Summary
CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA ライブラリをについて説明します。
Abstract
CCCTC 結合因子 (CTCF)-仲介された安定した位相ドメインを関連付ける (TADs) 近隣 TADs のある DNA 要素の制約の相互作用で重要な役割を果たします。CTCF は、胚や体のパターン形成、造血、白血病を制御するHOX遺伝子発現の時空の調節に重要な役割を果たしています。しかし、それはHOX遺伝子の関連付けられている CTCF 境界クロマチン構造およびHOXの遺伝子発現を調節する方法かどうか、主として未知に残る。現在のプロトコルで少し形成とHOX遺伝子のクロマチンの CTCF 関連付けられた境界を中断することの効果を検討するHOXA/B/C/D座すべて CTCF 結合部位をターゲット特定 sgRNA プールされたライブラリが生成されました。式です。CRISPR Cas9 を介して遺伝学的スクリーニング、 HOXA7/HOXA9遺伝子 (CBS7/9) の間にある CTCF 結合部位は、 HOX遺伝子の異所性の維持のために重要であることと同様、発癌性クロマチン ドメインの重要な調節因子として同定されています。MLL 再配置の急性骨髄性白血病 (AML) の発現パターン。したがって、スクリーニングのアプローチこの sgRNA ライブラリの特定遺伝子座における媒介 CTCF ゲノム構成に新しい洞察力を提供し、また両方のコーディング、注釈付きの遺伝的規制要素の機能特性の基礎を提供し、ポスト人間ゲノム プロジェクト時代の正常な生物学的プロセスの間に、非翻訳。
Introduction
最近のゲノムの相互作用の研究では、細胞の種類と種の間で保存されているトポロジとして関連付けるドメイン (TADs) を人間の核ゲノム フォームに安定を明らかにしました。ゲノムの組織を別ドメインは容易、規制要素 (例えば、エンハンサーやプロモーター) 間の相互作用を制限します。CCCTC 結合因子 (CTCF) 少しの境界に、近隣 TADs1である DNA 要素の制約の相互作用に重要な役割を果たしています。ただし、ゲノム広い CTCF のデータ バインディングは、CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取りが多くの場合として機能する他の示唆ではなく 1 つのセル型で特定のサイトでのクロマチン障壁を明らかにしたその CTCF 関数クロマチンの境界2の形成の他の活動。かどうか境界要素 (CTCF 結合部位) に直結する、CTCF の生物学的機能と、これらのリンクが発生する方法は不明のまま。したがって、我々 はゲノムの特定の CTCF 結合サイトは直接 TADs の形成を調節して制御プロモーター/エンハンサー相互作用ドメイン内または隣接ドメイン間と仮定します。人間とマウスのゲノム プロジェクト以降のエピジェネティクス解析の完了は、ゲノムの分子および遺伝の新しい署名を発見されています。しかし、遺伝子細胞の機能とその分子機構、特定の署名/変更の役割はまだ完全に理解するのにあります。
証拠の複数のラインをサポート CTCF を介した TADs はクロマチン機能ドメイン3,4,5を表します。CTCF とほとんど同じ DNA サイトを異なる種類の細胞でやり取り、ゲノム広い CTCF チップ seq データが判明 CTCF しばしば他の2ではなく 1 つのセル型でクロマチン バリアとして機能しています。CTCF はゲノム組織4,6,7を仲介することにより開発時に重要な役割を果たしています。CTCF 境界の中断障害エンハンサー/プロモーターの相互作用および遺伝子発現、発達的閉塞に 。TADs を CTCF に関与が示唆された構造のコンポーネントだけでなく、適切なエンハンサー アクションと遺伝子転写5,8,9に必要な規制の単位が。
HOX遺伝子は萌芽期の開発の間に重要な役割を果たす、彼らが時間的、空間的制限されてその発現パターン。HOXA軌跡 hESCs と IMR90 セル1の CTCF 関連付けられた境界要素で前部と後部の遺伝子を分離する 2 つの安定した TADs を形成します。最近のレポートは示したHoxBlinc、 HoxB軌跡関連付けられている lncRNA が CTCF の形成を仲介する TADs およびHOXB軌跡のプロモーター/エンハンサー相互作用を監督します。これは ESC のコミットメントと分化の10の間に前部HOXB遺伝子の活性化に します。さらに、 HOXAの軌跡を含む特定の遺伝子座、CTCF の変質は少しドメイン変更系統特異的遺伝子発現プロファイルを介したし、疾患状態11,12の開発に関連付けられていた。証拠は、遺伝子転写の調整と機能ドメインにゲノムを組織することによって細胞のアイデンティティを決定する CTCF の主な機能をサポートします。
HOX遺伝子は, 造血巣の中に萌芽期の開発に於いての役割にもかかわらず造血幹・前駆細胞 (HS/PC) の機能を調節します。これは、増殖・分化10,13,14,15の間のバランスを制御することによって行われます。HOX遺伝子の発現が仕様と HS の最高の表現で、造血細胞の分化の中で堅く調整される pc HOX遺伝子発現は徐々 にその最も低いレベルの成熟に伴う減少/造血細胞16を区別で発生しています。HOX遺伝子の調節不全は、HS/pc 白血病変換17,18につながる dysregulating の自己複製と分化プロパティによる白血病変換の支配的なメカニズムです。ただし、確立と関連規制の網と同様、 HOX遺伝子の発癌性発現パターンと通常を維持のメカニズムは不明のまま。
CRISPR Cas9 sgRNA ライブラリ スクリーニングは、lncRNA20 miRNA21種なども、非コーディングの遺伝子と蛋白質のコーディングの遺伝子19を尋問する広く使用されています。ただし、新しいゲノム標的を識別する CRISPR Cas9 sgRNA ライブラリを使用するためのコストは、高スループット ゲノム sgRNA ライブラリ スクリーニングに応用する頻繁ので高、まま。スクリーニング システム私たちの sgRNA は特定ゲノム遺伝子に焦点を当てたし、 HOXA9などのマーカー遺伝子の発現によるとワンステップ RT-PCR をターゲット sgRNAs を評価します。さらに、サイトをターゲット sgRNA を識別するためにサンガー シーケンス確認、sgRNA はゲノムと塩基変異に統合されたことを検出できます。軌跡固有 CRISPR Cas9 の遺伝学的スクリーニングを通じて CBS7/9 クロマチン境界は発癌性クロマチン ドメインを確立し、急性骨髄性白血病の病因における異所性のHOX遺伝子の発現パターンを維持するための重要な調節因子として同定されています。12. メソッドは、将来のエピジェネティック療法の潜在的な治療上のターゲットとして CTCF 萌芽期の開発、造血、白血病がまた CTCF 境界の境界だけでなく特定の機能を識別するために広く適用できます。
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Protocol
1. CTCF sgRNALibrary オンライン ツールを使用して設計
- 遺伝的摂動プラットフォーム (GPP) デザイナー ツール (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) を使用して人間のHOX遺伝子の CTCF 結合部位をターゲット sgRNA をデザインします。
- 303 ランダム ターゲット遺伝子、60 のポジティブ コントロール、500 の非人間ターゲット コントロール 207 CTCF 要素または lncRNA (図 1表 1) 遺伝子をターゲット対象と sgRNAs から成る 1,070 の sgRNAs の合計を合成します。各ターゲット DNA 要素は 5-10 の異なる sgRNAs の対象となります。
2. sgRNA ライブラリのクローニング
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CRISPR レンチ ウイルス バックボーン ベクトル (lentiCRISPRv2) に合成オリゴヌクレオチドを複製します。
- LentiCRISPRv2 ベクター 2 h の 37 ° C で BsmBI 制限の酵素と消化します。
- 大きいバンドの存在を探すため (約 12,873 bp) BsmBI 消化後ゲルのゲルの抽出キットを浄化し、。
注:2 kb 小さいフィラー部分も、消化後ゲル上に存在がこれは無視されます。 - 合成オリゴヌクレオチドを縛るし、150 LentiCRISPR ベクトルを消化の ng 1 μ 10 μ M oligos、10 x T4 リガーゼ バッファー 2 μ、1 μ L T4 リガーゼの LentiCRISPR DNA を消化し、一晩で, 16 ° C で。
-
レンチ ウイルスの CRISPR/sgRNA ライブラリを増幅用エレクトロ有能なセルに変換します。
- 1.8 で本体を準備 25 μ F、200 Ω kV。あらかじめ回復 37 ° C の水浴の SOC のメディアを暖かくし、あらかじめ暖かい 37 ° C で LB アンピシリン抗生物質プレート
- 10 分間氷の上有能なセルを解凍します。
- 氷の上のエレクトロポレーション キュヴェット 1.5 mL マイクロ遠心チューブと 1 mm を準備します。
- 1.5 mL のマイクロ遠心チューブに有能なセルの 25 μ L に 10 ng/μ L ライブラリ プラスミッド DNA の 1 μ L を混合し、数回手動で管の底をフリックで優しく混ぜます。
- キュヴェットは十分に寒いです、一度、DNA/有能な細胞の混合物を転送します。カウンターを 2 回たたくし、ティッシュ ペーパーでキュヴェットの外から水滴を拭いてください。キュヴェットをエレクトロポレーション モジュールで、パルスを押します。
- すぐに 37 ° C に予め温めておいた SOC のメディアの 975 μ L を追加します。上下にピペッティングして 15 mL チューブへの転送のミックス。
- 回転し、37 ° C 1 時間インキュベートします。
- 900 μ L の SOC のメディアに 100 μ L 細胞を希釈し、LB アンピシリン抗生物質寒天プレートに 100 μ L を配置します。37 ° C で一晩インキュベートします。
-
製造元のプロトコルの詳細としてマキシ prep 列を使用して結合されたコロニーからプラスミド DNA を抽出します。
- LB 寒天培地プレートからすべてのコロニーをこすりとスターター文化 LB アンピシリン抗生物質培地 2 mL を接種して活発な動揺 (~ 200 x g) 37 ° C で一晩インキュベートします。
- LB アンピシリン培地 100 mL にスターター文化レバレッジを希釈し、活発な動揺 (~ 200 x g) で 12-16 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- 4 ° C で 15 分間 6,000 × gで遠心分離することで細菌の細胞ペレットを収穫します。
- 再懸濁液バッファーの 10 mL の細菌のペレットを中断します。
- 10 mL の溶解バッファーで中断されたペレットを溶解し、精力的に反転 4-6 回。ライセートの室温で 5 分間インキュベートします。
- チルドの中和バッファーの 10 mL で溶解液を中和します。ミックスを軽く反転管 4-6 回と氷の上に 20 分間インキュベートします。
- 4 ° C で 30 分間 13,500 x gでスピンダウンします。上清を新しいチューブにプラスミド DNA を含むを速やかに転送します。
- 2.3.7, 手順を繰り返し、上清を新しいチューブにプラスミド DNA を含むを速やかに転送します。
- 10 mL の平衡バッファーを適用することによってコラムを平衡させ、重力流による空の列ができます。
- 列に上清を追加し、重力流によって樹脂を入力できるようにします。
- 2 x 30 mL 洗浄液を洗い流します。
- 15 mL の溶出バッファーで DNA を溶出します。
- 10.5 ml 溶離された DNA を室温イソプロパノールの DNA を沈殿させます。ミックスのスピン 4 ° C で 30 分間 15,000 × gですぐにダウンし、優しく、上清をデカントが。
- 15,000 × g 10 分間遠心分離機 DNA ペレット 70% エタノール 5 mL で DNA ペレットを洗浄し、クリアの上澄みを廃棄します。
- 2.5.14 倍の手順を繰り返します。
- 15,000 × g , 10 分間で DNA の餌を遠心し、優しく DNA の餌を乱すことがなく、上清をデカントします。
- 5-10 分のペレットを風乾、バッファー (TE バッファー、pH 8.0) の必要量の DNA を溶解します。
3. 高価 sgRNA ライブラリ レンチ ウイルスを生成
- セルの準備: 文化 HEK293T 細胞でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% (巻/巻) ウシ胎児血清 (FBS)、T-25 フラスコで 1% (巻/巻) ペニシリン-ストレプトマイシン (PS) 抗生物質。37 ° C、5% CO2インキュベーターに入れます。
- レンチ ウイルスのパッケージ: 共同 transfect HEK293T 細胞精製ライブラリからのベクトル ステップ 2、パッケージ プラスミド (psPAX2) の 15 μ g ・ 10 μ g ウイルスを収穫前に 48 h の封筒プラスミド (pMD2.G) の 20 μ g。
- ウイルス コレクション: 後 48 h、料率ウイルス上清と 0.45 μ m 低蛋白結合 PVDF 膜培養上清中のウイルスをフィルターします。
- ウイルス濃度: 50 コンセントレーターを使用してレンチ ウイルス上清を集中し、5 の手順でウイルス MOI をテストします。
- ウイルス ストレージ: 因数集中的ウイルス、-80 ° C の冷凍庫に保管します。
4. 最適化ピューロマイシン濃度
- 白血病細胞培養: 10% (巻/巻) ウシ胎児血清 (FBS) と T-125 のフラスコの中のペニシリン-ストレプトマイシン (PS) 抗生物質 x 1 添加 RPMI 1640 年に文化 MOLM13 AML 細胞。37 ° C、5% CO2インキュベーターに入れます。
注:セルは通常 70% の confluency 以上の分割比 4:1 または 1:6 に到達する細胞をできないようにすることですべての 4-5 d を渡されます。 - MOLM13 細胞密度 (10 の4セル × 2.0) ウェルあたり 2 mL の容量で 104セル/mL、x 1.0 12 ウェル プレートを設定します。
-
経時的分析: 治療 MOLM13 細胞濃度 (0.1 μ g/mL、0.2 μ G/ml、0.5 μ G/ml、1.0 μ g/mL、2.0 μ g/mL) の増加で 7 日間の産
- 0 日目にピューロマイシンなし MOLM13 セルを設定し、セットアップ コントロールとしてピューロマイシンなし 3 複製井戸 0 日目から 7 日目。
- 3 複製井戸を含む各実験条件と別に、0.1 μ g/mL、0.2 μ g/mL、0.5 μ G/ml、1.0 μ g/mL、2.0 μ g/mL、MOLM13 細胞を扱います。
- 生細胞率をカウントし、すべての条件を含まれている 7 日目を 0 日から生存曲線を作る。
- 生存曲線: トリパン ブルーとカウントの存続可能性毎日各ピューロマイシン濃度の生存曲線を取得すると細胞を染色します。
- 最低限ピューロマイシン濃度の最適化: 5-7 日間のすべての MOLM13 でセルに殺されるトリパン ブルー染色を最小限ピューロマイシン濃度を決定します。
5. MOLM13 白血病細胞におけるレンチ ウイルス ライブラリの滴定
- 急性骨髄性白血病細胞の準備: 伝達媒体 MOLM13 AML 細胞を収集 (RPMI 1640 年 10 %fbs、1 %ps と 8.0 μ g/mL コーティング媒体) 1.5 x 10 の密度で6セル/mL です。
- 各ウェルに 10 の6セル × 1.5 12 ウェル プレートに MOLM13 セルを配置します。
- 解凍、レンチ ウイルス:-80 ° C のフリーザーから集中のレンチ ウイルスを削除し、氷の上にそれを解凍します。
- 0、1、2.5、5 を含む別の井戸で集中レンチ ウイルスの異なる用量でミックス MOLM13 セル 7.5 と 10 μ L (総 6 グループ)。
- すぐに 33 ° C で 2 時間 1,000 x gでこれらの混合物を遠心分離し、12 ウェル プレートを 37 ° C および 5% CO2で 4 h のためのインキュベーターに転送します。
- 4 h 後室温で 5 分間 400 x gで感染した細胞をスピンします。
- 優しく細胞ペレットを乱すことがなく、上清を吸引再新鮮なメディア (RPMI 1640、10 %fbs と 1 %ps) で導入された細胞を中断、T-25 フラスコに転送し、, ピューロマイシンなし 48 h の 37 ° C で。
- 48 時間後 2 フラスコ (2 グループ) にこれらの細胞を分割: 1 μ G/ml ピューロマイシンで 5 日間、治療実験グループと 5 日間ピューロマイシンなし制御グループ。
- すべての非導入制御の細胞が死んでいるまで 5 日間ステップ 4 に従って 1 μ G/ml ピューロマイシン ピューロマイシンを選択を実行します。新鮮なメディア 2 日ごとの交換です。
- ライブ ピューロマイシン ピューロマイシンなし細胞数と細胞数を割ることによって伝達の最適化された慣性モーメント値を測定します。
6. プール CRISPR Cas9 KO ライブラリの伝達
- レンチ ウイルスの伝達: 1.5 倍の中プール sgRNA レンチ ウイルスの 0.3 MOI 106 MOLM13 細胞に感染 (RPMI 1640 年 10 %fbs、1 %ps、8 μ g/mL コーティング媒体) 6 ウェル プレートでコントロールとしてレンチ ウイルス感染細胞を使用し、。
- すぐに spinfect への 33 ° C で 2 時間 1,000 x gで 6 ウェル プレート細胞を遠心分離し、プレートを 37 ° C、5% CO2で 4 h のためのインキュベーターに転送します。
- 室温で 5 分間 400 x gで感染した細胞をスピンします。
- 優しく細胞ペレットを乱すことがなく上清を吸引し新鮮なメディア (RPMI 1640、10 %fbs と 1 %ps) で導入された細胞を再停止 T-25 フラスコに転送し、ピューロマイシンなし 48 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- 48 時間後の 5 日間 1 μ G/ml ピューロマイシンとセルを扱います。2 日後、新規メディアの交換し、最適な細胞密度で維持します。
- 希釈方法を制限することに 96 ウェル プレートで単一のクローンをシードし、37 ° C および 5% の CO2のこれらの単一クローンを孵化させなさい。3-4 週間の彼らを文化します。
- 単一のセルは人口に育つ後、さらに養殖ピューロマイシンを選択 24 ウェル プレートにセルの半分を転送次のステップでこれらのクローンを確認してください。セルの残りの部分を保ちます。
7. ワンステップ Rt-qpcr プール CRISPR Cas9 KO ライブラリーのスクリーニング
- SgRNA 統合されたクローン一歩逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (ワンステップ Rt-qpcr) とマーカー遺伝子HOXA9の発現を評価することによってスクリーニングの有効性を決定します。
注:HOXA9は高い白血病22,23MOLM13 AML 細胞で表されます。 - カウント、sgRNA は、MOLM13 セルおよび転送 1 × 104細胞/ウェルの 96 ウェル PCR プレートに統合されています。
- 1,000 x gで 5 分でチューブを遠心分離機し徹底的に削除し、細胞ペレットを乱すことがなく、ピペットで上澄みを廃棄します。
- 125 μ L の PBS バッファーで細胞を洗浄し、1,000 x gで 5 分でチューブを遠心分離します。120 μ L のピペットを使用して上清を削除し、約 5 μ L の PBS 各井戸を保持します。
- 48 μ L のセル換散バッファー、プロテイナーゼ K 溶液 (10 mg/mL) の 1 μ L、DNase 溶液 (1 mg/mL) 1 μ L を含むセル換散のマスターの組合せの 50 μ L を各ウェルに追加します。その後、細胞ペレットを再停止する 5 回上下ピペットで移しなさい。
- 37 ° C で 5 分間続いて、室温で 10 分間のミックスをインキュベートし、5 分、75 ° C。
- -80 ° C のフリーザーの細胞ライセートを格納します。
- ワンステップ RT qPCR 反応の準備: ワン・ステップ反作用の組合せおよび 4 ° C の他の反応コンポーネントを解凍後、スピンダウンについて簡単にチューブの下部にソリューションを収集し、光のない氷の場所します。ミックスし、軽くスピンします。
- マーカー遺伝子の前方プライマーの 1 μ L を含む RT qPCR 反応ミックスと PCR 井戸に細胞ライセートの 1 μ L を追加 (300 nM) と逆プライマー (300 nM)、逆転写酵素 (10 U/μ L)、0.125 μ とワンステップの反作用の組合せ (2 x) の 5 μ L。
- 光学的透明フィルム、優しく渦と井戸をシールし、反応成分をミックスします。
- リアルタイム PCR 機器に 96 ウェル PCR プレートを配置します。
- 続いてポリメラーゼの不活性化と DNA の変性 95 ° C で 1 分の 50 ° C で 10 分間逆のトランスクリプション反作用を実行します。
- PCR の反作用の 40 のサイクルと RT-PCR を実行: 15 変性 95 ° C、焼鈍/エクス テンション、プレート蛍光 20 のための読書で 60 ° C とし、2-5 秒/ステップで 0.5 の ° C 単位で 65-95 ° C で融解曲線解析で s。
- 誘導、ダウンレギュ レート、 HOXA9遺伝子の発現レベルに従った変更グループはありませんちなみにコントロールには別にセットアップします。ハウスキーピング遺伝子制御としてβ-アクチン遺伝子を使用します。
8. 統合 sgRNAs ジェノタイピングとサンガー シーケンスを通して肯定的なクローンの検証
- サンガー HOXA9減少発現クローンを確認 50 100 ng MOLM13 ゲノム DNA の 5 μ L ポリメラーゼ反応バッファー (10 x)、1 μ L 前方プライマー (10 μ M) で PCR を行いシーケンス (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) と逆の 1 μ Lプライマー (10 μ M) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG)、1 μ L dNTP (10 mM)、1 ユニット ポリメラーゼ (5 U/µL)。30 の初期変性 94 ° c で PCR の反作用を実行 s、およびより変性 94 ° c 20 s、20 56 ° C で熱処理 s、20 68 ° C で拡張子 s (合計 30 サイクル)、68 ° C 10 分で最後の拡張、4 ° C で押しと
- 抽出し、PCR 精製キットで PCR の製品 (サイズ 285 bp) を浄化します。
- 2 μ L T4 結紮バッファー (10 倍) 50 ng T ベクター DNA を持つ T ベクターに精製 PCR 産物を縛る (50 ng/μ L)、25 ng 精製 PCR DNA (285 bp)、1 μ L T4 リガーゼ (3 単位/μ L)、および場所、結紮は一晩、16 ° C の定温器にミックスします。
- DH5α 有能なセルに結紮ミックスを転送、LB アンピシリン抗生物質寒天プレートに成長し、37 ° C で一晩インキュベート
- LB プレートから単一のクローンをピックアップし、遺伝子型とサンガーによる検証を行うシーケンス。
9 sgRNAs ヌクレアーゼ消化法による誘導塩基変異の検出
- SgRNA の統合された単一のクローンはヌクレアーゼ試験分析による塩基料金を検出します。
- 50-100 ng 塩基変異 (テスト) と野生型 (WT、参照) DNA PCR のテンプレートとして PCR 産物を別途準備 5 μ L ポリメラーゼ反応バッファー (10 倍)、1 μ L dNTP (10 mM)、1 ユニット ポリメラーゼ (5 U/μ L)、1 μ L 前方プライマー (10 μ M) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') と 1 μL 逆プライマー (10 μ M) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3')。PCR の反作用は 98 ° C、30 秒で初期変性し、変性 20 98 ° C で行われた 20 56 ° C で熱処理 s s、30 秒 (合計 30 サイクル)、72 ° C での拡張子と最終的な 10 分のための 72 ° c、4 ° C で押し
- 200 とヘテロ二本鎖の混合グループを設定「参照」(20 ng/μ L) および 200 の ng 0.2 mL PCR チューブに「テスト」(20 ng/μ L) PCR 産物の唯一の 400 homoduplex 混合グループ ng「参照」コントロールとして PCR 産物の ng。
- 別に 800 mL の水でいっぱいとアニールし、ヘテロ二本鎖または homoduplexes を形成するために室温を徐々 にクールダウンし、1 L ビーカーに 5 分 95 ° C でヘテロ二本鎖と homoduplex の混合物を孵化させなさい。
- 焼なましヘテロ二本鎖と homoduplex の混合物、1 μ L 塩基変異検出ヌクレアーゼ (2.5 U/μ L) と 2 μ L ヌクレアーゼ反応バッファー (10 x) 42 ° C, 60 分の個別にダイジェスト 400 ng。
- Agarose のゲルの電気泳動と消化液のサンプルを分析し、ヘテロ二本鎖の混合物の DNA の小さな断片 (70-250 bp) と homoduplex DNA に切られるべき (320 bp) カットしてはいけません。
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Representative Results
CRISPR Cas9 技術機能ゲノム研究のための強力な研究ツールです。編集技術従来の遺伝子の交換は急速に、ゲノム全体と個々 の遺伝子に焦点を当てたアプリケーションの高いユーティリティです。ここでは、最初個別に複製された軌跡固有 CRISPR 配列 Cas9 sgRNA ライブラリに含まれる sgRNAs 303 ランダム ターゲット遺伝子、60 のポジティブ コントロール、500 の非人間ターゲット コントロールと 207 CTCF 要素または lncRNA をターゲットから成る 1,070 sgRNAs(図 1表 1)、4 つのHOX遺伝子の遺伝子をターゲットに。このライブラリには、すべての CTCF コア結合モチーフ、 HOX遺伝子 lncRNAs、 HOX遺伝子座のポジティブ コントロールとして規制要素、およびいくつかのHOX遺伝子が知られているが対象します。SgRNAs ランダムな非HOX遺伝子、ヒト以外の遺伝子、ネガティブ コントロールとしての遺伝子間領域のターゲットも含まれています。LentiCRISPR 伝達によって効率性と CTCF サイト ノックアウト (KO) の特異性を向上させるため、各ターゲット サイトには 5-10 sgRNAs (表 1) が含まれています。ここで説明したプロトコル、sgRNA ライブラリは、 HOXA/B/C/Dの軌跡とブロード研究所 sgRNA ツール (図 1図 2) に基づいているこれらの遺伝子座の lncRNAs CTCF 結合部位によると設計されています。MLL AF9 融合を運ぶ MOLM13 セルで 0.3、MOI 感染の低い多様性における伝達後、感染率がより小さい 1 つの sgRNA/セル ピューロマイシンを選択、続いてし、シードの単一細胞から成長した耐性あったHOXA9遺伝子発現の減損に上映。
SgRNA ライブラリのスクリーニングのためのワークフローが簡単になった (図 3) を説明します。まず、ウイルス含む sgRNA ライブラリは、(psPAX2 と pMD2.G) 2 つのベクトルの助けを借りて HEK293T 細胞で生成されました。プール sgRNA ライブラリのレンチを濃縮し、polybrane (8.0 μ g/mL) MOLM13 急性骨髄性白血病細胞に導入します。48 h の伝達後、細胞は、ピューロマイシンの最適濃度と扱われました。5 日後に、セルは 96-ウェル プレートに 1 つの細胞/ウェル播種、ピューロマイシンの存在下で生成された単一のクローン。最後に、sgRNA 単一クローンのゲノムには、ワンステップ RT-PCR、サンガーによって識別された配列と塩基変異検出 (図 3)。ピューロマイシン耐性の単一クローン、ワンステップ液滴によって識別されますデジタル RT-qPCR (RT ddqPCR) HOXA9遺伝子 (図 4) の式を変更するによると。SgRNA ライブラリーの構築と検証 (図 2 図4) 遺伝子多型とサンガー シーケンスを行った。
sgRNA ターゲット MOLM13 96 ウェル PCR プレートに肯定的なクローンはさらに制御の細胞との比較を通してHOXA9 の発現レベルの遺伝子に基づく RT qPCR 法で確認されました。クローンを存続 528 から上映、10 展示クローン以上のHOXA9レベル (図 4 a) で 50% 削減。sgRNAs は、 HOXA9に統合-削減、 HOXA9-そのままとHOXA9-増加クローンさらに並ぶベクトル プライマーを使用して sgRNA シーケンスの PCR 法で確認されました。精製 PCR 産物 T4 リガーゼを T ベクター システムにされ、サンガー シーケンスによって識別のため送信される (手順 8 を参照してください)。30 クローン塩基配列のうち 21 クローンに、単一 sgRNA (テーブル 2) が含まれているシーケンス データが示されます。SgRNA のカテゴリは識別され、 HOXA9式のレベルによると分析します。六つのHOXA9含まれているレベル sgRNAs CBS7/9 サイトをターゲットではなく、非人間の遺伝子、ランダムな遺伝子および他の CTCF サイト コントロール (図 4および表 2) 削減を示す 10 のクローン。
sgRNA は、単一クローンによる塩基変異を PCR に基づくジェノタイピングとヌクレアーゼ消化ヌクレアーゼの試金 (図 5) に基づくによって決定される肯定的な統合。ヌクレアーゼ消化アッセイを行ってきた代表HOXA9の CBS7/9 境界で発生した変異塩基を識別- HOXA9-そのまま、減少し、 HOXA9 -クローンの増加します。6 HOXA9から 4 CBS7/9 突然変異が見つかったことがわかった-クローンを削減: #15 と #31 (図 5) ではなくクローンがクローン #5、6、28、および 121。ただし、クローン #15 クローン #31 含まれていくつかの sgRNAs HOAIRM1 lncRNA、ホットエアlncRNA、 HOXD9/10 CTCF 結合部位をターゲットとしながら、 HOTTIP lncRNA サイト,をターゲット sgRNA を含まれて (図 4 b、5および表 2)。
図 1:4 つの lncRNAs と CTCF 結合部位模式図HOX遺伝子座。各ターゲット DNA の要素には、5-10 の異なる sgRNAs が含まれています。CTCF チップ seq データセットしお (GSM1335528) からダウンロードし、統合ゲノム ビューアー (IGV) を視覚化します。HOX遺伝子座の SgRNA ターゲット CTCF サイトいたオレンジ色のはさみ付けられて。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:SgRNA ベクトル シーケンスおよび PCR 増幅プライマーの統合の一部を表す図。PCR 増幅プライマー sgRNA レンチウイルスベクターの空白のシーケンスに従って設計されていた。前方のプライマー (P1) は黄色で強調表示された、逆プライマー (P2) が赤で強調表示された、sgRNA は、sgRNA レンチウイルスベクターで緑色で強調されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:SgRNAs ライブラリの設計、建設および検証のワークフローを表す図。このワークフローは次のとおりです。最初に、sgRNA ライブラリだった設計・ CRISPR レンチウイルスベクターに複製し、レンチ ウイルスは、sgRNA ライブラリ ベクトル、psPAX2、pMD2.G レンチウイルスベクター HEK293T 細胞内でパッケージ化され。次に、MOLM13 細胞低慣性モーメント (0.3) ウイルスに感染していたし、これらの細胞は、ピューロマイシンを選択を施行しました。次に、単一のクローンは、96 ウェル プレートでシードだった。最後に、sgRNA の単一クローン ゲノムに統合されたワンステップ Rt-qpcr、サンガー シーケンスと塩基変異検出によって識別されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:プール CRISPR Cas9 島ライブラリ スクリーニングがワンステップ Rt-qpcr とサンガー シーケンスを識別します。(A) 1 ステップ RT 液滴デジタル PCR のスクリーニングの sgRNA ライブラリを含むレンチ ウイルスに感染している単一のクローンのHOXA9式。HOXA9式レベル 528 sgRNA ライブラリ感染クローンのスクリーニングには、(528 ドット) が表示されます。10 展示 528 クローンよりもHOXA9で 50% 削減のレベル (紫矢印) です。赤い線; 制御の細胞と比較して 2 倍の減少変更の境界を意味します。青い線は、2 倍の増加変更の境界を示します。(B) 6 クローン #5、6、28、121、207、420 はサンガー シーケンス (緑の矢印) を CBS7/9 の特定の sgRNA によって目標とされました。WT MOLM13 (C) HOXA9の RT ddqPCR 分析レベルおよび 21 含む単一ターゲット sgRNA を複製します。HOXA9式データが sgRNA シーケンスの区分に応じ 5 つのグループにグループ化: HOXA7/9 CTCF サイト、非人間ターゲット、 HOX遺伝子座、 HOX関連付けられている lncRNAs の他の CTCF のサイトと他の人間のターゲット。この図は、羅ら12から変更されています。統計、スチューデントの t 検定と 3 つの独立した実験からこのデータは平均 ± SD として表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:統合 sgRNAs 肯定的なクローンの塩基変異を PCR に基づくジェノタイピングとヌクレアーゼ アッセイと確認しました。(A) ゲノム DNA が減少、そのまま、または増加のHOXA9発現レベルを展示代表 CRISPR Cas9 島上映ライブラリ クローンから分離されました。HOXA7とHOXA9遺伝子 (CBS7/9 境界) の間に位置する CTCF サイトのヘテロ接合体の削除された PCR に基づくジェノタイピングによって識別されます。HOXA9-CBS7/9 の境界の場所 (黒矢印) でクローン #5、6、28、および出展 121 削除を減少しました。(B) CBS7/9 サイトで、塩基変異、ヌクレアーゼ消化法による代表的なクローンが展示した削減 (赤い線) からそのまま (青線) を行ったまたは (紫ライン) HOXA9表現のレベルを増加しました。HOXA9-CBS7/9 の境界の場所 (オレンジの矢印) のクローン #5、6、28、および 121 展示変異を減少しました。この図は、羅ら12から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1:sgRNAs プール ライブラリ ターゲット情報をします。このデータは、羅ら12からです。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
表 2:サンガーsgRNAs 選択した提示の結果のシーケンス処理HOXA9-減少、HOXA9-変更、およびHOXA9-クローンを増加します。HOXA9-減少、変更および増加のクローンが別に赤、青、紫で強調表示されます。このデータは、羅ら12からです。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
蛋白質コーディングの遺伝子は、遺伝子と sgRNA 濃縮24,25,26 を通じて特定の細胞機能を調節するネットワークを識別するための機能的スクリーニング システム sgRNA ライブラリを適用されている関連、27,28。いくつかの非コーディングの地域関連 sgRNA ライブラリは、またの遠位と近位BCL11A、 Tdgf1a薬剤耐性などの要素を調整する遺伝子特定機能画面で示されていた調節遺伝子28、 29,30。これらの sgRNA ライブラリのすべての詳細なバイオインフォマティクスによって生成されたデザイン、オリゴヌクレオチド合成オリゴヌクレオチド プールをベクトルに補助的クローニングします。全体のゲノム広いスクリーニング アプローチは非常に強力で役に立つが、ゲノム sgRNA デザインと高価な合成に一貫した資金の計算の専門知識が必要です。したがって、ほとんどの実験室のためにまだ挑戦です。ただし、スクリーニングのアプローチ私たちの軌跡固有 sgRNA ライブラリは便利でクロマチン組織と (図 1の転写制御に関与する CTCF 結合部位など特定の DNA の要素を識別するために効率的ですおよび図 2)。CTCF の境界を絞り、ターゲット sgRNA HOXA9特異的マーカー遺伝子の発現レベルによるとクローンを評価するワンステップ RT-PCR 法を適用されます。さらに、サンガーを行った (図 2と図 4) これらの肯定的な統合された sgRNAs のクローンを確認するシーケンス。これらの肯定的な sgRNAs は、クローンを対象とした機能的確認するには、sgRNA がターゲット サイト挿入または削除の突然変異 (図 5) を誘発するかどうかを決定するために PCR を用いた遺伝子型と突然変異の検出法を行った。これは私たちの非コーディング DNA の特定の要素をターゲットし、哺乳類細胞の生物学的機能を評価する有望な方法を与えます。
提案プロトコルでは、我々 は言及ことより効率的なサブ lentiCRIPSRV2 ベクトルへのクローニングに特定のオリゴヌクレオチドのデザインを確保しより確実に正確な sgRNA ライブラリを生成 (ステップ 1-2)。高価 sgRNA ライブラリ レンチ ウイルスを得るためにレンチ ウイルス上清は次のプロトコル (手順 3) と複数因数 (ステップ 3.1 から 3.5) で-80 ° C のフリーザーで保存されているコンセントレーターを使用して, 50 倍濃縮する必要があります。その他の懸念は、伝達の最適の MOI 値を見つけることです。MOI が低すぎる場合、感染細胞の数は減少、sgRNA 障害のスクリーニングに 。慣性モーメントが大きすぎる場合、それは単一のセルに複数の sgRNA を統合してワンステップ RT-PCR と塩基変異検出のスクリーニング sgRNA ライブラリと干渉します。したがって、上映、前にレンチ ウイルス ライブラリの滴定からのセルのグループごとに最適な慣性モーメントを見つけることは重要なステップです。MOLM13 白血病細胞におけるレンチ ウイルス ライブラリの滴定し、MOI の評価はプロトコル (手順 5.1-5.10) で実施されます。また、逆のトランスクリプションのための細胞の完全な溶解した成功したワンステップ RT-PCR 法を確保できます。これは、換散のプロトコル (手順 7.5 7.6) のすべての温度の段階でのインキュベーション時間を増やすことによって行うことができます。したがって、プールの CRISPR Cas9 島図書館徹底した細胞のスクリーニングの効率を高めるために、換散および逆のトランスクリプションが Rt-qpcr ワンステップ (手順 7.1-7.14) を決定する上で重要な役割を再生します。さらに、PCR の製品の質の向上を確認できます成功した塩基変異の検出、低品質の PCR の製品はヘテロ二本鎖/homoduplex 生成プロセス (手順 9.1-.6) に影響を与えるため。
さらに、メソッドは、初期胚と異常なHOX遺伝子シグネチャを持つ特定の白血病のHOX遺伝子の規則の CTCF の役割を識別するために使用できます。HOX遺伝子は萌芽期の開発の間に重要な役割を果たすなど、 HOX gens のすべての 4 つのクラスターが時間的、空間的胚での発現パターンに制限されています。さらに、NPM1 変異はアジア ・ マイル リミテッドと正常の染色体核型31急性骨髄性白血病患者の 30% を占める最も一般的な遺伝的異常。アジア ・ マイル リミテッドのこのサブセットの展示、異常なHOXAおよびHOXB遺伝子署名、白血病変換17の支配的なメカニズムとなります。通常の開発とで白血病の中にHOX遺伝子を調整する方法を明らかにするが重要です。私たちと他の人は、CTCF がHOX遺伝子座9,12クロマチン組織と遺伝子転写で重要な役割を果たしていることを示しています。したがって、 HOX遺伝子集中 sgRNA ライブラリ スクリーニングの開発および造血器腫瘍中にHOX遺伝子発現制御 CTCF 結合部位の特定の機能を紛糾する便利な手段を提供します。しかし、アプローチの制限は、スループットの高い次世代シークエンシングのための有用なマーカーを見つけることの難しさです。今後の研究目標の一つは、高選択的マーカーがあり、マーカーの効果を確認するためにゲノム広い次世代シーケンシングを行うことでしょう。したがって、研究追跡レポーターは将来的に重要なツールになると特定の蛍光タグ付きのマーカー遺伝子を使用して計画しています。
エンハンサーは、プロモーターの機能と遺伝子発現の調節に重要な役割の多くを再生します。長い距離からプロモーター活性が位置や向きに依存しない方法で起動でき、エンハンサーはしばしばトランス向きで遺伝子発現を調節します。したがって、それはポストゲノム時代において特定の遺伝子の enhancer(s) を正確に困難です。伝統的な記者と相関解析 (例えば、クロマチン免疫沈降と DNaseI の過敏感細胞試金) は、エンハンサー機能32,33を調べるに使用されています。同様に、小さなスケールの軌跡に焦点を当てた上映された特定の遺伝子34の遠位と近位規制要素の活動を探るにも適用。HOXA7とHOXA9遺伝子とHOTTIP lncRNA の間に位置する CTCF 結合部位の正常にHOX遺伝子座の非コーディング規制要素を対象とするプール sgRNA KO ライブラリ戦略を最近、識別後部のHOXAクロマチン ドメイン組織は、急性骨髄性白血病 (AML)12 HOXA遺伝子の異所性発現のドライブを制御するために重要であります。これらの研究は、プールされた sgRNA KO ライブラリス クリーニングも、その場で私達のゲノムの非コーディング要素の生物学的機能を評価する強力な遺伝学アプローチであることを示した。
CTCF、クロマチン絶縁体蛋白として役割を果たしている重要なゲノム構成で特定のセル型11,35のクロマチン随一の特定の遺伝子発現パターンを定義します。トポロジ的に関連するドメイン (TAD) 構造の変化は、病気の状態5,11のプロモーター/エンハンサーの相互作用を変更します。CTCF 後生動物の保存性が高いと少し境界で濃縮されます。ただし、不明のまま CTCF がクロマチン境界構造と少し形成を維持に貢献しているかどうか、どのように。それは識別し、CTCF の境界を解剖する強力な方法である、タッド ドメインと同様にエンハンサー/プロモーター作用と内転写を定義する証明した 4 つのHOX遺伝子のプールの CTCF sgRNA ノックアウト ライブラリ スクリーニングが集中していたが少しドメイン12。また、クロマチン構造とHOX遺伝子座におけるアクセシビリティ活動に関与する転写因子の lncRNA 要素とを識別するためにこのメソッドを効率的に適用できます。我々 はまた CTCF チップ seq によると次世代シーケンス識別を通じてゲノム CTCF サイトを含む CRISPR/sgRNA ライブラリを探索しようと嘉ペット データは将来の研究します。したがって、この戦略は、全染色体やゲノム全体ではさらに拡張できます。
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Disclosures
我々 は本レポートに関する利害の対立があります。
Acknowledgments
著者はまた原稿を編集のニコラス セザーリを感謝します。仕事は、国立衛生研究所 (s. h.、R01DK110108、R01CA204044) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
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