Summary
Библиотеку ТРИФОСФАТЫ/sgRNA был применен для допроса белка кодирование генов. Однако возможности библиотеки sgRNA раскрыть функцию CTCF границы в регуляции генов остается неизведанной. Здесь мы описываем библиотеки конкретных sgRNA Гомеозисных локусов для выяснения функцию CTCF границ в Гомеозисных локусов.
Abstract
Фактор CCCTC-привязки (CTCF)-опосредованной, стабильной, топологически связывания доменов (ТЗЖ) играют важную роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs. CTCF играет важную роль в регулировании пространственных и временных выражение Гомеозисных генов, которые контролируют эмбрионального развития, патронирования тела, кроветворения и leukemogenesis. Однако остается неизвестным, ли и как HOX локусов связанные CTCF границы регулирования организации хроматина и экспрессии Гомеозисных генов. В текущем протоколе конкретные sgRNA пула библиотека ориентации всех сайтов связывания CTCF в HOXA/B/C/D локусов был создан для изучения последствий нарушения границ связанного CTCF хроматина на TAD формирования и Гомеозисные гены выражение. Через ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генетический скрининг, сайт связывания CTCF, расположенный между HOXA7/HOXA9 генов (CBS7/9) были определены как критические регулятор онкогенных хроматина домена, а также имеет важное значение для поддержания внематочная Гомеозисные гены шаблоны выражений в переставить MLL острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Таким образом, эта библиотека sgRNA, скрининг подход обеспечивает новые идеи в CTCF при посредничестве Организации генома в определенных генных локусов и также обеспечивает основу для функциональных характеристик аннотированный генетических нормативных элементов, как кодирование и ««некодирующей, во время обычных биологических процессов в эпоху пост человеческого генома проекта.
Introduction
Недавние исследования взаимодействия генома показали, что форм ядерного генома человека стабильные топологически связывая доменов (ТЗЖ), которые сохраняются в различных видов и типов клеток. Организация генома в отдельные домены облегчает и ограничивает взаимодействие между регуляторных элементов (например, усилители и промоутеров). Коэффициент CCCTC-привязки (CTCF) связывается с TAD границ и играет решающую роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs1. Однако, генома широкий CTCF привязки данных показал, что, хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, он часто функционирует как хроматина барьер на определенном сайте в одну ячейку типа, но не в другом, предлагая что CTCF функции Вместе с другими мероприятиями в формировании хроматина границы2. Что остается неизвестным является ли граничных элементов (CTCF-привязки сайтов) напрямую связаны с биологической функции CTCF, и как эти ссылки встречаются. Таким образом мы предполагаем, что конкретных сайтов связывания CTCF в геноме непосредственно регулировать образование TADs и промоутер/усилитель взаимодействия в рамках этих доменов или между соседними доменами. Завершение проектов секвенирования генома мыши и последующий анализ эпигеномные человека и обнаружили новых молекулярных и генетических подписей генома. Однако роль конкретных подписей/изменения в регулирование гена и клеточную функцию, а также их молекулярные механизмы, еще не в полной мере понять.
Несколько строк доказательства поддержки, что CTCF-опосредованной TADs представляют функциональные хроматина домены3,4,5. Хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, генома широкий CTCF чип seq данные показали, что CTCF часто действует как барьер хроматина в одной ячейке тип, но не в других2. CTCF играет важную роль в процессе разработки путем посредничества генома организации4,6,7. Нарушение границ CTCF нарушениями усилитель/промоутер взаимодействий и экспрессии генов, приводит к закупорке развития. Это свидетельствует о том, что CTCF при посредничестве TADs являются не только структурные компоненты, но и регулирования подразделений, необходимых для надлежащего enhancer действий и Джин транскрипции5,8,9.
Гомеозисные гены играют решающую роль в ходе эмбрионального развития и они височно и пространственно ограничены в их шаблоны выражений. Локус HOXA образует два стабильных TADs разделения генов передней и задней границы CTCF-связанный элемент в ЭСК и IMR90 клетки1. Последние доклады свидетельствуют, что HoxBlinc, HoxB lncRNA Локус связанные, опосредует формирования CTCF направлены TADs и усилитель/промоутер взаимодействий в локусе HOXB . Это приводит к передней HOXB генов активации во время ESC приверженность и дифференциации10. Кроме того в определенных генов локусов, включая HOXA локус, переоборудование CTCF опосредованной TAD доменов изменил линии конкретный ген выражение профили и был связан с развитием болезни государства11,12. Доказательства поддерживает основную функцию CTCF в координации транскрипции гена и определения личности клетки путем организации генома в функциональных областях.
Несмотря на свою роль в развитии эмбриона, кроветворения HOX гены регулируют функции кроветворных стволовых и прогениторных клеток (HS/PC). Это делается путем контроля баланса между пролиферации и дифференцировки10,13,14,15. Экспрессии Гомеозисных генов жестко регулируется в спецификации и дифференциации кроветворных клеток, с высшим выражением в HS / экспрессии шт. Гомеозисных генов постепенно уменьшается во время созревания, с ее низким уровнем происходящие в дифференцированной гемопоэтические клетки16. Регуляции генов HOX является доминирующей механизмом лейкозных трансформации свойствами самообновления и дифференциации dysregulating HS/ПК, ведущих к лейкозных преобразования17,18. Однако механизм установления и поддержания нормальной против онкогенных выражение модели Гомеозисных генов, а также связанные с ними нормативных сети остается неясным.
ТРИФОСФАТЫ-Cas9 sgRNA библиотека скрининг широко использовался допросить белка кодирование генов19 как гены, также как не кодирования, например lncRNA20 и Мирна21 в разных видов. Однако стоимость использования библиотеки ТРИФОСФАТЫ-Cas9 sgRNA для выявления новых геномных целей остается высокой, потому что высок объём генома часто применяется для проверки проверки библиотеки sgRNA. Наши sgRNA скрининг системы сосредоточена на конкретных генома локусов и оценивает таргетинга sgRNAs через Одношаговая RT-PCR согласно маркер экспрессии генов, например HOXA9. Кроме того Сэнгер, секвенирование подтвердил, что sgRNA была интегрирована в геноме и Indel мутации могут быть обнаружены для определения ориентации сайта sgRNA. Посредством конкретных локусов ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генетический скрининг, границы хроматина CBS7/9 была определена в качестве критического регулятор для создания домена онкогенных хроматина и поддержания внематочная HOX картин выражения гена в патогенезе бод 12. метод может широко применяется для определения не только конкретные функции CTCF границы в эмбриональное развитие, кроветворения, leukemogenesis, но и CTCF границы как потенциальных терапевтических целей для будущих эпигеномные терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. CTCF sgRNALibrary дизайн с использованием онлайн инструмент
- Дизайн sgRNA ориентации сайтов связывания CTCF в человека HOX локусов в конструкторе генетических возмущений платформы (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
- Синтезировать в общей сложности 1070 sgRNAs, состоящий из sgRNAs ориентации 303 случайные ориентации генов, 60 позитивные элементы, 500 человека ненацеливания контроля и 207 CTCF элементы или lncRNA ориентации генов (рис. 1, Таблица 1). Каждый элемент нацеленности ДНК является мишенью для 5-10 различных sgRNAs.
2. sgRNA библиотека клонирование
-
Клон синтезированные олигонуклеотиды в вектор лентивирусные позвоночника ТРИФОСФАТЫ (lentiCRISPRv2).
- Дайджест LentiCRISPRv2 вектор с BsmBI энзима ограничения при 37 ° C на 2 ч.
- Посмотрите на наличие более крупные группы (около 12873 bp) на гель после BsmBI пищеварение и затем очистить его с комплектом извлечения геля.
Примечание: 2 часть малых наполнитель КБ присутствует также на геле, после переваривания, но это должны быть проигнорированы. - Перевязать синтезированные олигонуклеотиды и переваривается LentiCRISPR вектор с 150 нг переваривается LentiCRISPR ДНК, 1 мкл 10 мкм oligos, 2 мкл 10 x T4 лигаза буфера, 1 мкл лигаза T4 и затем инкубировать их в 16 ° C на ночь.
-
Трансформировать лентивирусные ТРИФОСФАТЫ/sgRNA библиотеки в электро компетентных клеток для амплификации.
- Подготовка electroporator в 1,8 кв, 200 Ω и 25 МКФ. Затем предварительно теплой восстановления SOC СМИ в ванну воды 37 ° C и предварительно теплой LB ампициллин антибиотик пластин при 37 ° C.
- Оттепель сведущие клетки на льду за 10 мин.
- Подготовьте микро-пробирок 1.5 мл и 1 мм электропорации кюветы на льду.
- Смешайте 1 мкл 10 нг/мкл библиотека плазмидной ДНК в 25 мкл компетентных клеток в микро пластиковых пробирок 1.5 мл и осторожно перемешать, стряхивая в нижней части трубки несколько раз вручную.
- После кювет достаточно холодно, передача ДНК/компетентных клеток смеси на него. Нажмите дважды на столешницу и уничтожить любые капли воды от наружной поверхности кювета с папиросной бумаги. Затем поместите кювету в модуле электропорации и нажмите пульс.
- Сразу же 975 мкл 37 ° C подогретым SOC СМИ. Mix закупорить вверх и вниз и передачи 15 мл.
- Поворот и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
- Разбавляют 100 мкл клеток в 900 мкл SOC СМИ и место 100 мкл на пластины агар антибиотик ампициллин фунтов. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
-
Экстракт плазмидной ДНК из комбинированных колоний, с помощью столбца макси prep как подробно указано в протоколе производителя.
- Очистите все колонии от плиты агара LB и прививать закваски по 2 мл среды антибиотик ампициллин LB и инкубировать на ночь при 37 ° C с энергичной встряхивания (~ 200 x g).
- Разбавить 1: 500 Культура стартера в 100 мл LB ампициллин среды и инкубировать при 37 ° C для 12-16 h с энергичной встряхивания (~ 200 x g).
- Урожай Пелле бактериальной клетки центрифугированием при 6000 x g 15 мин при 4 ° C.
- Вновь приостановите бактериальных Пелле в 10 мл подвеска буфера.
- Лизировать приостановлено лепешка с 10 мл буфера lysis и энергично инвертировать 4 - 6 раз. Инкубируйте lysate 5 мин при комнатной температуре.
- Нейтрализовать lysate с 10 мл охлажденного нейтрализации буфера. Смешайте нежно инвертирование трубы 4 - 6 раз и проинкубируйте втечение 20 мин на льду.
- Спин вниз на 13500 x г за 30 мин при 4 ° C. Незамедлительно перенесите супернатанта, содержащий плазмида ДНК к новой пробке.
- Повторите шаг 2.3.7 и незамедлительно передавать супернатанта, содержащий плазмида ДНК к новой пробке.
- Сбалансировать столбце путем применения 10 мл буфера уравновешивания и разрешить столбец пустой, самотечный поток.
- Добавить супернатант в столбце и позволить ему войти смолы самотечный поток.
- Промойте колонку с 2 x 30 мл отмывающего буфера.
- Элюировать ДНК с 15 мл буфера.
- Осадок ДНК с 10,5 мл-комнатной изопропанола eluted ДНК. Mix и спин вниз сразу на 15000 x г за 30 мин при температуре 4 ° C и осторожно декантируют супернатант.
- Помыть лепешка ДНК с 5 мл 70% этанола, центрифуги ДНК гранул на 15000 x g 10 мин и отбросить ясно супернатант.
- Повторите шаг 2.5.14 вдвое больше.
- Центрифуга Пелле ДНК на 15000 x g за 10 мин и осторожно декантируют супернатант не нарушая Пелле ДНК.
- Просушите Пелле за 5-10 мин и распустить ДНК в необходимый объем буфера (TE буфера, pH 8.0).
3 высокий титр sgRNA библиотека человека поколения
- Сотовый подготовка: HEK293T культуры клеток в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% (vol/vol) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% (vol/vol) пенициллин стрептомицином (Л.С.) антибиотик в колбах, T-25. Поместите их в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
- Пакет Лентивирусы: совместное transfect HEK293T клетки с 20 мкг очищенный библиотека векторов из шага 2, 15 мкг пакет плазмида (psPAX2) и 10 мкг конверт плазмида (pMD2.G) за 48 ч до уборки вирусов.
- Вирусной коллекции: после 48 ч, collectthe вирус супернатанта и фильтровать вирус супернатанта через 0.45 мкм низкопротеиновое привязки PVDF мембрану.
- Концентрация вируса: концентрат лентивирусные супернатант производится используя концентратор и тестовый вирус МВД на шаге 5.
- Вирус хранения: Алиготе концентрированного вирусов и хранить в холодильнике-80 ° С.
4. оптимизированный Puromycin концентрация
- Культура клеток лейкемии: Культура MOLM13 бод клетки в RPMI 1640 с 10% (vol/vol) плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 x антибиотики пенициллин стрептомицином (PS) в T-125 колбу. Поместите их в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
Примечание: Клетки обычно передаются каждые 4-5 d на Сплит соотношение 1:4 или 1:6, никогда не позволяя клеток для достижения более 70% confluency. - Настройка ячейки MOLM13 в 12-ну тарелку с плотностью 1,0 x 104 клеток/мл, в общем объеме 2 мл в колодец (2,0 х 104 клетки).
-
Время курс пробирного: лечить MOLM13 клетки с puromycin для 7 дней в повышении концентрации (0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл и 2,0 мкг/мл)
- Настройка MOLM13 клетки без лечения puromycin в день 0 и 3 реплицировать скважины без лечения puromycin как элемент управления от дня 0 для 7 день.
- Лечить MOLM13 клетки с 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл и 2,0 мкг/мл, отдельно, с каждого экспериментальные условия, содержащие 3 реплицировать скважин.
- Подсчитать соотношение живой клетки и сделать выживание кривой от дня 0 день 7, содержащий все условия.
- Кривая выживания: пятно клетки с Трипановый синий и количество жизнеспособности ежедневно для получения кривых выживания для каждого puromycin концентрации.
- Оптимизация puromycin минимальная концентрация: определить минимальный puromycin концентрацию через Трипановый синий окрашивания, в котором все MOLM13 клетки погибают между 5-7 дней.
5. титрование лентивирусные библиотеки в MOLM13 лейкозных клеток
- AML клетки подготовка: собрать клетки MOLM13 бод с трансдукции среднего (RPMI 1640, 10% FBS, Л.С. 1% и 8.0 среднего покрытие мкг/мл) при плотности 1,5 х 106 клеток/мл.
- Место MOLM13 клетки в 12-ну пластины с 1,5 х 106 клеток в каждой скважине.
- Оттепель человека: удалить сосредоточены человека из морозильной камеры-80 ° C и оттаивания на льду.
- Смесь MOLM13 клетки с различными дозы человека сконцентрированы в отдельных скважинах, включая 0, 1, 2.5, 5, 7,5 и 10 мкл (всего 6 групп).
- Немедленно центрифуга эти смеси на 1000 x g 2 h на 33 ° C и передать инкубатора при 37 ° C и 5% CO2 для 4 h 12-ну пластины.
- После 4 ч спина вниз инфицированных клеток на 400 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно аспирационная супернатант не нарушая ячейки Пелле и вновь приостановить transduced клетки с свежими СМИ (RPMI 1640, PS FBS и 1% 10%) и затем перенести их в T-25 колб и инкубировать при 37 ° C в течение 48 часов без puromycin.
- После 48 ч, разделить эти клетки на 2 фляги (2 группы): экспериментальная группа лечение с 1 мкг/мл puromycin на 5 дней и контрольной группы без лечения puromycin на 5 дней.
- Осуществлять выбор puromycin на 5 дней с 1 мкг/мл puromycin согласно шаг 4 до тех пор, пока все ячейки не преобразованы управления мертвы. Обмен на свежие СМИ каждые 2 дня.
- Измерьте значение оптимизированной MOI для трансдукции путем деления количества живых клеток, лечение с puromycin с количество клеток без puromycin лечения.
6. трансдукции библиотеки KO пуле ТРИФОСФАТЫ Cas9
- Трансдукция с человека: заразить 1,5 x 10-6 MOLM13 клеток с 0,3 MOI sgRNA объединили человека в среде (RPMI 1640, 10% FBS, Л.С. 1% и 8 мкг/мл покрытия средних) в 6-ну пластины и использовать клетки без инфекции человека как элемент управления.
- Немедленно центрифуга 6-ну пластины на 1000 x g 2 h на 33 ° C до spinfect клетки и передать пластины обратно в инкубатор при 37 ° C и 5% CO2 на 4 ч.
- Спин вниз инфицированных клеток на 400 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Аккуратно аспирационная супернатант не нарушая ячейки Пелле и вновь приостановить transduced клетки с свежими СМИ (RPMI 1640, 10% FBS и 1% PS) и затем перенести их в T-25 колб и инкубировать при 37 ° C в течение 48 часов без puromycin.
- После 48 ч лечить клетки с 1 мкг/мл puromycin на 5 дней. Обмен на свежие СМИ после 2 дней и держать на плотность оптимального клеток.
- Семян одного клона в 96-луночных пластины с предельной методы разрежения и инкубировать эти один клонов при 37 ° C и 5% CO2. Их культура для 3-4 недели.
- После того, как одна ячейка растет вверх в население, передача половина клеток в 24-ну пластины для дальнейшего культуры под puromycin выбор и проверить эти клоны в следующем шаге. Храните остальные клетки.
7. Скрининг пуле ТРИФОСФАТЫ Cas9 KO библиотеки с одношаговый RT-ПЦР
- Определите эффективность комплексных клон sgRNA, скрининг путем вычисления выражения гена маркер HOXA9 с один шаг транскриптазы полимеразной цепной реакции (Одношаговая RT-ПЦР).
Примечание: HOXA9 высоко выражаются в клетках MOLM13 бод в leukemogenesis22,23. - Фото sgRNA комплексного MOLM13 клеток и передачи 1 x 104 клетки на хорошо 96-луночных ПЦР-планшете.
- Центрифуга трубки на 1000 x g 5 минут и затем тщательно снимите и выбросьте супернатант с пипетки не нарушая Пелле ячейки.
- Вымыть клетки с 125 мкл буфера PBS и центрифуги трубки на 1000 x g за 5 мин. Затем удалите 120 мкл супернатанта, с помощью пипетки и удерживать приблизительно 5 мкл PBS в каждой скважине.
- 50 мкл смеси мастер лизис клеток содержащих 48 мкл буфера lysis клетки, 1 мкл раствора (10 мг/мл) протеиназы K и 1 мкл раствора DNase (1 мг/мл) для каждой скважины. А затем накапайте вверх и вниз 5 раз вновь приостановить Пелле ячейки.
- Инкубировать смесь для 10 мин при комнатной температуре, затем 5 минут при 37 ° C, а затем 75 ° C за 5 мин.
- Храните lysate клетки в морозильник-80 ° С.
- Подготовка одношаговый RT-ПЦР-реакции: оттепель одношаговый реакция смеси и другие реакции компонентов до 4 ° C. То спина вниз кратко собирать решения в нижней части трубы, и место на льду без света. Смешать и спина аккуратно.
- 1 мкл lysate клетки для ПЦР скважин с RT-ПЦР реакция смеси, в том числе 1 мкл вперед праймер Джин маркер (300 Нм) и обратить вспять грунтовка (300 Нм), 0,125 мкл обратной транскриптазы (10 U/мкл) и 5 мкл одношаговый реакция смеси (2 x).
- Печать скважин с оптически прозрачная пленка и аккуратно водоворот и смешивать компоненты реакции.
- Место пластину 96-луночных ПЦР в реальном масштабе времени PCR инструмента.
- Запустите реакция обратной транскрипции для 10 мин при 50 ° C, а затем инактивирование полимеразы и ДНК денатурации за 1 мин на 95 ° C.
- Выполнять ПЦР-с 40 циклов реакции PCR: денатурация 15 s на 95 ° C, отжиг/расширение и пластины флуоресценции, чтение для 20 s 60 ° C, а затем анализа кривой расплава на 65-95 ° C через 0,5 ° C с шагом в 2-5 s/шаг.
- Настройка upregulated, downregulated и без изменения групп согласно уровни выражения гена HOXA9 в сравнении к элементу управления, отдельно. Используйте гена β-актина как элемент управления гена уборки.
8. Проверка комплексной sgRNAs положительные клоны через генотипирования и Сэнгер последовательности
- Проверьте HOXA9 снизилась выражение клоны через Сэнгер секвенирования и выполнять ПЦР с 50-100 нг MOLM13 генома ДНК, 5 мкл полимеразной реакции буфера (10 x), 1 мкл вперед грунт (10 мкм) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) и 1 мкл обратный Грунтовки (10 мкм) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 мкл dNTP (10 мм), 1 единица полимеразы (5 U µл). Выполните реакции PCR с первоначального Денатурация при 94 ° C за 30 s, а затем более денатурации на 94 ° C для 20 s, отжиг на 56 ° C для 20 s, расширение на 68 ° C для 20 s (всего 30 циклов), окончательное расширение на 68 ° C в течение 10 мин , а затем проведение при 4 ° C.
- Извлечь и очистить продукты PCR (размер 285 bp) с комплектом очистки ПЦР.
- Перевязать очищенных продуктов ПЦР в T вектор с 2 мкл T4 лигирование буфера (10 x), 50 нг T вектор ДНК (50 нг/мкл), 25 нг очищенного ПЦР ДНК (285 bp), 1 мкл T4 лигаза (3 единицы/мкл) и место лигирование смешать в инкубаторе на 16 ° C на ночь.
- Передача смеси перевязка в компетентных клеток DH5α, растут на тарелку антибиотик агар ампициллин LB и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
- Выбрать один клоны от плиты LB и проверить их, Генотипирование и Сэнгер последовательности.
9. Обнаружение sgRNAs индуцированные мутации Indel от нуклеиназы пищеварение Assay
- Обнаружить интегрированный один клон sgRNA индуцированных пробирного тест нуклеиназы Indel ставки.
- Отдельно готовить ампликонов ПЦР с 50-100 нг Indel мутант (тест) и одичал тип (WT, ссылка) ДНК как шаблон ПЦР, 5 мкл полимеразной реакции буфера (10 x), 1 мкл dNTP (10 мм), 1 единица полимеразы (5 U/мкл), 1 мкл вперед грунтовка (10 мкм) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') и 1 мкг L отменить грунтовка (10 мкм) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). Реакции PCR была выполнена с первоначальных Денатурация при 98 ° C за 30 сек, а затем денатурации 98 ° с в течение 20 сек, отжиг на 56 ° C для 20 s, расширение на 72 ° C для 30 s (всего 30 циклов), а окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин и проведение при 4 ° C.
- Гетеродуплексного смесь группу с 200 нг «ссылку» (20 нг/мкл) и 200 нг «тест» (20 нг/мкл) ПЦР ампликонов в 0.2 мл ПЦР-пробирку, homoduplex смесь группы и с только 400 нг «ссылку» ПЦР ампликонов как элемент управления.
- Отдельно Инкубируйте смесь гетеродуплексного и homoduplex на 95 ° C за 5 минут в 1 Л стакан наполнен 800 мл воды и затем остыть постепенно до комнатной температуры отжига и образуют гетеродуплексного или homoduplexes.
- Отдельно дайджест 400 нг отожженная смеси гетеродуплексного и homoduplex с 1 мкл indel мутации обнаружения нуклеиназы (2,5 U/мкл) и 2 мкл нуклеиназы реакции буфера (10 x) при 42 ° C 60 мин.
- Анализировать переваривается образцы с геля агарозы, гетеродуплексного ДНК смесь следует разрезать на небольшие фрагменты (70-250 bp) и homoduplex ДНК (320 bp) не должны быть сокращены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технология является мощным исследовательского инструмента для функциональных геномных исследований. Он быстро заменить обычные генов, изменения методов и имеет высокую полезность для генома широкий и отдельных приложений, ориентированных на ген. Здесь, первый индивидуально клонированных конкретных локусов ТРИФОСФАТЫ-Cas9-одетые sgRNA библиотека содержит 1070 sgRNAs, состоящий из sgRNAs ориентации 303 случайные ориентации генов, 60 позитивные элементы, 500 человека ненацеливания контроля и 207 CTCF элементы или lncRNA ориентация генов в четырех HOX локусов (рис. 1, Таблица 1). Эта библиотека ориентирована на все CTCF ядро привязки мотивы, HOX Джин связанный lncRNAs, известный как позитивные элементы в локусах HOX регуляторных элементов и несколько Гомеозисных генов. Она также содержит sgRNAs, ориентированные на случайные номера -Гомеозисных генов, без человеческих генов и intergenic регионах как негативный контроль. Для повышения эффективности и специфика CTCF сайт нокаут-(KO) к трансдукции lentiCRISPR, каждое определение сайта содержит 5-10 sgRNAs (Таблица 1). В протоколе, описанные здесь sgRNA библиотек конструированы согласно сайтов связывания CTCF на HOXA/B/C/D локусов и lncRNAs в этих локусов, которая базируется на широкой институт sgRNA инструменты (рис. 1, рис. 2). После трансдукции в низкой кратности инфекции с мои 0,3 в MOLM13 клетки, несущие MLL-AF9 fusion показатель инфицирования составляет менее чем одну sgRNA/клетки, следуют puromycin выбор, а затем были устойчивы клоны, выросло с семенами одну ячейку проверяются на обесценение экспрессии генов HOXA9 .
Процесс отбора библиотека sgRNA была кратко описал (рис. 3). Во-первых вирус библиотеки содержащие sgRNA были созданы в HEK293T клеток с помощью двух векторов (psPAX2 и pMD2.G). Библиотека lentiviruses sgRNA пула были сосредоточены и преобразованы в MOLM13 бод клетки с polybrane (8.0 мкг/мл). После 48 ч трансдукции клетки были относиться с оптимальной концентрации puromycin. После 5 дней клетки были посеяны одной ячейки/скважины в 96-луночных пластины и один клоны были получены в присутствии puromycin. Наконец, один клоны sgRNA интегрированы в геном были определены одношаговый RT-PCR, Сэнгер последовательности и Indel мутации обнаружения (рис. 3). Puromycin устойчивостью одного клоны определяются через капли одношаговый цифровой RT-ПЦР (RT-ddqPCR) согласно изменяя выражение онкогена HOXA9 (рис. 4). Генотипирование и последовательности Сэнгер были исполнены на строительство библиотеки sgRNA и проверки (рис. 2, рис. 4).
sgRNA против MOLM13, позитивные клонов в пластине ПЦР 96-луночных далее были подтверждены с методом RT-ПЦР, основанный науровни выражения HOXA9 генов через сравнение с ячейками элемента управления. Из сохранившихся клонов 528 скрининг, 10 клонов выставлены более 50% снижение уровня HOXA9 (Рисунок 4A). sgRNAs интегрированы в HOXA9-уменьшена, HOXA9-без изменений и HOXA9-увеличение клоны были далее подтверждены амплификации PCR sgRNA последовательностей с использованием фланкируя вектор грунтовки. Чистые продукты PCR были лигируют в систему вектор T через T4 лигаза и разосланы для идентификации Сэнгер последовательности (см. шаг 8). Последовательность данных отметил, что из 30 клоны виртуализации, 21 клоны включают один sgRNA (Таблица 2). Категории sgRNA были определены и проанализированы в соответствии с уровнями выражение HOXA9 . Шесть из десяти клонов, сокращения показателей в HOXA9 уровни содержится sgRNAs ориентация на сайте CBS7/9, но не в не человеческим гены, случайных человеческих генов и другие элементы сайта CTCF (рис. 4 и Таблица 2).
sgRNA интегрированный положительное, что один клон индуцированной мутации Indel определяются на основе ПЦР генотипирования и нуклеиназы пищеварение, основанный на нуклеиназы assay (рис. 5). Assay нуклеиназы пищеварение было выполнено для выявления Indel мутации произошло в границы CBS7/9, представитель HOXA9-сокращение, HOXA9-без изменений, и HOXA9 -повышение клонов. Результаты показали, что мутация CBS7/9 была обнаружена в 4 из 6 HOXA9-сокращение клонов: клоны #5, 6, 28 и 121, но не в клонов #15 и #31 (рис. 5). Однако, клон #15 содержится таргетинга сайта lncRNA HOTTIP , , в то время как клон #31 содержится несколько sgRNAs, HOAIRM1 lncRNA, HOTAIR lncRNA и HOXD9/10 CTCF привязки сайта sgRNA (цифры 4B, 5 и Таблица 2).
Рисунок 1 : Схематическая диаграмма, показывающая сайтов связывания CTCF и lncRNAs в четырех Гомеозисные генных локусов. Каждый элемент нацеленности ДНК содержит 5-10 различных sgRNAs. CTCF чип seq набор данных был загружен с GEO (GSM1335528) и визуализированы с интегрированной геномной просмотра (IGV). SgRNA определение CTCF сайтов в Гомеозисных локусов были названы оранжевый ножницами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема, представляющая часть интеграции sgRNA вектор последовательности и праймеры PCR амплификация. Праймеры PCR амплификация были разработаны согласно пустой последовательности лентивирусные вектора sgRNA. Вперед грунтовка (P1) была выделена желтым цветом, обратный грунтовка (P2) была выделена красным, и sgRNA был выделен зеленым цветом в лентивирусные вектора sgRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Схема, представляющая рабочий процесс для sgRNAs Библиотека проектирования, строительства и контроля. Этот рабочий процесс заключается в следующем. Во-первых библиотека sgRNA был разработан и клонирования в лентивирусные ТРИФОСФАТЫ вектор, и затем человека была упакована с sgRNA библиотека лентивирусные вектор, psPAX2 и pMD2.G векторов в HEK293T клетках. Далее MOLM13 клетки были инфицированы вирусом низкой MOI (0,3), и эти клетки прошли puromycin выбор. Затем один клон был посеян в 96-луночных пластине. Наконец sgRNA одного клоны, интегрирована в геном были определены одношаговый RT-ПЦР, Сэнгер последовательности и Indel мутации обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Обобщённые ТРИФОСФАТЫ-Cas9 KO библиотека скрининг отождествляется с одношаговый RT-ПЦР и Сэнгер последовательности. (A) один шаг RT-капелька цифровой PCR скрининг HOXA9 выражение в одном клоны, инфицированных человека, содержащий библиотеку sgRNA. Скрининг 528 sgRNA библиотека инфицированных клонов для HOXA9 выражение уровней показано (528 точек). Десять из 528 клоны выставлены более 50% сокращение в HOXA9 уровни (фиолетовые стрелки). Красная линия обозначает границы 2 раза снижение изменения, сравнивая с ячейками элемента управления; синяя линия обозначает границу в 2 раза увеличить изменения. (B) шесть клоны #5, 6, 28, 121, 207 и 420 были объектом конкретных sgRNA CBS7/9 через последовательность Сангер (зеленые стрелки). (C) анализ RT-ddqPCR HOXA9 уровни в WT MOLM13 и 21 клоны содержащих единый целевой sgRNA. HOXA9 выражение данные были разбиты на пять групп в соответствии с категориями sgRNA последовательностей: сайт CTCF HOXA7/9 , не человеческого цели, другие сайты CTCF в Гомеозисных локусов, HOX связанные lncRNAs, и другие человеческие цели. Эта цифра была изменена Luo et al.12. По статистике эти данные была представлена как среднее ± SD от трех независимых экспериментов с t тест Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Indel мутации комплексной sgRNAs положительные клона подтвердил с ПЦР генотипирования и нуклеиназы assay. (A) Геномной ДНК был изолирован от представителя ТРИФОСФАТЫ-Cas9 KO библиотека экранированный клоны, которые выставлены сокращается, неизменным или увеличение уровня выражения HOXA9 . Гетерозиготных удаление сайта CTCF, расположенный между HOXA7 и HOXA9 генов (CBS7/9 границы) был определен на основе ПЦР генотипирования. HOXA9-снижение удаления клоны #5, 6, 28 и 121 выставлены в расположение границ CBS7/9 (черные стрелки). (B) Indel мутации на сайте CBS7/9 были проанализированы нуклеиназы пищеварение assay от представителя клонов которые выставлены сокращены (красная линия), без изменений (синяя линия), или увеличить уровни выражения HOXA9 (фиолетовая линия). HOXA9-снижение клоны #5, 6, 28 и 121 выставлены мутации в расположение границ CBS7/9 (оранжевые стрелки). Эта цифра была изменена Luo et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: sgRNAs объединить сведения библиотеки. Эти данные являются Luo et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Сэнгер секвенирование результаты представлены в выбранной sgRNAs HOXA9 -уменьшилось, HOXA9 -без изменений, и HOXA9 -увеличение клонов. HOXA9-снижение, неизменным и увеличение клоны в красный, синий и фиолетовый, выделяются отдельно. Эти данные являются Luo et al.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Белок кодирование гена, связанные с sgRNA библиотеки были применены в системе функциональной скрининг для выявления генов и сетей регулирования конкретных клеточных функций через sgRNA обогащения24,25,26 ,27,28. Несколько некодирующих региона, относящиеся sgRNA библиотеки были также показаны в ген специфического функциональных экранов дистальных и проксимальной регулирующих элементов, включая BCL11A, Tdgf1a и лекарственной устойчивости регулирования генов28, 29,30. Эти sgRNA библиотеки созданные подробный биоинформатики дизайн, Синтез олигонуклеотида и югу клонирование олигонуклеотида бассейн(ы) в векторы. Скрининг всего генома широкий подход является очень мощным и полезным, но требует вычислительных опыт для всей генома sgRNA дизайн и последовательное финансирование для дорогих синтеза; Таким образом она по-прежнему сложным для большинства лабораторий. Однако наша библиотека конкретных локусов sgRNA скрининг подход является удобным и эффективным для идентификации конкретного элемента ДНК как сайт связывания CTCF, участвующих в организации хроматина и регуляцию (рис. 1 и Рисунок 2). По ориентации CTCF границ, мы применили одношаговый RT-PCR для оценки целевых sgRNA клоны согласно уровень экспрессии гена конкретных маркер, HOXA9. Кроме того, мы провели Сэнгер последовательности для подтверждения этих положительных комплексной sgRNAs клонов (рис. 2 и рис. 4). Функционально подтвердить, что эти позитивные sgRNAs целевых клоны, мы провели на основе ПЦР генотипирования и мутация обнаружения проба для того, чтобы определить, является ли sgRNA индуцирует целевого сайта вставки или удаления мутации (рис. 5). Это дает нам перспективным методом для целевых конкретных элементов-кодирования ДНК и оценить свои биологические функции в mammalian клетках.
В нашем протокол, мы упомянули, что конкретные олигонуклеотида дизайн обеспечит более эффективный югу клонирования в lentiCRIPSRV2 векторов и более надежно создавать точные sgRNA библиотека (шаги 1 – 2). Для того, чтобы получить высокий титр sgRNA библиотека человека, лентивирусные супернатант следует сосредоточить 50-fold используя концентратор после протокол (шаг 3) и хранить в морозильной камере-80 ° C в нескольких аликвоты (шаги 3.1-3.5). Дополнительную озабоченность находит оптимальное значение MOI для трансдукции. Если МВД является слишком низким, количество зараженных клеток будет уменьшить и привести к sgRNA скрининг провал. Если МВД слишком высок, он будет включать более одного sgRNA в одну ячейку, и он будет вмешиваться с библиотекой sgRNA скрининг через одношаговый RT-PCR и Indel мутации обнаружения. Таким образом перед скрининг, нахождение оптимального MOI для каждой группы клеток путем титрования лентивирусные библиотеки является важным шагом. Титрование лентивирусные библиотеки в MOLM13 лейкозных клеток и оценки МВД будет осуществляться в протоколе (шаги 5.1-5.10). Кроме того тщательное лизировать клетки для обратной транскрипции может обеспечить успешное одношаговый RT-PCR. Это можно сделать, увеличив время инкубации для лизиса на всех стадиях температура в протоколе (шаги 7,5 – 7,6). Таким образом для повышения эффективной для скрининга пуле ТРИФОСФАТЫ-Cas9 KO библиотеки, тщательное клеток лизис и обратная транскрипция играют важную роль в определении одношаговый RT-ПЦР (шаги 7,1-7.14). Кроме того повышение качества продуктов ПЦР может обеспечить успешное indel мутации обнаружения, потому что продукты PCR низкого качества будут влиять на процесс формирования гетеродуплексного/homoduplex (шаги 9.1-.6).
Кроме того этот метод может использоваться для определения роли CTCF Гомеозисных генов регулирования в начале эмбрионального развития и некоторые лейкемии с аномальным Гомеозисных генов подписью. Например HOX гены играют решающую роль в ходе эмбрионального развития и все четыре группы HOX Генс ограничены височно и пространственно, их выражение структуры в эмбриональном развитии. Кроме того NPM1 мутации являются среди наиболее распространенных генетических аномалий в борьбе с отмыванием денег и приходится 30% больных бод с нормальный кариотип цитогенетических31. Это подмножество ОМЛ экспонатов ненормальное HOXA и HOXB гена подпись, которая становится доминирующим механизм лейкозных преобразования17. Важно, чтобы выяснить, как Гомеозисные гены, регулируются в нормальное развитие и dysregulated во время leukemogenesis. Мы и другие показали, что CTCF играет важную роль в Организации и Джин транскрипции хроматина в Гомеозисных локусов9,12. Таким образом HOX локусов сосредоточены sgRNA библиотека скрининг обеспечивает удобный способ втянуть конкретные функции привязки сайта CTCF в регуляции генов HOX во время разработки и кроветворная злокачественных. Однако ограничение подхода является трудность нахождения полезным маркером для высокопроизводительного секвенирования следующего поколения. Одна из целей будущих исследований будет найти маркер весьма избирательно и проведения следующего поколения секвенирования генома широкий для того, чтобы увидеть эффекты маркера. Таким образом с помощью конкретных флуоресцентные маркер тегами ген, как отслеживание репортером в будущем станет одним из важнейших инструментов планы исследований.
Улушители играть множество крайне важную роль в регуляции функции и генной экспрессии промоутер. Однако он также может активировать промоутер активность издалека независимым образом позиции и ориентации, и усилители часто регулируют экспрессии генов в транс ориентации. Таким образом это сложно определить enhancer(s) для конкретных генов, особенно в постгеномной эре. Традиционные репортер анализов и корреляционные функционального анализа (например, иммунопреципитации chromatin и DNaseI гиперчувствительные анализов) использовались для изучения усилитель функция32,33. Аналогичным образом небольших масштабных ориентированных Локус показы были также применяется для изучения деятельности проксимальных и дистальных нормативных элементов для специфических генов34. Недавно объединенные sgRNA-KO Библиотека, ориентированном некодирующих регуляторных элементов в Гомеозисных генов локусов успешно стратегия сайт связывания CTCF, расположенный между HOXA7 и HOXA9 генов, а также HOTTIP lncRNA Это имеет решающее значение для управления задняя HOXA хроматина домена организации, которая диски внематочная HOXA экспрессии генов в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)12. Эти исследования продемонстрировали, что скрининг библиотека объединения sgRNA-KO является также мощным генетики подход к выявлению и оценке биологической функции некодирующих элементов в нашем геноме на месте.
CTCF, как изолятор белка хроматина, играет важную роль в Организации генома, определяя хроматина районы для картин выражения определенного гена в конкретной ячейке тип11,35. Изменения структуры топологически связанного домена (TAD) изменяет усилитель/промоутер взаимодействий, что приводит к больной государства5,11. CTCF высоко сохраняется в многоклеточные и обогащается на границах TAD. Однако остается неясным, ли и как CTCF способствует сохранению структуры хроматина границы и формирования TAD. Хотя пула CTCF sgRNA нокаут библиотека скрининга было сосредоточено на четырех HOX локусов, она оказалась мощным методом для выявления и вскрыть CTCF границ, и определить TAD домена, а также усилитель/промоутер взаимодействия и транскрипции в рамках TAD домена12. Кроме того этот метод может эффективно применяться для выявления lncRNA элементы и факторы транскрипции, которые посредником хроматина конформации и доступность активности в Гомеозисных локусов. Мы также пытаемся исследовать ТРИФОСФАТЫ/sgRNA библиотеки, содержащей генома всей CTCF сайты через следующего поколения последовательность идентификации согласно CTCF чип seq и Чиа-PET данных в будущих исследований. Таким образом эта стратегия может быть продлен на всей хромосомы или даже весь геном.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.
Acknowledgments
Авторы также поблагодарить Николая Cesari для редактирования рукопись. Работа была поддержана субсидии от национального института здравоохранения (с.х., R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
- Phillips, J. E., Corces, V. G.
- Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
- Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
- Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
- Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
- Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
- Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
- Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
- Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
- Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
- Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
- Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
- Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
- Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
- Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
- Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
- Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
- Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Rajagopal, N., et al.
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
- Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
- Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
- Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
