Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

HOX Loci fokusert CRISPR/sgRNA biblioteket Screening identifisere kritiske CTCF grenser

Published: March 31, 2019 doi: 10.3791/59382
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 3, 1
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Summary

En CRISPR/sgRNA bibliotek er utlignet til avhør protein-koding gener. Muligheten for et sgRNA-bibliotek for å avdekke funksjonen til en CTCF grense i genet regulering imidlertid uutforsket. Her beskriver vi et HOX loci bestemte sgRNA bibliotek for å belyse funksjon CTCF grenser i HOX loci.

Abstract

CCCTC-binding faktor (CTCF)-mediert stabil topologisk knytte domener (var TADs) spille en avgjørende rolle i egenskapen interaksjoner DNA elementer som finnes i nabolandet var TADs. CTCF spiller en viktig rolle i å regulere romlige og tidsmessige uttrykk for HOX gener som styrer embryonale utvikling, kropp mønstre, hematopoiesis og leukemogenesis. Men forblir det hovedsakelig ukjent om og hvordan HOX loci forbundet CTCF grenser regulere chromatin organisasjon og HOX genuttrykk. I gjeldende protokollen, er et bestemt sgRNA gruppert bibliotek rettet mot alle CTCF bindende områder i HOXA/B/C/D loci generert for å undersøke effektene av forstyrre CTCF-assosiert chromatin grenser på TAD dannelse og HOX gene uttrykk. Gjennom CRISPR-Cas9 har genetisk screening, CTCF binding området ligger mellom HOXA7/HOXA9 gener (CBS7/9) blitt identifisert som en viktig regulator av kreftfremkallende chromatin domene, samt å være viktig for ektopisk HOX gene uttrykket mønstre i MLL-omorganisert akutt myelogen leukemi (AML). Dermed sgRNA biblioteket screening tilnærming gir ny innsikt i CTCF mediert genomet organisasjon i bestemte genet loci og gir også en basis for funksjonell karakterisering av kommenterte genetisk regulatoriske elementene, både koding og Noncoding, under normal biologiske prosesser i post menneskelige genom prosjektet tid.

Introduction

Genomet samhandling studier viste at skjemaene menneskelige kjernefysiske genom stabil topologisk knytte domener (var TADs) som er bevart i celletyper og arter. Organisasjonen i genomet i separate domener forenkler og begrenser interaksjoner mellom regulatoriske elementer (f.eks enhancers og arrangører). CCCTC-binding faktoren (CTCF) binder til TAD grenser og spiller en avgjørende rolle i egenskapen interaksjoner DNA elementer som finnes i nabolandet var TADs1. Men genom bredt CTCF binding data avslørte at selv om CTCF mest samhandler med samme DNA-områder i ulike celletyper, det ofte fungerer som en chromatin barriere på et bestemt sted i en celle, men ikke i den andre, antyder at CTCF funksjoner sammen med andre aktiviteter i dannelsen av chromatin grenser2. Hva er ukjent er om grensen elementene (CTCF-bindende områder) er direkte knyttet til biologiske funksjonen til CTCF, og hvordan disse koblingene oppstår. Derfor hypothesize vi at bestemte CTCF bindende områder i genomet direkte regulerer dannelsen av var TADs og kontroll promoter/enhancer interaksjoner i disse domenene eller mellom nærliggende domener. Ferdigstillelse av menneskelige og mus genomet sekvensering prosjekter og påfølgende epigenetic analyser har avdekket ny molekylære og genetiske signaturer i genomet. Men rollen signaturer/endringer i genet regulering og cellulære funksjoner, samt deres molekylær mechanism(s), har ennå å bli fullt ut forstått.

Flere linjer med bevis støtter at de CTCF-mediert var TADs representerer funksjonelle chromatin domener3,4,5. Selv om CTCF mest samhandler med samme DNA-områder i ulike celletyper, avdekket genomet bredt CTCF ChIP-seq data at CTCF ofte fungerer som en barriere for chromatin i én celle, men ikke i de andre2. CTCF spiller en viktig rolle under utviklingen av formidling genomet organisasjon4,6,7. Avbrudd i CTCF grenser nedsatt enhancer/arrangøren interaksjoner og genuttrykk, fører til utviklingsmessige blokkering. Dette tyder på at CTCF mediert var TADs ikke bare strukturelle komponenter, men også regulatoriske enheter kreves for riktig enhancer handling og gene transkripsjon5,8,9.

HOX genene spiller avgjørende roller under embryonale utviklingen og de er timelig og romlig begrenset i deres uttrykk mønstre. HOXA locus danner to stabil var TADs skille fremre og bakre gener av et CTCF-assosiert grensen element i både hESCs og IMR90 celler1. Nye rapporter har vist at HoxBlinc, en HoxB locus forbundet lncRNA, formidler dannelsen av CTCF var TADs og enhancer/Promotoren samhandling i HOXB locus. Dette fører til fremre HOXB gene aktivisering under ESC engasjement og differensiering10. Videre på bestemte genet loci inkludert HOXA locus, endring av CTCF mediert TAD domener endret avstamning bestemte genet uttrykket profiler og ble knyttet til utviklingen av sykdom stater11,12. Bevisene støtter en primær funksjon for CTCF i koordinering genet transkripsjon og bestemme cellen identitet ved å organisere genomet i funksjonelle domener.

Til tross for sin rolle i embryonale utviklingen, i hematopoiesis, regulere HOX gener blodkreft stilk og stamfar celle (HS/PC)-funksjonen. Dette gjøres ved å kontrollere balansen mellom spredning og differensiering10,13,14,15. Uttrykket av HOX gener er strengt regulert hele spesifikasjon og differensiering av blodkreft cellene, med høyeste uttrykk i HS / PCer HOX genuttrykk gradvis synker under modning, med sitt laveste nivå forekommer i differensiert blodkreft cellene16. HOX gene feilregulering er en dominerende mekanisme leukemic transformasjon av dysregulating selvtillit fornyelse og atskilling egenskaper HS/stk fører til leukemic transformasjon17,18. Mekanismen for å etablere og opprettholde normale vs kreftfremkallende uttrykk mønstre av HOX gener samt tilhørende forskrifter nettverk er imidlertid uklart.

CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotek screening har vært mye brukt til å lage protein-koding gener19 som vel som ikke-koding gener, som lncRNA20 og miRNA21 i forskjellige arter. Imidlertid er kostnaden bruke CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteket til å identifisere nye genomisk mål fortsatt høy, fordi høy gjennomstrømming genomet sekvensering er ofte brukt for å kontrollere sgRNA biblioteket screening. Våre sgRNA screening systemet er fokusert på spesifikke genomet loci og evaluerer den målretting sgRNAs gjennom ettrinns RT PCR etter merketråden genet uttrykk, for eksempel HOXA9. I tillegg kan Sanger sekvensering bekreftet at sgRNA ble integrert i genom og Indel mutasjoner oppdages for å identifisere sgRNA målretting området. Gjennom loci-spesifikke CRISPR-Cas9 genetisk screening, har CBS7/9 chromatin grensen blitt identifisert som en viktig regulator for å etablere kreftfremkallende chromatin domene og opprettholde ektopisk HOX gene expression mønstre i AML patogenesen 12. metoden kan bli mye brukt for å identifisere ikke bare bestemt funksjon av CTCF grensen i embryonale utviklingen, hematopoiesis, leukemogenesis, men også CTCF grensen som potensielle terapeutiske mål for fremtidige epigenetic terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. CTCF sgRNALibrary Design bruke en Online verktøyet

  1. Utforme sgRNA målretting CTCF bindende områder i de menneskelige HOX loci bruke genetisk forstyrrelsene plattform (GPP) designer verktøyet (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Syntetisere totalt 1070 sgRNAs bestående av sgRNAs målretting 303 tilfeldig målretting gener, 60 positiv kontroller, 500 ikke menneskelige-målretting kontroller, og 207 CTCF elementer eller lncRNA målretting gener (figur 1, tabell 1). Hvert målretting DNA-element er målrettet av 5-10 forskjellige sgRNAs.

2. sgRNA biblioteket kloning

  1. Klone de syntetiserte oligonucleotides i CRISPR lentiviral ryggraden vektor (lentiCRISPRv2).
    1. Fordøye LentiCRISPRv2 vektoren med BsmBI begrensning enzym ved 37 ° C i 2 timer.
    2. Se etter større bandet (rundt 12,873 bp) på gel etter BsmBI fordøyelsen, og deretter rense den med gel utvinning kit.
      Merk: En 2 kb små filler stykke er også til stede på gel etter fordøyelsen, men dette bør ignoreres.
    3. Ligate de syntetiserte oligonucleotides og fordøyd LentiCRISPR vektor med 150 ng av fordøyd LentiCRISPR DNA, 1 µL av 10 µM oligos, 2 µL av 10 x T4 ligase buffer, 1 µL av T4 ligase, og deretter ruge dem på 16 ° C over natten.
  2. Lentiviral CRISPR/sgRNA biblioteket forvandle electro-kompetent celler for forsterkning.
    1. Forberede electroporator på 1,8 kV, 200 Ω og 25 µF. Deretter Forvarm utvinning SOC media i et 37 ° C vannbad og Forvarm LB ampicillin antibiotika plater på 37 ° C.
    2. Tine kompetent cellene på is 10 min.
    3. Forbered 1,5 mL mikro-sentrifuge rør og 1 mm electroporation cuvettes på is.
    4. Bland 1 µL av en 10 ng/µL biblioteket plasmider DNA i 25 µL av kompetente celler i en 1,5 mL mikro-sentrifuge rør, og bland forsiktig ved å sveipe bunnen av røret noen ganger manuelt.
    5. Når cuvette er kald overføring DNA/kompetente celle blandingen til den. Tapp to ganger på benken og tørk eventuelle vanndråper fra utsiden av cuvette med et papir. Deretter plasserer cuvette-modulen electroporation og trykker puls.
    6. Straks legge 975 µL av 37 ° C forvarmes SOC media. Blandingen av pipettering opp og ned og overføre til en 15 mL tube.
    7. Rotere og ruge ved 37 ° C i 1 time.
    8. Fortynne 100 µL celler i 900 µL av SOC media og plassere 100 µL på en LB ampicillin antibiotika agar tallerken. Ruge over natten på 37 ° C.
  3. Ekstra plasmider DNA fra kombinerte koloniene med en maxi-prep kolonne som beskrevet i produsentens protokollen.
    1. Skrape alle koloniene fra LB agar platen og vaksinere en startkulturer 2 ml av LB ampicillin antibiotika medium og ruge over natten på 37 ° C med kraftig risting (~ 200 x g).
    2. Fortynne starter kultur 1:500 til 100 mL LB ampicillin medium og ruge ved 37 ° C i 12-16 h med kraftig risting (~ 200 x g).
    3. Høste bakteriell celle pellets med sentrifugering 6000 x g i 15 min på 4 ° C.
    4. Nytt avbryte den bakterielle pellet 10 mL suspensjon bufferen.
    5. Lyse suspendert pellets med 10 mL lyseringsbuffer og kraftig Inverter 4 - 6 ganger. Inkuber lysate i 5 minutter ved romtemperatur.
    6. Nøytralisere den lysate med 10 mL kjølt nøytralisering Buffer. Bland ved å forsiktig snu rør 4 - 6 ganger og ruge det etter 20 min på is.
    7. Nedspinning 13.500 x g i 30 min på 4 ° C. Raskt overføre nedbryting inneholder plasmider DNA til en ny tube.
    8. Gjenta trinn 2.3.7, og raskt overføre nedbryting inneholder plasmider DNA til en ny tube.
    9. Equilibrate kolonnen ved å bruke 10 mL balanse bufferen og la kolonnen til tom av gravitasjon flow.
    10. Legg nedbryting kolonnen og tillate det å angi harpiks ved gravitasjon flow.
    11. Vask kolonnen med 2 x 30 mL vaske bufferen.
    12. Elute DNA med 15 mL elueringsbufferen.
    13. Utløse DNA med 10,5 mL romtemperatur isopropanol til eluted DNA. Blanding og spinn ned umiddelbart på 15.000 x g i 30 min på 4 ° C, og Dekanter forsiktig nedbryting.
    14. Vask DNA pellets med 5 mL av 70% etanol, sentrifuger DNA pellet 15.000 x g i 10 min og forkaste klart nedbryting.
    15. Gjenta trinn 2.5.14 to ganger mer.
    16. Sentrifuge DNA pellet 15.000 x g i 10 min, og forsiktig Dekanter nedbryting uten å forstyrre DNA-pellets.
    17. Air-Dry pellets i 5-10 min og oppløse DNA i et bestemt volum bufferen (TE buffer, pH 8.0).

3. høy Titer sgRNA bibliotek Lentivirus generasjon

  1. Celle forberedelse: kultur HEK293T celler i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% (vol/vol) fetal bovin serum (FBS) og 1% (vol/vol) penicillin-streptomycin (PS) antibiotika i T-25 flasker. Plass dem i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2.
  2. Pakke lentivirus: co transfect HEK293T celler med 20 µg renset biblioteket vektorer fra trinn 2, 15 µg av pakken plasmider (psPAX2) og 10 µg av konvolutten plasmider (pMD2.G) for 48 timer før høsting virus.
  3. Virus samling: etter 48 h, collectthe virus supernatant og filtrere viruset supernatant gjennom en 0,45 µm lav protein bindende PVDF membran.
  4. Virus konsentrasjon: konsentrere lentiviral nedbryting av 50-fold bruker du konsentratoren og teste viruset MOI i trinn 5.
  5. Virus lagring: Aliquot den konsentrert virus og oppbevar i en-80 ° C fryseren.

4. optimalisert Puromycin konsentrasjon

  1. Leukemi cellekultur: kultur MOLM13 AML celler i RPMI 1640 supplert med 10% (vol/vol) fetal bovin serum (FBS) og 1 x penicillin-streptomycin (PS) antibiotika i en T-125 bolle. Plass dem i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
    Merk: Celler sendes vanligvis hver 4-5 d på en delt forholdet 1:4 eller 1:6, aldri la celler å nå mer enn 70% confluency.
  2. Definere MOLM13 celler i en 12-vel plate med en tetthet på 1,0 x 104 cellen/mL, med totalt volum 2 ml per brønn (2,0 x 104 celler).
  3. Tid-retters analysen: behandle MOLM13 celler med puromycin i 7 dager på økende konsentrasjoner (0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL og 2.0 µg/mL)
    1. Definert MOLM13 celler uten puromycin behandling på dag 0 sette opp 3 Repliker brønner uten puromycin behandling som en kontroll fra dag 0 til dag 7.
    2. Behandle MOLM13 celler med 0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL og 2.0 µg/mL, separat, med hver eksperimentelle tilstand som inneholder 3 Repliker brønner.
    3. Telle levende celle forholdet og foreta en overlevelse kurve fra dag 0 til dag 7 inneholder alle forhold.
  4. Overlevelse kurven: Stain celler med Trypan blå og telle levedyktighet daglig å få den overlevelse kurver for hver puromycin konsentrasjon.
  5. Optimalisere minimal puromycin konsentrasjon: bestemme minimal puromycin konsentrasjonen gjennom Trypan blå flekker, som alle MOLM13 celler er drept mellom 5-7 dager.

5. titrering Lentiviral bibliotek i MOLM13 leukemi celler

  1. AML celler forberedelse: samle MOLM13 AML celler med signaltransduksjon mediet (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS og 8.0 µg/mL belegg medium) på en tetthet av 1,5 x 106 celler /mL.
  2. Plass MOLM13 celler i 12-vel platen med 1,5 x 106 celler i hver brønn.
  3. Tine lentivirus: Fjern konsentrert lentivirus fra-80 ° C fryseren og tine det på is.
  4. Blanding MOLM13 cellene med en annen dose av konsentrert lentivirus i separate brønner, inkludert 0, 1, 2.5, 5, 7,5 og 10 µL (totalt 6 grupper).
  5. Umiddelbart sentrifuge disse blandinger 1000 x g 2 h 33 ° c og overføre 12-vel platene tilbake til inkubator på 37 ° C og 5% CO2 4 h.
  6. Etter 4 h, spinne ned de infiserte cellene på 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  7. Forsiktig Sug opp nedbryting uten å forstyrre den cellen pellet, å suspendere transduced cellene med fersk media (RPMI 1640, 10% FBS og 1% PS) og overføre dem til T-25 flasker og ruge ved 37 ° C i 48 timer uten puromycin.
  8. Etter 48 timer, kan du dele disse cellene i 2 flasker (2 grupper): en forsøksgruppe behandlet med 1 µg/mL puromycin for 5 dager, og en kontrollgruppe uten puromycin behandling for 5 dager.
  9. Utføre puromycin utvalg for 5 dager med 1 µg/mL puromycin ifølge trinn 4 til alle ikke-transduced kontroll cellene er død. Exchange for fersk medier hver 2 dager.
  10. Måle optimalisert MOI verdien for signaltransduksjon ved å dele antall levende celler behandlet med puromycin med antall celler uten puromycin behandling.

6. signaltransduksjon grupperte CRISPR-Cas9 KO biblioteket

  1. Signaltransduksjon med lentivirus: infisere 1,5 x 106 MOLM13 celler med 0,3 MOI av sgRNA samlet lentivirus i medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS og 8 µg/mL belegg medium) i 6-vel plate og bruke cellene uten lentivirus infeksjon som en kontroll.
  2. Umiddelbart sentrifuge 6-vel platen på 1000 x g 2 h på 33 ° C spinfect cellene og overføre platene tilbake til inkubator på 37 ° C og 5% CO2 4 h.
  3. Nedspinning infiserte celler på 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  4. Forsiktig Sug opp nedbryting uten å forstyrre den cellen pellet, å suspendere transduced cellene med fersk media (RPMI 1640, 10% FBS og 1% PS) og overføre dem til T-25 flasker og ruge ved 37 ° C i 48 timer uten puromycin.
  5. Etter 48 timer, kan du unne celler med 1 µg/mL puromycin 5 dager. Bytte for fersk media etter 2 dager og holde på en optimal celle tetthet.
  6. Frø enkelt klone i 96-brønnen plater med begrense fortynning metoder og ruge disse enkelt kloner på 37 ° C og 5% CO2. Kultur dem i 3-4 uker.
  7. Når en enkeltcelle vokser opp i en populasjon, overføre halvparten av cellene til 24-vel plater for videre kultur under puromycin valg og kontrollerer disse Klonene i neste trinn. Holde resten av cellene.

7. screening av grupperte CRISPR-Cas9 KO biblioteket med ettrinns RT-qPCR

  1. Avgjøre effektiviteten av sgRNA integrert klone screening ved å evaluere uttrykk for markør genet HOXA9 med ett trinn revers transkriptase polymerasekjedereaksjons (ettrinns RT-qPCR).
    Merk: HOXA9 er svært uttrykt i MOLM13 AML celler i leukemogenesis22,23.
  2. Antall i sgRNA integrert MOLM13 cellen og overføre 1 x 104 celler per brønn til en 96-brønns PCR plate.
  3. Sentrifuge røret på 1000 x g i 5 minutter, og deretter grundig fjerne og kast nedbryting med en Pipetter uten å forstyrre den cellen pellet.
  4. Vask celler med 125 µL PBS bufferen, og sentrifuge røret på 1000 x g i 5 min. Deretter fjerne 120 µL av nedbryting bruker en pipette og beholde ca 5 µL av PBS i hver brønn.
  5. Legge til 50 µL av cellen lysis master mix som inneholder 48 µL av cellen lyseringsbuffer, 1 µL proteinasen K løsning (10 mg/mL) og 1 µL DNase løsning (1 mg/mL) i hver brønn. Deretter Pipetter opp og ned 5 ganger å suspendere celle pellets.
  6. Inkuber en miks for 10 min i romtemperatur, etterfulgt av 5 min på 37 ° C, og deretter 75 ° C i 5 minutter.
  7. Lagre cellen lysate i-80 ° C fryser.
  8. Utarbeidelse av ettrinns RT-qPCR reaksjon: tine ettrinns reaksjonen blanding og andre reaksjon komponenter til 4 ° C. Deretter spinne ned kort å samle løsninger på bunnen av rør, og plassere på is uten lys. Bland og spinne forsiktig.
  9. Legge 1 µL av celle lysate PCR fordelt med RT-qPCR reaksjonen blanding, inkludert 1 µL av markør genet frem primer (300 nM) og reversere primer (300 nM), 0.125 µL av revers transkriptase (10 U/µL) og 5 µL av ettrinns reaksjonen blanding (2 x).
  10. Forsegle brønner med optisk gjennomsiktig film og forsiktig vortex og bland reaksjon komponentene.
  11. Plass 96-brønns PCR platen på en sanntid PCR-instrument.
  12. Kjøre omvendt transkripsjon reaksjonen på 10 min ved 50 ° C, etterfulgt av polymerase inaktivering og DNA denaturering for 1 min på 95 ° C.
  13. Utføre RT PCR med 40 sykluser av PCR reaksjon: rødsprit 15 s på 95 ° C, annealing/utvidelse og plate fluorescens lesing for 20 s på 60 ° C, og deretter smelte curve analyse ved 65-95 ° C via 0,5 ° C intervaller på 2-5 s/trinn.
  14. Angi upregulated, downregulated eller endre grupper etter uttrykk nivåene av HOXA9 genet sammenligning til kontrollen separat. Bruke β-utgangen genet som en housekeeping gen kontroll.

8. verifisering av integrert sgRNAs Positive kloner gjennom genotyperingteknologi og Sanger sekvens

  1. Kontroller HOXA9 redusert uttrykk kloner gjennom Sanger sekvensering og utføre PCR med 50-100 ng MOLM13 genomet DNA, 5 µL polymerase reaksjon buffer (10 x), 1 µL frem primer (10 µM) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) og 1 µL omvendt primer (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), 1 enhet utvalg (5 U /µL). Utføre PCR reaksjon med den første rødsprit 94 ° c for 30 s, og deretter mer rødsprit 94 ° c for 20 s, annealing på 56 ° C for 20 s, forlengelse på 68 ° C for 20 s (totalt 30 sykluser), endelig utvidelse på 68 ° C i 10 min , og deretter holde på 4 ° C.
  2. Ekstra og rense PCR produktene (størrelse 285 bp) med en PCR rensing Kit.
  3. Ligate renset PCR produktene i T-vektor med 2 µL T4 ligation buffer (10 x), 50 ng T vektor DNA (50 ng/µL), 25 ng renset PCR DNA (285 bp), 1 µL T4 ligase (3 enheter/µL) og sted ligation blande inn i en inkubator på 16 ° C over natten.
  4. Overføre ligation blandingen i DH5α kompetent celle vokser på en LB ampicillin antibiotika agar plate og ruge over natten på 37 ° C.
  5. Plukker enkelt kloner fra LB platen og kontrollere dem ved genotyperingteknologi og Sanger sekvensering.

9. påvisning av sgRNAs utførte Indel mutasjon av Nuclease fordøyelsen analysen

  1. Oppdage sgRNA integrert enkelt klone indusert Indel priser av en nuclease test-analysen.
  2. Forbered separat PCR amplicons med 50-100 ng Indel mutant (test) og vill-type (WT, referanse) DNA som PCR mal, 5 µL polymerase reaksjon buffer (10 x), 1 µL dNTP (10mM), 1 enhet utvalg (5 U/µL), 1 µL frem primer (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3 "), og 1 µ L reversere primer (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3 "). PCR reaksjonen ble utført med første rødsprit ved 98 ° C i 30 s og denaturering 98 ° c for 20 s, annealing på 56 ° C for 20 s, utvidelsen ved 72 ° C i 30 s (totalt 30 sykluser), og endelig utvidelse ved 72 ° C i 10 min , og holde på 4 ° C.
  3. Definere gruppen heteroduplex blanding med 200 ng "referanse" (20 ng/µL) og 200 ng "test" (20 ng/µL) PCR amplicons i 0,2 mL PCR rør og gruppen homoduplex blanding med bare 400 ng "referanse" PCR amplicons som en kontroll.
  4. Separat ruge heteroduplex og homoduplex blandingen ved 95 ° C i 5 min med en 1 liters kanne fylt med 800 mL vann og deretter avkjølt gradvis til romtemperatur anneal og danne heteroduplex eller homoduplexes.
  5. Separat digest 400 ng av glødet heteroduplex og homoduplex blandingen med 1 µL indel mutasjon oppdagelse nuclease (2,5 U/µL) og 2 µL nuclease reaksjon buffer (10 x) på 42 ° C for 60 min.
  6. Analysere fordøyd prøvene med agarose gel geleelektroforese, heteroduplex blanding DNA bør kuttes i små fragmenter (70-250 bp) og homoduplex DNA (320 bp) skal ikke være avkuttet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CRISPR-Cas9-teknologi er et kraftig søkeverktøy for funksjonell genomisk studier. Det er raskt å erstatte konvensjonelle genet redigering teknikker og har høy verktøy for både genomet-omfattende og personlige gen-fokuserte programmer. Her, første individuelt klonet loci-spesifikke CRISPR-Cas9-plassert sgRNA biblioteket inneholder 1070 sgRNAs bestående av sgRNAs målretting 303 tilfeldig målretting gener, 60 positiv kontroller, 500 ikke menneskelige-målretting kontroller, og 207 CTCF elementer eller lncRNA målretting gener i fire HOX loci (figur 1, tabell 1). Dette biblioteket mål alle CTCF kjernen bindende motiver, HOX gene forbundet lncRNAs, kjent regulatoriske elementer, og flere HOX gener som positive kontroller i HOX loci. Den inneholder også sgRNAs tilfeldig ikke -HOX gener, ikke-menneskelige gener og intergenisk områder som negative kontroller. For å forbedre effektiviteten og spesifisitet av CTCF området knock-out (KO) av lentiCRISPR signaltransduksjon, inneholder hver målretting nettstedet 5-10 sgRNAs (tabell 1). I protokoll beskrevet her, laget sgRNA biblioteker etter CTCF bindende områder på HOXA/B/C/D loci og lncRNAs i disse loci, som er basert på bred Institute sgRNA verktøy (figur 1, figur 2). Etter signaltransduksjon på et lavt mangfold av infeksjon med en MOI på 0,3 i MOLM13 celler bærer MLL-AF9 fusion, infeksjon er mindre enn en sgRNA/cell etterfulgt av puromycin valg, og så motstandsdyktig kloner vokst fra frø enkeltcelle var vist for verdifall av HOXA9 genuttrykk.

Arbeidsflyten for sgRNA biblioteket screening ble kort beskrevet (Figur 3). Først virus som inneholder sgRNA biblioteket ble generert i HEK293T celler ved hjelp av to vektorer (psPAX2 og pMD2.G). sgRNA samlet bibliotek lentiviruses var konsentrert og transduced i MOLM13 AML celler med polybrane (8.0 µg/mL). Etter en 48t transduction, ble celler behandlet med optimal konsentrasjonen av puromycin. Etter 5 dager, cellene var frø en celle/brønn i 96-brønnen platene og enkelt kloner ble generert i nærvær av puromycin. Endelig sgRNA enkelt kloner integrert i genomet ble identifisert av ettrinns RT PCR, Sanger sekvensering og Indel mutasjon oppdagelsen (Figur 3). Puromycin motstandsdyktig enkelt kloner er identifisert gjennom ettrinns slippverktøy digital RT-qPCR (RT-ddqPCR) ifølge endre uttrykk for HOXA9 oncogene (Figur 4). Genotyperingteknologi og Sanger sekvensen ble utført for sgRNA biblioteket konstruksjon og bekreftelse (figur 2, figur 4).

sgRNA rettet mot MOLM13 positive kloner i en 96-brønns PCR plate ble ytterligere bekreftet med metoden RT-qPCR basert påuttrykk nivåer av HOXA9 gener gjennom sammenligning med kontroll celler. Av 528 gjenlevende kloner vist, 10 kloner utstilt mer enn 50% reduksjon i HOXA9 nivåer (figur 4A). sgRNAs integrert i HOXA9-redusert, HOXA9-uendret, og HOXA9-økt kloner ble ytterligere bekreftet av PCR forsterkning av sgRNA sekvenser med flankemanøveren vektor primere. Renset PCR produktene var samskrevet i T vektor systemet gjennom T4 ligase og sendt ut for identifikasjon av Sanger sekvens (se trinn 8). Sekvens data indikerte at av 30 kloner sekvensert, 21 kloner med én sgRNA (tabell 2). Kategoriene for sgRNA ble identifisert og analysert i henhold HOXA9 uttrykk tilgangsnivåene. Seks av ti kloner viser en reduksjon i HOXA9 nivåer som finnes sgRNAs målretting webområdet CBS7/9, men ikke i ikke-menneskelige genene, tilfeldig menneskelige gener og andre CTCF nettstedet kontroller (Figur 4 og tabell 2).

sgRNA integrert positiv enkelt klone-indusert Indel mutasjoner bestemmes av PCR-basert genotyperingteknologi og nuclease fordøyelsen basert på nuclease analysen (figur 5). Nuclease fordøyelsen analysen er utført for å identifisere Indel mutasjoner oppstod i CBS7/9 grensen i representant HOXA9-redusert, HOXA9 -uendret, og HOXA9 -økt kloner. Resultatene viste at CBS7/9 mutasjonen har blitt funnet i 4 av de 6 HOXA9-redusert kloner: kloner #5, 6, 28 og 121, men ikke kloner #15 og #31 (figur 5). Imidlertid klone #15 inneholdt sgRNA målretting HOTTIP lncRNA nettstedet, , mens klone #31 inneholdt flere sgRNAs HOAIRM1 lncRNA, HOTAIR lncRNA og HOXD9/10 CTCF bindende nettsted (tall 4B, 5 og tabell 2).

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk diagram som viser CTCF bindende områder og lncRNAs i fire HOX gene loci. Hver målretting DNA-elementet inneholder 5-10 forskjellige sgRNAs. CTCF ChIP-seq dataset ble lastet ned fra GEO (GSM1335528) og visualisert med integrert Genomic seer (IGV). SgRNA rettet mot CTCF områder i HOX loci var merket med oransje saks. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Skjematisk diagram som representerer delen av integrere sgRNA vektor sekvens og PCR forsterkning primere. PCR forsterkning primerne ble utformet i henhold til tom sekvensen av sgRNA lentiviral vektor. Fremover primer (P1) var merket med gult, omvendt primer (P2) ble markert med rødt, og sgRNA ble markert med grønt i sgRNA lentiviral vektor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 : Skjematisk diagram representerer arbeidsflyten for sgRNAs biblioteket design, konstruksjon og verifisering. Denne arbeidsflyten er som følger. Først sgRNA biblioteket ble designet og klonet i en lentiviral CRISPR vektor, og deretter lentivirus var pakket med sgRNA bibliotek lentiviral vektor, psPAX2 og pMD2.G vektorer i HEK293T celler. Deretter MOLM13 celler var virusinfisert lav MOI (0,3) og disse cellene gjennomgikk puromycin utvalg. Deretter ble enkelt klone sådd i en 96-brønns plate. Endelig ble sgRNA enkelt kloner integrert i et genom identifisert av ettrinns RT-qPCR, Sanger sekvens og Indel mutasjon oppdagelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 4
Figur 4 : Grupperte CRISPR-Cas9 KO biblioteket screening identifisert med ettrinns RT-qPCR og Sanger sekvens. (A) en trinn RT-slippverktøy digital PCR screening av det HOXA9 uttrykket i enkelt kloner infisert med lentivirus som inneholder sgRNA biblioteket. Screening av 528 sgRNA biblioteket infisert kloner for HOXA9 uttrykk nivåer vises (528 prikker). Ti av 528 kloner utstilt mer enn 50% reduksjon i HOXA9 nivåer (lilla piler). Den røde linjen angir grensen av 2-fold nedgang endringen ved å sammenligne med kontroll celler; den blå linjen angir grensen for en 2-fold økning endring. (B) seks kloner #5, 6, 28, 121, 207 og 420 var målrettet av CBS7/9 bestemt sgRNA gjennom Sanger sekvens (grønne pilene). (C) RT-ddqPCR analyse av HOXA9 nivåer i WT MOLM13 og 21 kloner med enkelt målrettet sgRNA. HOXA9 uttrykk dataene ble gruppert i fem grupper i henhold til kategoriene sgRNA sekvenser: HOXA7/9 CTCF område, ikke-menneskelige mål, andre CTCF områder i HOX loci, HOX tilknyttet lncRNAs, og andre menneskelige mål. Dette tallet er endret fra Luo et al.12. For statistikk, var disse dataene representert som den gjennomsnittlig ± SD fra tre uavhengige eksperimenter med Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Indel mutasjoner av integrert sgRNAs positive klone bekreftet med PCR-basert genotyperingteknologi og nuclease analysen. (A)  Genomic DNA ble isolert fra representant CRISPR-Cas9 KO biblioteket vist kloner som utstilt redusert, uendret eller økt HOXA9 uttrykk nivåer. Heterozygote sletting av CTCF området ligger mellom HOXA7 og HOXA9 gener (CBS7/9 grense) ble identifisert av PCR-baserte genotyperingteknologi. HOXA9-redusert kloner #5, 6, 28 og 121 utstilt sletting på CBS7/9 grensen sted (svart piler). (B) The Indel mutasjoner i området CBS7/9 ble analysert av nuclease fordøyelsen analysen fra representant kloner som utstilt redusert (rød linje), uendret (blå linjen), eller økt (lilla linje) HOXA9 uttrykk nivåer. HOXA9-redusert kloner #5, 6, 28 og 121 utstilt mutasjoner i CBS7/9 grensen plasseringen (oransje piler). Dette tallet er endret fra Luo et al.12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Tabell 1: sgRNAs pool biblioteket målinformasjon. Disse dataene er Luo et al.12. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Tabell 2: Sanger sekvensering resultatene av sgRNAs i den valgte HOXA9 -redusert, HOXA9 -uendret, og HOXA9 -økt kloner. HOXA9-redusert, uendret og økt kloner er uthevet i rødt, blått og lilla, separat. Disse dataene er Luo et al.12. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protein-koding genet relatert sgRNA biblioteker er brukt i en funksjonell screening system å identifisere gener og nettverk regulere bestemte cellulære funksjoner gjennom sgRNA berikelse24,25,26 ,27,28. Flere ikke-koding regionen relatert sgRNA biblioteker ble også vist i genet-spesifikke funksjonelle skjermer for distale og proksimale regulere elementer, inkludert BCL11A, Tdgf1a og resistens regulere gener28, 29,30. Disse sgRNA bibliotekene ble generert av en detaljert bioinformatikk design, oligonucleotide syntese og sub kloning oligonucleotide pool(s) i vektorer. Hele genomet hele screening tilnærming er svært kraftig og nyttig men krever beregningsorientert kompetanse for genomet hele sgRNA design og konsekvent finansiering for dyre syntese; Dermed er det fortsatt utfordrende for de fleste laboratorier. Men er hotellbiblioteket loci-spesifikke sgRNA, screening tilnærming både praktisk og effektiv til å identifisere det spesifikke DNA elementet som CTCF binding området involvert i chromatin organisasjon og transcriptional regulering (figur 1 og figur 2). Ved målretting CTCF grenser, brukt vi en ettrinns RT PCR for å evaluere sgRNA målrettet kloner etter hvilket uttrykk med et bestemt merke, HOXA9. I tillegg vi spilte Sanger sekvensering å bekrefte disse positive integrert sgRNAs kloner (figur 2 og Figur 4). For å bekrefte funksjonelt disse positive sgRNAs målrettet kloner, gjennomført vi en PCR-basert genotyperingteknologi og mutasjon oppdagelsen analysen for å avgjøre om sgRNA induserer målet området inn eller sletting mutasjoner (figur 5). Dette gir oss en lovende metode for å målrette bestemte ikke-koding DNA elementer og vurdere deres biologisk funksjon i pattedyrceller.

I vår protokollen, nevnte vi at en bestemt oligonucleotide design sikrer mer effektiv sub kloning i lentiCRIPSRV2 vektorer og mer pålitelig generere et nøyaktig sgRNA bibliotek (trinn 1-2). For å oppnå høy titer sgRNA bibliotek lentivirus, skal lentiviral nedbryting konsentrert 50-fold bruker du konsentratoren følger protokollen (trinn 3), og lagret i en-80 ° C fryser i Quidel (trinn 3.1-3,5). En annen bekymring er å finne den optimale MOI verdien for signaltransduksjon. Hvis MOI er for lav, vil antall infiserte celler redusere og føre til sgRNA screening feil. Hvis MOI er for høy, det vil integrere flere sgRNA i en enkelt celle, og det vil forstyrre sgRNA biblioteket screening gjennom ettrinns RT PCR og Indel mutasjon gjenkjenning. Derfor før screening, finne den optimale MOI for hver gruppe med celler gjennom titrering lentiviral biblioteket er et viktig skritt. Titrering av lentiviral biblioteket i MOLM13 leukemi celler og evaluering av MOI skal utføres i protokollen (trinn 5.1-5.10). Videre kan en grundig lysing celler for omvendt transkripsjon sikre vellykket ettrinns RT PCR. Dette kan gjøres ved å øke inkubasjon tiden for lyse i alle temperatur stadier i protokollen (trinn 7.5-7.6). Derfor, for å øke den effektive for screening av grupperte CRISPR-Cas9 KO biblioteket, grundig celle lyse og omvendt transkripsjon spille en avgjørende rolle i å bestemme ettrinns RT-qPCR (trinn 7.1-7.14). I tillegg kan øker kvaliteten på PCR produkter sikre vellykket indel mutasjon oppdagelsen, fordi lav kvalitet PCR produkter vil påvirke heteroduplex/homoduplex Generasjonsprosessen (trinn 9.1-.6).

I tillegg kan metoden brukes til å identifisere CTCF rolle i HOX gene regulering i embryonale utviklingen og visse leukemi med avvikende HOX gene signatur. For eksempel HOX genene spiller avgjørende roller under embryonale utviklingen, og alle fire klynger av HOX gens er timelig og romlig begrenset i deres uttrykk mønstre i embryonale utviklingen. Videre er NPM1 mutasjoner blant de vanligste genetiske abnormiteten i AML og utgjør 30% av AML pasienter med normal cytogenetic karyotype31. Denne utvalg av AML utstillinger en avvikende HOXA og HOXB gene signatur, som blir en dominerende mekanisme leukemic transformasjon17. Det er viktig å belyse hvor HOX genet er regulert i normal utvikling og dysregulated under leukemogenesis. Vi og andre har vist at CTCF spiller en viktig rolle i chromatin organisasjon og gene transkripsjon i HOX loci9,12. Dermed gir HOX loci fokusert sgRNA biblioteket screening en praktisk måte å vikle inn bestemte funksjonen til webområdet CTCF binding i HOX gene regulering under utvikling og blodkreft malignancies. Men er en begrensning av tilnærming problemer en nyttig markør for høy gjennomstrømming neste generasjons sekvensering. En av fremtidig forskning mål vil være å finne en svært selektive markør og utføre genomet hele neste generasjons sekvensering vil se markørens effekter. Derfor bruker et bestemt fluorescerende markør-merket gen som sporing reporteren blir et avgjørende verktøy for fremtiden forskning planer.

Enhancers spille en rekke avgjørende roller i regulering av arrangøren funksjon og gene expression. Men det kan også aktivere promoter aktivitet fra lang avstand på en posisjon og orientering uavhengig måte og enhancers regulere ofte byggkorn under en trans orientering. Dermed er det utfordrende for å finne enhancer(s) for bestemte gener, spesielt i post-genom tid. Tradisjonelle journalist analyser og correlative funksjonelle analyser (f.eks chromatin immunoprecipitation og DNaseI overfølsom analyser) har blitt brukt til å undersøke enhancer funksjonen32,33. Tilsvarende ble liten skalert locus-fokusert screenings også brukt til å utforske aktiviteter distale og proksimale regulatoriske elementer for bestemte gener34. Nylig identifisert den grupperte sgRNA-KO bibliotek strategien som er rettet mot ikke-kodingen regulatoriske elementer i HOX gene loci vellykket en CTCF binding området ligger mellom HOXA7 og HOXA9 gener, samt en HOTTIP lncRNA Det er avgjørende for å kontrollere bakre HOXA chromatin domene organisasjon, som kjører ektopisk HOXA genuttrykk i akutt myelogen leukemi (AML)12. Disse studier vist at grupperte sgRNA-KO biblioteket screening er også en kraftig genetikk tilnærming til å identifisere og evaluere biologisk funksjon av ikke-koding elementer i vår genomet i situ.

CTCF, spiller som en chromatin isolator protein, en viktig rolle i genomet organisasjonen ved å definere chromatin nabolag for bestemte genet uttrykk mønstre i bestemt celle type11,35. Endring av topologisk tilknyttede domenestruktur (TAD) endrer enhancer/Promotoren samhandling, resulterer i en sykelig tilstand5,11. CTCF er svært bevart i metazoan og berikes ved TAD grensene. Men det er fortsatt uklart om og hvordan CTCF bidrar til å opprettholde chromatin grensen struktur og TAD dannelse. Selv om grupperte CTCF sgRNA-knockout biblioteket screening ble fokusert på de fire HOX loci, det viste seg å være en kraftig metode å identifisere og dissekere CTCF grenser, og definere TAD domene samt enhancer/Promotoren samhandling og transkripsjon i den TAD domene12. I tillegg kan denne metoden effektivt brukes til å identifisere lncRNA elementer og transkripsjonsfaktorer som megle chromatin konformasjon og tilgjengelighet aktivitet i HOX loci. Vi prøver også å utforske CRISPR/sgRNA biblioteket som inneholder genomet hele CTCF nettsteder gjennom neste generasjons sekvensering identifikasjon ifølge CTCF ChIP-seq og ChIA-PET data i fremtiden forskning. Denne strategien kan dermed utvides til et hele Kromosom eller selv hele genomet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen konflikter av interesse knyttet til denne rapporten.

Acknowledgments

Forfatterne takker også Nicholas Cesari for redigering manuskriptet. Arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institute of Health (SH, R01DK110108, R01CA204044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Proteinase K Thermo Fisher Scientific 25530049
Puromycin Thermo Fisher Scientific A1113802
Stbl3 cells  Life Technologies  C737303
HEK293T ATCC CRL-3216
MOLM-13 DSMZ ACC 554
lentiCRISPRv2 Addgene 52961
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
pGEM®-T Easy Vector Systems  Promega A137A
T4 ligase  New England Biolabs  M0202S
QIAquick Gel Extract kit QIAGEN 28706
QIAuick PCR purification kit QIAGEN 28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit Bio-Rad Laboratories 1725095
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific  11965084
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 11875093
Fetal bovine serum (FBS)  Thermo Fisher Scientific 10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine  Life Technologies  10378016
Lenti-X Concentrator  Clontech 631232
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Genessee Scientific  25-507
TAE buffer  Thermo Fisher Scientific  FERB49
Surveyor® Mutation Detection Kits Integrated DNA Technologies 706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc System Bio-Rad 170-8126
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000138
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Fisher Scientific 88870002
TSX Series Ultra-Low Freezers Thermo Fisher Scientific TSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series Thermo Fisher Scientific 75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths Thermo Fisher Scientific FSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems Thermo Fisher Scientific 13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
MiniAmp™ Thermal Cycler Applied Biosystems technology A37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply Thermo Fisher Scientific 7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fisher Scientific 09-528-178
VWR® Tube Rotator and Rotisseries VWR International 10136-084
VWR® Incubating Mini Shaker VWR International 12620-942
Analytical Balance MS104TS/00 METTLER TOLEDO 30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer DeNovix Inc. DS-11 FX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Tags

Genetikk problemet 145 CRISPR/Cas9 sgRNA biblioteket screening CTCF grensen HOX loci ettrinns RT-qPCR Indel mutasjon oppdagelsen akutt myelogen leukemi
<em>HOX</em> Loci fokusert CRISPR/sgRNA biblioteket Screening identifisere kritiske CTCF grenser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D.,… More

Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D., Brewer, E., Dovat, S., Qiu, Y., Huang, S. HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries. J. Vis. Exp. (145), e59382, doi:10.3791/59382 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter