Summary
一个 crisprsgrna 文库已被应用于蛋白质编码基因的询问。然而, sgRNA 文库揭示 CTCF 边界在基因调控中的作用的可行性仍未得到探讨。在这里, 我们描述了一个Hox位点特定的 sgRNA 库, 以阐明在hox位点中 ctcf 边界的功能。
Abstract
ccctc 结合因子 (CTCF) 介导的稳定拓扑关联域 (Tad) 在约束位于邻近 Tad 的 DNA 元素的相互作用方面起着至关重要的作用。CTCF 在调节 hox 基因的时空表达方面发挥着重要作用, 这些基因控制胚胎发育、身体模式、造血和白血病发生。然而, 它在很大程度上是未知的是否和如何乡相关的 CTCF 边界调节染色质组织和hox基因表达。在目前的协议中, 生成了一个针对 Hoxa/bcp 位点中所有 CTCF 结合位点的特定 sgrna 集合库, 以检查破坏 ctcf 相关染色质边界对 tad 形成和hox基因的影响表达。通过 CRISPR-CAS9 基因筛选, 位于hoxaeeehoxa9基因 (CBS7/9) 之间的 CTCF 结合位点已被确定为致癌染色质域的关键调节剂, 对维持异位hox基因也很重要。mll 重组急性髓系白血病 (AML) 的表达模式。因此, 这种 sgRNA 库筛选方法为特定基因位点中 CTCF 介导的基因组组织提供了新的见解, 也为注释遗传调控元素的功能表征提供了基础, 包括编码和编码。在人类基因组计划时代的正常生物过程中, 不编码。
Introduction
最近的基因组相互作用研究表明, 人类核基因组形成稳定的拓扑关联域 (Tad), 这些位点在细胞类型和物种之间是保守的。将基因组组织成不同的领域, 促进和限制了监管要素 (例如增强剂和促进剂) 之间的相互作用。ccctc 结合因子 (CTCF) 与 TAD边界结合在一起, 在约束位于邻近 tad 1 的 dna 元素的相互作用方面发挥着至关重要的作用。然而, 全基因组 CTCF 结合数据显示, 尽管 CTCF 在不同细胞类型中大多与相同的 dna 位点相互作用, 但它通常在一种细胞类型的特定部位起到染色质屏障的作用, 但在另一种细胞类型中却不起作用, 这表明 CTCF 的功能与其他活动一起形成染色质边界2。目前尚不清楚的是, 边界元素 (ctcf 结合位点) 是否与 CTCF 的生物功能直接相关, 以及这些联系是如何发生的。因此, 我们假设基因组中特定的 CTCF 结合位点直接调节 Tad 的形成和控制启动者在这些领域内或相邻域之间的相互作用。人类和小鼠基因组测序项目的完成以及随后的表观遗传分析发现了基因组的新的分子和遗传特征。然而, 特定签名修饰在基因调控和细胞功能中的作用及其分子机制尚未完全了解。
多行证据支持 ctcf 介导的 tad 代表功能染色质域3,4,5。虽然 CTCF 主要与不同细胞类型的相同 dna 位点相互作用, 但全基因组范围的 CTCF ChIP-seq 数据显示, CTCF 在一种细胞类型中通常起到染色质屏障的作用, 但在另一种细胞类型中却没有。ctcf 通过调解基因组组织 4、6、7在发育过程中发挥着至关重要的作用。CTCF 边界的破坏损害了增强剂的相互作用和基因表达, 导致发育障碍。这表明 ctcf 介导的 tad 不仅是结构成分, 也是适当的增强剂作用和基因转录所需的调控单位 5,8,9.
hox基因在胚胎发育过程中起着至关重要的作用, 它们的表达模式受到时间和空间的限制。Hoxa位点形成两个稳定的 tad, 通过在 HESCS 和 IMR90 细胞1中的 ctcf 相关边界元素分离前、后基因。最近的报告表明, HoxBlinc, 一个与 Hoxb相关的 incrna 位点, 介导了在HOXB位点中 Ctcf 定向 tad 和 hancer 类似物的形成。这导致前hoxb基因激活在 esc 承诺和分化10。此外, 在包括Hoxa位点在内的特定基因位点, ctcf 介导的 tad 域的改变改变了谱系特异性基因表达谱, 并与疾病状态11,12的发展有关。这些证据支持 CTCF 在协调基因转录和确定细胞身份方面的主要功能, 通过将基因组组织成功能域。
尽管 Hox 基因在胚胎发育过程中的作用,但它调节造血干细胞和祖细胞 (hsspc) 的功能。这是通过控制增殖和分化之间的平衡来实现的, 10、13、14、15。hox基因的表达在造血细胞的整个规格和分化过程中都受到严格的调控, hsp 中的表达最高, hox基因的表达在成熟过程中逐渐下降, 达到最低水平发生在分化的造血细胞16。hox基因失调是白血病转化的主要机制, 它通过对 hsp pc 的自我更新和分化特性的失调, 导致白血病转化17,18.然而, 建立和维持正常与肿瘤表达模式的机制以及相关的调控网络仍然不清楚。
CRISPR-CAS9 sgRNA 库筛选已被广泛用于检测蛋白质编码基因19以及非编码基因, 如 Ncrna20和 mirna21在不同的物种。然而, 使用 CRISPR-CAS9 sgRNA 文库来确定新的基因组目标的成本仍然很高, 因为高通量基因组测序通常用于验证 sgRNA 库筛选。我们的 sgRNA 筛选系统侧重于特定的基因组位点, 并根据标记基因表达 (如 Hoxa9), 通过一步 RT-PCR 评估靶向 sgRNA。此外, Sanger 测序证实 sgRNA 已被整合到基因组中, 并且可以检测到 Indel 突变以识别 sgRNA 靶向位置。通过 lci 特异性 Crispr-cas9 基因筛选, CBSVI/9 染色质边界被确定为建立致癌染色质域和维持 aml 发病机制中异位Hox基因表达模式的关键调节器12. 该方法不仅可广泛应用于确定 CTCF 边界在胚胎发育、造血、白细胞生成中的特定功能, 而且可作为未来表观遗传治疗的潜在治疗靶点。
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Protocol
1. 使用在线工具进行库设计
- 利用遗传摄动平台 (GPP) 设计工具 (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) 设计了人类Hox位点 Ctcf 结合位点的 sgRNA 靶向。
- 合成了总共 1, 070 Sgrna, 包括针对303个随机靶向基因的 Sgrna、60个阳性对照、500个非人类靶向对照和 207个 CTCF 元素或靶向基因的 lncRNA (图 1,表 1)。每个靶向 DNA 元素都有5-10 种不同的 Sgrna 作为目标。
2. sgRNA 文库克隆
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将合成的寡核苷酸克隆到 CRISPR 慢病毒主干载体 (慢晶 Crisprv2) 中。
- 在37°c 下, 用 BsmBI 限制性酶消化 LentiCRISPRv2 载体2小时。
- 寻找 BsmBI 消化后凝胶上存在较大的带 (约 12, 873 bp), 然后用凝胶提取试剂盒进行纯化。
请注意:消化后凝胶上也有2kb 的小填充物, 但这一点应该忽略。 - 将合成的寡核苷酸和消化的 LentiCRISPR 载体与150纳克消化的 LentiCRISPR dna、1μl 10Μm 寡核苷酸、2μl 10x T4 连接酶缓冲液、1微米的 T4 连接酶, 然后在16°c 隔夜孵育。
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将慢病毒 crisprsgrna 文库转化为电位细胞进行扩增。
- 在 1.8 kV、200ω和25μf 的环境下准备电控剂。然后在37°c 的水浴中预加热回收 SOC 介质, 在37°c 的水浴中预加热 lb 氨匹西林抗生素板。
- 将有能力的细胞在冰上解冻10分钟。
- 在冰上准备 1.5 mL 微离心管和1毫米电穿孔块。
- 将10μμl 文库质粒 dna 的1μl 混合到 1.5 mL 微离心管中的25Μl 中, 并手动将管底闪烁几次轻轻混合。
- 一旦试剂盒足够冷, 将 dna/合格的细胞混合物转移到它。在台面上轻拍两次, 用纸巾擦拭立方外部的任何水滴。然后将立方放置在电穿孔模块中, 然后按脉冲。
- 立即加入37°c 预热 SOC 介质的975Μl。通过上下移液混合, 转移到15毫升管。
- 在37°c 下旋转和孵育1小时。
- 将100μl 细胞稀释为900μl 的 SOC 介质, 并将100μl 置于 LB 氨匹西林抗生素琼脂板上。在37°c 下过夜。
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使用制造商协议中详细说明的最大准备柱从组合菌落中提取质粒 DNA。
- 将所有菌落从 LB 琼脂板上刮下来, 接种2毫升 lb 氨匹西林抗生素培养基的发酵剂培养, 并在37°c 时进行剧烈晃动 (~ 200 x g) 孵育。
- 将起始培养 1: 500 稀释为 LB 氨匹西林培养基的 100 mL, 在37°c 孵育 12-16小时, 剧烈晃动 (~ 200 x g)。
- 在4°C 条件下, 以 6, 000 x 克离心 15分钟, 通过离心收获细菌细胞颗粒。
- 在悬浮液的10毫升中重新悬浮细菌颗粒。
- 将悬浮颗粒与10毫升的裂解缓冲液结合, 并大力反转4-6 倍。在室温下培养溶液5分钟。
- 用10毫升的冷冻中和缓冲液中和裂解液。混合方法: 将管材轻轻倒置4-6 次, 在冰上孵育20分钟。
- 在 13,500 x g的温度下旋转 30分钟, 在4°c 下。迅速将含有质粒 DNA 的上清液转移到新的试管中。
- 重复步骤 2.3.7, 并及时将含有质粒 DNA 的上清液转移到新的试管中。
- 采用10毫升的平衡缓冲器对柱进行平衡, 并允许柱通过重力流清空。
- 将上清液添加到柱中, 使其通过重力流进入树脂。
- 用2x30 毫升的洗涤缓冲液清洗色谱柱。
- 用15毫升的洗脱缓冲液清除 DNA。
- 用室温异丙醇的10.5 毫升将 DNA 沉淀到洗脱的 DNA 中。在4°C 下, 以 15, 000 x克的速度立即混合和旋转 30分钟, 并轻轻地对上清液进行装饰。
- 用7毫升乙醇清洗 DNA 颗粒, 在 15, 000 x克离心 dna 颗粒10分钟内清洗, 并丢弃清除的上清液。
- 重复步骤2.5.14 再重复两次。
- 以 15, 000 x克离心dna 颗粒 10分钟, 并在不干扰 dna 颗粒的情况下轻轻地切去上清液。
- 将颗粒风干 5-10, 并将 DNA 溶解在所需的缓冲液量中 (TE 缓冲液, pH 8.0)。
3. 高标题 sgRNA 库慢病毒生成
- 细胞制剂: 在 Dulbecco 的修饰鹰培养基 (DMEM) 中培养 HEK293T 细胞, 辅以 10% (vol/vol) 胎儿牛血清 (FBS) 和 1-1% (vol/vol) 青霉素-链霉素 (PS) 抗生素 T-25 瓶中的补充。将它们放在37°c 和 5% CO2的孵化器中。
- 包慢病毒: 在采集病毒之前, 将 HEK293T 细胞与来自步骤2、15微克的包质粒 (psPAX2) 和10μg 包膜质粒 (pmd2. g) 的20μg 纯化的文库与体载体共同转染。
- 病毒收集: 48小时后, 通过0.45μm 低蛋白结合 PVDF 膜收集病毒上清液并过滤病毒上清液。
- 病毒浓度: 使用选矿厂将慢病毒上清液浓缩 50倍, 并在第5步中测试病毒 MOI。
- 病毒储存: 将浓缩病毒液体储存在-80°c 的冰柜中。
4. 优化普霉素浓度
- 白血病细胞培养: 在 RPMI 1640 中培养 MOLM13 AML 细胞, 并在 t-125 瓶中添加 10% (vol2 vol) 胎儿牛血清 (FBS) 和1x 青霉素-链霉素 (PS) 抗生素。将它们放在37°c 和 5% CO2的孵化器中。
请注意:单元格通常每4-5d 传递一次, 拆分比例为1:4 或 1:6, 永远不会允许单元格达到70% 以上的融合度。 - 将 MOLM13 细胞安装在密度为 1.0 x 10 4 ml 的12孔板中, 总体积为每口2毫升 (2.0 x10 4个单元)。
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时间-过程分析: 用 puromycin 在不断增加的浓度 (0.1μg/ml, 0.2μg/ml, 0.5μg/ml, 1.0μgml 和2.0 μgml) 治疗 MOM13 细胞7天
- 在第0天建立不受 puromycin 治疗的 MOLM13 细胞, 并在第0天至第7天建立3口不受 puromycin 治疗的复制井。
- 分别用0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μgml 和2.0μgml 处理 molm13 细胞, 每个实验条件包含3个复制井。
- 计算活细胞比率, 并使一个生存曲线从第0天到第7天包含所有条件。
- 生存曲线: 使用色氨酸蓝的染色细胞, 每天计数活力, 以获得每个 puromycin 浓度的存活曲线。
- 优化最小的 puromycin 浓度: 通过 Trypan 蓝色染色确定最小的 puromycin 浓度, 在这种染色中, 所有 MOLM13 细胞在5-7 之间被杀死。
5. MOLM13 白血病细胞慢病毒文库的滴定
- AML 细胞制备: 在 1.5 x 10 6 细胞的密度下, 用转导介质 (RPMI 1640、10% FBS、1% PS 和8.0Μg/ml 涂层介质) 收集 MOLM13 aml 细胞.
- 将 MOLM13 细胞放置在12孔板中, 每口井中有 1.5 x10 6个细胞。
- 解冻慢病毒: 从-80°c 的冷冻机中取出浓缩的慢病毒, 并将其解冻在冰上。
- 将不同剂量的浓缩慢病毒的 MOLM13 细胞混合在不同的井中, 包括0、1、2.5、5、7.5 和 10μl (共6组)。
- 立即以 1, 000 x g的速度在33°c 下将这些混合物离心 2, 并将12孔板在37°c 时转移回孵化器, 将 5% co 2 转移到4小时内的孵化器中。
- 4小时后, 在室温下, 以 400 x g的速度将受感染的细胞旋转5分钟。
- 在不干扰细胞颗粒的情况下轻轻吸吸上清液, 用新鲜培养基 (RPMI 1640, 10% FBS 和 1% PS) 重新悬浮被转移的细胞, 然后将其转移到 T-25°c 的烧瓶中, 在没有紫霉素的情况下孵育48小时。
- 48小时后, 将这些细胞分成2个瓶 (2 组): 一组用1微克霉素治疗 5天, 对照组5天不接受 puromycin 治疗。
- 根据步骤 4, 用 1μgl puromycin 进行5天的 puromycin 选择, 直到所有未转移的对照细胞死亡。每2天更换一次新鲜媒体。
- 通过将 puromycin 治疗的活细胞数量与不治疗 puromycin 的细胞数量分开, 测量转导的优化 MOI 值。
6. 池化 CRISPR-CASR9 Ko 图书馆的转移
- 慢病毒转导: 在6井板中感染 1.5 x10 6 molm13 细胞, 其中 0.3 moi sgRNA 集合的慢病毒 (rpmi 1640、10% fbs、1% ps 和8μgml 涂层介质), 并在没有慢病毒感染的情况下使用细胞作为对照。
- 立即以 1, 000 x克的速度离心6井板, 在33°c 下进行2小时的喷水, 并将板转移回37°c 的孵化器, 将 5% co 2 转移到 4 h 的孵化器中。
- 在室温下, 以 400 x g的速度将受感染的细胞向下旋转5分钟。
- 在不干扰细胞颗粒的情况下轻轻吸吸上清液, 用新鲜培养基 (RPMI 1640, 10% FBS 和 1% PS) 重新悬浮被转移的细胞, 然后将其转移到 T-25°c 的烧瓶中, 在没有 puromycin 的情况下在37°c 孵育48小时。
- 48小时后, 用1微克/升普莱霉素治疗细胞5天。2天后更换新鲜介质, 并保持最佳细胞密度。
- 用限制稀释法在96孔板中播种单克隆, 并在37°c 和 5% CO 2 中孵育这些单克隆.培养他们3-4周。
- 在单个细胞成长为一个种群后, 将一半的细胞转移到24孔板中, 以便在 puromycin 选择下进一步培养, 并在下一步验证这些克隆。保留其余的细胞。
7. 用一步 RT-qPCR 筛选集合 CRISPR-CAS9 Ko 图书馆
- 用一步逆转录酶聚合酶链反应 (一步 RT-qPCR) 评估标记基因Hoxa9的表达, 确定 sgRNA 综合克隆筛选的有效性。
请注意:hoxa9在 molm13 aml 细胞中的高度表达, 在白血病中呈 22,23。 - 计数 sgRNA 整合 MOLM13 细胞, 并将每口井 1 x10 4个细胞转移到96孔 pcr 板。
- 以 1, 000 x克的速度离心管 5分钟, 然后用管道彻底取出并丢弃上清液, 而不会干扰细胞颗粒。
- 用125μl 的 PBS 缓冲液清洗细胞, 并以 1, 000 x克的速度将管离心5分钟。然后使用移液器去除120Μl 的上清液, 并在每口井中保留约5μl 的 PBS。
- 在每口井加入50Μl 的细胞裂解主混合物, 其中含有48μl 的细胞裂解缓冲液、1μl 的蛋白酶 k 溶液 (10mg/ml) 和1μl 的 DNase 溶液 (1 mg/mL)。然后向上和向下向上和向下下移出 5次, 重新悬浮细胞颗粒。
- 在室温下将混合物加氢 10分钟, 在37°c 下加氢 5分钟, 然后在75°c 下孵化5分钟。
- 将细胞裂解液存放在-80°c 的冰柜中。
- 一步 RT-qPCR 反应的制备: 将一步反应混合物和其他反应组分解冻至4°c。然后短暂旋转, 收集管道底部的溶液, 在没有光线的情况下放在冰上。轻轻混合和旋转。
- 用 RT-qPCR 反应混合物在 PCR 井中加入1μl 的细胞裂解液, 包括标记基因正向引物 (300 nM) 和反向引物 (300 nM) 的1μl、逆转录酶的 0.125μl (10ueμl) 和一步反应混合物的 5Μl (2x)。
- 用光学透明膜封井, 轻轻旋涡混合反应成分。
- 将96孔 PCR 板放置在实时 PCR 仪器上。
- 在50°c 下进行10分钟的逆转录酶反应, 然后在95°c 下进行聚合酶失活和 DNA 变性1分钟。
- 用 40个 PCR 反应周期进行 RT-PCR: 95°c 时变性 15秒, 在60°c 下退火延伸和平板荧光读数 20秒, 然后在65-95°c 时通过0.5°c 增量在2-5 步进行熔融曲线分析。
- 分别根据hoxa9基因的表达水平与对照建立了可调节、下调、无变化组。使用β-肌动蛋白基因作为家养基因控制。
8. 通过基因分型和单片序列验证综合 Sgrna 阳性克隆
- 通过 Sanger 测序验证Hoxa9降低表达克隆, 并使用 50-100 NG MOLM13 基因组 dna 进行 pcr, 5μl 聚合酶反应缓冲液 (10倍)、1μl 正向底漆 (10μm) (aatgattattattattatactacttattatcg) 和1μl 反向底漆 (10mM) (TCTTTATTCCCTGGGGGGGGGGGCCCTG), 1μl dNTP (10mM), 1个单位聚合酶 (5u/μl)。在94°c 下进行 PCR 反应 30秒, 然后在94°c 下进行更多变性 20秒, 在56°c 下退火 20秒, 在68°c 下延长 20秒 (共 30周), 最后在68°c 下延长10分钟, 然后保持在4°c。
- 用 PCR 纯化试剂盒提取和纯化 PCR 产品 (285 bp 大小)。
- 用 2μl T4 结扎缓冲液 (10倍) 将纯化后的 PCR 产物连接到 T 载体中, 50 ng t 载体 DNA (50ngnqμl), 25 ng 纯化 PCR DNA (285 bp), 1Μl T4 连接酶 (3unitsμh), 并将结扎混合物放入16°c 的孵化器过夜。
- 将结扎混合物转移到 DH5Α有能力的细胞中, 在 LB 氨匹西林抗生素琼脂板上生长, 并在37°c 孵育过夜。
- 从 LB 板中选取单个克隆体, 并通过基因分型和桑格测序对其进行验证。
9. 核核酸酶消化法检测 Sgrna 诱导的 Indel 突变
- 通过核酸酶检测, 检测 sgRNA 集成的单克隆诱导 Indel 率。
- 用50-100 纳克指数突变体 (测试) 和野生类型 (WT, 参考) DNA 作为 PCR 模板分别制备 pcr 放大器, 5μl 聚合酶反应缓冲液 (10倍)、1μl dNTP (10X)、1单元聚合酶 (5uucμl)、1μl 正向底漆 (10Μm) (5 '-GAGGGGGGGGGGGGGAG-3 ') 和1μL 反向底漆 (10Μm) (5 '-AAATAGGGGGGCTCTCT-3 ')。PCR 反应在98°c 下进行了30秒的初始变性, 然后在98°c 下变性了 30秒, 在56°c 下退火了 20秒, 在72°c 下延长了 30秒 (共 30周), 最后在72°c 下进行了10分钟的扩展, 并保持在4°c。
- 在 0.2 mL PCR 管中设置具有 200 ng 的 "参考" (20ngμ-l) 和 200 ng 的 "测试" (20 ngμl) PCR 放大器的异相混合物组, 以及仅有400纳克 "参考" PCR 振幅作为对照的同源双相混合物组。
- 在充满800毫升水的1升烧杯中, 在95°c 下分别孵育异相混合物和同相混合物 5分钟, 然后逐渐冷却到室温退火, 形成异双工或同双工。
- 在42°C 下分别消化 400 ng 退火异相和同源混合物, 在42°c 下进行1Μl 缩进突变检测核酸酶 (2.5 uesμl) 和2μl 核酸酶反应缓冲液 (10x) 60分钟。
- 用琼脂糖凝胶电泳分析消化样品, 将异相混合物 DNA 切割成小片段 (70-250 bp), 不切割同源 DNA (320 bp)。
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Representative Results
Crispr-cas9 技术是功能基因组研究的有力研究工具。它正在迅速取代传统的基因编辑技术, 在全基因组和以基因为中心的个人应用中都具有很高的用途。在这里, 第一个单独克隆的 lace 特异性 Crispr-casr9 排列的 sgRNA 库包含 1, 070 SgRNA, 包括针对303随机靶向基因的 SgRNA、60个阳性对照、500个非人类靶向对照和 207个 CTCF 元素或 lncRNA在四个Hox位点中靶向基因 (图 1,表 1)。该文库针对所有 CTCF 核心结合图案、 hox基因相关的 incrna、已知的调控元素和几个hox基因作为hox位点中的阳性对照。它还包含针对随机非hox基因、非人类基因和基因间区域作为阴性对照的 Sgrna。为了提高 CTCF 站点敲除 (KO) 的效率和特异性, 每个靶向站点包含 5-10 Sgrna (表 1)。在这里描述的协议中, sgRNA 库是根据这些位点的 HOXAB/BACE/DACE 和 Inrna 上的 CTCF 结合位点设计的, 它基于广泛的研究所 sgRNA 工具 (图 1,图 2). 在携带 MLL-AF9 融合的 MOLM13 细胞中, MOI 为0.3 的转导后, 感染率小于 1 sgrn·细胞, 然后选择 puromycin, 然后从种子单细胞中生长出耐药克隆。筛选Hoxa9基因表达障碍。
简要介绍了 sgRNA 库筛选的工作流程 (图 3)。首先, 在两个载体 (psPAX2 和 pmd2. g) 的帮助下, 在 HEK293T 细胞中生成了含有 sgRNA 库的病毒。用聚苯甲 (8.0μg/ml) 将 sgRNA 集合培养的慢病毒浓缩并转化为 MOLM13 AML 细胞。48小时转导后, 细胞以最佳浓度的 puromycin 进行治疗。5天后, 细胞被播种成96孔板的细胞, 并在 puromycin 的存在下生成单个克隆体。最后, 采用一步 RT-PCR、Sanger 测序和 Indel 突变检测 (图 3) 对整合到基因组中的 sgRNA 单克隆进行了鉴定。根据Hoxa9癌基因的改变表达, 通过一步液滴数字 RT-qPCR (rt-dqpcr) 鉴定出抗普罗霉素的单克隆 (图 4)。对 sgrna 库的构建和验证进行了基因分型和桑格序列的构建和验证 (图 2, 图4)。
利用基于HOXA9基因表达水平的 RT-qPCR 方法, 通过与对照细胞的比较, 进一步证实了96孔 pcr 板中 molm13 阳性克隆体的 sgRNA。在528存活的克隆中, 有10个克隆体的Hoxa9水平下降了50% 以上 (图 4 a)。Sgrna 集成到Hoxa9还原、 hoxa9不变和hoxa9增加的克隆中, 通过使用侧翼载体引物对 SGRNA 序列进行 pcr 扩增, 得到了进一步的证实。纯化后的 PCR 产物通过 T4 连接酶连接到 T 载体系统中, 并通过 Sanger 序列进行鉴定 (见步骤 8)。序列数据表明, 在30个测序克隆中, 21个克隆包括单个 sgRNA (表 2)。根据Hoxa9的表达水平, 对 sgrna 的种类进行了鉴定和分析。在显示 hoxa9水平降低的10个克隆中, 有6个克隆包含针对 cbsne9 位点的 sgrna, 但不包括非人类基因、随机人类基因和其他 CTCF 位点对照 (图 4和表 2)。
基于 pcr 基因分型和核酸酶消化法 (图 5), 确定了 sgRNA 综合阳性单克隆诱导的 indel 突变。进行了核酸酶消化试验, 以确定在 cbs粤9边界发生的 indel 突变, 在代表性Hoxa9-减少, hoxa9-不变, 和hoxa9-增加的克隆。结果表明, 在 6个Hoxa9减少的克隆中, 有4个发现了 cbs国际性突变: 克隆 #5、6、28和 121, 但不是克隆 #15 和 #31 (图 5)。然而, 克隆 #15 包含了针对hottip lncrna 站点的sgRNA, 而克隆 #31 中包含了几个针对hoairm1 lncrna、 hotair lncrna 和HOXD9/10结合位点的 sgRNA (图 4b, 5)和表 2)。
图 1:示意图, 显示四个中的 ctcf 绑定站点和神经网络公司基因位点.每个靶向 DNA 元素包含5-10 种不同的 Sgrna。CTCF ChIP-seq 数据集是从 GEO (GSM1335528) 下载的, 并通过集成基因组查看器 (IGV) 进行可视化。用橙色剪刀标记了 hox 位点中 ctcf 位点的 SgRNA。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 代表整合 sgRNA 载体序列和 PCR 扩增引物部分的原理图.根据 sgRNA 慢病毒载体的空白序列设计了 PCR 扩增引物。正向引物 (P1) 以黄色突出显示, 反向引物 (P2) 以红色突出显示, sgRNA 在 sgRNA 慢病毒载体中以绿色突出显示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 代表 sgrna 库设计、建设和验证的工作流程的原理图.此工作流如下所示。首先, 将 sgRNA 文库设计并克隆为慢病毒 CRISPR 载体, 然后将慢病毒与 Hek293t 细胞中的 sgRNA 文库慢病毒载体 psPAX2 和 pmd2. g 载体包装在一起。接下来, MOLM13 细胞感染了低 MOI (0.3) 病毒, 这些细胞接受了 puromycin 的选择。然后, 在一个96孔的盘子里播种了这个单一的克隆体。最后, 采用一步 RT-qPCR、Sanger 序列和 Indel 突变检测方法对整合到基因组中的 sgRNA 单克隆进行了鉴定。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:用一步 RT-QPCR 和 Sanger 序列进行了集中的 Crispr-cas9 ko 图书馆筛选。(a) 一步 RT-droplet 数字 pcr 筛选Hoxa9在感染了含有 sgrna 文库的慢病毒的单个克隆中的表达。对 528 sgRNA 文库中感染的克隆体进行了Hoxa9表达水平的筛选 (528 点)。528克隆中有10个显示Hoxa9水平 (紫色箭头) 降低了50% 以上。通过与对照单元的比较, 红线表示2倍减少变化的边界;蓝线表示2倍增加变化的边界。(b) cbs7/9 特定 Sgrna 通过 sanger 序列 (绿色箭头) 将 #5、6、28、121、207和420的6个克隆体作为目标。(c) 对 WT molm13 和含有单靶向 sgrna 的21个克隆中的 hoxa9水平进行 rt-ddqpcr 分析。Hoxa9 表达数据根据 sgRNA 序列的类别分为五组: hoxaabe9ctcf站点、非人类目标、 hox位点中的其他 Ctcf 站点、氧相关的 ncrna 和其他人类目标。这一数字已从 Roo 等人 12人的修改。对于统计, 这些数据表示为学生 t 测试的三个独立实验中的平均值±sd。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:基于 pcr 的基因分型和核酸酶检测证实了综合 Sgrna 阳性克隆的压头突变。(一) 基因组 dna 从具有代表性的 Crispr-cas9 ko 文库中分离出来, 筛选出的克隆显示出降低、不变或增加的 Hoxa9表达水平。采用基于 pcr 的基因分型方法, 确定了位于Hoxa7和hoxa9基因 (cbs7/9 边界) 之间的 ctcf 位点杂合缺失。Hoxa9减少的克隆 #5、6、28和121在 cbs79 边界位置 (黑色箭头) 中显示出删除。(b)用核酸酶消化法分析了 cbs79 位点的 indel 突变, 该位骨表现出减少 (红线)、不变 (蓝线) 或增加 (紫色线) Hoxa9表达水平的代表克隆。Hoxa9减少的克隆 #5、6、28和121在 cbs79 边界位置 (橙色箭头) 中表现出突变。这一数字已从 Roo 等人 12人的修改。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1:面向信息的库.这一数据来自罗等人.请点击此处下载此表格.
表 2:桑格选定的 Sgrna 的测序结果Hoxa9-减少,Hoxa9-不变, 和Hoxa9-增加克隆.Hoxa9减少, 不变和增加克隆突出显示红色, 蓝色和紫色, 分别。这一数据来自罗等人.请点击此处下载此表格.
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Discussion
蛋白质编码基因相关的 sgrna 文库已应用于功能筛选系统, 通过 sgrna 富集 24,25,26 来识别调节特定细胞功能的基因和网络,27,28。几个与非编码区域相关的 sgRNA 文库也显示在远端和近端调节元素的基因特异性功能屏幕中, 包括bcl11a、 tgf1a和耐药调节基因28。 29,30。这些 sgRNA 文库都是由详细的生物信息学设计、寡核苷酸合成和将寡核苷酸池亚克隆化为载体生成的。整个全基因组筛选方法非常强大和有用, 但需要计算专业知识来进行全基因组的 sgRNA 设计, 并为昂贵的合成提供一致的资金;因此, 它仍然是挑战的大多数实验室。然而, 我们的特定于肝脏的 sgRNA 库筛选方法是既方便又有效地识别特定的 DNA 元素, 如涉及染色质组织和转录调控的 CTCF 结合位点 (图 1) 和图 2)。通过针对 CTCF 边界, 我们应用一步 RT-PCR 方法, 根据特定标记基因Hoxa9的表达水平, 对 sgRNA 靶向克隆进行评估。此外, 我们还执行了 Sanger 测序来确认这些正集成的 Sgrna 克隆 (图 2 和图 4)。为了在功能上确认这些阳性 Sgrna 靶向克隆, 我们进行了基于 pcr 的基因分型和突变检测检测, 以确定 sgRNA 是否诱导目标位点插入或删除突变 (图 5)。这为我们确定特定非编码 DNA 元素并评价其在哺乳动物细胞中的生物学功能提供了一种很有希望的方法。
在我们的协议中, 我们提到, 特定的寡核苷酸设计将确保更有效地亚克隆到小环 Cripsrv2 载体, 并更可靠地生成一个准确的 sgRNA 库 (步骤 1-2)。为了获得高滴度 sgRNA 库慢病毒, 慢病毒上清液应按照协议 (步骤 3) 使用集中器浓缩50倍, 并储存在-80°c 的冰柜中多个等价物 (步骤 3.1-3.5)。另一个值得关注的问题是找到转导的最佳 MOI 值。如果 MOI 太低, 受感染细胞的数量就会减少, 导致 sgRNA 筛查失败。如果 MOI 过高, 它将多个 sgRNA 集成到单个细胞中, 并通过一步 RT-PCR 和 Indel 突变检测干扰 sgRNA 库筛选。因此, 在筛选之前, 通过慢病毒库的滴定法, 为每一组细胞找到最佳的 MOI 是一个重要步骤。该协议 (步骤 5.1-5.10) 将对 MOLM13 白血病细胞中的慢病毒库进行滴定和 MOI 评估。此外, 彻底裂解细胞进行逆转录酶检查可以确保成功的一步 RT-PCR。这可以通过增加在协议中的所有温度阶段进行裂解的孵育时间来实现 (步骤 7.5–7.6)。因此, 为了提高筛选集合 CRISPR-CAS9 ko 库的效率, 彻底的细胞裂解和逆转录酶在确定一步 RT-qPCR (步骤 7.1-7.14) 方面发挥着至关重要的作用。此外, 提高 PCR 产品的质量可以确保成功的 indel 突变检测, 因为低质量的 PCR 产品将影响异质双面/同源双工生成过程 (步骤 9.1–6)。
此外, 该方法还可用于识别 CTCF 在早期胚胎发育和某些具有异常hox基因特征的白血病中的 hox 基因调控中的作用。例如, hox基因在胚胎发育过程中起着至关重要的作用, 所有四个 hox 基因簇在胚胎发育过程中的表达模式都受到时间和空间的限制。此外, NPM1 突变是 AML 中最常见的基因异常之一, 占正常细胞遗传核型 31 aml 患者的 30%.AML 的这个子集表现出异常的Hoxa和hoxb基因特征, 成为白血病转化17的主导机制。关键是要阐明Hox基因是如何调节在正常发育和调节失调在白血病发生。我们和其他人已经证明, CTCF 在聊染色质组织和基因转录中起着至关重要的作用。因此, Hox位点聚焦 sgRNA 库筛选提供了一种方便的手段, 可以在开发过程中将 CTCF 结合位点在 ux 基因调控和造血恶性肿瘤中的特异性功能纠缠在一起。然而, 该方法的一个局限性是很难找到一个有用的标记, 为高通量下一代测序。未来的研究目标之一将是找到一个高度选择性的标记, 并进行全基因组的下一代测序, 以看到标记的效果。因此, 使用特定的荧光标记基因作为跟踪记者将成为未来研究计划中的一个关键工具。
增强剂在启动子功能和基因表达的调节中发挥着多种关键作用。然而, 它也可以激活启动子活性从远距离在一个位置和方向独立的方式, 增强剂往往调节基因表达在一个反式方向。因此, 为特定基因精确定位增强剂是很有挑战性的, 尤其是在后基因组时代。传统的记者分析和相关功能分析 (如染色质免疫沉淀和 dnseesi 超敏分析) 已被用来检查增强剂功能32,33。同样, 小规模的以位为中心的筛选也被用于探索特定基因的远端和近端调节因子的活性 34。最近, 针对hox基因位点中的非编码调控元素的集合 sgRNA-KO 库策略成功地确定了位于Hoxa7和HOXA9基因之间的 Ctcf 结合位点, 以及hotip lncrna这对于控制急性髓系白血病 (aml) 12 中异位hoxa基因表达是控制后 hxa 染色质组织的关键.这些研究表明, 汇集的 sgRNA-KO 库筛选也是一种强大的遗传学方法, 用于识别和评估非编码元素在我们的基因组中的生物功能在我们的原位。
ctcf 作为染色质绝缘蛋白, 通过定义特定细胞类型 11、35的特定基因表达模式的染色质邻域, 在基因组组织中发挥着重要作用。拓扑相关域 (TAD) 结构的改变改变了提升剂的相互作用, 导致病变状态5,11。CTCF 在元氮中高度守控, 在 TAD 边界处富集。然而, 目前仍不清楚 CTCF 是否以及如何有助于维持染色质边界结构和 TAD 形成。虽然汇集的 CTCF sgrna 敲除库筛选的重点是四个hox位点, 但它被证明是识别和剖析 CTCF 边界的有力方法, 并定义了 tad 域以及在内部的相互作用和转录TAD 域12。此外, 该方法可有效地用于识别在 Hox 位点介导染色质构象和可获得性活性的 Ncrna 元素和转录因子。我们还在根据未来的研究中, 通过下一代测序识别, 探索包含全基因组 CTCF 站点的 CRISPR/sgRNA 库。因此, 这种策略可以扩展到整个染色体, 甚至整个基因组。
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Disclosures
我们与本报告没有利益冲突。
Acknowledgments
作者还感谢尼古拉斯·塞萨里编辑了手稿。这项工作得到了国家卫生研究所 (s. h., R01DK110108, R01DK110108) 的赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
References
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