Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

HOX المكاني مركزة كريسبر/سجرنا "مكتبة الفرز تحديد الحرجة كتكف الحدود"

Published: March 31, 2019 doi: 10.3791/59382
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 3, 1
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Summary

مكتبة كريسبر/سجرنا طبق لاستجواب الجينات ترميز البروتين. بيد أن جدوى مكتبة سجرنا للكشف عن الوظيفة لحد كتكف في تنظيم الجينات لا تزال غير مستكشفة. هنا، يمكننا وصف مكتبة HOX سجرنا محددة المكاني لتوضيح وظيفة الحدود كتكف في HOX المكاني.

Abstract

عامل ملزم كككتك (كتكف)-وساطة مستقرة توبولوجيكالي الربط بين المجالات (تادس) تلعب دوراً هاما في التفاعلات المقيدة لعناصر الحمض النووي التي تقع في المجاورة تادس. كتكف دوراً هاما في تنظيم التعبير المكاني والزماني HOX الجينات التي تتحكم في التطور الجنيني والزخرفة الجسم، هيماتوبويسيس، وليوكيموجينيسيس. بيد أنها لا تزال غير معروفة إلى حد كبير وكيفية تنظيم HOX المكاني المرتبطة كتكف حدود منظمة الكروماتين والتعبير الجيني HOX . في البروتوكول الحالي، قد تم إنشاء مكتبة مجمعة سجرنا محددة تستهدف جميع مواقع الربط CTCF في المكاني هوكسا/ب/ج/د لدراسة آثار الإخلال بالحدود المرتبطة CTCF الكروماتين على تشكيل صبي و HOX الجينات التعبير. تم التعرف على من خلال كريسبر-Cas9 الفرز الجيني، الموقع ملزم كتكف الواقعة بين الجينات HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) كمنظم حرجة من المجال النمطان الكروماتين، فضلا عن الأهمية للمحافظة على حمل خارج الرحم HOX الجينات أنماط التعبير في اللوكيميا النقوي الحاد MLL ترتيبها (مكافحة غسل الأموال). وهكذا، هذه المكتبة سجرنا فحص نهج يوفر نظرة ثاقبة رواية CTCF وساطة منظمة الجينوم في مواضع محددة من الجينات ويوفر أيضا أساسا لتوصيف وظيفي من العناصر التنظيمية الوراثية المشروح، وكلا الترميز و فضله، خلال العمليات البيولوجية الطبيعية في عصر الجينوم البشري بعد انتهاء المشروع.

Introduction

كشفت دراسات التفاعل الجينوم مؤخرا أن أشكال الجينوم البشري النووية مستقرة مجالات ربط توبولوجيكالي (تادس) التي يتم المحافظة عليها عبر أنواع الخلايا والأنواع. منظمة المجين في مجالات منفصلة وييسر ويحد من التفاعلات بين العناصر التنظيمية (مثل القدرة على والمروجين). يربط الحدود تاد عامل ملزم كككتك (كتكف) ويقوم بدور حاسم في التفاعلات المقيدة لعناصر الحمض النووي التي تقع في المجاورة تادس1. ومع ذلك، كشفت الجينوم واسعة CTCF ربط البيانات أنه على الرغم من أن معظمهم CTCF يتفاعل مع الحمض النووي-المواقع نفسها في أنواع مختلفة من الخلايا، غالباً ما تعمل كحاجز الكروماتين في موقع معين في نوع خلية واحدة ولكن ليس في غيرها، مما يوحي بأن وظائف كتكف جنبا إلى جنب مع الأنشطة الأخرى في تكوين الكروماتين حدود2. هو ما لا يزال غير معروف ما إذا كانت عناصر الحدود (كتكف-ربط المواقع) ترتبط مباشرة بالوظيفة البيولوجية كتكف، وكيفية حدوث هذه الارتباطات. ولذلك، نحن افترض أن CTCF ملزم مواقع محددة في الجينوم مباشرة تنظيم تشكيل تادس ومراقبة المروج/محسن التفاعلات داخل هذه المجالات أو بين المجالات المجاورة. الانتهاء من الإنسان ومشاريع تسلسل الجينوم الماوس وتحليلات جينية اللاحقة كشفت تواقيع جديدة الجزيئية والوراثية للجينوم. بيد أن دور التواقيع/تعديلات محددة في تنظيم الجينات ووظيفة الخلوية، فضلا عن الآليات الجزيئية، لم يفهم تماما.

دعم خطوط متعددة من الأدلة أن تمثل تادس CTCF بوساطة الكروماتين الوظيفية المجالات3،4،5. على الرغم من أن معظمهم CTCF يتفاعل مع الحمض النووي-المواقع نفسها في أنواع مختلفة من الخلايا، وكشفت البيانات CTCF رقاقة-seq واسعة الجينوم أن كتكف غالباً ما يعمل كحاجز الكروماتين في نوع خلية واحدة ولكن ليس في غيرها2. كتكف دوراً أساسيا أثناء تطوير طريق التوسط الجينوم المنظمة4،،من67. تعطيل الحدود CTCF البصر التفاعلات محسن/المروج والتعبير الجيني، مما يؤدي إلى انسداد التنموية. وهذا يوحي بأن كتكف بوساطة تادس المكونات الهيكلية، ليس فقط ولكن أيضا الوحدات التنظيمية اللازمة لمحسن سليم العمل والجينات النسخ5،،من89.

HOX الجينات تلعب أدواراً حاسمة خلال التطور الجنيني وأنها مقيدة زمنياً ومكانيا في أنماط التعبير. يشكل محور هوكسا تادس مستقرة اثنين فصل الجينات الأمامي والخلفي بعنصر حدود المرتبطة كتكف في هيسكس و الخلايا IMR901. أظهرت التقارير الأخيرة أن هوكسبلينك، حزب موضع المرتبطة لنكرنا، يتوسط تشكيل CTCF توجه تادس والتفاعلات محسن/المروج في محور حزب . وهذا يؤدي إلى تنشيط الجينات حزب الأمامي خلال ESC الالتزام والتمايز10. وعلاوة على ذلك، في جين معين المكاني بما في ذلك محور هوكسا ، تغيير CTCF وساطة تاد المجالات تغيرت النسب جين معين التعبير التشكيلات الجانبية، وترافق مع تطور المرض الدول11،12. وتؤيد الأدلة وظيفة أساسية كتكف في تنسيق النسخ الجينات وتحديد هوية الخلية بتنظيم الجينوم في المجالات الفنية.

وعلى الرغم من دورها في التنمية الجنينية، أثناء هيماتوبويسيس، تنظيم HOX الجينات المكونة للدم وظيفة الخلية (HS/PC) الجذعية والسلف. وهذا يتم عن طريق التحكم في التوازن بين الانتشار والتمايز10،13،،من1415. أحكام تنظم HOX الجينات طوال بمواصفات والتفريق بين الخلايا المكونة للدم، مع التعبير أعلى في النظام المنسق/أجهزة الكمبيوتر- HOX الجينات يتناقص بالتدريج خلال النضج، مع أدنى المستويات المتباينة التي تحدث في الخلايا المكونة للدم16. HOX الجينات التقلبات إليه مهيمنة للتحول ليوكيميك بخصائص ديسريجولاتينج الذاتي تجديد والتمايز HS/أجهزة الكمبيوتر مما أدى إلى تحول ليوكيميك17،18. ومع ذلك، الآلية لإنشاء وصيانة عادية مقابل أنماط التعبير النمطان HOX الجينات، فضلا عن الشبكات التنظيمية المرتبطة بها لا يزال غير واضح.

فحص مكتبة سجرنا كريسبر-Cas9 قد استخدمت على نطاق واسع لاستجواب الجينات ترميز بروتين19 كالجينات جيدا كما غير الترميز، مثل لنكرنا20 وميرنا21 في الأنواع المختلفة. بيد أن تكلفة استخدام المكتبة سجرنا كريسبر-Cas9 لتحديد أهداف جديدة في الجينوم لا تزال عالية، لأنه غالباً ما يتم تطبيق تسلسل الجينوم الفائق للتحقق من عرض مكتبة سجرنا. لدينا سجرنا فحص نظام يركز على مواضع محددة من الجينوم ويقيم سجرناس الاستهداف من خلال خطوة واحدة RT-PCR وفقا لتعبير الجينات ماركر، مثل HOXA9. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن سانغر التسلسل وأكد أن سجرنا أدمجت في الجينوم، والطفرات إينديل لتحديد سجرنا استهداف الموقع. من خلال الفحص الجيني المكاني على حدة كريسبر-Cas9، تم التعرف على حدود الكروماتين CBS7/9، كمنظم حاسمة لإنشاء المجال النمطان الكروماتين والحفاظ على أنماط التعبير الجيني HOX حمل خارج الرحم في المرضية مكافحة غسل الأموال 12-يمكن تطبيق الأسلوب على نطاق واسع لتحديد وظيفة معينة ليس فقط من الحدود كتكف في التنمية الجنينية، هيماتوبويسيس، ليوكيموجينيسيس، ولكن أيضا الحدود CTCF كالأهداف العلاجية المحتملة للعلاج جينية مستقبلا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-كتكف سجرناليبراري التصميم باستخدام "أداة على الإنترنت"

  1. تصميم سجرنا استهداف مواقع الربط CTCF في المكاني HOX البشرية باستخدام أداة مصمم منصة (GPP) اضطراب الوراثية (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. تجميع مجموعة سجرناس 1,070 تتكون من سجرناس تستهدف 303 الجينات الاستهداف العشوائي، 60 من عناصر إيجابية، ضوابط عدم استهداف الإنسان 500، و 207 عناصر كتكف أو لنكرنا استهداف الجينات (الشكل 1، الجدول 1). ويستهدف كل عنصر الحمض النووي تستهدف خلال 5-10 سجرناس مختلفة.

2-سجرنا مكتبة الاستنساخ

  1. استنساخ النوكليوتيد المركب في ناقلات العمود الفقري لينتيفيرال كريسبر (lentiCRISPRv2).
    1. هضم ناقل LentiCRISPRv2 مع بسمبي إنزيم التقييد في 37 درجة مئوية ح 2.
    2. ابحث عن وجود الفرقة أكبر (حوالي 12,873 bp) في الجل بعد بسمبي الهضم، وتنقية ثم أنه مع مجموعة أدوات استخراج هلام.
      ملاحظة: قطعة صغيرة من حشو 2 كيلو بايت موجودة أيضا في الجل بعد الهضم، ولكن هذا يجب أن يتم تجاهل.
    3. سد النوكليوتيد المركب ويهضم ناقل لينتيكريسبر مع 150 نانوغرام من هضم "الحمض لينتيكريسبر"، 1 ميليلتر من 10 ميكرون أوليجوس, 2 ميليلتر من المخزن ليجاسى x T4 10, 1 ميليلتر من ليجاسى T4، واحتضان لهم ثم في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. تحويل مكتبة كريسبر/سجرنا لينتيفيرال إلى الخلايا الكهربائية المختصة للتضخيم.
    1. إعداد اليكتروبوراتور في 1.8 كيلو فولت، 200 Ω و 25 µF. ثم الدافئة قبل الانتعاش وسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب في حمام مائي 37 درجة مئوية، وقبل الحارة رطل الأمبيسلّين لوحات المضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية.
    2. ذوبان الجليد الخلايا المختصة بالثلج لمدة 10 دقائق.
    3. إعداد أنابيب 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي و 1 مم الترعة انهانسر على الجليد.
    4. مزيج 1 ميليلتر من بلازميد مكتبة 10 نانوغرام/ميليلتر الحمض النووي إلى 25 ميليلتر من الخلايا المختصة في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل، وتخلط بلطف بالتحريك الجزء السفلي من الأنبوبة عدة مرات يدوياً.
    5. مرة واحدة ومبومو الباردة ما يكفي، نقل الخليط خلية الحمض النووي/المختصة إليها. اضغط مرتين على كونترتوب ومسح أية قطرات الماء من السطح الخارجي ومبومو مع ورقة الأنسجة. ثم ضع في ومبومو في الوحدة النمطية انهانسر ثم اضغط النبض.
    6. فور إضافة ميليلتر 975 للإعلام شركة نفط الجنوب قبل حرارة 37 درجة مئوية. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    7. تدوير واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
    8. تمييع 100 ميليلتر الخلايا إلى 900 ميليلتر لوسائل الإعلام في شركة نفط الجنوب ووضع 100 ميليلتر على طبق أجار المضادات الحيوية الأمبيسلّين رطل. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. استخراج بلازميد الحمض النووي من المستعمرات مجتمعة باستخدام عمود ماكسي الإعدادية كما هو مفصل في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    1. تتخلص من جميع المستعمرات من لوحة أجار رطل وتطعيم ثقافة كاتب 2 مل من المتوسطة المضادات الحيوية الأمبيسلّين رطل واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع قوي يهز (~ 200 س ز).
    2. تمييع 1: ثقافة كاتب 500 إلى 100 مل من رطل الأمبيسلّين المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية ح 12-16 مع قوي يهز (~ 200 س ز).
    3. حصاد بيليه الخلية البكتيرية باستخدام الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    4. إعادة تعليق بيليه البكتيرية في 10 مل من المخزن المؤقت للتعليق.
    5. بيليه مع وقف التنفيذ مع 10 مل من المخزن المؤقت تحلل، وعكس بقوة 4-6 مرات. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تحييد مع 10 مل من "المخزن المؤقت لتحييد" مبردة. المزيج بلطف عكس الأنابيب 4-6 مرات واحتضان عليه لمدة 20 دقيقة على الجليد.
    7. زيادة ونقصان لأسفل في س 13,500 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. على الفور نقل المادة طافية المحتوية على بلازميد الحمض النووي لأنبوب جديد.
    8. كرر الخطوة 2.3.7، وعلى الفور نقل المادة طافية المحتوية على بلازميد الحمض النووي لأنبوب جديد.
    9. حجته العمود عن طريق تطبيق 10 مل من المخزن المؤقت للموازنة وتسمح عمود فارغ بتدفق الجاذبية.
    10. إضافة المادة طافية على العمود والسماح لها بدخول الراتنج بتدفق الجاذبية.
    11. أغسل العمود مع 2 x 30 مل من الغسيل المخزن المؤقت.
    12. الوت الحمض النووي مع 15 مل من شطف المخزن المؤقت.
    13. يعجل بالحمض النووي مع 10.5 مل الايزوبروبانول درجة حرارة الغرفة للحمض النووي الوتيد. ميكس وتدور أسفل فورا في س 15,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وصب المادة طافية بلطف.
    14. أغسل بيليه الحمض النووي مع 5 مل إيثانول 70%، بيليه الحمض النووي للطرد المركزي في س 15,000 ز لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية واضحة.
    15. كرر الخطوة 2.5.14 أكثر مرتين.
    16. الطرد المركزي بيليه الحمض النووي في س 15,000 ز لمدة 10 دقائق، وصب المادة طافية بلطف دون إزعاج بيليه الحمض النووي.
    17. أيردري بيليه لمدة 5-10 دقائق، ويحل الحمض النووي بحجم مطلوب في المخزن المؤقت (المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، ودرجة الحموضة 8.0).

3-ارتفاع عيار سجرنا "مكتبة الجيل لينتيفيروس"

  1. إعداد الخلايا: الخلايا HEK293T الثقافة في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) تستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) المصل البقري الجنين (FBS) والمضادات الحيوية البنسلين 1% (المجلد/المجلد)-ستربتوميسين (PS) في قوارير T-25. مكان لهم في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2.
  2. حزمة لينتيفيروس: شارك ترانسفيكت HEK293T الخلايا التي تحتوي على 20 ميكروغرام من ناقلات مكتبة المنقي من الخطوة 2، 15 ميكروغرام من بلازميد الحزمة (psPAX2) و 10 ميكروغرام من بلازميد المغلف (pMD2.G) عن 48 ساعة قبل الحصاد الفيروسات.
  3. جمع الفيروس: بعد 48 ساعة، كوليكتثي الفيروس طافية وتصفية الفيروس طافية عبر غشاء PVDF ملزمة بروتين منخفض 0.45 ميكرومتر.
  4. تركيز الفيروس: تركيز المادة طافية لينتيفيرال باستخدام 50-fold مركزات واختبار الفيروس موي في الخطوة 5.
  5. تخزين الفيروس: قاسمة تتركز الفيروسات ومخزن في ثلاجة-80 درجة مئوية.

4-محسن بوروميسين تركيز

  1. الثقافة خلية اللوكيميا: خلايا الثقافة MOLM13 مكافحة غسل الأموال في 1640 RPMI تستكمل مع 10% (المجلد/المجلد) المصل البقري الجنين (FBS) و 1 × المضادات الحيوية البنسلين-ستربتوميسين (PS) في قارورة T-125. مكان لهم في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    ملاحظة: يتم تمرير الخلايا عادة كل 4-5 د في تقسيم نسبة 1:4 أو 1:6، ابدأ السماح للخلايا تصل إلى أكثر من 70% كونفلوينسي.
  2. قم بإعداد الخلايا MOLM13 في صفيحة 12-جيدا مع كثافة 1.0 × 104 خلايا مليلتر، في إجمالي حجم 2 مل في البئر (2.0 × 104 خلايا).
  3. فحص وقت-بالطبع: الخلايا MOLM13 التعامل مع بوروميسين لمدة 7 أيام في زيادة تركيزات (0.1 ميكروغرام/مل، 0.2 ميكروغرام/مل, 0.5 ميكروغرام/ملليلتر، 1.0 ميكروغرام/مل و 2.0 ميكروغرام/مل)
    1. إعداد الخلايا MOLM13 دون علاج بوروميسين في اليوم 0 وإعداد 3 آبار تكرار دون علاج بوروميسين كعنصر تحكم من اليوم 0 ليوم 7.
    2. علاج MOLM13 الخلايا مع 0.1 ميكروغرام/ملليلتر، 0.2 ميكروغرام/مل, 0.5 ميكروغرام/ملليلتر، 1.0 ميكروغرام/مل و 2.0 ميكروغرام/ملليلتر، كل على حدة، مع كل حالة تجريبية تحتوي على 3 نسخ متماثل الآبار.
    3. حساب نسبة الخلايا الحية وجعل منحنى البقاء على قيد الحياة من يوم 0 إلى يوم 7 التي تحتوي على كافة الشروط.
  4. منحنى البقاء على قيد الحياة: وصمة عار الخلايا مع تريبان الأزرق وعدد مرات بقاء يوميا للحصول على منحنيات البقاء على قيد الحياة لكل تركيز بوروميسين.
  5. تحسين تركيز بوروميسين الحد الأدنى: تحديد تركيز بوروميسين الحد الأدنى من خلال تلطيخ تريبان الأزرق، التي MOLM13 جميع يقتل الخلايا من بين 5-7 أيام.

5-معايرة مكتبة لينتيفيرال في خلايا سرطان الدم MOLM13

  1. خلايا مكافحة غسل الأموال إعداد: جمع الخلايا MOLM13 مكافحة غسل الأموال مع المتوسطة تنبيغ (RPMI 1640، 10% FBS و PS 1% و 8.0 المتوسطة طلاء ميكروغرام/مل) في كثافة 1.5 × 106 خلايا/mL.
  2. مكان الخلايا MOLM13 في لوحة 12-جيدا مع 1.5 × 106 خلايا في كل بئر.
  3. ذوبان الجليد في لينتيفيروس: إزالة lentivirus مركزة من الثلاجة-80 درجة مئوية وذوبان الجليد من على الجليد.
  4. خلايا MOLM13 ميكس مع جرعة مختلفة من lentivirus تتركز في آبار منفصلة، بما في ذلك 0، 1، 2، 5، 5، 7.5 و 10 ميليلتر (مجموع 6 مجموعات).
  5. الطرد المركزي هذه المخاليط في 1,000 س ز 2 ح في 33 درجة مئوية على الفور ونقل لوحات 12-جيدا مرة أخرى إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ح 4.
  6. بعد ح 4، تدور أسفل الخلايا المصابة في 400 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. بلطف نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية، وإعادة تعليق الخلايا ترانسدوسيد مع وسائط جديدة (RPMI 1640، PS FBS و 1% 10%)، ثم نقلها إلى قوارير T-25 واحتضان في 37 درجة مئوية ل 48 ساعة دون بوروميسين.
  8. بعد 48 ساعة، تقسيم هذه الخلايا إلى قوارير 2 (2 مجموعات): مجموعة تجريبية تعامل مع 1 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 5 أيام، ومجموعة مراقبة دون علاج بوروميسين لمدة 5 أيام.
  9. القيام باختيار بوروميسين لمدة 5 أيام مع 1 ميكروغرام/مل بوروميسين وفقا للخطوة 4 حتى مات بكافة الخلايا غير ترانسدوسيد عنصر التحكم. تبادل وسائط جديدة كل يومين.
  10. قياس قيمة موي الأمثل لتوصيل بقسمة عدد الخلايا الحية التي تعامل مع بوروميسين مع عدد الخلايا دون علاج بوروميسين.

6-توصيل مكتبة كو Cas9 كريسبر المجمعة

  1. توصيل مع لينتيفيروس: تصيب 1.5 × 106 MOLM13 الخلايا مع موي 0.3 من lentivirus سجرنا المجمعة في المتوسط (RPMI 1640، 10% FBS و PS 1% و 8 ميكروغرام/مل طلاء المتوسطة) في لوحة 6-جيدا واستخدام الخلايا دون العدوى lentivirus كعنصر تحكم.
  2. الطرد المركزي لوحة 6-جيدا في 1,000 س ز 2 ح في 33 درجة مئوية إلى سبينفيكت الخلايا على الفور ونقل اللوحات مرة أخرى إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ح 4.
  3. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا المصابة في 400 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. بلطف نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية، وإعادة تعليق الخلايا ترانسدوسيد مع وسائط جديدة (RPMI 1640، PS FBS و 1% 10%)، ثم نقلها إلى قوارير T-25 واحتضان في 37 درجة مئوية ل 48 ساعة دون بوروميسين.
  5. بعد 48 ساعة، يعامل الخلايا مع 1 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 5 أيام. تبادل وسائط جديدة بعد يومين والحفاظ كثافة خلية أمثل.
  6. البذور استنساخ واحدة في لوحات 96-جيدا مع الحد من أساليب التخفيف واحتضان هذه الحيوانات المستنسخة واحد في 37 درجة مئوية و 5% CO2. الثقافة لهم لمدة 3-4 أسابيع.
  7. بعد يكبر خلية واحدة إلى عدد سكان، نقل نصف عدد الخلايا في لوحات 24-جيدا للمزيد من الثقافة ضمن التحديد بوروميسين والتحقق من هذه الحيوانات المستنسخة في الخطوة التالية. الحفاظ على ما تبقى الخلايا.

7-فرز المكتبة كو Cas9 كريسبر المجمعة مع خطوة واحدة RT-قبكر

  1. تحديد مدى فعالية استنساخ المتكاملة سجرنا الفحص قبل تقييم التعبير عن الجين علامة HOXA9 مع خطوة واحدة المنتسخة العكسية تفاعل البوليميراز المتسلسل (خطوة واحدة RT-قبكر).
    ملاحظة: وأعرب عن HOXA9 هي عالية في خلايا مكافحة غسل الأموال MOLM13 في ليوكيموجينيسيس،من2223.
  2. عد سجرنا المتكاملة خلية MOLM13 ونقل 1 × 104 خلايا كل جيدا لصفيحة بكر 96-جيدا.
  3. الطرد المركزي الأنبوب في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق، ثم دقة إزالة وتجاهل المادة طافية مع بيبيت دون إزعاج بيليه الخلية.
  4. تغسل الخلايا مع 125 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني، والطرد المركزي الأنبوب في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق. ثم إزالة ميليلتر 120 من المادة طافية باستخدام ماصة والاحتفاظ بحوالي 5 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في كل بئر.
  5. إضافة 50 ميليلتر من مزيج الرئيسي تحلل الخلية التي تحتوي على 48 ميليلتر المخزن المؤقت لتحلل الخلية، 1 ميليلتر لحل بروتيناز ك (10 ملغ/مل) و 1 ميليلتر من الدناز الحل (1 ملغ/مل) لكل بئر. ثم بيبيت صعودا وهبوطاً 5 مرات بتعليق إعادة بيليه الخلية.
  6. احتضان هذا المزيج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها 5 دقائق في 37 درجة مئوية، وثم 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. تخزين الخلية ليستي في الثلاجة-80 درجة مئوية.
  8. إعداد رد فعل RT qPCR خطوة واحدة: ذوبان الجليد في مزيج التفاعل خطوة واحدة ومكونات أخرى رد فعل إلى 4 درجات مئوية. ثم تدور إلى أسفل بإيجاز لجمع الحلول في الجزء السفلي من الأنابيب، وعلى الجليد بدون الضوء. خلط وتدور بلطف.
  9. إضافة 1 ميليلتر من الخلية ليستي إلى الآبار PCR مع مزيج رد فعل RT-قبكر، بما في ذلك 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام الجينات ماركر (300 نانومتر) وعكس التمهيدي (300 نانومتر)، 0.125 ميليلتر من المنتسخة العكسية (يو 10/ميليلتر)، و 5 ميليلتر من خطوة واحدة رد فعل مزيج (2x).
  10. ختم الآبار مع فيلم شفافة بصريا، ولطف دوامة وخلط مكونات رد فعل.
  11. ضع لوحة بكر 96-جيدا على أداة PCR في الوقت الحقيقي.
  12. تشغيل رد النسخ العكسي لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية، تليها المنظمة بوليميريز وتمسخ الحمض النووي لمدة 1 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
  13. أداء RT-PCR مع دورات 40 من تفاعل PCR: تمسخ لمدة 15 ق في الأسفار 95 درجة مئوية والصلب/ملحق لوحة القراءة ل 20 s في 60 درجة مئوية، ومن ثم تحليل منحنى تذوب في 65-95 درجة مئوية عن طريق زيادات 0.5 درجة مئوية في s/الخطوة 2-5.
  14. إعداد أوبريجولاتيد ودوونريجولاتيد ولا توجد مجموعات التغيير وفقا لمستويات التعبير الجيني HOXA9 بالمقارنة بعنصر التحكم، كل على حدة. استخدام الجينات β أكتين كعنصر تحكم جينات في التدبير المنزلي.

8-تحقق سجرناس المتكاملة "استنساخ الإيجابية" من خلال التنميط وتسلسل سانجر

  1. تحقق من المستنسخين التعبير HOXA9 انخفض خلال سانغر التسلسل وأداء بكر مع 50-100 نانوغرام MOLM13 الجينوم الحمض النووي، 5 ميليلتر بوليميريز رد فعل المخزن المؤقت (10 x)، 1 ميليلتر الأمام التمهيدي (10 ميكرون) (آتجاكتاتكاتاتجكتاككجتاكتجااجتاتتكج) وعكس 1 ميليلتر التمهيدي (10 ميكرون) (تكتاكتاتكتتككككتجكاكتجتجتججكجاتجتجكجكتكتج)، 1 ميليلتر دنتب (10 ملم)، والوحدة 1 بوليميراز (5 يو/µL). إجراء تفاعل PCR مع تمسخ الأولى في 94 درجة مئوية لمدة 30 s ومن ثم أكثر تمسخ في 94 ° ج ل 20 ق، الصلب في 56 درجة مئوية 20 s، والتمديد في 68 درجة مئوية 20 s (المجموع 30 دورات)، والتمديد النهائي في 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم الضغط على 4 درجة مئوية.
  2. استخراج وتنقية منتجات PCR (حجم 285 bp) مع مجموعة تنقية PCR.
  3. اضطر المنتجات بكر المنقي إلى ناقل تي مع 2 ميليلتر T4 ربط المخزن المؤقت (10 x)، دنا ناقل نغ ر 50 (50 نانوغرام/ميليلتر)، 25 نغ تنقية PCR الحمض الخلوي الصبغي (285 bp)، 1 ميليلتر T4 ليجاسى (3 وحدات/ميليلتر)، والمكان الربط مزيج في حاضنة في 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. تحويل المزيج ربط إلى الخلية المختصة DH5α وتنمو على طبق أجار المضادات الحيوية الأمبيسلّين رطل، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  5. اختيار استنساخ واحد من لوحة رطل والتحقق منها بالتنميط وسانغر التسلسل.

9-كشف سجرناس الطفرة إينديل التسبب "مقايسة الهضم نوكلاس"

  1. الكشف عن استنساخ واحدة متكاملة سجرنا الناجمة عن معدلات إينديل نوكلياسي اختبار مقايسة.
  2. إعداد أمبليكونس بكر بشكل منفصل مع 50-100 نانوغرام إينديل المسخ (اختبار) والحمض النووي البرية من نوع (WT، مرجع) كقالب بكر، 5 ميليلتر بوليميريز رد فعل المخزن المؤقت (10 x)، 1 ميليلتر دنتب (10 ملم)، بوليميراز 1 وحدة (يو 5/ميليلتر)، 1 ميليلتر التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرون) (-جاجاتجكجكجكجاج 5 '-3')، و 1 μ L عكس التمهيدي (10 ميكرون) (-آآتاتاججكجكتجتكاكت 5 '-3'). تم إجراء تفاعل PCR مع تمسخ الأولية عند 98 درجة مئوية عن 30 ثانية، ومن ثم تمسخ عند 98 درجة مئوية 20 s، الصلب في 56 درجة مئوية 20 s، والتمديد في 72 درجة مئوية ل 30 s (المجموع 30 دورات)، والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وعقد في 4 درجات مئوية.
  3. إنشاء مجموعة الخليط هيتيرودوبليكس مع 200 نانوغرام من "المرجع" (20 نانوغرام/ميليلتر) و 200 نانوغرام أمبليكونس بكر "اختبار" (20 نانوغرام/ميليلتر) في أنبوب بكر 0.2 مل، ومجموعة هومودوبليكس المخلوط مع 400 فقط نانوغرام من "مرجع" أمبليكونس PCR كعنصر تحكم.
  4. احتضان المخلوط هيتيرودوبليكس وهومودوبليكس على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كوب 1 لتر مليئة 800 مل من الماء وثم يبرد تدريجيا لدرجة حرارة الغرفة يصلب وتشكل هيتيرودوبليكس أو هومودوبليكسيس بشكل منفصل.
  5. بشكل منفصل هضم 400 نانوغرام من خليط هيتيرودوبليكس وهومودوبليكس ملدن مع نوكلاس 1 ميليلتر إينديل، طفرة الكشف (2.5 يو/ميليلتر) و 2 ميليلتر نوكلاس رد فعل المخزن المؤقت (10 x) في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  6. تحليل العينات هضمها مع [اغروس] هلام التفريد، وينبغي قطع الحمض النووي مزيج هيتيرودوبليكس إلى أجزاء صغيرة (bp 70-250)، وهومودوبليكس الحمض النووي (320 bp) يجب أن لا تكون قطع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تكنولوجيا كريسبر-Cas9 أداة قوية لبحث عن الدراسات الجينومية الوظيفية. فهو سرعة استبدال الجينات التقليدية تقنيات التحرير وفائدة عالية للتطبيقات الفردية وعلى نطاق الجينوم تركز على الجينات. هنا، الأولى المستنسخة على حدة المكاني على حدة كريسبر-Cas9-صفت سجرنا مكتبة تحتوي على سجرناس 1,070 تتكون من سجرناس استهداف 303 الجينات الاستهداف العشوائي أو عناصر إيجابية 60، ضوابط عدم استهداف الإنسان 500، و 207 عناصر كتكف أو لنكرنا استهداف الجينات في أربعة مواضع HOX (الشكل 1، الجدول 1). وتستهدف هذه المكتبة جميع CTCF الأساسية الملزمة زخارف، HOX الجينات المرتبطة لنكرناس، المعروف العناصر التنظيمية، والجينات HOX عدة عناصر إيجابية في المكاني HOX . كما أنه يحتوي على سجرناس استهداف عشوائي غيرHOX الجينات والمورثات غير البشرية والمناطق إينتيرجينيك كعناصر سلبية. تعزيز الكفاءة وخصوصية CTCF موقع المغلوب (كو) بتوصيل لينتيكريسبر، يحتوي كل موقع الاستهداف على 5-10 سجرناس (الجدول 1). في البروتوكول هو موضح هنا، صممت مكتبات سجرنا وفقا كتكف مواقع الربط المكاني هوكسا/ب/ج/د ولنكرناس في هذه المكاني، الذي يستند إلى أدوات سجرنا معهد واسع (الشكل 1، الشكل 2). بعد توصيل في تعدد انخفاض الإصابة مع موي 0.3 في خلايا MOLM13 التي تحمل الانصهار MLL AF9، أن معدل الإصابة سجرنا/خلية أقل من واحد متبوعاً بالتحديد بوروميسين، وثم تم استنساخ مقاومة نمت من خلية مفردة المصنف فحص للأضرار بالتعبير الجيني HOXA9 .

كان سير العمل لفحص مكتبة سجرنا بإيجاز وصف (الشكل 3). أولاً، تم إنشاؤها المكتبة سجرنا المحتوية على الفيروس في خلايا HEK293T بمساعدة اثنين من ناقلات (psPAX2 و pMD2.G). كانت تتركز سجرنا تجميع مكتبة لينتيفيروسيس وترانسدوسيد في خلايا مكافحة غسل الأموال MOLM13 مع بوليبراني (8.0 ميكروغرام/مل). بعد توصيل ح 48، تعامل الخلايا مع تركيز الأمثل بوروميسين. بعد 5 أيام، كانت تبذر الخلايا خلية/بئر واحدة في لوحات 96-جيدا واستنساخ واحدة تم إنشاؤها بحضور بوروميسين. وأخيراً، حددت سجرنا استنساخ واحدة متكاملة في المجين بخطوة واحدة الرايت-بكر، سانجر التسلسل والكشف عن الطفرات إينديل (الشكل 3). يتم تحديد استنساخ واحدة مقاومة بوروميسين من خلال خطوة واحدة الحبرية الرقمية RT-قبكر (RT-دكبكر) وفقا لتغيير التعبير عن السرطاني HOXA9 (الشكل 4). التنميط وتسلسل سانجر أجريت لبناء مكتبة سجرنا والتحقق (الشكل 2، الرقم 4).

سجرنا استهداف MOLM13 استنساخ الإيجابية في صفيحة بكر 96-جيدا تأكدت كذلك مع أسلوب RT qPCR استناداً إلى الجيناتمستويات التعبير من HOXA9 عن طريق مقارنة مع خلايا عنصر التحكم. من أصل 528 الباقين على قيد الحياة استنساخ فرزهم، 10 استنساخ عرضت أكثر من 50 ٪ تخفيض في مستويات HOXA9 (الشكل 4 أ). دمج سجرناس في HOXA9-خفضت، HOXA9-بدون تغيير، و HOXA9-استنساخ زيادة أكدتها كذلك التضخيم PCR التسلسلات سجرنا استخدام كبسولة تفجير ناقلات ترافقه. كانت متصلة في نظام ناقل T من خلال ليجاسى T4 المنتجات بكر المنقي وأرسله لتحديد تسلسل سانجر (راجع الخطوة 8). تسلسل البيانات أشارت إلى أن من أصل 30 استنساخ متسلسلة، تشمل استنساخ 21 سجرنا واحد (الجدول 2). وحددت فئات سجرنا وتحليلها وفقا لمستويات التعبير HOXA9 . ستة من عشرة استنساخ تبين أن ثمة انخفاضا في سجرناس المستويات الواردة HOXA9 استهداف الموقع CBS7/9، ولكن ليس في المورثات غير البشرية والجينات البشرية العشوائية و CTCF موقع عناصر التحكم الأخرى (الشكل 4 و الجدول 2).

سجرنا متكاملة إيجابية الطفرات إينديل الناجمة عن استنساخ واحدة تتحدد بواسطة الهضم التنميط ونوكلاس المستندة إلى بكر استناداً إلى التحليل نوكلاس (الشكل 5). والرزن الهضم نوكلاس قد أجريت للتعرف على الطفرات التي حدثت في الحدود CBS7/9 في الممثل HOXA9إينديل--قللت، HOXA9-بدون تغيير، و HOXA9-زادت الحيوانات المستنسخة. وكشفت النتائج أن الطفرة CBS7/9 وقد تم العثور عليها في 4 من أصل 6 HOXA9--خفضت استنساخ: استنساخ #5، 6، 28، و 121، لكن ليس في استنساخ #15 و #31 (الشكل 5). ولكن استنساخ #15 الواردة سجرنا استهداف الموقع لنكرنا هوتيب ، حين استنساخ #31 الوارد سجرناس عدة تستهدف لنكرنا HOAIRM1 ، HOTAIR لنكرنا، وكتكف HOXD9/10 ربط الموقع (4B الأرقام، 5 و الجدول 2).

Figure 1
الشكل 1 : رسم تخطيطي يبين مواقع الربط كتكف ولنكرناس في أربعة HOX الجيني المكاني- يحتوي كل عنصر الحمض النووي الاستهداف على 5-10 سجرناس مختلفة. كتكف رقاقة seq dataset تحميلها من توقعات البيئة العالمية (GSM1335528) وتصور مع عارض الجينوم المتكاملة (إيجف). كانت المسمى استهداف مواقع CTCF سجرنا في HOX المكاني مع المقص البرتقالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 2
الشكل 2 : رسم تخطيطي يمثل جزءا من دمج سجرنا ناقل تسلسل والإشعال التضخيم PCR. كبسولة تفجير التضخيم PCR صممت وفقا للتسلسل الذي فارغاً من النواقل لينتيفيرال سجرنا. التمهيدي إلى الأمام (P1) سلط الضوء باللون الأصفر وعكس التمهيدي (P2) سلط الضوء الأحمر وسلط الضوء سجرنا باللون الأخضر في ناقلات لينتيفيرال سجرنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 3
الشكل 3 : رسم تخطيطي يمثل سير العمل لتصميم مكتبة سجرناس والبناء والتحقق- يقوم سير العمل هذا كما يلي. أولاً، تم تصميم المكتبة سجرنا والمستنسخة في ناقل كريسبر لينتيفيرال، وثم تم حزم في لينتيفيروس مع سجرنا مكتبة لينتيفيرال ناقلات و psPAX2 و pMD2.G الناقلات في الخلايا HEK293T. بعد ذلك، الخلايا MOLM13 كانوا مصابين بفيروس موي (0.3) منخفضة وخضع اختيار بوروميسين لهذه الخلايا. ثم، وكان المصنف استنساخ واحدة في لوحة 96-جيدا. وأخيراً، حددت سجرنا نسيلة واحدة دمج جينوم خطوة واحدة RT-قبكر، تسلسل سانغر والكشف عن الطفرات إينديل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 4
الشكل 4 : المجمعة "كو" كريسبر-Cas9 مكتبة الفحص المحددة مع خطوة واحدة RT-قبكر وتسلسل سانجر. (أ) واحد خطوة الحبرية RT فحص PCR الرقمية التعبير HOXA9 في استنساخ واحد المصابين lentivirus يحتوي على مكتبة سجرنا. ويبين فحص سجرنا 528 مكتبة المصابة استنساخ لمستويات التعبير HOXA9 (528 النقاط). عشرة من الحيوانات المستنسخة 528 عرضت أكثر من تخفيض 50% في HOXA9 المستويات (الأرجواني السهام). يعني الخط الأحمر حدود التغيير نقصان إضعاف بمقارنة مع خلايا المراقبة؛ يعني الخط الأزرق الحدود لتغيير زيادة إضعاف. (ب) الستة استنساخ #5، 6، 28، 121، 207 و 420 استهدفت سجرنا CBS7/9 محددة من خلال تسلسل سانجر (الأسهم الخضراء). مستويات (ج) تحليل RT-دكبكر HOXA9 في MOLM13 بالوزن و 21 استنساخ سجرنا مستهدفة واحدة تحتوي على. تم تجميع البيانات التعبير HOXA9 إلى خمس مجموعات طبقاً للفئات من تسلسلات سجرنا: موقع كتكف HOXA7/9 ، أهدافا غير البشرية، ومواقع أخرى كتكف في المكاني HOX ، لنكرناس HOX المرتبطة، و أهداف بشرية أخرى. لقد تم تعديل هذا الرقم من لوه et al.12. للإحصاءات، مثلت هذه البيانات ك ± يعني SD من ثلاث تجارب مستقلة مع اختبار t للطالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : و أكد الطفرات إينديل لاستنساخ الإيجابية سجرناس المتكاملة مع الفحص الوراثي ونوكلاس المستندة إلى PCR. (A)  "الحمض النووي" تم عزلها من الممثل "كو" كريسبر-Cas9 مكتبة فحص النسخ التي أظهرت انخفاض أو دون تغيير، أو زيادة مستويات التعبير HOXA9 . وحددت التنميط القائم على بكر متخالف حذف الموقع CTCF يقع بين HOXA7 و HOXA9 الجينات (الحدود CBS7/9). HOXA9--انخفض الحذف استنساخ #5، 6، 28، و 121 معروضة في موقع الحدود CBS7/9 (الأسهم السوداء). (ب) "إينديل" الطفرات في موقع CBS7/9 تم تحليلها من قبل نوكلاس الهضم المقايسة من الممثل المستنسخين التي أظهرت انخفاض (خط أحمر)، دون تغيير (الخط الأزرق)، أو بزيادة مستويات التعبير HOXA9 (خط أرجواني). HOXA9--انخفض الطفرات استنساخ #5، 6، 28، و 121 معروضة في موقع الحدود CBS7/9 (البرتقال الأسهم). لقد تم تعديل هذا الرقم من لوه et al.12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

الجدول 1: سجرناس تجمع معلومات مكتبة الاستهداف. هذه البيانات من لوه et al.12. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: سانجر ترتيب نتائج سجرناس قدم في المحدد HOXA9 --انخفضت، HOXA9 -بدون تغيير، و HOXA9 -زاد المستنسخين. HOXA9--استنساخ نقصان ودون تغيير وزيادة المميزة في الأحمر والأزرق والأرجواني، كل على حدة. هذه البيانات من لوه et al.12. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتين-ترميز الجينات المتعلقة بالمكتبات سجرنا قد طبقت في نظام فرز وظيفية لتحديد الجينات وشبكات تنظيم الوظائف الخلوية المحددة من خلال سجرنا تخصيب24،،من2526 ،،من2728. المنطقة غير الترميز عدة تتعلق بالمكتبات سجرنا وظهرت أيضا في الشاشات الخاصة بالجينات الوظيفية للقاصي والدانية تنظيم العناصر، بما في ذلك BCL11A، Tdgf1a ، ومقاومة العقاقير تنظيم الجينات28، ،من 2930. هذه المكتبات سجرنا جميعا تم إنشاؤها باستخدام المعلوماتية الحيوية مفصلة تصميم، توليف اليغنوكليوتيد، وشبه الاستنساخ pool(s) اليغنوكليوتيد في ناقلات. نهج الفرز على نطاق الجينوم كله قوية ومفيدة جداً ولكن يتطلب الخبرة الحسابية لتصميم سجرنا على نطاق الجينوم والتمويل الثابت لتوليف مكلفة؛ وهكذا، أنها لا تزال تمثل تحديا لمعظم المختبرات. ومع ذلك، مكتبتنا سجرنا المكاني-خاصة بفحص النهج سواء ملائمة وفعالة لتحديد العنصر الحمض النووي محددة مثل موقع الربط CTCF تشارك في تنظيم الكروماتين وتنظيم النسخي (الشكل 1 و الشكل 2). باستهداف حدود كتكف، طبقنا RT-PCR خطوة واحدة لتقييم استنساخ سجرنا المستهدفة وفقا لمستوى تعبير الجينات علامة معينة، HOXA9. وباﻹضافة إلى ذلك، أجرينا سانغر التسلسل لتأكيد هذه الحيوانات المستنسخة سجرناس المتكاملة الإيجابية (الشكل 2 و الشكل 4). وظيفيا تأكيد هذه سجرناس إيجابية تستهدف استنساخ، قمنا بتنفيذ المستندة إلى بكر الوراثي والطفرات كشف تحليل من أجل تحديد ما إذا كان سجرنا الحث على هدف الموقع إدراج أو حذف الطفرات (الشكل 5). وهذا يعطينا طريقة واعدة لاستهداف عناصر الحمض النووي الترميز غير محددة وتقييم وظيفتها البيولوجية في خلايا الثدييات.

لدينا بروتوكول، ذكرنا أن يضمن تصميم اليغنوكليوتيد محددة أكثر كفاءة دون الاستنساخ في ناقلات lentiCRIPSRV2 وأكثر تولد موثوق في مكتبة سجرنا دقيقة (الخطوات 1-2). من أجل الحصول على لينتيفيروس مكتبة سجرنا عيار عالية، ينبغي أن تكون المادة طافية لينتيفيرال مركزة 50-fold باستخدام مركزات يتبع البروتوكول (الخطوة 3)، وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية في مختبرين متعددة (الخطوات 3.1-3.5). شاغل إضافي هو إيجاد قيمة موي الأمثل لتوصيل. إذا كانت وزارة الداخلية منخفضة جداً، سوف ينخفض عدد الخلايا المصابة وتؤدي إلى سجرنا الفحص فشل. إذا كانت وزارة الداخلية عالية جداً، سوف تدمج سجرنا واحد أو أكثر في خلية واحدة، وأنها سوف تتداخل مع المكتبة سجرنا الفحص من خلال خطوة واحدة RT-PCR والكشف عن الطفرة إينديل. ولذلك، قبل الفحص، إيجاد وزارة الداخلية الأمثل لكل مجموعة من الخلايا عن طريق معايرة مكتبة لينتيفيرال خطوة هامة. سوف تنفذ معايرة مكتبة لينتيفيرال في خلايا سرطان الدم MOLM13 والتقييم من وزارة الداخلية في البروتوكول (خطوات 5.1 – 5.10). وعلاوة على ذلك، يمكن ضمان ليسينج شامل للخلايا للنسخ العكسي RT-PCR ناجح في خطوة واحدة. يمكن أن يتم ذلك بزيادة فترة الحضانة لتحلل جميع مراحل درجة الحرارة في البروتوكول (خطوات 7.5 – 7.6). ولذلك، بغية تعزيز كفاءة لفحص المكتبة كريسبر-Cas9 "كو" المجمعة، خلية شامل تحلل والنسخ العكسي تلعب دوراً حاسما في تحديد خطوة واحدة RT-قبكر (خطوات 7.1 – 7.14). بالإضافة إلى ذلك، يمكن ضمان زيادة جودة المنتجات PCR الكشف عن الطفرات إينديل ناجحة، نظراً لتدني نوعية المنتجات PCR سوف تؤثر على عملية توليد هيتيرودوبليكس/هومودوبليكس (خطوات 9.1 –.6).

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الطريقة لتحديد دور كتكف في تنظيم HOX الجينات في التطور الجنيني المبكر واللوكيميا معينة مع الشاذة HOX الجينات التوقيع. على سبيل المثال، HOX الجينات تلعب أدواراً حاسمة خلال التطور الجنيني وجميع المجموعات الأربع من جينز HOX مقيدة زمنياً ومكانيا في أنماط التعبير في التنمية الجنينية. وعلاوة على ذلك، والطفرات NPM1 من بين التشوهات الجينية الأكثر شيوعاً في مكافحة غسل الأموال، وتمثل 30 في المائة مرضى مكافحة غسل الأموال مع تناذر الخلوية الوراثية العادية31. يسلك هذه المجموعة الفرعية لمكافحة غسل الأموال شاذة هوكسا و حزب جينات توقيعاً، الذي يصبح إليه مهيمنة للتحول ليوكيميك17. من المهم توضيح كيف ينظم HOX الجينات في التطور الطبيعي و dysregulated أثناء ليوكيموجينيسيس. نحن وآخرون أظهرت أن كتكف دوراً أساسيا في الكروماتين المنظمة والجينات النسخ في HOX المكاني9،12. وهكذا، بفحص المكتبة سجرنا المكاني وركزت HOX يوفر وسيلة مريحة توريط الوظيفة المحددة للموقع ملزم كتكف في تنظيم الجينات HOX خلال التنمية، والأورام الخبيثة المكونة للدم. ومع ذلك، حد النهج هو صعوبة العثور على علامة مفيدة لتسلسل الجيل الفائق. أحد أهداف البحوث في المستقبل سيكون للبحث عن علامة انتقائية للغاية والاضطلاع على نطاق الجينوم تسلسل الجيل المقبل من أجل معرفة الآثار على العلامة. ولذلك، باستخدام جين معين معلم علامة نيون المراسل تتبع سوف تصبح أداة حاسمة في المستقبل خطط البحوث.

القدرة على لعب العديد من الأدوار الهامة في تنظيم التعبير الدالة والجينات المروج. ومع ذلك، فإنه أيضا تفعيل نشاط المروج من مسافة بعيدة بطريقة مستقلة الموقف والتوجه، وغالباً ما تنظم القدرة على التعبير الجيني في اتجاه عبر . وهكذا، فإنه يمثل تحديا لتحديد enhancer(s) لجينات محددة، لا سيما في حقبة ما بعد الجينوم. فحوصات مراسل التقليدية والتحليلات الفنية الارتباطية (مثلاً، إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين وفحوصات دناسي شديدة الحساسية) قد استخدمت لدراسة محسن الدالة32،33. وبالمثل، طبقت أيضا عروض تركز على موضع المحجمة صغيرة لاستكشاف أنشطة العناصر التنظيمية البعيدة والقريبة لجينات محددة34. في الآونة الأخيرة، استراتيجية مكتبة كو سجرنا المجمعة التي تستهدف العناصر التنظيمية غير الترميز في مواضع الجينات HOX بنجاح تحديد موقع ملزمة CTCF الواقعة بين الجينات HOXA7 و HOXA9 ، فضلا عن لنكرنا هوتيب وهذا ذات أهمية حاسمة للسيطرة على مؤخرة هوكسا الكروماتين المجال المنظمة، والذي يدفع التعبير الجيني هوكسا حمل خارج الرحم في سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال)12. هذه الدراسات تبين أن فحص مكتبة المجمعة سجرنا-كو أيضا اتباع نهج علم الوراثة قوية لتحديد وتقييم الوظيفة البيولوجية للعناصر غير الترميز في الجينوم لدينا في الموقع.

كتكف، بروتين عازل الكروماتين، يلعب دوراً هاما في منظمة الجينوم بتعريف الأحياء الكروماتين لأنماط التعبير جين معين في خلية معينة نوع11،35. تغيير بنية المجال المقترن توبولوجيكالي (صبي) يغير التفاعلات محسن/المروج، نتج عنه5،دولة مريضة11. كتكف هو الغاية المصانة في تواليات وأثرى في حدود صبي. ومع ذلك، يظل من غير الواضح مدى وكيفية كتكف يسهم في الحفاظ على الهيكل الحدود الكروماتين وتشكيل صبي. على الرغم من أن فحص مكتبة سجرنا-خروج المغلوب CTCF المجمعة انصب على المكاني HOX الأربعة، فقد ثبت أن تكون وسيلة قوية تحديد وتشريح حدود كتكف، وتحدد المجال صبي، فضلا عن التفاعل محسن/المروج والنسخ داخل المجال تاد12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب كفاءة لتحديد عناصر لنكرنا وعوامل النسخ التي تتوسط تكيف الكروماتين وإمكانية الوصول إلى النشاط في HOX المكاني. أننا نحاول أيضا استكشاف كريسبر/سجرنا المكتبة التي تحتوي على مواقع CTCF المجين على نطاق المنظومة عن طريق تحديد تسلسل الجيل المقبل وفقا كتكف الرقاقة-seq والحيوانات الأليفة شيا البيانات البحثية في المستقبل. وهكذا، يمكن توسيع هذه الاستراتيجية على كروموسوم كله أو حتى أن الجينوم كامل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لدينا لا تضارب في المصالح المتصلة بهذا التقرير.

Acknowledgments

كما يشكر المؤلفون سيزاري نيكولاس لتحرير المخطوطة. وأيد الأعمال المنح المقدمة من "المعهد الوطني للصحة" (أدمغة، R01DK110108، R01CA204044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Proteinase K Thermo Fisher Scientific 25530049
Puromycin Thermo Fisher Scientific A1113802
Stbl3 cells  Life Technologies  C737303
HEK293T ATCC CRL-3216
MOLM-13 DSMZ ACC 554
lentiCRISPRv2 Addgene 52961
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
pGEM®-T Easy Vector Systems  Promega A137A
T4 ligase  New England Biolabs  M0202S
QIAquick Gel Extract kit QIAGEN 28706
QIAuick PCR purification kit QIAGEN 28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit Bio-Rad Laboratories 1725095
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific  11965084
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 11875093
Fetal bovine serum (FBS)  Thermo Fisher Scientific 10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine  Life Technologies  10378016
Lenti-X Concentrator  Clontech 631232
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Genessee Scientific  25-507
TAE buffer  Thermo Fisher Scientific  FERB49
Surveyor® Mutation Detection Kits Integrated DNA Technologies 706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc System Bio-Rad 170-8126
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000138
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Fisher Scientific 88870002
TSX Series Ultra-Low Freezers Thermo Fisher Scientific TSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series Thermo Fisher Scientific 75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths Thermo Fisher Scientific FSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems Thermo Fisher Scientific 13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
MiniAmp™ Thermal Cycler Applied Biosystems technology A37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply Thermo Fisher Scientific 7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fisher Scientific 09-528-178
VWR® Tube Rotator and Rotisseries VWR International 10136-084
VWR® Incubating Mini Shaker VWR International 12620-942
Analytical Balance MS104TS/00 METTLER TOLEDO 30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer DeNovix Inc. DS-11 FX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Tags

علم الوراثة، 145 قضية، كريسبر/Cas9، وفحص مكتبة سجرنا، الحدود كتكف، HOX المكاني، خطوة واحدة RT-قبكر، إينديل الطفرة الكشف، "سرطان الدم النقوي الحاد"
<em>HOX</em> المكاني مركزة كريسبر/سجرنا "مكتبة الفرز تحديد الحرجة كتكف الحدود"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D.,… More

Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D., Brewer, E., Dovat, S., Qiu, Y., Huang, S. HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries. J. Vis. Exp. (145), e59382, doi:10.3791/59382 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter