Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

Published: March 31, 2019 doi: 10.3791/59382
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 3, 1
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Summary

Una biblioteca CRISPR/sgRNA ha sido aplicada a interrogar a genes de la proteína-codificación. Sin embargo, la factibilidad de una biblioteca sgRNA para descubrir la función de un límite CTCF en Regulación génica sigue siendo inexplorada. Aquí, describimos una biblioteca de sgRNA específicos HOX loci para aclarar la función de los límites CTCF en loci HOX .

Abstract

Factor de Unión CCCTC (CTCF)-mediado estable topológicamente asociar dominios (TADs) juegan un papel crítico en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en la vecina TADs. CTCF juega un papel importante en la regulación de la expresión espacial y temporal de los genes HOX que controlan el desarrollo embrionario, modelar cuerpo, hematopoyesis y leukemogenesis. Sin embargo, sigue siendo en gran parte desconocido si y cómo HOX loci asociados CTCF límites regulan la organización de la cromatina y expresión de genes HOX . En el protocolo actual, se ha generado una biblioteca los sgRNA específicos dirigidos a los sitios de unión de CTCF en los loci HOXA/B/C/D para examinar los efectos de alterar límites de cromatina asociada de CTCF en formación TAD y gene HOX expresión. A través de CRISPR Cas9 screening genético, el sitio de unión de CTCF entre los genes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) ha sido identificado como un regulador crítico de dominio de cromatina oncogénicos, como importante para el mantenimiento de genes HOX ectópico patrones de expresión en leucemia mieloide aguda (AML) reordenado MLL. Así, esta biblioteca sgRNA proyección enfoque proporciona nuevas penetraciones en CTCF mediada por genoma organización en loci gen específico y también proporciona una base para la caracterización funcional de los elementos reguladoras genéticos anotados, tanto de codificación y cubierta, durante los procesos biológicos normales en la época del proyecto genoma humano posterior.

Introduction

Estudios recientes de interacción genoma revelaron que las formas del genoma nuclear humano estable dominios topológicamente asociaba (TADs) que se conservan a través de especies y tipos celulares. La organización del genoma en dominios separados facilita y restringe las interacciones entre elementos reguladores (por ejemplo, promotores y potenciadores). El factor de Unión CCCTC (CTCF) se une a límites TAD y juega un papel fundamental en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en el vecino TADs1. Sin embargo, los datos de Unión CTCF amplia del genoma revelaron que aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos sitios de ADN en diferentes tipos celulares, a menudo funciona como una barrera de la cromatina en un sitio específico en una celda tipo pero no en el otro, lo que sugiere que las funciones CTCF junto con otras actividades en la formación de cromatina límites2. Lo que se desconoce es si los elementos de frontera (sitios de unión a CTCF) están directamente relacionados con la función biológica de CTCF y cómo se producen estos enlaces. Por lo tanto, presumimos que sitios específicos de unión de CTCF en el genoma directamente regulan la formación de TADs y controlan las interacciones promotor/enhancer dentro de estos dominios o entre los dominios vecinos. La terminación de los humanos y proyectos de secuenciación de genoma de ratón y posterior análisis epigenéticos han descubierto nuevas firmas moleculares y genéticas del genoma. Sin embargo, el papel de las firmas/modificaciones específicas en la regulación de genes y función celular, así como sus mecanismos moleculares, han de entenderse completamente.

Múltiples líneas de evidencia apoyan que el TADs CTCF-mediada representa cromatina funcional de dominios3,4,5. Aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos sitios de ADN en diferentes tipos celulares, datos del CTCF ChIP-seq amplia genoma revelaron que CTCF a menudo funciona como una barrera de cromatina en tipo de una célula pero no en los otros2. CTCF juega un papel esencial durante el desarrollo por mediación de genoma organización4,6,7. Alteración de límites CTCF deteriorado interacciones reforzador/promotor y expresión génica, llevando a la obstrucción del desarrollo. Esto sugiere que el CTCF mediado TADs no sólo son componentes estructurales, sino también unidades regulatorias necesarias para reforzador adecuado acción y gene transcripción5,8,9.

Genes HOX desempeñan papeles importantes durante el desarrollo embrionario y se limitan temporal y espacial en sus patrones de expresión. El locus HOXA forma dos TADs estables separación de genes anteriores y posteriores, por un elemento límite asociado de CTCF en hESCs y IMR90 las células1. Informes recientes demuestran que HoxBlinc, un HoxB locus asociado lncRNA, interviene en la formación de CTCF dirigido TADs e interacciones reforzador/promotor en el locus HOXB . Esto conduce a la activación de gen HOXB anterior durante el compromiso y la diferenciación de ESC10. Además, en lugares geométricos del gene específicos incluyendo el lugar geométrico HOXA , alteración de CTCF mediada por perfiles de expresión de gen específico de linaje TAD dominios cambiados y se asoció con el desarrollo de la enfermedad los Estados11,12. La evidencia apoya una función primaria de CTCF en coordinación de transcripción genética y determinar la identidad de la célula mediante la organización del genoma en dominios funcionales.

A pesar de su papel en el desarrollo embrionario, durante la hematopoyesis, genes HOX regulan función hematopoyética de la célula (capítulo/PC) del vástago y del progenitor. Esto se hace controlando el equilibrio entre la proliferación y diferenciación10,13,14,15. La expresión de genes HOX se regula firmemente a lo largo de la especificación y diferenciación de células hematopoyéticas, con la más alta expresión en HS / Uds. HOX genes disminuyen gradualmente durante la maduración, con sus niveles más bajos que ocurre en había distinguido células hematopoyéticas16. Dysregulation del gene HOX es un mecanismo dominante de la transformación leucémica por propiedades de auto renovación y diferenciación de dysregulating de HS/PCs a transformación leucémica17,18. Sin embargo, el mecanismo de establecer y mantener normal frente a patrones de la expresión oncogénica de genes HOX como redes de regulación asociadas sigue siendo confuso.

Proyección de biblioteca CRISPR Cas9 sgRNA ha sido ampliamente utilizado para interrogar la proteína-codificación genes19 como bien como no codificantes de genes, como lncRNA20 y miRNA21 en diferentes especies. Sin embargo, el costo de usar la biblioteca de sgRNA CRISPR Cas9 para identificar nuevas dianas genómicas sigue siendo alto, porque la secuencia del genoma de alto rendimiento se aplica a menudo para comprobar la proyección de la biblioteca de sgRNA. Nuestro sgRNA sistema se centra en los loci del genoma específicas y evalúa los objetivos sgRNAs a través de RT-PCR de un paso según la expresión del gen marcador, como HOXA9. Además, puede detectarse Sanger secuenciación confirmó que los sgRNA fue integrado en el genoma y las mutaciones Indel identificar lo sgRNA a sitio. A través de la investigación genética de CRISPR Cas9 loci específicos, el límite de la cromatina CBS7/9 ha sido identificado como un regulador crítico para establecer dominio de cromatina oncogénico y mantener patrones de expresión de gene HOX ectópicos en patogenesia AML 12. el método puede ser ampliamente aplicado para identificar no sólo la función específica de límite de CTCF en desarrollo embrionario, la hematopoyesis, leukemogenesis, pero también límite CTCF como potenciales dianas terapéuticas para la futura terapia epigenética.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. CTCF sgRNALibrary diseño de una herramienta en línea

  1. Diseño de lo sgRNA dirigidos a sitios de unión de CTCF en los loci HOX humanos usando la herramienta diseñador de la plataforma (GPP) de la perturbación genética (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Sintetizar un total de 1.070 sgRNAs de sgRNAs a 303 al azar genes de segmentación, 60 controles positivos, controles objetivos de humanos no 500 y 207 CTCF elementos o lncRNA dirigidos a genes (figura 1, tabla 1). Cada elemento de ADN targeting es dirigida por la sgRNAs diferentes de 5-10.

2. sgRNA biblioteca clonación

  1. Clonar los oligonucleótidos sintetizados en el vector de la columna vertebral lentivirales de CRISPR (lentiCRISPRv2).
    1. Digerir el vector LentiCRISPRv2 con la enzima de restricción BsmBI a 37 ° C por 2 h.
    2. Buscar la presencia de la banda más grande (alrededor de 12.873 bp) sobre el gel después de la digestión de la BsmBI y luego la purifican con el kit de extracción de gel.
      Nota: Una pieza de relleno pequeños kb 2 también está presente en el gel después de la digestión, pero esto debe ser ignorado.
    3. Ligar los oligonucleótidos sintetizados y digerido LentiCRISPR vector con 150 ng de digerido LentiCRISPR ADN, 1 μl de 10 μm oligos, 2 μl de tampón de ligasa de 10 x T4, 1 μl de T4 ligasa y entonces les incube a 16 ° C durante la noche.
  2. Transformar la biblioteca CRISPR/sgRNA lentivirales en células electro-competentes para la amplificación.
    1. Preparar el electroporator en 1,8 kV, Ω 200 y 25 μF. A continuación, precaliente la recuperación media SOC en un baño de agua de 37 ° C y caliente previamente las placas antibióticas de LB ampicilina a 37 ° C.
    2. Descongelar las células competentes en hielo durante 10 minutos.
    3. Preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y 1 mm cubetas de electroporación en hielo.
    4. 1 μl de un plásmido de la biblioteca de 10 ng/μl ADN en 25 μl de células competentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL de la mezcla y mezclar suavemente por sacudiendo la parte inferior del tubo varias veces manualmente.
    5. Una vez que la cubeta está lo suficientemente fría, transferir la mezcla de células ADN competente a él. Pulse dos veces sobre la cubierta y limpie cualquier gotas de agua desde el exterior de la cubeta con un papel de tejido. Luego colocar la cubeta en el módulo de electroporación y pulse pulso.
    6. Inmediatamente añadir 975 μl de 37 ° C con media SOC. Mezclar por pipeteo arriba y abajo y transfiéralo a un tubo de 15 mL.
    7. Gire e incubar a 37 ° C durante 1 h.
    8. Diluir 100 células μl en 900 μl de medio SOC y coloque 100 μL en una placa de agar antibiótico de ampicilina LB. Incubar durante una noche a 37 ° C.
  3. Extraer el ADN del plásmido de las colonias combinadas usando una columna de maxi-prep como se detalla en el protocolo del fabricante.
    1. Raspe todas las colonias de la placa de agar LB y sembrar una cultura de arrancador de 2 mL de medio antibiótico de LB ampicilina e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación vigorosa (~ 200 x g).
    2. Diluir la cultura de arrancador 1: 500 en 100 mL de medio LB ampicilina e incubar a 37 ° C durante 12-16 h con agitación vigorosa (~ 200 x g).
    3. Recoger el precipitado de células bacterianas por centrifugación a 6.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
    4. Resuspenda el sedimento bacteriano en 10 mL de buffer de suspensión.
    5. Lyse el sedimento suspendido con 10 mL de la solución de lisis e invierta vigorosamente 4 - 6 veces. Incubar el lisado por 5 min a temperatura ambiente.
    6. Neutralizar el lisado con 10 mL de tampón de neutralización refrigerados. Mezcle suavemente invirtiendo los tubos 4 - 6 veces e incubar durante 20 min sobre hielo.
    7. Desactivación a 13.500 x g durante 30 min a 4 ° C. Inmediatamente transferir el sobrenadante que contiene el plásmido de ADN a un tubo nuevo.
    8. Repita el paso 2.3.7 y rápidamente transferir el sobrenadante que contiene el plásmido de ADN a un tubo nuevo.
    9. Equilibrar la columna aplicando 10 mL de tampón de equilibrado y permitir que la columna a vacío por flujo de gravedad.
    10. Añadir el sobrenadante a la columna y deje que se introduzca la resina de flujo por gravedad.
    11. Lavar la columna con 2 x 30 mL de tampón de lavado.
    12. Eluir el ADN con 15 mL de tampón de elución.
    13. Precipitar el ADN con 10,5 mL de isopropanol temperatura del ADN eluídas. Mezcla spin hacia abajo inmediatamente a 15.000 x g durante 30 min a 4 ° C y decantar cuidadosamente el sobrenadante.
    14. Lavar el pellet de DNA con 5 mL de etanol al 70%, pellet de ADN centrífuga a 15.000 x g por 10 min y descartar el sobrenadante.
    15. Repita el paso dos veces más 2.5.14.
    16. Centrifugue el pellet de ADN a 15.000 x g por 10 min y decante suavemente el sobrenadante sin perturbar el pellet de DNA.
    17. Secar el pellet para 5-10 min y disolver el ADN en un volumen requerido del búfer (buffer TE, pH 8.0).

3. el alto título sgRNA biblioteca Lentivirus generación

  1. Preparación de la célula: las células HEK293T cultura en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 10% (vol/vol) y antibiótico de penicilina-estreptomicina de 1% (vol/vol) (PS) en frascos de T-25. Colocarlos en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
  2. Paquete de lentivirus: Co transfectar las células HEK293T con 20 μg de vectores biblioteca purificada del paso 2, 15 μg de plásmido de paquete (psPAX2) y 10 μg de plásmido envolvente (pMD2.G) 48 h antes de la cosecha de los virus.
  3. Colección de virus: después de 48 h, collectthe virus sobrenadante y filtrar el sobrenadante a través de una membrana PVDF 0.45 μm baja proteína vinculante de virus.
  4. Concentración de virus: concentrar el sobrenadante lentivirales 50-fold utilizando el concentrador y prueba el virus MOI en el paso 5.
  5. Almacenamiento de información de virus: alícuota del concentrado virus y almacenar en un congelador de-80 ° C.

4. optimizado puromicina concentración

  1. Cultivo de células de leucemia: las células de AML de MOLM13 cultura en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 10% (vol/vol) y 1 x antibióticos de penicilina-estreptomicina (PS) en un matraz de T-125. Colocarlos en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
    Nota: Las células típicamente pasan cada 4-5 d en una relación de split de 1:4 o 1:6, nunca permitiendo que las células llegar a más de confluencia de 70%.
  2. Configurar MOLM13 células en una placa de 12 pozos con una densidad de 1.0 x 104 células/mL, en un volumen total de 2 mL por pozo (2.0 x 104 células).
  3. Análisis del curso del tiempo: las células de MOLM13 tratar con puromicina durante 7 días en el aumento de las concentraciones (0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1,0 μg/mL y 2,0 μg/mL)
    1. Configurar MOLM13 células sin tratamiento de puromicina en el día 0 y fijar 3 pozos replicadas sin tratamiento puromicina como control de día 0 a día 7.
    2. Tratar células MOLM13 con 0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1,0 μg/mL y 2,0 μg/mL, por separado, con cada condición experimental con 3 pozos de replicar.
    3. Cuenta la proporción de células vivas y hacer una curva de supervivencia desde el día 0 al día 7 que contiene todas las condiciones.
  4. Curva de supervivencia: tiñen las células con Trypan azul cuenta viabilidad y todos los días para obtener las curvas de supervivencia para cada concentración de puromicina.
  5. Optimización de la concentración mínima de puromicina: determinar la concentración mínima de puromicina mediante tinción Trypan azul, en que MOLM13 todas las células mueren entre 5-7 días.

5. valoración de biblioteca lentivirales en células de la leucemia MOLM13

  1. Preparación de las células de la AML: recoger las células de AML de MOLM13 con el medio de la transducción de señales (RPMI 1640, 10% FBS, PS de 1% y medio de capa de 8.0 μg/mL) a una densidad de 1.5 x 106 células/ml.
  2. Células de MOLM13 lugar en la placa de la pozo 12 con 1.5 x 106 células en cada pozo.
  3. Descongelar los lentivirus: Retire los lentivirus concentrado del congelador de-80 ° C y descongelar el hielo.
  4. Las células MOLM13 de mezcla con una dosis diferente de los lentivirus concentrado en pocillos distintos, incluyendo el 0, 1, 2.5, 5, 7.5 y 10 μl (total 6 grupos).
  5. Inmediatamente centrifugar estas mezclas a 1.000 x g durante 2 h a 33 ° C y transferir las placas 12-bien a la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante 4 horas.
  6. Después de 4 h, desactivación de las células infectadas a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  7. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, Resuspenda las células transduced con medio fresco (RPMI 1640, 10% FBS y 1% PS) y transferirlos a frascos T-25 e incubar a 37 ° C por 48 h sin puromicina.
  8. Después de 48 h, dividir estas células en 2 frascos (2 grupos): un grupo experimental tratado con 1 puromicina μg/mL durante 5 días y un grupo control sin tratamiento de puromicina durante 5 días.
  9. Realizar selección de puromicina durante 5 días con 1 puromicina μg/mL según el paso 4 hasta que todas las células control no-transduced están muertas. Cambio de medio fresco cada 2 días.
  10. Medir el valor MOI optimizado para la transducción dividiendo el número de células vivas con puromicina con el número de células sin tratamiento de puromicina.

6. transducción de la biblioteca de KO agrupado CRISPR-Cas9

  1. Transducción con lentivirus: infectar a 1.5 x 106 MOLM13 células con 0,3 MOI de lentivirus sgRNA agrupado en medio (RPMI 1640, 10% FBS, PS 1% y medio de capa de 8 μg/mL) en placa de 6 pozos y utilice las células sin la infección por lentivirus como control.
  2. Inmediatamente centrifugar la placa de 6 pozos a 1.000 x g durante 2 h a 33 ° C a spinfect las células y transferir las placas a la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante 4 horas.
  3. Desactivación de las células infectadas a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Suavemente aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet celular, Resuspenda las células transduced con medio fresco (RPMI 1640, 10% FBS y 1% PS) y luego transferirlos a frascos T-25 e incubar a 37 ° C por 48 h sin puromicina.
  5. Después de 48 h, tratar las células con 1 puromicina μg/mL durante 5 días. Intercambio de medios frescos después de 2 días y mantener una densidad óptima de la célula.
  6. La única copia en placas de 96 pocillos con limitación de los métodos de dilución de la semilla e incubar estos clones solo a 37 ° C y 5% CO2. La cultura les durante 3-4 semanas.
  7. Después de una sola célula crece para arriba en una población, transferir la mitad de las células en placas de 24 pocillos para más cultura selección de puromicina y verificar estos clones en el paso siguiente. Mantenga el resto de las células.

7. proyección de la biblioteca de KO CRISPR-Cas9 combinado con un solo paso RT-qPCR

  1. Determinar la efectividad del sgRNA clon integrado por evaluación de la expresión del gen marcador HOXA9 con un paso de la transcriptasa reversa reacción en cadena polimerasa (RT-qPCR de un solo paso).
    Nota: HOXA9 son altamente expresada en las células de la AML MOLM13 en leukemogenesis22,23.
  2. Cuenta lo sgRNA había integrado MOLM13 de la célula y transferencia 1 x 104 células por pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos.
  3. Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 5 min, bien retirar y desechar el sobrenadante con una pipeta sin perturbar el sedimento celulares.
  4. Lavar las células con 125 μl de tampón PBS y centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 5 minutos. Luego retire 120 μl del sobrenadante con una pipeta y aproximadamente 5 μl de PBS en cada pocillo.
  5. Añadir 50 μl de la mezcla principal de lisis celular que contiene 48 μl de tampón de lisis celular, 1 μl de solución de proteinasa K (10 mg/mL) y 1 μl de DNasa solución (1 mg/mL) a cada pocillo. Luego pipetear arriba y abajo 5 veces para volver a suspender el sedimento celular.
  6. Incubar la mezcla por 10 min a temperatura ambiente, seguido de 5 min a 37 ° C y luego de 75 ° C durante 5 minutos.
  7. Almacenar el lisado de célula en congelador de-80 ° C.
  8. La preparación de la reacción de RT-qPCR de un solo paso: descongelar la mezcla de reacción de un solo paso y otros componentes de la reacción a 4 ° C. Luego girar por brevemente para recoger las soluciones en la parte inferior de los tubos y coloque en hielo sin luz. Mezclar y centrifugar suavemente.
  9. Añadir 1 μl de lisado de célula a los pozos de la PCR con la mezcla de reacción RT-qPCR, incluyendo 1 μl del primer avance del gen marcador (300 nM) y la cartilla (300 nM), 0.125 μl de transcriptasa reversa (10 U/μL) y 5 μl de la mezcla de reacción de un solo paso (2 x).
  10. Sellar pozos con película ópticamente transparente y suavemente agitar y mezclar los componentes de la reacción.
  11. Coloque la placa PCR de 96 pocillos en un instrumento PCR en tiempo real.
  12. Ejecutar la reacción reversa de la transcripción por 10 min a 50 ° C, seguida por la polimerasa inactivación y desnaturalización de la DNA durante 1 min a 95 ° C.
  13. Realizar RT-PCR con 40 ciclos de reacción de PCR: desnaturalización durante 15 s a 95 ° C, recocido/extensión y placa de fluorescencia de 20 s a 60 ° C y luego análisis de curva de fusión a 65-95 ° C mediante incrementos de 0,5 ° C en 2-5 s/paso.
  14. Configurar alza, reguladas y no cambio los grupos según los niveles de expresión del gene HOXA9 en comparación al control, por separado. Uso de gen β-actina como control gen housekeeping.

8. verificación del integrado sgRNAs Clones positivos mediante genotipificación y secuencia de Sanger

  1. Verificar los clones de expresión HOXA9 disminuyó a través de Sanger secuenciación y realizar la PCR con el genoma de 50-100 ng MOLM13 ADN, tampón de reacción polimerasa de 5 μl (10 x), primer avance de 1 μl (10 μm) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) y 1 μl de reversa cartilla (10 μm) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 μl dNTP (10mM), polimerasa (5 U /µL) de la 1 unidad. Realizar la reacción de PCR con la desnaturalización inicial a 94 ° C por 30 s y luego más desnaturalización a 94 ° C por 20 s, recocido a 56 ° C por 20 s, extensión a 68 ° C por 20 s (total 30 ciclos), extensión final a 68 ° C por 10 min. y a 4 ° C.
  2. Extraer y purificar los productos PCR (tamaño 285 bp) con un PCR Purification Kit.
  3. Ligan los productos PCR purificados en el vector de T con 2 μl T4 ligadura de tampón (10 x), 50 ng T vector ADN (50 ng/μL), 25 ng purificada PCR DNA (285 bp), ligasa de T4 1 μl (3 unidades/μL) y el lugar de la ligadura de la mezcla en una incubadora a 16 ° C durante la noche.
  4. Transferir la mezcla de ligadura en células competentes DH5α, crecen en una placa de agar antibiótico LB ampicilina e incubar durante una noche a 37 ° C.
  5. Selección de los clones individuales de la placa LB y verificar por genotipificación y Sanger secuenciación.

9. detección de sgRNAs inducida Indel mutación digestión por nucleasa

  1. Detectar que lo sgRNA integrado solo clon inducida tarifas Indel por un ensayo de prueba de la nucleasa.
  2. Por separado preparar amplicones de PCR con 50-100 ng Indel mutante (prueba) y DNA de tipo salvaje (WT, referencia) como plantilla de PCR, 5 μl de tampón de reacción polimerasa (x 10), 1 μl dNTP (10mM), polimerasa (5 U/μL) de la 1 unidad, primer avance de 1 μl (10 μm) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') y 1 μ L invertir primer (10 μm) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). La reacción de PCR fue realizada con una desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s y luego desnaturalización a 98 ° C por 20 s, recocido a 56 ° C por 20 s, extensión a 72 ° C por 30 s (total 30 ciclos) y extensión final a 72 ° C por 10 min. y el mantenimiento a 4 ° C.
  3. Configurar el grupo de mezcla del heterodúplex con 200 ng de la "referencia" (20 ng/μL) y 200 ng de amplicones de PCR "test" (20 ng/μL) en tubo PCR de 0,2 mL y el grupo de mezcla homoduplex con sólo 400 ng de «referencia» amplicones de PCR como un control.
  4. Por separado incubar la mezcla del heterodúplex y homoduplex a 95 ° C por 5 min en un vaso de precipitados de 1 L llena con 800 mL de agua y luego enfriar gradualmente a temperatura ambiente para templar y formar heteroduplex o homoduplexes.
  5. Por separado digest 400 ng de la mezcla del heterodúplex y homoduplex recocida 1 μl indel mutación detección nucleasa (2.5 U/μL) y 2 μl nucleasa reacción tampón (10 x a 42 ° C durante 60 min).
  6. Analizar las muestras digeridas con electroforesis en gel de agarosa, el ADN de mezcla del heterodúplex debe cortarse en pequeños fragmentos (70-250 PA) y el homoduplex ADN (320 bp) no debe cortarse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CRISPR Cas9 tecnología es una herramienta potente para los estudios de genómica funcional. Está rápidamente reemplazando genes convencionales técnicas de edición y tiene gran utilidad para aplicaciones gene-centrado de genoma e individuales. Aquí, la primera individual clonados loci específicos CRISPR Cas9 de v. sgRNA biblioteca contiene 1.070 sgRNAs de sgRNAs a 303 al azar genes de segmentación, 60 controles positivos, controles objetivos de humanos no 500 y 207 CTCF elementos o lncRNA dirigidos a genes en cuatro loci HOX (figura 1, tabla 1). Esta biblioteca está dirigido a todos CTCF núcleo vinculante motivos, HOX gene asociado lncRNAs, conocido elementos reguladores y varios genes HOX como controles positivos en los loci HOX . También contiene sgRNAs dirigidos al azar noHOX genes, genes no humanos y regiones intergénicas como controles negativos. Para mejorar la eficiencia y especificidad de CTCF sitio knock-out (KO) por transducción de lentiCRISPR, cada sitio dirigida a contiene 5-10 sgRNAs (tabla 1). En el protocolo descrito aquí, sgRNA bibliotecas están diseñadas según los sitios de unión de CTCF en el HOXA/B/C/D y de lncRNAs en estos loci, que se basa en las herramientas de sgRNA Instituto Broad (figura 1, figura 2). Después de transducción de señales en una baja multiplicidad de infección con una MOI de 0,3 en células MOLM13 llevando la fusión MLL-AF9, la tasa de infección es menos sgRNA/celda seguida por la selección de puromicina, y luego estaban los clones resistentes de célula única cabeza de serie proyectado para el deterioro de la expresión de genes HOXA9 .

El flujo de trabajo para la investigación de biblioteca sgRNA fue brevemente descrito (figura 3). En primer lugar, la biblioteca de virus que contiene sgRNA obtuvieron en células HEK293T con la ayuda de dos vectores (psPAX2 y pMD2.G). sgRNA combinaron biblioteca lentiviruses se concentra y transduced en las células de AML de MOLM13 con polybrane (8.0 μg/mL). Después de una transducción de 48 h, las células fueron tratadas con la concentración óptima de puromicina. Después de 5 días, las células fueron sembradas un células/pozo en placas de 96 pocillos y se generaron los clones solo en presencia de puromicina. Finalmente, se identificaron clones solo sgRNA integrados en el genoma por RT-PCR de un solo paso, Sanger secuenciación y detección de mutación Indel (figura 3). Los clones solo puromicina resistentes se identifican a través de gotas de un solo paso digital RT-qPCR (RT-ddqPCR) según modificación de la expresión del oncogén HOXA9 (figura 4). Pruebas de genotipo y secuencia de Sanger se realizaron para sgRNA biblioteca construcción y verificación (figura 2, figura 4).

sgRNA targeting MOLM13 clones positivos en una placa de PCR de 96 pocillos más fueron confirmados con el método de RT-qPCR basado en losniveles de expresión de HOXA9 genes mediante comparación con las células del control. De las 528 sobrevivir clones evaluados, 10 clones exhibidos más de 50% de reducción en los niveles de HOXA9 (Figura 4A). sgRNAs integrado en el HOXA9-reducido, HOXA9-sin cambios y HOXA9-clones mayor más fueron confirmados por amplificación por PCR de las secuencias del sgRNA usando las cartillas acompañamiento de vector. Los productos PCR purificados fueron ligados al sistema de vector de T a través de la ligasa de T4 y enviados para identificación de secuencia de Sanger (ver paso 8). Los datos de secuencia indican que fuera de 30 clones secuenciados, 21 clones incluyeron solo sgRNA (tabla 2). Las categorías de sgRNA se identificaron y analizaron según los niveles de expresión de HOXA9 . Seis de diez clones mostrando una reducción en HOXA9 niveles contenidos sgRNAs a la página de CBS7/9, pero no en los genes no humanos, genes humanos al azar y otros controles de sitio CTCF (figura 4 y tabla 2).

sgRNA integrado positivo las mutaciones Indel solo clon-inducida se determinan por la polimerización en cadena-basado de genotipificación y nucleasa digestión basada en el ensayo de nucleasa (figura 5). Se ha realizado el ensayo de digestión nucleasa para identificar mutaciones ocurrieron en la frontera CBS7/9 en el representante HOXA9Indel-reducido, HOXA9-sin cambios y HOXA9 -aumento de clones. Los resultados revelaron que la mutación CBS7/9 se ha encontrado en 4 de los 6 HOXA9-reducido clones: clones #5, 6, 28 y 121, pero no en clones #15 y #31 (figura 5). Sin embargo, clon #15 contuvo lo sgRNA targeting HOTTIP lncRNA sitio, mientras que clon #31 contuvo varios sgRNAs contra HOAIRM1 lncRNA, aire caliente lncRNA y sitio de unión a CTCF HOXD9/10 (figuras 4B, 5 y tabla 2).

Figure 1
Figura 1 : Diagrama esquemático que muestra sitios de unión de CTCF y lncRNAs en cuatro HOX loci gen. Cada elemento de ADN dirigida a contiene 5-10 sgRNAs diferentes. Conjunto de datos de ChIP-seq CTCF fue bajado de GEO (GSM1335528) y visualizar con el visor de genómica integrada (IGV). SgRNA dirigidos a sitios CTCF en loci HOX fueron etiquetados con tijeras naranja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 2
Figura 2 : Diagrama esquemático que representa la parte de integrar sgRNA vector secuencia y cebadores de amplificación PCR. Los cebadores de amplificación del PCR fueron diseñados según la secuencia en blanco del vector lentivirales sgRNA. El primer avance (P1) fue destacado en amarillo la cartilla reversa (P2) se destacó en rojo y lo sgRNA se resaltarán en verde en el vector lentivirales sgRNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 3
Figura 3 : Diagrama esquemático que representa el flujo de trabajo para sgRNAs biblioteca diseño, construcción y verificación de. Este flujo de trabajo es la siguiente. En primer lugar, la biblioteca sgRNA ha sido diseñada y clonado en un vector lentivirales de CRISPR y después los lentivirus fue embalado con los sgRNA biblioteca lentivirales vector, psPAX2 y pMD2.G vectores en las células HEK293T. A continuación, MOLM13 células fueron infectadas con un virus baja de MOI (0,3) y estas células experimentaron selección de puromicina. Entonces, la única copia fue sembrada en una placa de 96 pocillos. Por último, los clones solo sgRNA integrados en un genoma fueron identificados por un solo paso RT-qPCR, secuencia de Sanger y detección de mutación Indel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figure 4
Figura 4 : Combinado CRISPR Cas9 KO biblioteca proyección identificado con un solo paso RT-qPCR y secuencia de Sanger. (A) una proyección digital del PCR de paso RT-gota de la expresión HOXA9 en solo clones infectados con lentivirus que contiene la biblioteca sgRNA. La proyección de 528 sgRNA biblioteca infectado clones para los niveles de expresión de HOXA9 aparece (528 puntos). Diez de 528 clones exhibidos más de 50% de descuento en HOXA9 niveles (flechas de color púrpura). La línea roja indica el límite de un disminución de 2 veces el cambio comparando con las células del control; la línea azul indica el límite de cambio de un aumento de 2 dobleces. (B) los seis clones #5, 6, 28, 121, 207 y 420 fueron atacados por la CBS7/9 sgRNA específico a través de la secuencia de Sanger (flechas verdes). Niveles (C) el análisis de RT-ddqPCR de HOXA9 en peso MOLM13 y la 21 clones sgRNA objetivo único que contiene. Los datos de expresión HOXA9 se agruparon en cinco grupos de acuerdo con las categorías de secuencias sgRNA: sitio CTCF HOXA7/9 , objetivos no humanos, otros sitios CTCF en los loci HOX , HOX asociada lncRNAs, y otros objetivos humanos. Esta figura ha sido modificada de Luo et al12. Para las estadísticas, esta información fue representada como la media ± SD de tres experimentos independientes con la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Mutaciones Indel de clon positivo integrado sgRNAs confirmaron con el ensayo de genotipado y nucleasa basados en PCR. (A)  ADN genómico fue aislado de los representante CRISPR Cas9 KO biblioteca proyectada clones que exhiben niveles reducidos, sin cambios o aumento de la expresión de HOXA9 . La canceladura heterozigótica del sitio CTCF entre HOXA7 y genes HOXA9 (límite de CBS7/9) fue identificada por genotipificación basada en PCR. HOXA9-disminuida eliminación de clones #5, 6, 28 y 121 exhibió en la localización del límite de CBS7/9 (flechas negras). (B) el Indel mutaciones en el sitio de CBS7/9 fueron analizadas por el nucleasa digestión análisis de los representante de clones que exhiben reducida (línea roja), sin cambios (línea azul), o aumento de los niveles de expresión de HOXA9 (línea morada). HOXA9-disminuido clones #5, 6, 28 y 121 exhibió mutaciones en la localización del límite de CBS7/9 (flechas naranjas). Esta figura ha sido modificada de Luo et al12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Tabla 1: sgRNAs información dirigida a la biblioteca de la piscina. Estos datos son de Luo et al12. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Sanger resultados de sgRNAs presentada en el seleccionado de la secuencia HOXA9 -disminuido, HOXA9 -sin cambios, y HOXA9 -clones de aumento. HOXA9-clones de disminución, sin cambios y mayor se destacan en rojo, azul y púrpura, por separado. Estos datos son de Luo et al12. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gen codificante de proteínas relacionadas con bibliotecas sgRNA se han aplicado en un sistema de evaluación funcional para identificar genes y redes de regulación de funciones celulares específicas sgRNA enriquecimiento24,25,26 ,27,28. Región no codificante varias relacionadas con sgRNA bibliotecas también fueron demostradas en pantallas funcionales específicos de gen distal y proximal de regulación de los elementos, incluyendo BCL11A, Tdgf1a y resistencia a los fármacos regulan genes28, 29,30. Estas bibliotecas sgRNA fueron generadas por un bioinformática detallado diseño, síntesis de oligonucleótidos y sub clonación los pools de oligonucleótidos en vectores. El enfoque de la proyección de todo el genoma es muy potente y útil pero requiere experiencia computacional para diseño genoma sgRNA y financiación consistente para la síntesis cara; así, es todavía un reto para la mayoría de los laboratorios. Sin embargo, nuestra biblioteca de loci específicos sgRNA proyección enfoque es conveniente y eficiente para identificar el elemento específico de la DNA como el sitio de unión de CTCF en organización de la cromatina y regulación transcripcional (figura 1 y figura 2). Al dirigirse a los límites CTCF, aplicamos una RT-PCR de un paso para evaluar clones sgRNA dirigida según el nivel de expresión de un gen marcador específico, HOXA9. Además, realizamos Sanger secuenciación para confirmar estos clones positivos sgRNAs integrado (figura 2 y figura 4). Para confirmar funcionalmente que estas sgRNAs positivas dirigidas clones, llevamos a cabo una polimerización en cadena-basado de genotipificación y mutación detección análisis para determinar si lo sgRNA induce el objetivo inserción o canceladura mutaciones del sitio (figura 5). Esto nos da un método prometedor a los específicos elementos de ADN no codificante y evaluar su función biológica en células de mamíferos.

En nuestro protocolo, hemos mencionado que un diseño de oligonucleótidos específicos asegurará más eficiente-clonación en vectores lentiCRIPSRV2 y más confiablemente generan una biblioteca sgRNA precisa (pasos 1 – 2). Para obtener el lentivirus de biblioteca sgRNA de alto título, el lentivirales sobrenadante debe ser concentrado 50 veces con el concentrador de oxígeno siguiendo el protocolo (paso 3) y almacenados en un congelador de-80 ° C en alícuotas múltiples (pasos 3.1 a 3.5). Una preocupación adicional es encontrar el valor óptimo de MOI para la transducción. Si el Ministerio del interior es demasiado baja, el número de células infectadas disminuirá y conducir a sgRNA falla de detección. Si el Ministerio del interior es demasiado alta, integrará sgRNA más de una en una sola celda e interferirá con la biblioteca sgRNA de detección a través de la RT-PCR de un solo paso y la detección de mutación Indel. Por lo tanto, antes de la proyección, el MOI óptimo para cada grupo de células a través de la valoración de la biblioteca lentivirales es encontrar un paso importante. Valoración de la biblioteca lentivirales en MOLM13 células de la leucemia y la evaluación de la MOI se llevará a cabo en el protocolo (pasos 5.1-5.10). Por otra parte, una lisis completa de las células para reversa de la transcripción pueden asegurarse de RT-PCR de un paso exitoso. Esto puede hacerse aumentando el tiempo de incubación para lisis en todas las etapas de temperatura en el protocolo (pasos 7.5, 7.6). Por lo tanto, con el fin de mejorar el eficiente para la detección de la biblioteca CRISPR Cas9 KO agrupada, célula completa lisis y transcripción inversa juegan un papel crítico en la determinación de la función RT-qPCR (pasos 7.1 – 7.14). Además, aumentar la calidad de los productos de la PCR puede asegurar detección de mutación indel exitosa, porque los productos PCR de baja calidad afectará el proceso de generación del heterodúplex/homoduplex (9.1 –.6 los pasos).

Además, el método puede utilizarse para identificar el papel de CTCF en regulación de los genes HOX en desarrollo embrionario y cierta leucemia con firma de gene HOX aberrante. Por ejemplo, genes HOX desempeñan papeles importantes durante el desarrollo embrionario y los cuatro grupos de HOX gens se limitan temporal y espacial en sus patrones de expresión en el desarrollo embrionario. Además, las mutaciones NPM1 son entre la anormalidad genética más común de AML y representan el 30% de los pacientes AML con cariotipo citogenético normal31. Este subconjunto de LMA exhibe una aberrante HOXA y HOXB gene la firma, que se convierte en un mecanismo dominante de la transformación leucémica17. Es fundamental para dilucidar cómo genes HOX están regulados en el desarrollo normal y altera en leukemogenesis. Nosotros y otros hemos demostrado que CTCF juega un papel esencial en la transcripción de cromatina del organización y gene HOX loci9,12. Así, la proyección de HOX loci centrados sgRNA biblioteca proporciona un medio conveniente para enredar a la función específica del sitio de unión de CTCF en regulación de los genes HOX durante el desarrollo y malignidades hematopoyéticas. Sin embargo, una limitación del enfoque es la dificultad de encontrar un marcador útil para la secuenciación de próxima generación de alto rendimiento. Uno de los objetivos de la investigación futura será encontrar un marcador altamente selectivo y llevar a cabo la secuencia de generación siguiente genoma para ver efectos del marcador. Por lo tanto, utilizando un gen marcador etiquetado fluorescente específico como el reportero de seguimiento se convertirá en una herramienta fundamental en el futuro los planes de investigación.

Potenciadores del juegan una multitud de roles críticos en la regulación del promotor la función y expresión genética. Sin embargo, puede activar también la actividad de promotor de la distancia de una manera independiente de posición y orientación, y potenciadores a menudo regulan la expresión génica en una orientación trans . Por lo tanto, es difícil identificar la enhancer(s) de genes específicos, especialmente en la era post-genómica. Reportero tradicional análisis y análisis funcionales correlativos (inmunoprecipitación de cromatina y ensayos hipersensibles DNaseI) se han utilizado para examinar el reforzador función32,33. Del mismo modo, pequeña escaladas orientada al locus proyecciones también se aplicaron para explorar las actividades de elementos reguladores distales y proximal para genes específicos34. Recientemente, la estrategia de biblioteca los sgRNA-KO que se dirige a elementos reguladores no codificante en los loci de genes HOX con éxito identificado un sitio de unión de CTCF entre genes HOXA7 y HOXA9 , así como un lncRNA HOTTIP es fundamental para el control posterior HOXA cromatina dominio organización, que conduce la expresión ectópica de genes HOXA en leucemia mieloide aguda (AML)12. Estos estudios demostraron que la proyección de la biblioteca de los sgRNA-KO es un enfoque potente genética para identificar y evaluar la función biológica de los elementos no codificantes en nuestro genoma in situ.

CTCF, como una proteína de aislador de cromatina, desempeña un papel importante en la organización del genoma mediante la definición de barrios de cromatina de patrones de expresión de genes específicos en células específicas tipo11,35. Alteración de la estructura de dominio topológico asociado (TAD) cambia las interacciones reforzador/promotor, dando por resultado un estado enfermo5,11. CTCF se conserva altamente en metazoos y se enriquece en los límites de la TAD. Sin embargo, no está claro si y cómo CTCF contribuye a mantener la estructura de límite de la cromatina y la formación de TAD. Aunque la proyección de nocaut sgRNA biblioteca combinada de CTCF se centró en los cuatro loci HOX , demostró ser un método eficaz para identificar y disecar límites CTCF y definir dominio TAD como interacción de reforzador/promotor y transcripción en el TAD dominio12. Además, este método puede aplicarse eficientemente para identificar los elementos lncRNA y factores de transcripción que median la actividad de accesibilidad en loci HOX y conformación de la cromatina. También estamos tratando de explorar la biblioteca CRISPR/sgRNA que contienen el genoma CTCF sitios a través de la identificación de secuenciación de próxima generación según el CTCF ChIP-seq y datos del animal doméstico de ChIA de investigación en el futuro. Por lo tanto, esta estrategia puede ampliarse a un cromosoma entero o incluso todo el genoma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

No tenemos conflictos de interés relacionados con este informe.

Acknowledgments

Los autores también agradecen a Nicholas Cesari para editar el manuscrito. El trabajo fue financiado por becas del Instituto Nacional de salud (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Proteinase K Thermo Fisher Scientific 25530049
Puromycin Thermo Fisher Scientific A1113802
Stbl3 cells  Life Technologies  C737303
HEK293T ATCC CRL-3216
MOLM-13 DSMZ ACC 554
lentiCRISPRv2 Addgene 52961
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
pGEM®-T Easy Vector Systems  Promega A137A
T4 ligase  New England Biolabs  M0202S
QIAquick Gel Extract kit QIAGEN 28706
QIAuick PCR purification kit QIAGEN 28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit Bio-Rad Laboratories 1725095
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific  11965084
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 11875093
Fetal bovine serum (FBS)  Thermo Fisher Scientific 10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine  Life Technologies  10378016
Lenti-X Concentrator  Clontech 631232
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Genessee Scientific  25-507
TAE buffer  Thermo Fisher Scientific  FERB49
Surveyor® Mutation Detection Kits Integrated DNA Technologies 706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc System Bio-Rad 170-8126
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000138
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Fisher Scientific 88870002
TSX Series Ultra-Low Freezers Thermo Fisher Scientific TSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series Thermo Fisher Scientific 75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths Thermo Fisher Scientific FSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems Thermo Fisher Scientific 13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
MiniAmp™ Thermal Cycler Applied Biosystems technology A37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply Thermo Fisher Scientific 7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fisher Scientific 09-528-178
VWR® Tube Rotator and Rotisseries VWR International 10136-084
VWR® Incubating Mini Shaker VWR International 12620-942
Analytical Balance MS104TS/00 METTLER TOLEDO 30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer DeNovix Inc. DS-11 FX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Tags

Genética número 145 CRISPR/Cas9 proyección de biblioteca sgRNA límite CTCF HOX loci un solo paso RT-qPCR detección de mutación Indel leucemia mieloide aguda
<em>HOX</em> Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D.,… More

Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D., Brewer, E., Dovat, S., Qiu, Y., Huang, S. HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries. J. Vis. Exp. (145), e59382, doi:10.3791/59382 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter