Summary
CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.
Abstract
CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF)-aracılı istikrarlı topolojik etki alanlarını ilişkilendirme (TADs) oynamak önemli bir rol TADs komşu bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri. CTCF embriyonik geliştirme, vücut desenlendirme, hematopoiesis ve leukemogenesis kontrol HOX genleri kayma ve zamansal ifade düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Ancak, olup olmadığını ve nasıl Kromatin organizasyon ve HOX gen ekspresyonu HOX ilişkili loci CTCF sınırları düzenleyen büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Geçerli protokol TAD oluşumu ve HOX gen CTCF ilişkili Kromatin sınırlarına engellemeden etkilerini incelemek için tüm CTCF bağlama HOXA/B/C/D loci Siteler'de hedefleme belirli sgRNA havuza alınan Kütüphane oluşturuldu ifade. CRISPR-Cas9 ile genetik tarama, HOXA7/HOXA9 genler (CBS7/9) arasında bulunan CTCF bağlama sitesinde kritik bir regülatör oncogenic Kromatin etki alanı, hem de Ektopik HOX gen korumak için önemli olarak belirlenmiştir MLL yeniden düzenlenmiş Akut Miyeloid Lösemi (AML) ifade desenleri. Böylece, bu sgRNA Kütüphane yaklaşım eleme içinde belirli bir gen loci aracılı CTCF genom örgüt yeni anlayışlar sağlar ve aynı zamanda her iki kodlama metin notlu genetik düzenleyici elemanlarının fonksiyonel karakterizasyonu için bir temel sağlar ve kodlamayan, sonrası İnsan Genom Projesi dönemde normal biyolojik süreçler sırasında.
Introduction
Son genom etkileşim çalışmaları insan nükleer genom formları hücre tipleri ve türler arasında korunmuş topolojik ilişkilendirirken etki (TADs) kararlı saptandı. Ayrı etki alanları içine genom organizasyonu kolaylaştırır ve düzenleyici elemanlarının (örneğin, arttırıcılar ve rehberleri) arasındaki etkileşimler kısıtlar. CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF) TAD sınırları bağlar ve komşu TADs1içinde bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri kritik bir rol oynar. Ancak, her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler'de etkileşim, bu kez bir hücre tipi ama diğer telkin içinde belirli bir sitenin bir Kromatin bariyer olarak çalışmasını genom geniş CTCF veri bağlama ortaya o CTCF işlevleri Kromatin sınırları2oluşumunda diğer faaliyetleri ile birlikte. Ne bilinmemektedir olsun sınır elemanları (CTCF-bağlayıcı siteleri) doğrudan CTCF biyolojik işleve bağlı olan ve nasıl bu bağlantıları ortaya olduğunu. Bu nedenle, belirli CTCF bağlayıcı siteleri genom içinde doğrudan TADs oluşumunu düzenleyen ve organizatörü/artırıcı etkileşimleri bu etki alanlarında veya komşu etki alanları arasında denetlemek öngörmekteyiz. İnsan ve fare genom sıralama projeleri ve sonraki epigenetik analizleri, genom kopyası yeni moleküler ve genetik imzaları ortaya çıkardı. Ancak, belirli imzaları/değişiklikler gen düzenlemesi ve hücresel işlev, hem de onların moleküler mechanism(s) rolü var. henüz tam olarak anlaşılması
CTCF-aracılı TADs fonksiyonel Kromatin etki alanları3,4,5temsil kanıt birden çok satırı destekler. Her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler'de etkileşim, genom geniş CTCF ChIP-seq veri CTCF bir Kromatin engel bir hücre tipi ama diğer2kez görür saptandı. CTCF genom organizasyonu4,6,7arabuluculuk tarafından geliştirme aşamasında önemli bir rol oynar. CTCF sınırları bozulma engelliler artırıcı/organizatörü etkileşimleri ve gelişimsel tıkanıklık için önde gelen Gen ekspresyonu. Bu CTCF TADs aracılı öneriyor sadece yapısal bileşenleri, aynı zamanda uygun artırıcı eylem ve gen transkripsiyonu5,8,9için gerekli yasal birimleri vardır.
HOX genleri embriyonik gelişim sırasında kritik rol oynarlar ve onlar onların ifade desenleri geçici ve dağınık şekilde kısıtlanır. HOXA locus hESCs ve IMR90 hücreleri1bir sınır CTCF ilişkili öğe anterior ve posteiror genler ayıran iki kararlı TADs oluşturur. Son raporlar gösterdi HoxBlinc, bir HoxB ilişkili locus lncRNA CTCF oluşumu aracılık eder TADs ve HOXB odağı etkileşimlerde artırıcı/organizatörü yönetti. Bu ön HOXB gen etkinleştirme sırasında ESC bağlılık ve farklılaşma10yol açar. Ayrıca, belirli bir gen loci HOXA odağı da dahil olmak üzere, CTCF İLETİMLERİNİZE TAD değişti etki alanları lineage belirli bir gen ifade profilleri aracılı ve hastalık Birleşik11,12gelişimi ile ilişkili. Kanıt CTCF gen transkripsiyonu koordine ve işlevsel etki alanlarına genom organize ederek hücre kimliğini belirlemek için birincil işlevini destekler.
Embriyonik gelişim sırasında hematopoiesis, rolü rağmen hematopoetik kök ve progenitör hücre (HS/PC) işlevi HOX genleri düzenler. Bu10,13,14,15yayılması ve farklılaşma arasındaki dengeyi kontrol ederek yapılır. Ifade HOX genleri sıkıca belirtimi ve hematopoetik hücrelerin en yüksek HS ifadede farklılaşma boyunca düzenlenir / PCs. HOX gen ekspresyonu yavaş yavaş azalır, en düşük fiyat seviyeleri ile olgunlaşma sırasında gerçekleşen hematopoetik hücrelerin16farklı. HOX gen bozukluk HS/PC'lerin lösemik dönüştürme17,-18önde gelen dysregulating kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerine göre lösemik dönüşümünün baskın bir mekanizmadır. Ancak, kurulması ve normal oncogenic ifade desenleri HOX genleri hem de ilişkili düzenleyici ağları vs koruma mekanizması belirsizdir.
CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane tarama protein kodlayıcı genlerin19 lncRNA20 ve miRNA21 farklı türler gibi de kadar kodlamayan genler olarak sorguya çekmek için yaygın olarak kullanılmış. Ancak, yüksek üretilen iş genom sıralama sgRNA Kütüphane tarama doğrulamak için sık sık uygulandığından CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane yeni genomik hedefler belirlemek için maliyeti yüksek, kalır. Bizim sgRNA eleme sistemi belirli genom loci üzerinde odaklanmıştır ve hedefleme sgRNAs aracılığıyla tek adımlı RT-PCR marker gen ekspresyonu HOXA9gibi göre değerlendirir. Ayrıca, sıralama sgRNA genom ve Indel mutasyonlar entegre edildi doğruladı Sanger site hedefleme sgRNA tanımlamak için tespit edilebilir. Loci özgü CRISPR Cas9 genetik tarama yoluyla, CBS7/9 Kromatin sınır oncogenic Kromatin etki alanı oluşturmaktan ve bakımını yapmaktan Ektopik HOX gen ifade desenleri AML patogenezinde önemli bir düzenleyici olarak belirlenmiştir 12. yöntemi gelecekteki epigenetik terapi için potansiyel terapötik hedef olarak embriyonik geliştirme, hematopoiesis, leukemogenesis, aynı zamanda CTCF sınır CTCF sınır sadece belirli işlevini tanımlamak için yaygın olarak uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. CTCF sgRNALibrary Online bir araç kullanarak tasarım
- CTCF bağlayıcı siteleri içinde genetik pertürbasyon platformu (GPP) tasarımcı araç (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) kullanarak insan HOX loci hedefleme sgRNA tasarım.
- 1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA genler (şekil 1, Tablo 1) Hedefleme hedefleme sgRNAs oluşan toplam sentez. Her hedefleme DNA öğe 5-10 farklı sgRNAs tarafından hedeflenmektedir.
2. sgRNA Kütüphane klonlama
-
Sentezlenmiş oligonucleotides CRISPR lentiviral omurga vektör (lentiCRISPRv2) kopyalayın.
- 2 h 37 ° C'de BsmBI restriksiyon enzimi ile LentiCRISPRv2 vektör sindirmek.
- Daha büyük bant varlığı için bak (yaklaşık 12,873 bp) jel BsmBI sindirim sonra Tarih ve sonra jel ekstraksiyon kiti ile arındırmak.
Not: 2 kb küçük dolgu parça aynı zamanda sindirim sonra üzerinde jel var, ancak bu göz ardı edilmemelidir. - Sentezlenmiş oligonucleotides ligate ve LentiCRISPR vektör 150 ile sindirilmiş ng, LentiCRISPR DNA, 10 µM oligos, 10 x T4 ligaz arabelleğinin 2 µL, T4 ligaz, 1 µL 1 µL sindirmek ve sonra onları gecede 16 ° C'de kuluçkaya.
-
Lentiviral CRISPR/sgRNA Kütüphane amplifikasyon için elektro-yetkili hücreleri dönüştürme.
- Electroporator 1.8 hazırlamak kV, 200 Ω ve 25 µF. Daha sonra kurtarma SOC kitle 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak ve LB Ampisilin antibiyotik plakaları 37 ° C'de önceden ısıtmak
- Buz 10 min için yetkili hücrelerdeyse çözülme.
- 1.5 mL mikro-santrifüj tüpleri ve 1 mm elektroporasyon cuvettes buzda hazırlayın.
- 25 µL 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü yetkili hücrelerinin içine 10 ng/µL Kütüphane plazmid DNA 1 µL mix ve karışımı yavaşça el ile bir kaç kez tüp alt flicking tarafından.
- Küvet yeterince soğuk olduğunda, DNA/yetkili cep karışımı için transfer. İki kez tezgah dokunun ve herhangi bir su damlacıkları küvet kağıt mendil ile dış üzerinden silin. O zaman küvet elektroporasyon modülünde yer ve nabız tuşuna basın.
- Hemen 975 µL 37 ° C Önceden ısıtılmış SOC medya ekleyin. Karıştırmak yanında yukarı ve aşağı pipetting ve 15 mL tüp aktarmak.
- Döndür ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- 100 µL hücreleri SOC kitle 900 µL sulandırmak ve 100 µL LB Ampisilin antibiyotik agar tabağa yerleştirin. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
-
Plazmid DNA ayrıntılı olarak üreticinin iletişim kuralı bir maxi-prep sütun kullanarak Birleşik kolonilerden ayıklayın.
- LB agar plaka tüm kolonileri scrape ve 2 mL LB Ampisilin antibiyotik orta starter kültürü aşılamak ve gecede 37 ° C'de dinç (~ 200 x g) sallayarak ile kuluçkaya.
- Starter kültür 1:500 LB Ampisilin orta 100 mL seyreltik ve 12-16 dinç (~ 200 x g) sallayarak ile h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Santrifüjü 6.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından bakteri hücre Pelet hasat
- Bakteriyel Pelet 10 mL süspansiyon arabellek yeniden askıya alma.
- Lizis arabellek 10 mL ile askıya alınmış Pelet parçalayıcı ve şiddetle ters 4 - 6 kez. Lysate oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Lysate 10 mL soğuk nötralizasyon arabellek ile etkisiz hale getirin. Yavaşça tüpler 4 - 6 kez ters çevirme tarafından mix ve buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya.
- Spin aşağı 13.500 x g 4 ° C'de 30 dk de Derhal yeni bir tüp plazmid DNA içeren süpernatant aktarın.
- 2.3.7. adımı yineleyin ve hemen yeni bir tüp plazmid DNA içeren süpernatant aktarmak.
- Denge arabellek 10 mL uygulayarak sütun equilibrate ve boş sütuna tarafından yerçekimi akışını sağlar.
- Süpernatant sütununu ekleyin ve reçine yerçekimi akış tarafından girmek izin.
- Sütun 2 x 30 mL, arabellek yıkama ile yıkayın.
- DNA elüsyon arabellek 15 mL ile elute.
- 10.5 mL oda sıcaklığında isopropanol eluted DNA ile DNA çökelti. Mix ve spin hemen 15.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de aşağı ve yavaşça süpernatant dikkatle boşaltmak.
- DNA Pelet 5 mL % 70 etanol, santrifüj DNA Pelet 10 dak için 15.000 x g de de ile yıkayın ve açık süpernatant atın.
- 2.5.14 iki kez daha tekrarlayın.
- 15.000 x g 10 dk de DNA Pelet santrifüj kapasitesi ve yavaşça süpernatant DNA Pelet rahatsız etmeden dikkatle boşaltmak.
- 5-10dk için Pelet kuruması ve DNA arabelleği (TE tampon, pH 8.0) gerekli bir hacim içinde çözülür.
3. yüksek titresi sgRNA Kütüphane Lentivirus üretimi
- Hücre hazırlık: Kültür HEK293T hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 (vol/vol) fetal sığır serum (FBS) ve T-25 şişeler %1 (vol/vol) penisilin-streptomisin (PS) antibiyotik ile takıma DMEM). Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2yer onları.
- Lentivirus paket: co transfect HEK293T hücreleri ile arıtılmış Kütüphane vektörlerin adım 2, 15 µg paket plazmid (psPAX2) ve belgili tanımlık virüs hasat önce 48 h (pMD2.G) zarf plazmid 10 µg 20 µg.
- Virüs koleksiyonu: sonra 48 s, collectthe virüs süpernatant ve virüs 0,45 µm düşük protein bağlayıcı PVDF membran süpernatant filtre.
- Virüs konsantrasyon: 50-fold dar kurutma başlığını kullanarak lentiviral süpernatant konsantre ve adım 5'te virüs MOI test.
- Virüs depolama: Aliquot konsantre virüs ve-80 ° C dondurucu deposunda.
4. en iyi duruma getirilmiş puromisindir konsantrasyonu
- Lösemi hücre kültürü: Kültür MOLM13 AML hücrelerinde RPMI % 10 (vol/vol) fetal sığır serum (FBS) ve 1 x T-125 şişe penisilin-streptomisin (PS) antibiyotik ile takıma 1640. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2yer onları.
Not: Hücreleri genellikle bir bölme oranı 1:4 ya da 1:6, asla hücreleri ulaşmak izin daha fazla % 70 confluency, her 4-5 d geçirilir. - MOLM13 hücreleri bir 12-şey plaka 1.0 x 104 hücre/mL, bir şey (2.0 x 104 hücreleri) başına 2 mL hacmi, yoğunluğu ile ayarlayın.
-
Zamanlı Kurs tahlil: puromisindir artan konsantrasyonları (0.1 µg/mL, 0.2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL ve 2.0 µg/mL) 7 gün için hücrelerle tedavi MOLM13
- MOLM13 hücreler puromisindir tedavi gün 0 olmadan ve puromisindir tedavi olarak bir denetim olmadan 3 Çoğalt wells 0 günden 7 gün ayarlayın.
- MOLM13 hücreleri 0.1 µg/mL, 0.2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL ve 2.0 µg/mL, ayrı ayrı, 3 Çoğalt wells içeren her deneysel koşulu ile tedavi.
- Canlı hücre oranı saymak ve gün 0 gün 7 tüm koşulları içeren bir hayatta kalma eğrisine olun.
- Sağkalım eğrisi: leke hücreleri ile her puromisindir konsantrasyon için hayatta kalma eğrileri elde etmek için Trypan mavi ve sayısı canlılığı günlük.
- En az puromisindir konsantrasyonu en iyi duruma getirme: hangi tüm MOLM13 hücresi öldürdün 5-7 gün arasında Trypan mavi boyama, üzerinden en az puromisindir konsantrasyonu belirlemek.
5. titrasyon MOLM13 lösemi hücreleri Lentiviral Kütüphanesi
- AML hücreleri hazırlık: toplamak MOLM13 AML hücreleri iletim orta ile (RPMI 1640, %10 FBS, % 1 PS ve 8.0 µg/mL kaplama orta) 1.5 x 10 bir yoğunluk6 /mL hücreler.
- MOLM13 hücreleri 1.5 x 106 hücrelerde her şey ile 12-şey plaka yerleştirin.
- Lentivirus çözülme: Konsantre lentivirus-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve buz çözme.
- Mix MOLM13 hücreleri konsantre lentivirus ayrı Wells, 0, 1, 2.5, 5, da dahil olmak üzere farklı bir doz 7.5 ve 10 µL (Toplam 6 grup).
- Hemen bu karışımları 1000 x g 33 ° c 2 h için de santrifüj kapasitesi ve 12-şey plakaları 37 ° C ve %5 CO2 kuluçka makinesi 4 h için geri aktarmak.
- 4 h sonra spin 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de enfekte hücreleri aşağı.
- Yavaşça hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin ve taze medya (RPMI 1640, % 10 FBS ve % 1 PS), transduced hücrelerle yeniden askıya alma ve sonra onları T-25 Şişeler için aktarmak ve puromisindir olmadan 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- 48 saat sonra 2 Şişeler (2 grup) bu hücreleri bölme: 1 µg/mL puromisindir ile 5 gün boyunca tedavi bir deney grubu ve kontrol grubu 5 gün puromisindir tedavi olmadan.
- Sigara transduced kontrol hücreleri ölene puromisindir seçimi 1 µg/mL puromisindir göre adım 4 ile 5 gün yerine getirir. Taze medya 2 günde karşılığında.
- İletim için en iyi duruma getirilmiş MOI değer ile puromisindir puromisindir tedavi olmadan hücre sayısı ile tedavi canlı hücre sayısı bölerek ölçmek.
6. iletim havuza alınan CRISPR-Cas9 KO Kütüphanesi
- İletim lentivirus ile: 1.5 x 106 MOLM13 hücreleri havuza alınmış sgRNA lentivirus ortamda 0.3 MOI ile enfekte (RPMI 1640, %10 FBS, % 1 PS ve 8 µg/mL kaplama orta) 6-şey plaka ve hücreleri lentivirus enfeksiyonu olmadan bir denetimi olarak kullanabilirsiniz.
- Hemen 1000 x g 33 ° c spinfect ile 2 h için de 6-şey plaka hücreleri santrifüj kapasitesi ve tabakları 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 4 h için geri aktarmak.
- 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de enfekte hücreleri aşağı spin.
- Yavaşça hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin ve taze medya (RPMI 1640, % 10 FBS ve % 1 PS), transduced hücrelerle yeniden askıya alma ve sonra onları T-25 Şişeler için aktarmak ve puromisindir olmadan 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- 48 saat sonra 5 gün için 1 µg/mL puromisindir hücrelerle tedavi. Taze medya için 2 gün sonra döviz ve optimum hücre yoğunluğu devam et.
- Seyreltme yöntemleri sınırlama ile 96-iyi tabaklar tek klon tohum ve 37 ° C ve % 5 CO2tek bu klonlar kuluçkaya. Onları 3-4 hafta boyunca kültür.
- Tek bir hücre bir nüfus büyür sonra hücrelerin yarısı 24-şey plakaları puromisindir seçimi altında daha fazla kültür için içine transfer ve bir sonraki adımda bu klonlar doğrulayın. Hücreleri kalanı tutmak.
7. tek adımlı RT-qPCR havuza alınan CRISPR-Cas9 KO kitaplıkla taranması
- Marker gen HOXA9 bir adım ters transkriptaz Polimeraz zincir reaksiyonu (tek adımlı RT-qPCR) ile ifade değerlendirerek eleme sgRNA entegre klon etkinliğini belirlemek.
Not: HOXA9 son derece leukemogenesis22,23MOLM13 AML hücrelerinde ifade. - Kont sgRNA MOLM13 ve transfer 1 x 104 hücreyi iyi bir 96-şey PCR plaka başına entegre.
- 1000 x g 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi ve sonra iyice kaldırmak ve süpernatant ile bir damlalıklı hücre Pelet bozmadan atın.
- PBS arabelleği 125 µL hücrelerle yıkama ve 1000 x g 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi. Sonra bir pipet kullanarak süpernatant 120 µL kaldırmak ve yaklaşık 5 µL PBS her iyi muhafaza.
- Hücre lizis arabellek, İndinavir K çözüm (10 mg/mL) 1 µL ve Dnaz çözüm (1 mg/mL) 1 µL 48 µL içeren hücre lizis ana Mix 50 µL her şey için ekleyin. Sonra yukarı ve aşağı hücre Pelet yeniden askıya almak için 5 kez damlalıklı.
- Karıştırmak 37 ° C'de 5 dk ardından oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya ve sonra 75 ° C 5 min için.
- Hücre-80 ° C dondurucu, lysate saklayın.
- Tek adımlı RT-qPCR reaksiyon hazırlanması: tek adımlı tepki mix ve diğer reaksiyon bileşenleri ile 4 ° c çözme O zaman kısaca çözümleri borular alt toplamak ve ışık olmadan buzda yerleştirmek için spin aşağı. Mix ve yavaşça döndürün.
- Hücrenin lysate 1 µL PCR wells marker gen ileri astar 1 µL dahil olmak üzere RT-qPCR reaksiyon karışımı ile eklemek (300 nM) ve ters astar (300 nM), ters transkriptaz (10 U/µL) 0,125 µL ve 5 µL tek adımlı tepki mix (2 x).
- Wells optik şeffaf film ve yavaşça girdap ile mühür ve reaksiyon bileşenleri karıştırmak.
- 96-şey PCR plaka bir gerçek zamanlı PCR araç üzerinde yerleştirin.
- Ardından polimeraz inactivation ve DNA denatürasyon 95 ° C'de 1 dk 50 ° C'de 10 dakika için ters transkripsiyon tepki çalıştırmak
- RT-PCR ile PCR reaksiyon 40 devir gerçekleştirmek: denatürasyon 15 95 ° C, tavlama/uzantı ve plaka floresan için 20 okuma s s 60 ° C ve 2-5 s/adım 0.5 ° C artışlarla üzerinden 65-95 ° c eritebilir eğrisi analizi.
- Upregulated, downregulated ve HOXA9 gen ifade düzeylerine göre hiçbir değişiklik grupları kıyasla denetim için ayrı ayrı ayarlayın. β-aktin gen bir temizlik gen denetimi olarak kullanın.
8. entegre sgRNAs olumlu klonlar Genotipleme ve Sanger sıralaması ile doğrulanması
- Azalma HOXA9 ifade klonlar Sanger aracılığıyla doğrulamak sıralama ve PCR 50-100 ng MOLM13 genom DNA, 5 µL polimeraz tepki arabellek (10 x), 1 µL ileri astar (10 µM) ile gerçekleştirmek (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) ve 1 µL ters astar (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), 1 adet polimeraz (5 U /µL). İlk denatürasyon 94 ° c ile PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için 30 s ve sonra daha fazla denatürasyon 20 94 ° C'de 20 56 ° C'de tavlama s, s, uzantısı 20 68 ° C'de s (Toplam 30 döngüleri), 10 dk 68 ° C'de son uzantısı ve 4 ° C'de tutma
- Hulâsa ve PCR arıtma kiti ile PCR ürünleri (boyutu 285 bp) arındırmak.
- 2 µL T4 ligasyonu arabelleği (10 x), 50 ng T vektör DNA ile T vektör içine arıtılmış PCR ürünleri ligate (50 ng/µL), 25 saf ng PCR DNA (285 bp), 1 µL T4 ligaz (3 adet/µL) yer ligasyonu mix ve bir kuluçka 16 ° C'de içine gecede.
- Tüp ligasyonu mix DH5α yetkili hücreye transfer LB Ampisilin antibiyotik agar tabağa büyümek ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- LB plaka tek klonlar almak ve onları Genotipleme ve Sanger tarafından doğrulayın sıralama.
9. sgRNAs Induced Indel mutasyon nükleaz sindirim tahlil tespiti
- SgRNA entegre tek klon Indel oranları nükleaz test tahlil tarafından indüklenen algılamak.
- Ayrı ayrı 50-100 ng Indel mutant (test) ve vahşi-tipi (WT, başvuru) DNA PCR şablon olarak PCR amplicons hazırlamak 5 µL polimeraz tepki tampon (10 x), 1 µL dNTP (10mM), 1 adet polimeraz (5 U/µL), 1 µL ileri astar (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') ve 1 µ L ters astar (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). PCR reaksiyon ilk denatürasyon 30 s için 98 ° C'de ve sonra denatürasyon 20 98 ° C'de gerçekleştirildi 20 56 ° C'de tavlama s, s, 30 s (Toplam 30 döngüleri) için 72 ° C'de uzantısı ve 10 dk 72 ° C'de son uzantısı ve 4 ° C'de tutan
- 200 ile heteroduplex karışımı grubu "başvuru" (20 ng/µL) ve 200 ng ng "test" (20 ng/µL) PCR amplicons 0.2 mL PCR tüp ve homoduplex karışımı grubu ile sadece 400 ng "referans" PCR amplicons kontrol olarak.
- Ayrı ayrı heteroduplex ve homoduplex karışımı bir 1 L ölçek 800 mL su ile dolu ve sonra serin aşağı yavaş yavaş tavlama ve heteroduplex veya homoduplexes oluşturmak için oda sıcaklığında 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya.
- Ayrı ayrı Özet 400 ng tavlanmış heteroduplex ve homoduplex karışımdan 1 µL Indel mutasyon algılama nükleaz (2.5 U/µL) ve 2 µL nükleaz tepki arabellek (10 x) 42 ° c 60 dk için.
- Özel Jel Elektroforez ile sindirilir örnekleri analiz, heteroduplex karışımı DNA küçük parçaları (70-250 bp) ve homoduplex DNA'sı içine kesmek gerekir (320 bp) değil kesilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CRISPR-Cas9 teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için bir güçlü araştırma araçtır. Bu düzenleme teknikleri geleneksel gen hızla değiştirme ve genom genelinde hem bireysel gen odaklı uygulamaları için yüksek faydalı vardır. Burada, ilk tek tek klonlanmış loci özgü CRISPR Cas9 dizilmiş sgRNA kitaplığı 1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA hedefleyen sgRNAs oluşan içerir dört HOX loci (şekil 1, Tablo 1) genlerinde hedefleme. Bu kütüphane hedefler tüm CTCF çekirdek bağlayıcı motifler, HOX ilişkili gen lncRNAs, düzenleyici elemanlarının ve birkaç HOX genleri HOX loci olumlu denetimler olarak bilinir. Ayrıca rastgele non -HOX genleri, insan olmayan genler ve intergenic bölgeleri olumsuz denetimleri olarak hedefleme sgRNAs içerir. Verimlilik ve CTCF sitesi knock-out (KO) özgüllüğü lentiCRISPR iletim tarafından geliştirmek için 5-10 sgRNAs (Tablo 1) hedefleme her site içerir. Burada açıklanan protokolünde sgRNA kütüphaneler CTCF bağlayıcı siteleri HOXA/B/C/D loci ve geniş Enstitüsü sgRNA araçlarda (Resim 1, Resim 2) temel lncRNAs bu loci içinde göre tasarlanmıştır. 0.3 MOLM13 hücrelerdeki MLL AF9 füzyon taşıyan bir MOI ile enfeksiyon iletim düşük çeşitlilik, sonra enfeksiyon oranı az bir sgRNA/puromisindir seçime göre takip hücredir ve sonra numaralı seribaşı tek hücreden yetişen dayanıklı klonlar HOXA9 gen ekspresyonu bozulma için tarandı.
Kısa süre sgRNA Kütüphane tarama için iş akışı olan (şekil 3) açıklanan. İlk olarak, virüs içeren sgRNA Kütüphane oluşturulan iki vektörel çizimler (psPAX2 ve pMD2.G) yardımıyla HEK293T hücrelerdeki. havuza alınmış sgRNA Kütüphane lentiviruses konsantre ve polybrane (8.0 µg/mL) ile MOLM13 AML hücreye transduced. 48 h iletim sonra hücreleri puromisindir en iyi konsantrasyon ile tedavi edildi. 5 gün sonra hücreleri tek hücre/iyi 96-şey kalıplara tohumlari ve tek klonlar puromisindir huzurunda oluşturulan. Son olarak, sgRNA tek klonlar genom entegre tarafından tek adımlı RT-PCR, Sanger tespit edilmiştir sıralama ve Indel mutasyon algılama (şekil 3). Puromisindir dayanıklı tek klonlar tek adımlı damlacık tanımlanır dijital RT- HOXA9 onkogen (şekil 4) ifade değiştirme göre qPCR (RT-ddqPCR). Genotipleme ve Sanger sıralaması sgRNA Kütüphane inşaat ve doğrulama (Şekil 2, şekil 4) için yapıldı.
sgRNA MOLM13 bir 96-şey PCR plaka pozitif klonlar daha fazla kontrol hücreleri ile karşılaştırmaHOXA9 düzeyde ifade genlerin dayalı RT-qPCR yöntemi ile teyit edildi hedefleme. Klonların hayatta 528 dışarı ekranlı, 10 sergilenen klonlar daha çok HOXA9 düzeyleri (4A rakam) % 50 azalma. sgRNAs entegre HOXA9-azaltılmış, HOXA9-değişmeden ve HOXA9-artan klonlar daha fazla kanat vektör primerler kullanılarak sgRNA dizileri PCR güçlendirme tarafından teyit. Arıtılmış PCR ürünleri T4 ligaz ile T vektör sistemine bakmaksızın ve kimlik için Sanger sırası tarafından gönderilen (bkz. Adım 8). Sıra veriler sıralı 30 klonlar dışında tek sgRNA (Tablo 2) 21 klonlar dahil göstermiştir. SgRNA kategorilerini tespit ve HOXA9 ifade düzeylerine göre analiz edildi. Altı on bir azalma HOXA9 düzeyleri bulunan sgRNAs CBS7/9 site hedefleme, ama değil insan olmayan genler, rastgele insan genleri ve diğer CTCF site denetimlerinin (şekil 4 ve Tablo 2) gösterilen klonlar.
sgRNA olumlu tek klon kaynaklı Indel mutasyonlar nükleaz tahlil (şekil 5) dayalı PCR tabanlı Genotipleme ve nükleaz sindirim tarafından belirlenir entegre. Nükleaz sindirim tahlil mutasyonlar oluştu temsilcisi HOXA9CBS7/9 sınır içinde Indel tanımlamak için gerçekleştirildi-azaltılmış, HOXA9 -değişmeden ve HOXA9 -artan klonlar. CBS7/9 mutasyon 4 6 HOXA9dışarı bulundu sonuçları ortaya-klonlar azaltılmış: klonlar #5, 6, 28 ve 121, ama değil klonlar #15 ve #31 (şekil 5). Ancak, birkaç sgRNAs HOAIRM1 lncRNA, HOTAIR lncRNA ve HOXD9/10 CTCF bağlama site hedefleme klon #31 bulunan iken HOTTIP lncRNA site, hedefleme sgRNA klon #15 yer alan (rakamlar 4B, 5 ve Tablo 2).
Resim 1 : CTCF bağlayıcı siteleri ve lncRNAs dört gösteren şematik diyagramı HOX Gen loci. Her hedefleme DNA öğe 5-10 farklı sgRNAs içerir. CTCF çip seq dataset GEO (GSM1335528) indirilen ve entegre genom Viewer (IGV) ile görüntülenir. SgRNA hedefleme CTCF sitelerdeki HOX loci turuncu makasla etiketli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : SgRNA vektör sırası ve PCR güçlendirme astar birleştirmenin bir parçası temsil eden şematik diyagramı. PCR güçlendirme astar sgRNA lentiviral vektör boş sıra göre dizayn edilmiştir. İleri astar (P1) sarı ile vurgulanmış, ters astar (P2) kırmızı renkte ve sgRNA sgRNA lentiviral vektör yeşil vurgulandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : SgRNAs Kütüphane tasarım, yapı ve doğrulama için iş akışı temsil eden şematik diyagramı. Bu iş akışını aşağıdaki gibidir. İlk olarak, sgRNA Kütüphane tasarlanmış ve bir lentiviral CRISPR vektör klonlanmış ve sonra lentivirus sgRNA Kütüphane lentiviral vektör, psPAX2 ve pMD2.G vektörler HEK293T hücrelerdeki ile paketlenmiştir. Daha sonra MOLM13 hücreleri düşük MOI (0,3) virüs bulaşmış ve bu hücreler puromisindir seçimi yapıldı. O zaman, tek klon bir 96-şey plaka numaralı seribaşı. Son olarak, bir genom entegre sgRNA tek klonlar tek adımlı RT-qPCR tarafından Sanger sırası ve Indel mutasyon algılama tespit edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Tek adımlı RT-qPCR ve Sanger sıralaması ile tanımlanan havuza alınan CRISPR-Cas9 KO Kütüphane tarama. (A) bir adım RT-damlacık dijital PCR testi ile taranması tek klonlar sgRNA kitaplığı içeren lentivirus ile enfekte HOXA9 ifadede. 528 sgRNA enfekte Kütüphane klonlar HOXA9 ifade düzeyleri için tarama (528 nokta) gösterilir. On HOXA9 azalma % 50'den fazla 528 klonlar sergilenen (mor oklar) düzeyleri. Kırmızı çizgi logosuna 2 kat azalma Değiştir sınır kontrol hücreleri ile karşılaştırarak ettiğinizi; mavi çizgi sınır logosuna 2 kat artış değişim anlamına gelir. (B) altı klonlar #5, 6, 28, 121, 207 ve 420 CBS7/9 belirli sgRNA Sanger sıra (Yeşil ok) aracılığıyla tarafından hedef. WT MOLM13 seviyelerinde (C) HOXA9 RT-ddqPCR analizi ve 21 klonlar içeren tek hedef sgRNA. HOXA9 ifade veri beş gruba sgRNA sıralarının Kategoriler uygun olarak gruplandırılmış: HOXA7/9 CTCF site, insan olmayan hedefler, HOX loci, ilişkili HOX lncRNAs, diğer CTCF sitelerde ve insan diğer hedefler. Bu rakam Luo ve ark.12den değiştirildi. İstatistikler için bu veri bir öğrenci t-testi ile üç bağımsız deneyler üzerinden ortalama ± SD temsil edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Indel mutasyonlar entegre sgRNAs olumlu klonu ile PCR tabanlı Genotipleme ve nükleaz tahlil doğruladı. (A) Genomik DNA azaltılmış, değişmeden veya artan HOXA9 ifade düzey yaşandığı temsilcisi CRISPR Cas9 KO ekranlı Kütüphane klonlar izole. HOXA7 ve HOXA9 genler (CBS7/9 sınır) arasında bulunan CTCF sitesinde heterozigoz silinmesi PCR tabanlı Genotipleme tarafından tespit edilmiştir. HOXA9-klonlar #5, 6, 28 ve sergilenen 121 silme (siyah oklar) CBS7/9 sınır konumda azalmıştır. (B) CBS7/9 sitesi Indel mutasyonların değişmeden nükleaz sindirim tahlil tarafından azaltılmış yaşandığı temsilcisi klonlar (kırmızı çizgi), (mavi çizgi) analiz edildi veya (mor çizgi) HOXA9 ifade düzeyleri artmış. HOXA9-CBS7/9 sınır konumu (turuncu oklar) mutasyonların klonlar #5, 6, 28 ve sergilenen 121 azalmıştır. Bu rakam Luo ve ark.12den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: sgRNAs Kütüphane hedefleme bilgisini havuz. Luo ve ark.12den veridir. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Tablo 2: Sanger Seçili sunulan sgRNAs sonuçlarını sıralama HOXA9 -azalma, HOXA9 -değişmeden, ve HOXA9 -klonlar arttı. HOXA9-azalmış, değişmeden ve artan klonlar olan vurgulanır kırmızı, mavi ve mor, ayrı ayrı. Luo ve ark.12den veridir. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SgRNA kütüphaneler genler ve ağ sgRNA zenginleştirme24,25,26 aracılığıyla belirli hücresel işlevleri düzenleyen tanımlamak için bir işlev tarama sistemi uygulanmış olan protein kodlayıcı gen ile ilgili ,27,28. SgRNA kütüphaneler gene özgü işlevsel ekranları distal ve proksimal elemanları, BCL11A, Tdgf1a ve ilaç direnci gibi düzenleyen için gösterildi da birkaç kodlamayan bölge ile ilgili genleri28, düzenleyen 29,30. Bu sgRNA kütüphaneler tüm detaylı bir Biyoinformatik tarafından oluşturulan tasarım, Oligonükleotid sentezi ve Oligonükleotid havuzunun vektörel çizimler alt klonlama. Genom geniş tarama yaklaşım çok güçlü ve yararlı ama genom-wide sgRNA tasarım ve tutarlı pahalı sentezi için finansman için Hesaplamalı uzmanlık gerektirir; Böylece, çoğu laboratuarlar için hala meydan okuyor. Ancak, uygun ve verimli CTCF bağlama sitesi Kromatin organizasyon ve transkripsiyon Yönetmeliği (şekil 1 dahil gibi belirli DNA öğeyi tanımlamak için bir yaklaşım eleme loci özgü sgRNA Kütüphane ve Şekil 2). CTCF sınırları hedefleyerek, biz bir tek adımlı RT-sgRNA hedef klonlar bir belirli marker gen, HOXA9ifade düzeyine uygun değerlendirmek için PCR uygulanır. Buna ek olarak, biz Sanger gerçekleştirilen bu olumlu entegre sgRNAs klonlar (Şekil 2 ve şekil 4) onaylamak için sıralama. İşlevsel olarak bu olumlu sgRNAs klonlar hedef onaylamak için biz bir PCR tabanlı Genotipleme ve mutasyon algılama tahlil sgRNA hedef site ekleme veya silme mutasyonlar (şekil 5) ikna olup olmadığını belirlemek için yapılır. Bu bize belirli kodlamayan DNA öğeleri hedef ve memeli hücrelerinde Biyolojik işlevleri değerlendirmek için umut verici bir yöntem verir.
Bizim iletişim kuralında, bahsettiğimiz belirli Oligonükleotid tasarım daha verimli lentiCRIPSRV2 vektörler alt klonlama sağlayacak ve daha güvenilir bir doğru sgRNA kütüphane oluşturmak (1-2) adımlar. Yüksek titresi sgRNA Kütüphane lentivirus elde etmek için lentiviral süpernatant 50-fold (Adım 3) protokolüne ve birden çok aliquots (Adım 3.1-3,5)-80 ° C dondurucuya depolanan dar kurutma başlığını kullanarak konsantre olmalıdır. Ek bir endişe iletim için optimal MOI değeri bulgudur. MOI çok düşükse, enfekte hücreleri sayısını azaltmak ve başarısızlık eleme sgRNA yol. MOI çok yüksek ise, tek bir hücrede birden fazla sgRNA entegre olacak ve tek adımlı RT-PCR ve Indel mutasyon algılama eleme sgRNA kütüphane ile engel olacaktır. Bu nedenle, tarama önce titrasyon lentiviral Kütüphanesi aracılığıyla hücrelerinin her grup için en uygun MOI bulma önemli bir adımdır. Titrasyon MOLM13 lösemi hücreleri lentiviral Kütüphanesi ve MOI değerlendirilmesi Protokolü (Adım 5.1-5.10) yapılacaktır. Ayrıca, hücre ters transkripsiyon için kapsamlı bir lysing başarılı tek adımlı RT-PCR emin olabilirsiniz. Bu lizis kuluçka süre Protokolü (adım 7.5-7,6) tüm sıcaklık aşamalarında artırarak yapılabilir. Bu nedenle, havuza alınan CRISPR-Cas9 KO kitaplığı kapsamlı hücre testi ile taranması için etkili geliştirmek amacıyla lizis ve ters transkripsiyon tek adımlı RT-qPCR (adım 7.1-7.14) belirlemede kritik bir rol oynamaktadır. Ayrıca, düşük kaliteli PCR ürünleri (adım 9.1-.6) heteroduplex/homoduplex oluşturma işlemi etkileyecek çünkü PCR ürünlerin kalitesi artan başarılı Indel mutasyon algılama, emin olabilirsiniz.
Ayrıca, yöntem CTCF rolünde HOX gen düzenlemesi erken embriyonik gelişme ve bazı lösemi anormal HOX gen imza ile tanımlamak için kullanılabilir. Örneğin, HOX genleri embriyonik gelişim sırasında kritik rol oynarlar ve tüm dört kümeleri HOX gens embriyonik geliştirme onların ifade şekillerindeki geçici ve dağınık şekilde kısıtlanır. Ayrıca, NPM1 mutasyonlar AML ve hesap normal sitogenetik karyotip31AML hastalarının % 30 için en yaygın genetik bozukluk arasındadır. Bu alt kümesini AML lösemik dönüştürme17baskın bir mekanizma haline bir anormal HOXA ve HOXB gen imzası, sergiler. Nasıl HOX gen düzenlenir normal gelişim ve dysregulated leukemogenesis sırasında aydınlatmak için çok önemlidir. Biz ve diğerleri CTCF Kromatin organizasyon ve gen transkripsiyonu HOX loci9,12önemli bir rol oynar göstermiştir. Böylece, HOX odaklı loci sgRNA Kütüphane tarama HOX gen düzenlemesi sırasında geliştirme ve hematopoetik maligniteler CTCF bağlama sitedeki belirli işlevi dolaştırmak için uygun bir yol sağlar. Ancak, bir yaklaşım yüksek üretilen iş yeni nesil sıralama için yararlı bir işaretleyici bulma zorluk kısıtlamasıdır. Gelecekteki araştırma amaçlarından biri çok seçici bir işaret bulmak ve marker'ın etkilerini görmek için genom çapında sonraki nesil sıralama dışarı taşımak olacaktır. Bu nedenle, izleme muhabir gelecekte çok önemli bir araç olacak gibi belirli floresan gen marker öğesini kullanarak araştırma planlar.
Arttırıcılar organizatörü işlevi ve gen ifade yönetmelikte çok sayıda kritik rol oynamak. Ancak, ayrıca bir pozisyon ve yönlendirmesini bağımsız şekilde organizatörü etkinlik uzun mesafe üzerinden etkinleştirebilirsiniz ve arttırıcılar kez gen ifadesinin bir trans yönde düzenler. Böylece, özellikle sonrası genomik dönemde belirli genler, enhancer(s) kesin olarak belirlemek için meydan okuyor. Geleneksel muhabir deneyleri ve Bağdaşık fonksiyonel analizleri (örneğin, Kromatin immunoprecipitation ve DNaseI aşırı duyarlı deneyleri) artırıcı işlev32,33incelemek için kullanılan. Benzer şekilde, küçük ölçekli locus odaklı gösterimleri için belirli genler34distal ve proksimal düzenleyici elemanlarının faaliyetleri keşfetmek için de uygulandı. Son zamanlarda, bir HOTTIP lncRNA yanı sıra HOXA7 ve HOXA9 genler arasında bulunan bir CTCF bağlama sitesinde kodlamayan düzenleyici elemanlarının HOX gen loci içinde başarıyla hedefleyen havuza alınan sgRNA-KO Kütüphane strateji tespit Bu Akut Miyeloid Lösemi (AML)12' Ektopik HOXA gen ekspresyonu sürücüler posterior HOXA Kromatin etki alanı organizasyon, kontrol etmek için önemlidir. Bu çalışmalar havuza alınan sgRNA-KO Kütüphane tarama da tanımlamak ve kodlamayan öğeleri bizim genom yerinde biyolojik işlev değerlendirmek için bir güçlü genetik yaklaşım olduğunu gösterdi.
CTCF, Kromatin yalıtkan protein belirli hücre türü11,35Kromatin mahalleler için belirli bir gen ifade desenleri tanımlayarak genom organizasyonu içinde önemli bir rol oynar. Değişiklik topolojik ilişkili etki alanı (TAD) yapısının bir hastalıklı devlet5,11' kaynaklanan artırıcı/organizatörü arasındaki etkileşimleri değiştirir. CTCF metazoan içinde son derece korunmuş ve TAD sınırları zenginleştirilmiş. Ancak ve nasıl CTCF Kromatin sınır yapı ve TAD oluşum korumak için yaptığı katkının belirsizdir. Havuza alınan CTCF sgRNA nakavt Kütüphane tarama dört HOX loci üzerinde duruldu rağmen güçlü bir yöntem tanımlamak ve CTCF sınırları incelemek için ve TAD etki alanı aynı zamanda artırıcı/organizatörü etkileşim ve transkripsiyon içinde ortaya çıktı TAD etki alanı12. Ayrıca, bu yöntem lncRNA öğeleri ve Kromatin uyum ve erişilebilirlik faaliyet HOX loci aracılık transkripsiyon faktörleri belirlemek için verimli bir şekilde uygulanabilir. Gelecekte çim veri araştırma ve da CRISPR/sgRNA Kütüphane genom-wide CTCF siteleri CTCF ChIP-seq göre sonraki nesil sıralama belirlenmesi yoluyla içeren keşfetmek için çalışıyoruz. Böylece, bu strateji tüm kromozom veya hatta tüm genom için genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu raporla ilgili hiçbir çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar ayrıca el yazması düzenleme için Nicholas Cesari teşekkür ederiz. İş Ulusal Sağlık Enstitüsü (S.H., R01DK110108, R01CA204044) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
- Phillips, J. E., Corces, V. G.
- Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
- Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
- Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
- Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
- Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
- Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
- Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
- Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
- Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
- Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
- Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
- Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
- Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
- Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
- Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
- Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
- Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Rajagopal, N., et al.
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
- Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
- Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
- Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
