Um genaue und präzise Ergebnisse zu erzielen, ist es notwendig, dass Analysten in der Verwendung von Glas-Mikroliter-Spritzen und Positivverschiebung stellrischen Pipetten mit Mikroliter-Spitzen kompetent sind.

Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie kostspielige LC-MS/MS-Instrumente und In der Enduthek stellung von Analysten erfordert, die in ihrer Verwendung und Wartung geschult sind. Da me-IPA und et-IPA jedoch mit den beschriebenen HPLC-Bedingungen basistauchwert gelöst werden, könnte die Methode möglicherweise an ein Single-Quadrupol-LCMS oder HPLC mit UV-Detektor angepasst werden, sofern keine Interferenzen beobachtet wurden.

Der Unterschied in den mittleren Serumkonzentrationen zwischen Mongos, die Köder mit et-IPA in der Blisterpackung und Ködermatrix bei der Dosis von 2,8 mg konsumierten, deutet auf eine Verschüttung hin, wenn der Marker in der Blisterpackung enthalten ist, anstatt in die Ködermatrix eingearbeitet zu werden. Dies kann Auswirkungen auf den Zweck der Schätzung von Impfstoff im Gegensatz zu Köderaufnahme haben. Beispielsweise kann die Aufnahme des Markers in die externe Ködermatrix die Schätzung der Impfstoffabdeckung aufblähen, wenn das Tier die Matrix isst, aber der Impfstoff austritt. Regulatorische Beschränkungen können jedoch die Möglichkeit ausschließen, einen biologischen Marker direkt mit einem Impfstoff innerhalb der Blisterpackung zu mischen. In den Fällen, in denen <100% Verbrauch aufgezeichnet wurde, befanden sich drei Fälle mit Ködern, die et-IPA in der Blisterpackung enthielten, von denen zwei die höhere Konzentration von 1 % waren. Dies deutet auf eine mögliche Geschmacksaversion hin, wenn et-IPA in höheren Konzentrationen ist. Wenn Köder mit 1% (20,0 mg) et-IPA, die in die Ködermatrix aufgenommen wurden, den Gänsen angeboten wurden, lehnten alle Tiere den Köder ab.

Die mittleren IPA-Konzentrationen für et- und me-IPA an Tag 14 betrugen etwa 17 bzw. 19 g/ml. Ähnliche Untersuchungen am Instituto de Investigacion en Recursos Cinegéticos, Ciudad Real, Spanien, mit Butyl und Pentyl-IPA fanden Tag 14 Konzentrationen von etwa 45 und 10 g/ml in Mongoose sera, wenn sie in der gleichen Konzentration und Köder geliefert Formulierung wie in unserer Studie. Diese Unterschiede deuten darauf hin, dass verschiedene IpA-Derivate bei Mongusten mit unterschiedlichen Raten verstoffwechseln können, was nützlich sein kann, wenn die Markerretention (entweder kurz- oder langfristige Retention) ein Problem darstellt.

Unterschiede in der Physiologie des Magen-Darm-Systems können die Absorption und Ausscheidung von IPA bei verschiedenen Arten beeinflussen. Die Plasmaeliminationshalbwertszeit von IPA bei Hauskatzen (Felis catus) bei der Lieferung bei 1,5 mg/kg betrug 107 Tage, während die Rate bei Pinselschwanz-Possums bei gleicher Dosisrate etwa einen Tag28betrug. Wenn IPA hauseigenen Ziegen (Capra aegagrus hircus) mit einer Dosisrate von 1,5 mg/kg verabreicht wurde, betrug die terminale Eliminationshalbwertszeit von IPA 81 Tage, obwohl die Forscher weiterhin erhöhte Jodkonzentrationen bis zu 160 Tage nach der Verabreichung feststellten. 39. Das Magen-Darm-System der Mitglieder von Vivveridae (der Familie, der man zuvor40zugeordnet hatte) wird als ähnlich wie bei der Hauskatze41beschrieben, was die Retentionszeit von IPA in Mongooses. Forschung schlägt auch vor, dass IPA in Beuteltieren unterschiedlich metabolisiert werden kann, was eine schnellere Ausscheidung als bei eutherischen Artenermöglicht 29.

Beide ipA-Derivate, die in dieser Studie bewertet wurden, lieferten eine langfristige (4-8 Wochen) Kennzeichnungsfähigkeit bei Mongusten. Bei der Verwendung von IPA als biologischem Marker bei Gänsen sollten die Studienziele und die gewünschte Dauer der Kennzeichnung berücksichtigt werden. In Fällen, in denen Tiere während aufeinander folgender Zeiträume von denselben Studienstandorten markiert werden sollen, könnten verschiedene IPA-Derivate verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse eines Markierungsereignisses nicht durch Markierung enden. Im Rahmen des operativen ORV für Wildtiere in den USA werden die Probenahmen der Zielarten und Tests auf das Vorhandensein von RVNA und Biomarker in der Regel 4 bis 6 Wochen nach der ORV-Verteilung42durchgeführt. Aus praktischer Sicht scheint es, dass entweder et- oder me-IPA während dieses Zeitraums leicht erkannt werden kann. Zukünftige Forschungen zur Bewertung der Rückstandszerfallsfunktion in Mongos boten verschiedene Konzentrationen beider konggener IPA-Kongener, die in dieser Studie bewertet wurden, wären nützlich.

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Disclosures

Die Autoren AV und SO sind hauptamtliche Mitarbeiter eines Herstellers von oralen Tollwut-Impfstoffködern.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde zum Teil durch das intramurale Forschungsprogramm des US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Tollwut Management Program und IDT Biologika (Dessau-Roßlau, Deutschland) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Immunologie und Infektion Ausgabe 147 biologischer Marker Herpestes auropunctatus Iophenoxsäure Tollwut kleine indische Mongoose LC-MS/MS
Analyse von Iophenoxic Acid Analoga in Small Indian Mongoose (<em>Herpestes Auropunctatus</em>) Sera zur Verwendung als orale Tollwut-Impfung Biologischer Marker
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Berentsen, A. R., Sugihara, R. T.,… More

Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

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