Summary
Nós oferecemos mangustos prisionais placebo iscas de vacina contra a raiva oral com ácido etílico ou metil iofenóxico como um biomarcador e verificado captação de isca usando uma nova cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) método.
Abstract
O Mongoose indiano pequeno (auropunctatus de Herpestes) é um reservatório do vírus da raiva (rabv) em Puerto Rico e compreende sobre 70% de casos animais da raiva relatados anualmente. O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado por uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. A pesquisa em vacinas orais da raiva e em vários tipos da isca para mangustos foi conduzida com resultados prometedores. O monitoramento do sucesso da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração nos anticorpos neutralizantes da RABV (RVNA) pós-vacinação. Esta estratégia pode ser difícil de interpretar em áreas com um programa ORV de vida selvagem ativa ou em áreas onde o RABV é enzoótico e níveis de fundo de RVNA estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incorporado com a vacina ou a matriz de isca pode ser útil. Nós oferecemos 16 mangustos em cativeiro placebo ORV iscas contendo ácido etil-iofenoxico (et-IPA) em concentrações de 0,4% e 1% dentro da isca e 0,14% na matriz de isca externa. Nós também oferecemos 12 mangustos cativos ORV iscas contendo ácido metil-iofenoxico (me-IPA) em concentrações de 0, 35%, 0, 7% e 0,14% na matriz de isca externa. Nós coletamos uma amostra do soro antes da oferta da isca e então semanalmente por até oito semanas de oferta do borne. Nós extraímos ácidos iophenoxic dos soros no acetonitrila e quantificamos usando a cromatografia líquida/espectrometria maciça. Foram analisados soros para et-IPA ou me-IPA por cromatografia líquida-espectrometria de massas. Nós encontramos a habilidade adequada da marcação por pelo menos oito e quatro semanas para o et-e o me-IPA, respectivamente. Ambos os derivados IPA poderia ser adequado para avaliação de campo de captação de isca ORV em Mongooses. Devido à longevidade do marcador em soros de Mangusto, o cuidado deve ser tomado para não confundir os resultados usando o mesmo derivado IPA durante avaliações consecutivas.
Introduction
O vírus da raiva (RABV) é um único lyssavirus encalhado do sentido negativo, e circula entre espécies diferentes do reservatório dos animais selvagens dentro das ordens Carnivora e Chiroptera. Várias espécies de mangusto são reservatórios de RABV, e o pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) é o único reservatório em Porto Rico e outras ilhas caribenhas no hemisfério ocidental1,2,3 . O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado através de uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Nos Estados Unidos (EUA), esta atividade de gestão é coordenada pelo USDA/APHIS/Wildlife Services programa nacional de gestão da raiva (NRMP)4. Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. Pesquisa em vacinas contra a raiva e vários tipos de isca para mangustos tem sido conduzido com resultados promissores sugerindo um programa ORV para mangustos é possível5,6,7,8.
O monitoramento do impacto da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração na soroprevalência de anticorpos RV. No entanto, essa estratégia pode ser desafiadora em áreas com programas ativos de ORV de vida selvagem ou em áreas onde o VD é enzoótico e níveis de fundo de anticorpos neutralizantes RABV (RVNA) estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incluído na isca ou a matriz de isca externa pode ser útil.
Vários marcadores biológicostêm sido utilizados para monitorizar a captação de iscas em numerosas espécies, incluindo guaxinins (Procyon lotor)9,10, Estats (Mustela arminho)11,12, texugos europeus ( Meles) 13, javalis selvagens (Sus scrofa)14, pequenos mangustos indianos15 e cães da pradaria (cynomysludovicianus)16,17, entre outros. Nos EUA, as iscas operacionais de ORV freqüentemente incluem um biomarcador de tetraciclina a 1% na matriz de isca para monitorar a captação de iscas18,19. Entretanto, os inconvenientes ao uso do tetraciclina incluem uma preocupação crescente sobre a distribuição dos antibióticos no ambiente e que a deteção do tetraciclina é tipicamente invasora, exigindo a extração ou a destruição do dente do animal para obter o osso amostras20. A rhodamina B foi avaliada como um marcador em uma variedade de tecidos e pode ser detectada usando luz ultravioleta (UV) e fluorescência no cabelo e bigodes10,21.
O ácido iofenoxico (IPA) é um pó branco, cristalino que tem sido utilizado para avaliar o consumo de iscas em coiotes (Canis latrans)22, Arctic Fox (Vulpes lagopus)23, Red Fox (VulpesVulpes)24, guaxinins 9 anos de , 25, javali14, cervos vermelhos (Cervus elaphus scoticus)26, Badgers europeus12 e furões (M. furo)27, entre várias outras espécies de mamíferos. Os tempos de retenção do IPA variam por espécies de menos de duas semanas em alguns marsupiais28,29, para pelo menos 26 semanas em ungulados26 e mais de 52 semanas em cães domésticos (Canis lupus familiaris)30. Os tempos de retenção também podem ser dependentes da dose31. O ácido iofenoxico liga-se fortemente à albumina sérica e foi historicamente detectado pela medição dos níveis de iodo no sangue32. Esta aproximação indireta foi suplantada por métodos da cromatografia líquida de capacidade elevada (HPLC) para medir diretamente concentrações do ácido iophenoxic com deteção UV33, e eventualmente com cromatografia líquida e espectrometria maciça (LCMS) 34,35. Para este estudo, foi desenvolvida uma cromatografia líquida altamente sensível e seletiva com método de espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) que utiliza o monitoramento de múltiplas reações (MRM) para quantificar dois análogos do ácido iofenoxico. Nosso objetivo foi usar este método LC-MS/MS para avaliar a capacidade de marcação de 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido propanoico (metil-IPA ou me-IPA) e 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzilo) ácido butanóico (etil-IPA ou et-IPA) e quando entregues em um ORV isca para Mongooses em cativeiro.
Os Mongooses foram capturados vivos em armadilhas da gaiola iscas com as salsichas fumadas comercialmente disponíveis e o óleo de peixes. Mongooses foram alojados em individuais 60 cm x 60 cm x 40 cm gaiolas de aço inoxidável e alimentados com uma ração diária de ~ 50 g alimento de gato seco comercial, suplementado duas vezes por semana com uma coxa de frango disponível comercialmente. A água estava disponível ad libitum. Nós entregamos dois derivados de IPA, de ethyl-IPA e de methyl-IPA, aos mangustos cativos em baits do placebo ORV. Todas as iscas foram compostas de um blister de 28 mm x 20 mm x 9 mm com revestimento externo (doravante "matriz de isca") contendo ovo de frango em pó e gelatina (tabela de materiais). As iscas continham 0,7 mL de água ou derivado do IPA e pesaram aproximadamente 3 g, dos quais ~ 2 g foi a matriz de isca externa.
Nós oferecemos 16 mangustos cativas et-IPA em três concentrações: 0,14% (2,8 mg et-IPA em ~ 2 g de matriz de isca; 3 machos [m], 3 fêmeas [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 3M, 3F) e 1,0% (7,0 mg de etil-IPA em 0,7 ml de volume de blisters; 2m , 2f). A dose global de 2,8 mg corresponde a uma taxa de dose de 5 mg/kg27,36 e baseia-se num peso médio de mangusto de 560 g em Porto Rico. Nós selecionamos 1% como a concentração a mais elevada como a pesquisa sugere a aversão do gosto a alguns biomarcadores pode ocorrer em concentrações > 1% em algumas espécies37. Nós oferecemos somente a dose de 1% no bloco de bolha como a floculação impediu o soluto de dissolver-se no solvente suficientemente para ser incorporado uniformente na matriz da isca. Um grupo controle (2m, 1f) recebeu iscas cheias de água estéril e sem IPA. Nós oferecemos iscas para mangustos na parte da manhã (~ 8 a.m.) durante ou antes da alimentação de sua ração de manutenção diária. Restos de isca foram removidos após aproximadamente 24 horas. Foram coletadas amostras de sangue antes do tratamento, um dia após o tratamento e, em seguida, semanalmente até 8 semanas após o tratamento. Nós Anestesiaram mangustos pela inalação do gás do isoflurano e coletamos até 1,0 ml do sangue inteiro pelo punção venosa da veia craniana oca como descrita para furões38. Nós centrifugados amostras inteiras do sangue, sera transferido aos cryovials e armazenamos-os em-80 ° c até a análise. Nem todos os animais foram amostrados durante todos os períodos de tempo para minimizar os impactos do sangue repetido se baseia na saúde dos animais. Os animais de controle foram amostrados no dia 0, depois semanalmente por até 8 semanas após o tratamento.
Nós entregamos o me-IPA em três concentrações: 0, 35% (0,7 MGS), 0, 7% (1,4 MGS) e 0,14% (2,8 MGS), todos incorporados na matriz da isca, com 2 machos e 2 fêmeas por o grupo do tratamento. Dois machos e duas fêmeas receberam iscas cheias de água estéril e sem IPA. Os tempos de oferecimento da isca e a anestesia do Mongoose são descritos acima. Nós coletamos amostras de sangue antes do tratamento no dia 1, e então semanalmente até 4 semanas após o tratamento.
Foram testados dados de concentração sérica para normalidade e médias estimadas para concentrações séricas de IPA de diferentes grupos de tratamento. Utilizou-se um modelo linear misto para comparar as concentrações médias de et-IPA sérica agrupadas em indivíduos. O tipo da isca (matriz/bloco de bolha) era um efeito fixo além do que o dia experimental, visto que a identificação animal era um efeito aleatório. Todos os procedimentos foram executados utilizando software estatístico comum (tabela de materiais) e a significância foi avaliada em α = 0, 5.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do USDA National Wildlife Research Center o protocolo de pesquisa aprovado QA-2597.
Nota: o seguinte protocolo descreve o procedimento de análise para detectar o ácido metil-iofenoxico no soro de mangusto. Este método é a versão final de um processo iterativo que começou com a análise do ácido etil-iofenoxico no soro do Mongoose. Durante a avaliação inicial do ácido etil-iofenoxico foram feitas modificações menores nos métodos, resultando no protocolo final apresentado abaixo. Os resultados representativos incluem aqueles obtidos durante ambas as iterações.
1. preparação de soluções e normas
- Compre-me-IPA e et-IPA.
- Para A fase móvel A, prepare 1 L de 0,1% (v/v) de ácido fórmico em água, combinando 1 mL de ácido fórmico com 1 L de água ultrapura (≥ 18 MΩ). Para a fase móvel B, prepare 1 L de 0,1% (v/v) de ácido fórmico em acetonitrila (ACN) combinando 1 mL de ácido fórmico com 1 L de ACN.
- Para diluente, prepare 200 mL de 0,5% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) na ACN, combinando 1 mL de TFA com 200 mL de ACN.
- Prepare soluções de ações do IPA concentrado de me-IPA e et-IPA na ACN em concentrações de aproximadamente 1.000 μg/mL.
- Pesar aproximadamente 10 mg de me-IPA em um microbalança e gravar a massa para ± 0, 1 mg. transferir quantitativamente o me-IPA para um balão volumétrico de 10 ml classe a usando 45 ml ACN. SONICATE 1 min para dissolver todos os sólidos e, em seguida, trazer para o volume com ACN.
- Transferência ~ 8 mL de cada estoque para âmbar 8 mL frascos de vidro com poli-tetrafluoroetileno (PTFE)-tampas forrado. Armazene à temperatura ambiente (RT). Transfira o estoque restante para resíduos perigosos.
- Para o estoque 25x-7 me-IPA (tabela 1), prepare um estoque de me-IPA na ACN em aproximadamente 200 μg/ml. Exemplo: Transfira 1 mL do estoque concentrado do me-IPA da etapa 1.4.2 para um balão volumétrico de 5 mL de classe A usando uma seringa de vidro de 1.000 μL. Diluir ao volume com a ACN. Transfira o estoque para um frasco de vidro âmbar de 8 mL com tampa revestida com PTFE. Loja em RT.
- Prepare as seis ações adicionais 25x me-IPA descritas na tabela 1. Para cada estoque, combine os volumes indicados usando um pipetador de repetição em um frasco de vidro âmbar âmbar de 8 ml com tampa revestida com PTFE. Armazene cada estoque em RT.
- Para o estoque substituto 25x, prepare um estoque substituto de me-IPA na ACN em aproximadamente 10 μg/mL do estoque concentrado preparado na etapa 1.4.2. Transfira 0,100 mL do estoque concentrado de me-IPA para um balão volumétrico de 10 mL de classe A usando uma seringa de vidro de 100 μL e, em seguida, diluir em volume com a ACN.
- Transfira ~ 8 mL para um frasco de vidro âmbar de 8 mL com tampa revestida com PTFE. Armazene no RT. Transfira o estoque restante para resíduos perigosos.
- Prepare os estoques de 4x contendo ambos os analitos em frascos de amostrador automático de vidro com rosca de 2 mL, conforme descrito na tabela 2.
- Por exemplo, para preparar o estoque 4x-7, para um frasco de 2 mL, adicione 0,20 mL do estoque 25x-7 me-IPA da etapa 1,5 usando um pipetador de repetição com uma ponta de capacidade de 0,5 mL. Adicione 0,20 mL do estoque de 25 x et-IPA substituto da etapa 1,7 usando uma pipeta de repetição com 0,5 mL de ponta de capacidade.
- Adicionar 0,85 mL de ACN utilizando uma pipeira de repetição com 1 mL de ponta de capacidade. Tampe o frasco com firmeza e inverta 5x para misturar.
- Prepare a curva padrão em frascos de amostrador automático de rosca de 2 mL, conforme descrito na tabela 3.
- Por exemplo, para preparar o padrão 7 (STD 7), para um frasco para injetáveis de 2 mL, adicione 0,20 mL do estoque 4x-7 da etapa 1.8.2 usando um pipetador de repetição com 0,5 mL de ponta de capacidade. Adicionar 0,60 mL de água de DI ultrapura utilizando um pipetador de repetição com 1 mL de ponta de capacidade. Tampe o frasco com firmeza e inverta 5x para misturar.
2. preparação da amostra
Cuidado: o pessoal que executa este procedimento deve ter recebido a série cheia de profilaxia da pre-exposição da raiva e ter um Titer documentado do anticorpo da raiva acima de 0,5 UI de uma facilidade médica designada da saúde ocupacional federal. O pessoal deve usar casacos de laboratório e proteção ocular em todos os momentos durante a realização da extração. Cuidado: execute as etapas 2.3 − 2.6 em um gabinete de biossegurança de classe II.
- Para cada amostra, prepare um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 200 − 300 mg de NaCl. organize os tubos em um rack de plástico 80-position. Reserve para uso na etapa 2,6.
Nota: uma colher micro (ou outro dispositivo de medição pequeno) é recomendada para um grande número de amostras. - Para cada amostra, rotule dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL: um como "A" e o outro como "B". Organize os tubos em um rack de plástico de 80 posições.
- Coloc os seguintes materiais e equipamento necessários para a extração do soro em um armário da Biossegurança da classe II: tubos do microcentrifugador (nos cremalheiras) preparados nas etapas 2,1 e 2,2, um misturador do vortex, pipetador da repetição com 0,5 ml e 5 pontas da capacidade de ml, deslocamento de ar de 100 − 1000 μl Pipetar com 1.000 μL de pontas, recipientes com cerca de 100 mL cada um de água DI diluente e ultrapura, e um contentor de resíduos de risco biológico.
- Retire as amostras de soro do armazenamento congelado e aqueça a RT no gabinete de biossegurança. Vortex misturar cada amostra de soro antes da amostragem.
- Usando um pipetador de repetição com 0,5 ml de ponta de capacidade, dispense 0, 50 ml de soro de mangusto no tubo "a" e adicione 0, 50 ml de 25x de estoque substituto. Em seguida, adicione 0,950 mL de diluente ao tubo "A" utilizando um pipetador de repetição com 5 mL de ponta de capacidade. Tampão firmemente e mistura do Vortex para 10 − 15 s.
- Dispense o NaCl pre-pesado da etapa 2,1 no tubo "A" e A mistura 3x do Vortex para 8 − 12 s. Limpe as superfícies exteriores da cremalheira do frasco contendo o tubo "A" que usa o isopropanol de 70% (v/v).
Nota: a cremalheira das amostras pode agora ser removida do armário da Biossegurança da classe II. - Tubo de centrifugação "A" a 12.000 x g durante 1 min para separar as fases aquosa e ACN. Pipetar 0,80 mL da fase superior da ACN para o tubo "B" utilizando uma pipeta de deslocamento aéreo de 100 − 1000 μL. Transfira a solução remanescente no tubo "a" para resíduos perigosos e elimine o tubo vazio num contentor de resíduos bioperigosos.
- Retire a ACN e a TFA do tubo "B" com um caudal suave de gás N2 num banho de água de 45 ° c.
- Adicionar 0,250 mL de ACN ao tubo "B" utilizando um pipetador de repetição, mistura Vortex para 4 − 5 s e, em seguida, centrifugar brevemente (2 − 4 s) a 12.000 x g para recolher o líquido na parte inferior do tubo.
- Adicione 0,750 ml de água de di ultrapura ao tubo "B" usando um pipetador da repetição com ponta da capacidade de 5 ml, mistura do Vortex para 4 − 5 s, e centrifugue então por 1 minuto em 12.000 x g para esclarecer a amostra.
- Transfira 0,75 mL do sobrenadante para um frasco para injetáveis de amostrador automático utilizando uma pipeta de deslocamento de ar 1.000 μL. Descarte as pontas da pipeta no recipiente de resíduos de risco biológico.
- Frascos de amostrador automático Cap de forma segura e analisar por LC-MS/MS (seção 4). Transfira a solução remanescente no tubo "B" para resíduos perigosos e elimine o tubo vazio num contentor de resíduos bioperigosos. Elimine todos os resíduos bioperigosos por autoclavagem ou incineração.
3. amostras de controle de qualidade
Cuidado: siga as instruções de advertência descritas na seção 2.
Nota: o procedimento a seguir descreve o número mínimo de amostras de controle de qualidade (QC) necessárias para uma análise. As repetições em cada nível são recomendadas se o soro suficiente do Mongoose do controle está disponível.
- Prepare quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 200 − 300 mg de NaCl. Organize os tubos em um rack de plástico de 80 posições.
- Para cada amostra de QC, rotule dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL: um como "A" e o outro como "B". Organize os tubos em um rack de plástico de 80 posições.
- Repita o passo 2,3.
- Remova o soro do Mongoose do controle do armazenamento congelado e aqueça-o ao RT no armário do biossegurança. Vortex misturar o soro de controle antes da amostragem.
- Dispense 0, 50 ml de soro de Mongoose de controle nos quatro tubos de "a" de 1,5 ml usando um pipetador de repetição com uma ponta de capacidade de 0,5 ml.
- Fortifique cada uma das quatro amostras do QC conforme especificado na tabela 4 usando um pipetador de repetição com 0,5 ml de ponta de capacidade. Tampão cada amostra do QC firmemente e mistura do Vortex para 10 − 15 s.
- Realize o procedimento de extração conforme descrito nas etapas 2.6 − 2.12.
4. análise LC-MS/MS
- Configure o LC-MS/MS com todos os parâmetros descritos na tabela 5. Ligue a LC-MS/MS e permita que a coluna atinja 70 ° c antes de definir a vazão para 0,800 mL/min.
- Configure uma sequência no software de aquisição de dados (tabela de materiais) para injetar a curva padrão antes e depois de cada lote constituído por amostras de controle de qualidade e amostras desconhecidas.
- Injete todos os padrões e amostras e adquira cromatogramas de íons MRM usando parâmetros listados na tabela 5.
- Após a conclusão da sequência, desligue a LC-MS/MS e elimine todos os frascos para amostradores automáticos como resíduos perigosos.
5. quantificação do
- Use o software de análise de dados para gerar uma curva de calibração de respostas relativas versus concentrações relativas para me-IPA usando et-IPA como padrão interno. Calcule as respostas relativas da transição do quantificador MRM para me-IPA (556,6 → 428,7) dividida pela transição de MRM para et-IPA (570,7 → 442,7). Construa uma curva de calibração de 7 níveis usando uma função quadrática de segunda ordem que é ponderada 1/x e ignora a origem.
- Calcule a concentração sérica (soroC) de me-IPA usando a seguinte equação:
onde oinstrumento c é a concentração determinada pelo instrumento a partir da curva de calibração em unidades de μg/mL, 1,25 é o
fator de diluição, vfinal é o volume amostral final (1,0 ml), e osoro v é o volume sérico em ml ( 0, 50 mL nominal).
fator de diluição, vfinal é o volume amostral final (1,0 ml), e osoro v é o volume sérico em ml ( 0, 50 mL nominal).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os cromatogramas de íons representativos de uma análise do me-IPA são apresentados na Figura 1. O soro do Mongoose do controle (Figura 1a) ilustra o tempo de retenção de et-IPA (analyte substituto) e a ausência de me-IPA no tempo de retenção indicado. A amostra de controle de qualidade (Figura 1b) ilustra a separação de linha de base do me-IPA do et-IPA, bem como as transições de quantificador e qualificador para o me-IPA. A Figura 1C mostra uma amostra representativa do estudo com uma concentração sérica observada de 33,5 μg/ml de me-IPA.
Uma curva de calibração representativa de uma análise do me-IPA é apresentada na Figura 2. A curva padrão de 7 níveis de 14 pontos varia de 0, 202 a 8,27 μg/mL me-IPA com um coeficiente de correlação (r2) de 0,9998. Os coeficientes de correlação variaram de 0,9998 a 0,99997 para as cinco análises do me-IPA. A concentração do et-IPA do analito do substituto era 0,502 μg/ml em todos os padrões.
A tabela 6 apresenta os resultados de precisão e precisão para o soro de controle Mongoose fortificado com 0, 1,3, 31 e 82 μg/ml me-IPA (n = 10 em cada nível). Os resultados foram coletados a partir de cinco análises separadas. Os percentuais de recuperações variaram de 96,9% a 109%. O desvio padrão relativo percentual (% RSD) nos três níveis de fortificação foi de 3,4%, 1,7% e 2,3%, respectivamente.
A relação sinal/ruído (S/N) observada nas amostras de controle de qualidade (n = 10 controles negativos; n = 10 em 1,3 μg/mL me-IPA) foi utilizada para determinar o limite de detecção (DL; 3 x S/N) e o limite de quantificação (QV; 10 x S/N). O DL e o QL para me-IPA no soro do Mongoose eram 0, 12 μg/mL e 0, 42 μg/mL, respectivamente.
As respostas da área de pico da transição de MRM do qualificador dividiram-se pela
transição do QUANTIFICADOR MRM (foi calculada para todos os padrões e amostras. Essa proporção para cada amostra foi então dividida pela razão média observada nos padrões de calibração para determinar a correspondência percentual do qualificador. A razão de qualificador para a amostra mostrada na Figura 1C foi 0,439, com uma correspondência de 96,3%.
A recuperação do analisador substituto do et-IPA foi calculada para todas as amostras de CQ e amostras desconhecidas dividindo a resposta da área de pico do et-IPA pela resposta média da área de pico do et-IPA observada nos padrões de calibração. As recuperações médias de analisadores substitutos foram de 91,0% (controles negativos), 91,4% (1,3 μg/mL), 92,8% (31 μg/mL) e 95,4% (82 μg/mL).
Não foram observados picos de interferência para as transições quantificador ou qualificador do me-IPA no soro de Mongoose controle (Figura 1a).
O procedimento de extração e as condições instrumentais utilizadas para determinar o et-IPA no soro Mongoose (Figura 3 e tabela 7) foram idênticos ao método me-IPA, mas com as seguintes alterações. O ácido propilo-iofenoxico (RP-IPA) foi utilizado como analito substituto e um LC-MS/MS mais antigo, menos sensível. A temperatura do gás de secagem da fonte era 350 ° c com um fluxo de 12 L/min e uma pressão do nebulizador de 35 libras por polegada quadrada. A tensão capilar foi de-2.500 V. A fonte não teve nenhum gás da bainha ou meios ajustar a tensão do bocal. A transição do quantificador MRM para et-IPA foi 570,7 → 442,8 (584,7 → 456,8 para pr-IPA). O fragmentor era 80 V e a energia da colisão era 10 V para ambos os analytes. O qualificador MRM para et-IPA foi 570,7 → 126,8 com uma energia de colisão de 40 V.
O teste de todas as amostras do soro do Mongoose para o et-IPA foi executado sobre oito análises. A curva de calibração de 7 níveis variou de 0, 207 a 8,48 μg/mL com coeficientes de correlação (r2) variando de 0,9990 a 0,9999. A concentração de PR-IPA do analisador substituto foi de 0,512 μg/mL. A tabela 7 apresenta os resultados de precisão e precisão para o soro de controle Mongoose fortificado com 0, 1,3, 13, 32, 85 e 170 μg/ml me-IPA. Os resultados foram coletados a partir de oito análises separadas. Os percentuais de recuperações variaram de 89,5% a 115%. O% RSD nos cinco níveis de fortificação foi de 4,3%, 1,5%, 2,3%, 5,6% e 1,1%, respectivamente. O S/N observado em amostras de controle de qualidade (n = 21 controles negativos; n = 21 em 1,3 μg/mL me-IPA) foi utilizado para determinar a DL e a QV. O DL e o QL para me-IPA no soro do Mongoose eram 0,12 μg/mL e 0,42 μg/mL, respectivamente. A recuperação média do analisador substituto das amostras de controle de qualidade foi de 86,8% (n = 75). Nenhum pico de interferência para o quantificador ou as transições do qualificador de et-IPA foi observado no soro do Mongoose do controle.
Todos os mangustos ofereceram as iscas do et-IPA consumiram ≥ 25% do Bait dentro da limitação do tempo de 24 horas e tiveram níveis quantificáveis de et-IPA em seus soros (tabela 8). A partir da análise do modelo misto, as concentrações plasmáticas médias globais do IPA foram marginalmente superiores às iscas com 2,8 mg de biomarcador na matriz de isca (17,5 μg/mL, 95% IC 11,7 − 23,3 μg/mL) em comparação com o blister (9,8 μg/mL, 95% IC 4,0 − 15,6 μg/mL) (F = 3,6 , P = 0, 7). Concentrações para ambos os tipos de isca deterioradas com o dia experimental (β =-0,15 ± 0, 4, F = 14,4, P = 0, 5). Observou-se variabilidade de nível individual nas concentrações séricas de IPA (estimativa do parâmetro de covariância animal ID = 46,6 ± 20,7). Todos os mangustos consumiram 100% das iscas do controle com somente o bloco de bolha vazio da folha restante. A concentração média de resíduo de et-IPA no soro foi variável por período de tempo e não parece diminuir consistentemente ao longo do tempo (Figura 3).
Todos os mangustos ofereceram as iscas de me-IPA consumiram ≥ 25% da isca dentro do limite de tempo de 24 horas e tinham níveis quantificáveis de me-IPA em seus soros (tabela 9). A concentração serologic média de et-e me-IPA em soros do Mongoose pareceu dependente da concentração de IPA na isca. Concentrações mais elevadas de IPA na isca resultaram em maiores resíduos séricos, mesmo nos casos em que a dose global (2,8 mg no caso de et-IPA) permaneceu a mesma. Curiosamente, me-IPA apareceu para produzir um padrão de degradação mais mesmo ao longo do tempo com um pico inicial no dia 1, seguido por um declínio constante até o dia 14, onde as concentrações apareceram ao planalto (Figura 4).
Figura 1 : Cromatogramas representativos do íon. (A) o cromatograma representativo de MRM íon do soro do Mongoose do controle fortificado com o ácido Ethyl-iophenoxic do analito do substituto (et-IPA). A seta indica o tempo de retenção para o ácido metil-iofenoxico (me-IPA). (B) cromatograma de íons representativos de MRM do soro de controle Mongoose fortificado com 31 μg/ml de me-IPA. As intensidades relativas do quantificador (Quant) e as transições de qualificador (qual) para o me-IPA são mostradas. C) cromatograma de íons representativos de MRM de uma amostra de soro de mangusto com uma concentração observada de me-IPA de 33,5 μg/ml. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Curva de calibração representativa. Uma curva de calibração original gerada pelo software de análise de dados para o ácido metil-iofenoxico (me-IPA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Concentração sérica média de etila IPA (et-IPA) por tipo de isca e concentração ao longo do tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Concentração sérica média de metil IPA (me-IPA) por concentração de isco ao longo do tempo. Todas as concentrações de me-IPA foram incorporadas na matriz de isca externa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Concentração de me-IPA (μg/mL) | ||
| Id | ||
| 25x-7 | Consulte a etapa 1,6 | 200 |
| 25x-6 | Combine 1, 0 mL 25x-7 Stock com 3, 0 mL ACN | 50 |
| 25x-5 | Combine 1, 0 mL 25x-6 Stock com 3, 0 mL ACN | 13 |
| 25x-4 | Combine 1, 0 mL 25x-5 Stock com 3, 0 mL ACN | 3,1 |
| 25x-3 | Combine 1, 0 mL 25x-4 Stock com 3, 0 mL ACN | 0,78 |
| 25x-2 | Combine 1, 0 mL 25x-3 Stock com 3, 0 mL ACN | 0,2 |
| 25x-1 | Combine 1, 0 mL 25x-2 Stock com 3, 0 mL ACN | 0, 49 |
Quadro 1: preparação das existências 25x me-IPA na ACN (em frascos de vidro âmbar de 8 mL).
| Concentração (μg/mL) | |||
| Id | me-IPA | et-IPA | |
| 4x-7 | 0,200 mL 25x-7 + 0,200 mL 25x substituto + 0,850 mL ACN | 32 | 1,6 |
| 4x-6 | 0,200 mL 25x-6 + 0,200 mL 25x substituto + 0,850 mL ACN | 8 | 1,6 |
| 4X-5 | 0,200 mL 25x-5 + 0,200 mL 25x substituto + 0,850 mL ACN | 2 | 1,6 |
| 4x-4 | 0,200 mL 25x-4 + 0,200 mL 25x substituto + 0,850 mL ACN | 0,5 | 1,6 |
| 4x-3 | 0,200 mL 25x-3 + 0,200 mL 25x substituto + 0,850 mL ACN | 0,12 | 1,6 |
| 4x-2 | 0,200 mL 25x-2 + 0,200 mL 25x substituto + 0,850 mL ACN | 0, 31 | 1,6 |
| 4x-1 | 0,200 mL 25x-1 + 0,200 mL 25x substituto + 0,850 mL ACN | 0, 8 | 1,6 |
| 4x-0 | 0,200 mL 25x substituto + 1, 50 mL ACN | 0 | 1,6 |
Quadro 2: preparação das existências de 4x IPA na ACN (em frascos para injectáveis automáticos de 2 mL).
| Concentração (μg/mL) | |||
| Id | me-IPA | et-IPA | |
| STD 7 | 0,200 mL 4x-7 + 0,600 mL DI água | 8 | 0,4 |
| STD 6 | 0,200 mL 4x-6 + 0,600 mL DI água | 2 | 0,4 |
| STD 5 | 0,200 mL 4X-5 + 0,600 mL DI água | 0,5 | 0,4 |
| STD 4 | 0,200 mL 4x-4 + 0,600 mL DI água | 0,13 | 0,4 |
| STD 3 | 0,200 mL 4x-3 + 0,600 mL DI água | 0, 3 | 0,4 |
| STD 2 | 0,200 mL 4x-2 + 0,600 mL DI água | 0, 78 | 0,4 |
| STD 1 (em) | 0,200 mL 4x-1 + 0,600 mL DI água | 0, 2 | 0,4 |
| STD 0 | 0,200 mL 4x-0 + 0,600 mL DI água | 0 | 0,4 |
| Vazio | 0,200 mL ACN + 0,600 mL DI água | 0 | 0 |
Tabela 3: preparação dos padrões do me-IPA em 75/25 água/ACN (em frascos para injetáveis de amostrador automático de 2 mL).
| Concentração (μg/mL) no soro | |||
| Id | me-IPA | et-IPA | |
| Controle negativo | 0, 50 mL 25x substituto + 0,950 mL diluente | 0 | 10 |
| Baixa fortificação | 0, 50 mL 25x substituto + 0, 20 mL 25x-4 + 0,930 mL diluente | 1,2 | 10 |
| Fortificação meados de | 0, 50 mL 25x substituto + 0, 30 mL 25x-6 + 0,920 mL diluente | 30 | 10 |
| Fortificação elevada | 0, 50 mL 25x substituto + 0, 20 mL 25x-7 + 0,930 mL diluente | 80 | 10 |
Tabela 4: fortificação da amostra de controle de qualidade (Prepare-se em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL).
| Cromatografia líquida: | |||||||||||||||||||||
| Coluna: | C18, 2,1 x 50 mm, tamanho de partícula de 2,5 μm | ||||||||||||||||||||
| Temperatura da coluna: | 70 ° c | ||||||||||||||||||||
| Volume da injeção: | 5 μL de | ||||||||||||||||||||
| Vazão: | 0,800 mL/min | ||||||||||||||||||||
| Fase móvel: | Solvente A: | 0,1% de ácido fórmico em água | |||||||||||||||||||
| Solvente B: | 0,1% de ácido fórmico na ACN | ||||||||||||||||||||
| Programa de gradiente: | |||||||||||||||||||||
| Tempo (min): | 0 | 0,25 | 2,25 | 2,26 | 3,4 | 3,41 | 4,75 | ||||||||||||||
| B | 40 | 40 | 55 | 100 | 100 | 40 | 40 | ||||||||||||||
| Lavagem da agulha: ACN, 3 s | |||||||||||||||||||||
| MS/MS fonte: ESI (modo negativo) | |||||||||||||||||||||
| Temperatura do gás: | 300 ° c | ||||||||||||||||||||
| Fluxo de gás: | 5 L/min | ||||||||||||||||||||
| Nebulizador: | 45 libras por polegada quadrada | ||||||||||||||||||||
| Capilar: | -4000 V | ||||||||||||||||||||
| Tensão do bocal: | -500 V | ||||||||||||||||||||
| Temperatura do gás da bainha: | 250 ° c | ||||||||||||||||||||
| Fluxo de gás da bainha: | 7 L/min | ||||||||||||||||||||
| Transições MRM: | |||||||||||||||||||||
| Analito | Íon precursor (m/z) | Íon do produto (m/z) * | Fragmentor (V) | Energia de colisão (V) | Tempo de permanência (MS) | Segmento de tempo | |||||||||||||||
| Me-IPA | 556,6 | 428,7 | 74 | 12 | 60 | 2 | |||||||||||||||
| 126,9 | 65 | 60 | |||||||||||||||||||
| 126,8 | 61 | 60 | |||||||||||||||||||
| Et-IPA | 570,7 | 442,7 | 87 | 16 | 60 | ||||||||||||||||
| Segmentos de tempo: | |||||||||||||||||||||
| Segmento | Início (min) | Fim (min) | Tipo | Desviador | Delta EMV | Polaridade | Dados armazenados | ||||||||||||||
| 1 | 0 | 0,6 | Scan MS2 | Para desperdiçar | 0 | Negativo | Não | ||||||||||||||
| 2 | 0,6 | 2 | Mrm | A MS | -100 | Negativo | Sim | ||||||||||||||
| 3 | 2 | 4,75 | MS2 Scan | Para desperdiçar | 0 | Positivo | Não | ||||||||||||||
| * As transições do quantificador são aparafadas. | |||||||||||||||||||||
Tabela 5: parâmetros LC-MS/MS. Os íons do produto do quantificador são em negrito.
| Alvo | Observado | Por cento | ||||
| Id | Dia | me-IPA | me-IPA | Recuperação | ||
| QC-1 | 1 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-2 | 1 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-11 | 2 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-12 | 2 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-21 | 3 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-22 | 3 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-31 | 4 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-32 | 4 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-3 | 5 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-4 | 5 | 0 | Nd | N/A | ||
| QC-13 | 1 | 1,25 | 1,26 | 101% de | Ave (10) = | 102% de |
| QC-14 | 1 | 1,25 | 1,23 | 98,40% de | DP = | 3,50% de |
| QC-23 | 2 | 1,25 | 1,26 | 101% de | % RSD = | 3,40% de |
| QC-24 | 2 | 1,25 | 1,28 | 102% de | ||
| QC-33 | 3 | 1,29 | 1,3 | 101% de | ||
| QC-34 | 3 | 1,29 | 1,25 | 96,90% de | ||
| QC-5 | 4 | 1,29 | 1,37 | 106% de | ||
| QC-6 | 4 | 1,29 | 1,41 | 109% de | ||
| QC-15 | 5 | 1,29 | 1,3 | 101% de | ||
| QC-16 | 5 | 1,29 | 1,34 | 104% de | ||
| QC-25 | 1 | 30,1 | 30,2 | 100% de | Ave (10) = | 103% de |
| QC-26 | 1 | 30,1 | 31,2 | 104% de | DP = | 1,80% de |
| QC-35 | 2 | 30,1 | 31,1 | 103% de | % RSD = | 1,70% de |
| QC-36 | 2 | 30,1 | 31,1 | 103% de | ||
| QC-7 | 3 | 31 | 31,6 | 102% de | ||
| QC-8 | 3 | 31 | 31,4 | 101% de | ||
| QC-17 | 4 | 31 | 32,5 | 105% de | ||
| QC-18 | 4 | 31 | 32,8 | 106% de | ||
| QC-27 | 5 | 31 | 31,7 | 102% de | ||
| QC-28 | 5 | 31 | 32,1 | 104% de | ||
| QC-37 | 1 | 80,2 | 77,8 | 97, 0% de | Ave (10) = | 101% de |
| QC-38 | 1 | 80,2 | 78,9 | 98,40% de | DP = | 2,30% de |
| QC-9 | 2 | 80,2 | 81,8 | 102% de | % RSD = | 2,30% de |
| QC-10 | 2 | 80,2 | 79,8 | 99,50% de | ||
| QC-19 | 3 | 82,7 | 83,5 | 101% de | ||
| QC-20 | 3 | 82,7 | 84 | 102% de | ||
| QC-29 | 4 | 82,7 | 84,7 | 102% de | ||
| QC-30 | 4 | 82,7 | 87,2 | 105% de | ||
| QC-39 | 5 | 82,7 | 83 | 100% de | ||
| QC-40 | 5 | 82,7 | 84,1 | 102% de |
Tabela 6: resultados do QC para me-IPA no soro do Mongoose (μg/mL).
| Alvo et-IPA (μg/mL) | N | Média (%) | SD (%) | % RSD |
| 0 | 21 | |||
| 1,3 | 12 | 103 | 4,5 | 4,3 |
| 13 | 9 | 91,7 | 1,4 | 1,5 |
| 32 | 12 | 106 | 2,4 | 2,3 |
| 85 | 12 | 105 | 5,8 | 5,6 |
| 170 | 9 | 106 | 1,1 | 1,1 |
Tabela 7: resultados do QC para o et-IPA no soro do Mongoose (μg/mL).
| Tipo de isco e concentração de isco etílico IPA (μg/mL) | ||||||||
| Período de tempo | 0,4%-blister | 1,0%-blister | 0,14%-matriz | Controle | ||||
| Média (DP) | N | Média (DP) | N | Média (DP) | N | Média (DP) | N | |
| Dia 0 | Nd | 5 | Nd | 4 | Nd | 6 | Nd | 3 |
| Dia 1 | 13,7 (10,9) | 2 | 11,2 (10,4) | 4 | 20,6 (17,3) | 2 | NA | NA |
| Dia 7 | 11,5 (6,3) | 6 | 9,9 (9,6) | 4 | 21,4 (10,9) | 6 | Nd | 3 |
| Dia 14 | 10,2 (5,2) | 6 | 5,7 (2,5) | 3 | 17,8 (10,2) | 6 | Nd | 3 |
| Dia 21 | 8,9 (4,1) | 4 | 10,0 (9,5) | 4 | 23,8 (5,3) | 3 | Nd | 2 |
| Dia 28 | 8,5 (3,9) | 5 | 11,1 (10,6) | 3 | 17,7 (9,3) | 4 | Nd | 3 |
| Dia 35 | 17,0 (NA) | 1 | 9,1 (9,0) | 4 | 21,7 (9,3) | 2 | Nd | 1 |
| Dia 42 | NA | 0 | 8,4 (8,5) | 4 | 16,5 (NA) | 1 | Nd | 2 |
| Dia 49 | 10,2 (5,8) | 2 | 8,1 (8,4) | 4 | 17,5 (4,7) | 2 | Nd | 2 |
| Dia 56 | 10,9 (5,4) | 2 | 3,8 (1,1) | 3 | 17,6 (6,1) | 2 | Nd | 2 |
Tabela 8: média (desvio de suporte [DP]) concentração sérica de etil-IPA por tipo de isca. ND = não detectado, NA = não aplicável.
| Dose e concentração de metil IPA (μg/mL) | ||||||||
| Período de tempo | 0, 4% de | 0, 7% de | 0,14% de | Controle | ||||
| Média (DP) | N | Média (DP) | N | Média (DP) | N | Média (DP) | N | |
| Dia 0 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dia 1 | 7,8 (7,1) | 4 | 22,2 (9,2) | 4 | 29,1 (16,0) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dia 7 | 4,4 (4,8) | 4 | 14,4 (4,6) | 4 | 21,3 (12,0) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dia 14 | 5,7 (5,9) | 4 | 12,0 (3,5) | 4 | 19,6 (10,6) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dia 21 | 4,9 (4,5) | 4 | 12,0 (0,8) | 3 | 18,3 (9,9) | 4 | ND (NA) | 4 |
| Dia 28 | 5,4 (5,0) | 4 | 9,8 (2,4) | 4 | 16,4 (8,1) | 4 | ND (NA) | 4 |
Tabela 9: concentração sérica média (DP) de metil-IPA por dose. ND = não detectado, NA = não aplicável. Todas as concentrações de metil IPA foram incorporadas na matriz de isca externa.
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Discussion
O método de LC-MS/MS desenvolvido para os estudos utilizou a seletividade da monitoração múltipla da reação para quantificar com precisão o me-IPA e o et-IPA no soro do Mongoose. A seletividade da detecção de MS/MS também permitiu um protocolo simples de limpeza que dependesse unicamente de acetonitrila para precipitar proteínas do soro antes da análise.
Os ácidos iofenóxicos são solúveis em ACN, mas são praticamente insolúveis em água. Para excluir a água da extração da ACN, foi adicionado cloreto de sódio para forçar uma separação da fase de água clara: ACN, aumentando a força iónica da fase aquosa (soro). O ácido trifluoracético de ácido volátil (TFA) também foi adicionado para garantir que os ácidos iofenóxicos fossem protonados durante a extração e fossem mais prontamente solubilizados na fase ACN. O TFA é removido durante a etapa seca-para baixo antes da análise de LC-MS/MS.
O sangue extrai do Mongoose era aproximadamente 1 mL, rendendo 0,5 mL ou menos dos soros. Para realizar análises replicadas de cada amostra, foi necessário um procedimento de preparação da amostra em microescala que utilizasse tubos de micro centrífuga em vez de produtos de vidro laboratoriais analíticos típicos, como pipetas volumétricas de classe A e frascos. Para alcançar resultados precisos e precisos, é necessário que os analistas sejam proficientes no uso de seringas de microlitros de vidro e pipetadores de repetição de deslocamento positivo com pontas de microlitros.
Uma limitação deste método é que exige A instrumentação e os analistas caros de LC-MS/MS treinados em seu uso e manutenção. No entanto, como o me-IPA e o et-IPA são resolvidos de acordo com as condições de HPLC descritas, o método pode ser adaptado a um único quadripolo LCMS ou HPLC com detector de UV, desde que nenhuma interferência tenha sido observada.
A diferença nas concentrações séricas médias entre os mangustos que consumiram iscas com et-IPA na matriz da embalagem de bolha e da isca na dose de 2,8 MGS sugere o derramamento quando o marcador é contido no bloco de bolha, um pouco do que incorporado na matriz da isca. Isto pode ter implicações para a finalidade de estimar a vacina ao contrário da tomada da isca. Por exemplo, incorporar o marcador na matriz externa da isca pode inflar a estimativa da cobertura vacinal se o animal come a matriz mas a vacina derrama para fora. No entanto, as restrições regulamentares podem impedir a capacidade de misturar um marcador biológico diretamente com uma vacina dentro do blister. Nos casos em que < 100% de consumo foi registrado, três casos foram com iscas contendo et-IPA no blister, dois dos quais foram a maior concentração de 1%. Isto sugere a aversão potencial do gosto quando o et-IPA está em umas concentrações mais elevadas. Quando iscas contendo 1% (20,0 mg) et-IPA incorporados na matriz de isca foram oferecidas para Mongooses, todos os animais rejeitaram a isca.
As concentrações médias de IPA para et-e me-IPA no 14º dia foram de aproximadamente 17 e 19 μg/mL, respectivamente. Pesquisas semelhantes realizadas no Instituto de Investigación en recursos cinegéticos, Ciudad Real, Espanha, utilizando butilo e pentyl-IPA encontraram 14 concentrações de aproximadamente 45 e 10 μg/mL em soros de mangusto quando entregues na mesma concentração e isca formulação como em nosso estudo. Essas diferenças sugerem que diferentes derivados do IPA podem se metabolizar em diferentes taxas em mangoses, o que pode ser útil quando a retenção de marcadores (retenção de curto ou longo prazo) é uma preocupação.
As diferenças na fisiologia do sistema gastrointestinal podem afetar a absorção e a excreção de IPA em diferentes espécies. A semivida de eliminação plasmática de IPA em gatos domésticos (Felis Catus) quando entregues em 1,5 mg/kg foi de 107 dias, enquanto a taxa em gambás de Trichosurus na mesma taxa de dose foi de aproximadamente um dia28. Quando o IPA foi administrado a caprinos domésticos (Capra aegagrus hircus) a uma taxa de dose de 1,5 mg/kg, a semivida de eliminação terminal do IPA foi de 81 dias, embora os investigadores continuassem a encontrar concentrações elevadas de iodo até 160 dias após a administração 39. o sistema gastrointestinal dos membros de vivveridae (a família a que os mangustos tinham sido atribuídos previamente40) é descrito como similar àquele do gato doméstico41, que pode explicar o tempo de retenção do IPA em Mangustos. A pesquisa também sugere que o IPA pode ser metabolizado diferentemente em marsupiais, permitindo uma excreção mais rápida do que na espécie eutheriana29.
Ambos os derivados do IPA avaliados neste estudo forneceram a habilidade de marcação a longo prazo (4 − 8 semanas) em Mongooses. O uso do IPA como marcador biológico em mangoses deve levar em consideração os objetivos do estudo e a duração desejada da marcação. Nos casos em que os animais devem ser marcados a partir dos mesmos sítios de estudo durante períodos de tempo consecutivos, podem ser utilizados diferentes derivados do IPA para garantir que os resultados de um evento de marcação não sejam confundidos com a marcação durante os acontecimentos anteriores. Como parte da ORV operacional para a vida selvagem nos EUA, a amostragem das espécies-alvo e testes para a presença de RVNA e biomarcador é tipicamente conduzido 4 − 6 semanas após a distribuição ORV42. De um ponto de vista prático, ele aparece tanto et-ou me-IPA pode ser prontamente detectado durante este período de tempo. A pesquisa futura para avaliar a função de deterioração de resíduos em mangoses ofereceu várias concentrações de ambos os congêgrafos do IPA avaliados neste estudo seria útil.
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Disclosures
Autores AV e SO são funcionários em tempo integral de um fabricante de isca de vacina oral raiva.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo programa de pesquisa intramural do departamento de agricultura dos EUA, serviço de inspeção de saúde animal e vegetal, serviços de vida selvagem, programa nacional de gestão da raiva e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Alemanha).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
References
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