Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

HOX Loci fokus CRISPR/sgRNA bibliotek Screening at identificere kritiske CTCF grænser

Published: March 31, 2019 doi: 10.3791/59382
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 3, 1
1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

Summary

En CRISPR/sgRNA bibliotek er blevet anvendt til spørgekriterierne protein-kodning gener. Dog stadig gennemførligheden af et sgRNA bibliotek til at afsløre funktionen af en CTCF grænse RIBOREGULATION uudforsket. Her beskriver vi et HOX loci specifikke sgRNA bibliotek for at klarlægge funktionen af CTCF grænser i HOX loci.

Abstract

CCCTC-bindende faktor (CTCF)-medieret stabil topologisk knytte domæner (TADs) spiller en afgørende rolle i Begrænsningsfacetten vekselvirkninger mellem DNA elementer, der er placeret i nabolandet TADs. CTCF spiller en vigtig rolle i reguleringen af den rumlige og tidsmæssige udtryk for HOX gener, der styrer embryonale udvikling, krop mønstre, bloddannelsen og årsager. Det er imidlertid stort set ukendt, om og hvordan HOX loci forbundet CTCF grænser regulere kromatin organisation og HOX genekspression. I den nuværende protokol, er en bestemt sgRNA poolede bibliotek rettet mod alle CTCF bindingssteder i HOXA/B/C/D loci genereret for at undersøge virkningerne af forstyrre CTCF-associerede kromatin grænser på TAD dannelse og HOX gen udtryk. Gennem CRISPR-Cas9 er genetisk screening, CTCF bindingssted ligger mellem HOXA7/HOXA9 gener (CBS7/9) blevet identificeret som en kritisk regulator af muterede kromatin domæne, samt at være vigtige for at opretholde ektopisk HOX gen udtrykket mønstre i MLL-omarrangeret akut myeloid leukæmi (AML). Således, denne sgRNA bibliotek screening tilgang giver ny indsigt i CTCF medieret genom organisation i bestemte gen loci og giver også et grundlag for den funktionelle karakterisering af de kommenterede genetiske regulerende elementer, begge kodning og Noncoding, under normale biologiske processer i den post-menneskelige genom-projektet æra.

Introduction

Nylige genom interaktion undersøgelser afslørede, at de menneskelige nukleare genom former stabil topologisk sætter domæner (TADs), der er bevaret på tværs af celletyper og arter. Organisation af genomet i separate domæner letter og begrænser interaktioner mellem regulerende elementer (fx smagsforstærkere og promotorer). CCCTC-bindende faktor (CTCF) bindes til TAD grænser og spiller en afgørende rolle i Begrænsningsfacetten vekselvirkninger mellem DNA elementer, der er placeret i nærliggende TADs1. Genom bred CTCF bindende data viste imidlertid, at selv om CTCF for det meste interagerer med de samme DNA-sites i forskellige celletyper, det ofte fungerer som en kromatin barriere på en bestemt lokalitet i én celletype, men ikke i den anden, hvilket tyder på at CTCF funktioner sammen med andre aktiviteter i dannelsen af kromatin grænser2. Hvad forbliver ukendt er om grænsen elementer (CTCF-bindingssteder) er direkte knyttet til den biologiske funktion af CTCF, og hvordan disse links forekommer. Derfor, vi hypotesen om, at specifikke CTCF bindingssteder i genomet direkte regulerer dannelsen af TADs og styre promotor/forstærker interaktioner i disse domæner eller mellem tilstødende domæner. Færdiggørelsen af de menneskelige og mus genome sequencing projekter og efterfølgende epigenetiske analyser har afsløret nye molekylære og genetiske signaturer af genomet. Men rollen som særlige signaturer/ændringer i genregulering samt cellefunktion og deres molekylære mekanismer, har endnu at være fuldt forstået.

Flere linjer af beviser støtter, at en CTCF-medieret TADs repræsenterer funktionel kromatin domæner3,4,5. Selv om CTCF for det meste interagerer med de samme DNA-sites i forskellige celletyper, viste genom bred CTCF ChIP-seq data, at CTCF ofte fungerer som kromatin barriere i én celletype, men ikke i de andre2. CTCF spiller en væsentlig rolle i udviklingen af mægle genom organisation4,6,7. Afbrydelse af CTCF grænser nedsat forstærker/promotor interaktioner og genekspression, fører til udviklingsmæssige blokering. Dette tyder på, at CTCF medieret TADs er ikke kun strukturelle komponenter, men også administrative enheder kræves for korrekt enhancer handling og gen transskription5,8,9.

HOX gener spiller en kritisk rolle i løbet af fosterudviklingen, og de er tidsmæssigt og rumligt begrænsede i deres udtryk mønstre. HOXA locus danner to stabile TADs adskille anteriore og posteriore gener af en CTCF-associerede grænse element i både hESCs og IMR90 celler1. De seneste rapporter viste, at HoxBlinc, en HoxB locus forbundet lncRNA, medierer dannelsen af CTCF instrueret TADs og forstærker/promotor interaktioner i HOXB locus. Dette fører til forreste HOXB genaktivering under ESC engagement og differentiering10. Desuden på bestemte gen loci herunder HOXA locus, ændring af CTCF medieret TAD domæner ændret lineage bestemt gen expression profiler og var forbundet med udvikling af sygdom stater11,12. Beviser understøtter en primær funktion for CTCF i koordinere gen transskription og bestemmelse af celle identitet ved at organisere genomet i funktionelle domæner.

Trods sin rolle i den embryonale udvikling, under bloddannelsen, regulere HOX gener hæmatopoietisk stilk og stamfader celle (HS/PC) funktion. Dette gøres ved at styre balancen mellem spredning og differentiering10,13,14,15. Udtryk af gener, HOX er stramt reguleret i hele specifikation og differentiering af hæmatopoietisk celler med højeste udtryk i HS / pc'er. HOX genekspression aftager gradvist under modning, med dens laveste niveauer forekommende i opdelte hæmatopoietisk celler16. HOX gen dysregulering er en dominerende mekanisme leukemic transformation af dysregulating selvfornyelse og differentiering egenskaber af HS/pc'er fører til leukemic transformation17,18. Men mekanismen for etablering og vedligeholdelse af normal vs. muterede udtryk mønstre af HOX gener samt tilknyttede regulerende net uklart.

CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotek screening har været meget anvendt til at afhøre protein-kodning gener19 som godt ikke-kodende gener, som lncRNA20 og miRNA21 i forskellige arter. Men omkostningerne til at bruge biblioteket CRISPR-Cas9 sgRNA til at identificere nye genomisk mål forbliver høj, fordi høj overførselshastighed genome sequencing er ofte anvendt til at kontrollere sgRNA bibliotek screening. Vores sgRNA screening system er fokuseret på specifikke genom loci og evaluerer den målretning sgRNAs gennem et-trins RT-PCR ifølge markør Gen-ekspression, såsom HOXA9. Derudover kan Sanger sekventering bekræftet, at sgRNA var integreret i genomet, og Indel mutationer påvises for at identificere sgRNA målretning site. Gennem loci-specifikke CRISPR-Cas9 genetisk screening, er CBS7/9 kromatin grænse blevet identificeret som en kritisk regulator for oprettelse af muterede kromatin domæne og vedligeholde ektopisk HOX gen expression mønstre i AML patogenese 12. metoden kan anvendes bredt til at identificere ikke kun specifikke funktion af CTCF grænse i fosterudviklingen, bloddannelsen, årsager, men også CTCF grænse som potentielle terapeutiske mål for fremtidige epigenetiske terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. CTCF sgRNALibrary Design ved hjælp af et Online-værktøj

  1. Design sgRNA målretning CTCF bindingssteder i de menneskelige HOX loci ved hjælp af genetiske undertrykkelse af netbårne platform (GPP) designer værktøj (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Syntetisere ialt 1,070 sgRNAs bestående af sgRNAs rettet mod 303 tilfældige målretning gener, 60 positive kontroller, 500 ikke-menneskelige-targeting kontrol, og 207 CTCF elementer eller lncRNA rettet mod gener (figur 1, tabel 1). Hver målretning DNA element er målrettet efter 5-10 forskellige sgRNAs.

2. sgRNA bibliotek kloning

  1. Klone de syntetiserede oligonukleotider i CRISPR lentiviral rygrad vektor (lentiCRISPRv2).
    1. Fordøje LentiCRISPRv2 vektor med BsmBI begrænsning enzym ved 37 ° C i 2 timer.
    2. Ser for tilstedeværelse af større bandet (omkring 12,873 bp) på gel efter BsmBI fordøjelse, og derefter rense det med gel udvinding kit.
      Bemærk: En 2 kb lille fyldstof stykke er også til stede på gelen efter fordøjelsen, men dette bør ignoreres.
    3. Ligate de syntetiserede oligonukleotider og fordøjet LentiCRISPR vektor med 150 ng af fordøjet LentiCRISPR DNA, 1 µL af 10 µM oligos, 2 µL af 10 x T4 ligase buffer, 1 µL af T4 ligase, og derefter inkuberes dem ved 16 ° C natten over.
  2. Omdanne lentiviral CRISPR/sgRNA biblioteket til electro-kompetente celler for forstærkning.
    1. Forberede en electroporator på 1,8 kV, 200 Ω og 25 µF. Derefter pre varm opsving SOC medier i et 37 ° C vandbad, og pre varm LB ampicillin antibiotika plader ved 37 ° C.
    2. Optø de kompetente celler i isbad i 10 min.
    3. Forberede 1.5 mL micro-centrifugeglas, og 1 mm elektroporation kuvetter på is.
    4. Bland 1 µL af en 10 ng/µL bibliotek plasmid DNA i 25 µL af kompetente celler i en 1.5 mL micro-centrifugerør, og forsigtigt Bland ved at bladre i bunden af røret et par gange manuelt.
    5. Når kuvette er koldt nok, overføre DNA/kompetente celle blandingen til det. Tryk to gange på køkkenbordet og tørre nogen vanddråber fra ydersiden af kuvette med en silkepapir. Derefter placere kuvette i modulet elektroporation og trykke på pulse.
    6. Straks tilføje 975 µL af 37 ° C pre varmede SOC medier. Mix af pipettering op og ned og overførsel til en 15 mL tube.
    7. Rotere og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
    8. Fortyndes 100 µL celler i 900 µL af SOC medier og placere 100 µL på en LB ampicillin antibiotika agar plade. Der inkuberes natten over ved 37 ° C.
  3. Uddrag plasmid DNA fra de kombinerede kolonier ved hjælp af en maxi-prep kolonne som beskrevet i producentens protokol.
    1. Skrab alle kolonier fra LB-agar plade og podes en igangsætter kultur på 2 mL af LB ampicillin antibiotika medium og inkuberes natten over ved 37 ° C under kraftig omrystning (~ 200 x g).
    2. Fortyndes 1: 500 med starteren kultur i 100 mL af LB ampicillin medium og inkuberes ved 37 ° C i 12-16 h under kraftig omrystning (~ 200 x g).
    3. Høste bakteriel celle pellet ved centrifugering ved 6.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
    4. Genopslæmmes bakteriel toerstoffet i 10 mL af suspension buffer.
    5. Lyse den suspenderede pellet med 10 mL af lysisbuffer og energisk invertere 4 - 6 gange. Inkubér lysate i 5 min ved stuetemperatur.
    6. Neutralisere den lysate med 10 mL af kølet neutralisering Buffer. Mix af forsigtigt invertere rør 4 - 6 gange og inkuberes det i 20 min. på is.
    7. Spin ned ved 13.500 x g i 30 min. ved 4 ° C. Straks overføre supernatanten indeholdende plasmid DNA til en ny tube.
    8. Gentag trin 2.3.7, og straks overføre supernatanten indeholdende plasmid DNA til en ny tube.
    9. Blandingen henstår kolonnen ved at anvende 10 mL af ækvilibrering buffer og tillade kolonnen til tomme af tyngdekraften flow.
    10. Tilføje supernatanten til kolonnen og gør det muligt at indtaste harpiksen af tyngdekraften flow.
    11. Kolonnen udvaskes med 2 x 30 mL vask buffer.
    12. Elueres DNA med 15 mL eluering buffer.
    13. Udfældes DNA med 10,5 mL stuetemperatur isopropanol i eluted DNA. Mix og spin ned straks ved 15.000 x g i 30 min. ved 4 ° C, og dekanteres forsigtigt.
    14. Vaske DNA pellet med 5 mL af 70% ethanol, centrifuge DNA pellet ved 15.000 x g i 10 min. og supernatanten klar.
    15. Gentag trin 2.5.14 to gange mere.
    16. Centrifugeres DNA pellet ved 15.000 x g i 10 min., og forsigtigt dekanteres uden at forstyrre DNA pellet.
    17. Lufttørre pellet for 5-10 min, og opløse DNA i en krævede antal buffer (TE buffer, pH 8,0).

3. høj Titer sgRNA bibliotek Lentivirus Generation

  1. Celle forberedelse: kultur HEK293T celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% (vol/vol) føtal bovint serum (FBS) og 1% (vol/vol) penicillin-streptomycin (PS) antibiotikum i T-25 kolber. Placere dem i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Pakke lentivirus: Co transfect HEK293T celler med 20 µg renset bibliotek vektorer fra trin 2, 15 µg i pakken plasmid (psPAX2) og 10 µg af kuvert plasmid (pMD2.G) for 48 h før høsten virus.
  3. Virus samling: efter 48 h, collectthe virus supernatanten og filtrere virussen supernatanten gennem et 0,45 µm lavt proteinindhold bindende PVDF membran.
  4. Virus fusionen: koncentrere lentiviral supernatanten ved 50-fold hjælp koncentratoren og teste virus MOI i trin 5.
  5. Virus opbevaring: alikvot af koncentreret virus og opbevares i et-80 ° C fryser.

4. optimeret Puromycin koncentration

  1. Leukæmi cellekultur: kultur MOLM13 AML celler i RPMI 1640 suppleret med 10% (vol/vol) føtal bovint serum (FBS) og 1 x penicillin-streptomycin (PS) antibiotika i en kolbe på T-125. Placere dem i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
    Bemærk: Celler er typisk bestået hver 4-5 d på en split forholdet 1:4 eller 1:6, aldrig tillade celler at nå mere end 70% confluency.
  2. Opsætning af MOLM13 celler i en 12-godt plade med en massefylde på 1,0 x 104 celler/mL, i en samlet maengde paa 2 mL pr. brønd (2.0 x 104 celler).
  3. Tidsforløb assay: behandling af MOLM13 celler med puromycin 7 dage i stigende koncentrationer (0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL og 2,0 µg/mL)
    1. Op MOLM13 celler uden puromycin behandling på dag 0 og konfigurere 3 Repliker brønde uden puromycin behandling som en kontrol fra dag 0 til dag 7.
    2. Behandling MOLM13 celler med 0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL og 2,0 µg/mL, separat, replikere med hver eksperimentelle betingelse, der indeholder 3 brønde.
    3. Tælle levende celle forholdet og gøre en overlevelse kurve fra dag 0 til dag 7 indeholdende alle betingelser.
  4. Overlevelse kurven: pletten celler med Trypan blå og tælle levedygtighed dagligt hente overlevelse kurver for hver puromycin koncentration.
  5. Optimere minimal puromycin koncentration: bestemmelse af den minimale puromycin koncentration gennem Trypan blå farvning, i hvilke alle MOLM13 celler er dræbt mellem 5-7 dage.

5. titrering af Lentiviral bibliotek i MOLM13 leukæmiceller

  1. AML celler forberedelse: indsamle MOLM13 AML celler med transduktion medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS og 8,0 µg/mL belægning medium) med en tæthed på 1,5 x 106 celler /mL.
  2. Placer MOLM13 celler i den 12-godt plade med 1,5 x 106 celler i hver brønd.
  3. Optø lentivirus: Fjern den koncentrerede lentivirus fra-80 ° C fryser og tø det på is.
  4. Mix MOLM13 celler med en anden dosis af den koncentrerede lentivirus i separate brønde, herunder 0, 1, 2.5, 5, 7,5 og 10 µL (samlede 6 grupper).
  5. Straks centrifugeres disse blandinger på 1.000 x g i 2 timer på 33 ° C og overføre 12-godt plader tilbage til inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 til 4 h.
  6. Efter 4 h, spin ned de inficerede celler ved 400 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  7. Forsigtigt Aspirér supernatanten uden at forstyrre pelleten celle og genopslæmmes i transduced celler med friske medier (RPMI 1640, 10% FBS og 1% PS), og derefter overføre dem til T-25 kolber og inkuberes ved 37 ° C for 48 h uden puromycin.
  8. Efter 48 h, opdeles disse celler i 2 flasker (2 grupper): en eksperimenterende gruppe behandlet med 1 µg/mL puromycin i 5 dage, og en kontrolgruppe uden puromycin behandling i 5 dage.
  9. Udføre puromycin udvalg i 5 dage med 1 µg/mL puromycin henhold til trin 4, indtil alle de ikke-transduced kontrol celler er døde. Exchange for friske medier hver 2 dage.
  10. Måle optimeret MOI værdien for transduktion ved at dividere antallet af levende celler behandles med puromycin med antallet af celler uden puromycin behandling.

6. transduktion af poolede CRISPR-Cas9 KO bibliotek

  1. Transduktion med lentivirus: inficere 1.5 x 106 MOLM13 celler med 0,3 MOI af sgRNA Puljet lentivirus i medium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS og 8 µg/mL belægning medium) i 6-godt plade og anvende celler uden lentivirus infektion som kontrol.
  2. Straks centrifugeres 6-godt pladen på 1.000 x g i 2 timer på 33 ° C til spinfect celler og overføre pladerne tilbage til inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 til 4 h.
  3. Spin ned de inficerede celler ved 400 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  4. Forsigtigt Aspirér supernatanten uden at forstyrre pelleten celle og genopslæmmes i transduced celler med friske medier (RPMI 1640, 10% FBS og 1% PS), og derefter overføre dem til T-25 kolber og inkuberes ved 37 ° C for 48 h uden puromycin.
  5. Efter 48 h, behandling af celler med 1 µg/mL puromycin i 5 dage. Udveksle for friske medier efter 2 dage og holde på en optimal celle tæthed.
  6. Seed enkelt klon i 96-brønd plader med begrænse fortynding metoder og Ruger disse enkelt kloner ved 37 ° C og 5% CO2. Kultur dem i 3-4 uger.
  7. Efter en enkelt celle vokser i en population, overføre halvdelen af cellerne i 24-godt plader for yderligere kultur under puromycin udvalg og kontrollere disse kloner i næste trin. Holde resten af cellerne.

7. screening af poolede CRISPR-Cas9 KO bibliotek med et-trins RT-qPCR

  1. Bestemme effektiviteten af sgRNA integreret klon screening ved at evaluere udtryk for markørgen HOXA9 med ét skridt reverse transkriptase polymerase kæde reaktion (et-trins RT-qPCR).
    Bemærk: HOXA9 er stærkt udtrykt i MOLM13 AML celler i årsager22,23.
  2. Grev sgRNA integreret MOLM13 celle og overførsel 1 x 104 celler pr. brønd til en 96-brønd PCR plade.
  3. Centrifugeres tube på 1.000 x g i 5 min, og derefter grundigt fjerne og supernatanten med en pipette uden at forstyrre den celle pellet.
  4. Vaske cellerne med 125 µL af PBS buffer, og centrifugeres tube på 1.000 x g i 5 min. Derefter fjerne 120 µL af supernatanten ved hjælp af en pipette og bevare ca 5 µL af PBS i hvert hul.
  5. Tilsæt 50 µL af celle lysis master mix der indeholder 48 µL af celle lysisbuffer, 1 µL af proteinase K løsning (10 mg/mL) og 1 µL af DNase løsning (1 mg/mL) til hver brønd. Derefter afpipetteres op og ned 5 gange til genopslæmmes celle pellet.
  6. Inkuber mix i 10 min. ved stuetemperatur, efterfulgt af 5 minutter ved 37 ° C, og derefter 75 ° C i 5 min.
  7. Gemme den celle lysate på-80 ° C fryser.
  8. Forberedelse af et-trins RT-qPCR reaktion: tø one-step mastermix og andre reaktion komponenter til 4 ° C. Derefter spin ned kort at indsamle løsninger i bunden af rør, og Anbring på is uden lys. Bland og spin forsigtigt.
  9. Tilføj 1 µL af celle lysate PCR-brønde med RT-qPCR mastermix, herunder 1 µL af markørgens fremad primer (300 nM) og vende primer (300 nM), 0,125 µL af reverse transkriptase (10 U/µL) og 5 µL af one-step mastermix (2 x).
  10. Forsegle brønde med optisk gennemsigtig film, og forsigtigt vortex og blande komponenterne reaktion.
  11. 96-brønd PCR pladen anbringes på en real-time PCR instrument.
  12. Køre omvendt transkription reaktionen i 10 min ved 50 ° C, efterfulgt af polymerase inaktivering og DNA denaturering i 1 min. ved 95 ° C.
  13. Udføre RT-PCR med 40 cyklusser af PCR reaktion: denaturering for 15 s på 95 ° C, udglødning/udvidelse og plade fluorescens læsning for 20 s på 60 ° C, og derefter smelte kurve analyse på 65-95 ° C via 0,5 ° C intervaller på 2-5 s/trin.
  14. Opsætning af upregulated, downregulated og ingen ændring grupper efter udtryk niveauer af HOXA9 gen ved sammenligning til kontrolelementet, separat. Brug β-aktin gen som en husholdning gen kontrol.

8. verifikation af integrerede sgRNAs Positive kloner gennem genotypebestemmelse og Sanger sekvens

  1. Kontroller HOXA9 faldt udtryk kloner gennem Sanger sekvensering og udføre PCR med 50-100 ng MOLM13 genom DNA, 5 µL polymerase reaktion buffer (10 x), 1 µL fremad primer (10 µM) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) og 1 µL omvendt primer (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), 1 enhed polymerase (5 U /µL). Udføre PCR reaktion med den oprindelige denaturering på 94 ° C til 30 s, og derefter mere denaturering på 94 ° C i 20 s, udglødning ved 56 ° C i 20 s, udvidelse på 68 ° C til 20 s (i alt 30 cykler), endelige udvidelse på 68 ° C i 10 min , og derefter holde ved 4 ° C.
  2. Uddrag og rense PCR-produkter (størrelse 285 bp) med en PCR rensning Kit.
  3. Ligate de renset PCR produkter til T vektor med 2 µL T4 ligatur buffer (10 x), 50 ng T vektor DNA (50 ng/µL), 25 ng renset PCR DNA (285 bp), 1 µL T4 ligase (3 enheder/µL), og Placer ligation blandes ind i en inkubator ved 16 ° C natten over.
  4. Overføre ligatur mix i DH5α kompetente celle, vokse på en LB ampicillin antibiotika agar plade, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
  5. Vælge en enkelt kloner fra LB-tallerkenen og kontrollere dem ved genotypebestemmelse og Sanger sekvensering.

9. detektion af sgRNAs Induced Indel Mutation af nukleasen fordøjelsen Assay

  1. Opdage sgRNA integreret enkelt klon induceret Indel satser af en nukleasen test assay.
  2. Separat forberede PCR-amplikoner med 50-100 ng Indel mutant (test) og wild-type (WT, reference) DNA som PCR skabelon, 5 µL polymerase reaktion buffer (10 x), 1 µL dNTP (10mM), 1 enhed polymerase (5 U/µL), 1 µL fremad primer (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3'), og 1 µ L reverse primer (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). PCR reaktion blev udført med indledende denaturering på 98 ° C til 30 s, og derefter denaturering på 98 ° C i 20 s, udglødning ved 56 ° C i 20 s, udvidelse ved 72 ° C i 30 s (i alt 30 cykler) og endelige udvidelse ved 72 ° C i 10 min , og holde ved 4 ° C.
  3. Oprette gruppen heteroduplex blanding med 200 ng "reference" (20 ng/µL) og 200 ng "test" (20 ng/µL) PCR-amplikoner i 0,2 mL PCR rør og gruppen homoduplex blanding med kun 400 ng af "reference" PCR-amplikoner som kontrol.
  4. Separat Inkuber heteroduplex og homoduplex blandingen ved 95 ° C i 5 min i et 1 L bæger fyldt med 800 mL vand og derefter køle ned gradvist til stuetemperatur at anneal og danne heteroduplex eller homoduplexes.
  5. Separat digest 400 ng af udglødet heteroduplex og homoduplex blandingen med 1 µL indel mutation påvisning nukleasen (2,5 U/µL) og 2 µL nukleasen reaktion buffer (10 x) på 42 ° C i 60 min.
  6. Analysere de udtog prøver med Agarosen gelelektroforese, heteroduplex blanding DNA skal skæres i små fragmenter (70-250 bp), og homoduplex DNA (320 bp) bør ikke skæres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CRISPR-Cas9 teknologi er en kraftfuld analyseværktøj for funktionelle genomisk undersøgelser. Det erstatter hurtigt konventionelle gen redigering teknikker og har høj nytteværdi for både genome-wide og individuelle gen-fokuserede ansøgninger. Her, indeholder den første individuelt klonede loci-specifikke CRISPR-Cas9-klædt sgRNA bibliotek 1,070 sgRNAs bestående af sgRNAs rettet mod 303 tilfældige målretning gener, 60 positive kontroller, 500 ikke-menneskelige-targeting kontrol, og 207 CTCF elementer eller lncRNA målretning gener i fire HOX loci (figur 1, tabel 1). Dette bibliotek er rettet mod alle CTCF core bindende motiver, HOX gen forbundet lncRNAs, kendt regulerende elementer og flere HOX gener som positive kontroller i HOX loci. Det indeholder også sgRNAs rettet mod tilfældige ikke -HOX gener, ikke-menneskelige gener og intergenic regioner som negative kontroller. For at forbedre effektiviteten og specificiteten af CTCF site knock-out (KO) ved lentiCRISPR transduktion, indeholder hver målretning websted 5-10 sgRNAs (tabel 1). I protokollen beskrevet her, er sgRNA biblioteker designet efter CTCF bindingssteder på HOXA/B/C/D loci og lncRNAs i disse loci, der er baseret på bred Institut sgRNA værktøjer (figur 1, figur 2). Efter transduktion på en lav mangfoldighed af infektion med et MOI af 0,3 i MOLM13 celler transporterer MLL AF9 fusion, infektion sats er mindre end én sgRNA/celle efterfulgt af puromycin udvalg, og derefter de resistente kloner vokset fra seedede enkelt celle var screenet for værdiforringelse af HOXA9 genekspression.

Arbejdsproces for sgRNA bibliotek screening var kort beskrevet (figur 3). Det første virus indeholdende sgRNA bibliotek blev genereret i HEK293T celler ved hjælp af to vektorer (psPAX2 og pMD2.G). sgRNA samles bibliotek lentiviruses var koncentreret og transduced i MOLM13 AML celler med polybrane (8,0 µg/mL). Efter en 48 h transduktion, blev celler behandlet med den optimale koncentration af puromycin. Efter 5 dage, cellerne var seedet én celle/brønd i 96-brønd plader og enkelt kloner blev genereret i overværelse af puromycin. Endelig, sgRNA enkelt kloner integreret i genomet blev identificeret ved et-trins RT-PCR, Sanger sekvensering og Indel mutation påvisning (figur 3). De puromycin resistente enkelt kloner er identificeret gennem et-trins droplet digital RT-qPCR (RT-ddqPCR) efter at ændre udtryk for HOXA9 onkogen (figur 4). Genotypebestemmelse og Sanger sekvens blev udført for sgRNA bibliotek opbygning og verifikation (figur 2, figur 4).

sgRNA rettet mod MOLM13 positive kloner i en 96-brønd PCR plade blev yderligere bekræftet med RT-qPCR metode baseret påudtryk niveauer af HOXA9 gener gennem sammenligning med kontrol celler. Ud af 528 overlevende kloner screenet, 10 kloner udstillet mere end 50% reduktion i HOXA9 niveauer (figur 4A). sgRNAs integreret i HOXA9-reduceret, HOXA9-uændret, og HOXA9-øget kloner blev yderligere bekræftet af PCR-amplifikation af de sgRNA sekvenser ved hjælp af ledsagende vektoren primere. De renset PCR produkter var forbundet til T vektorsystem gennem T4 ligase og sendt til identifikation af Sanger sekvens (Se trin 8). Sekvens data viste, at ud af 30 kloner sekventeret, 21 kloner med enkelt sgRNA (tabel 2). Kategorier af sgRNA blev identificeret og analyseres efter HOXA9 udtryk niveauerne. Seks af de ti kloner viser en reduktion i HOXA9 niveauer indeholdt sgRNAs rettet mod webstedet CBS7/9, men ikke i de ikke-menneskelige gener, tilfældige menneskelige gener og andre CTCF site kontrol (figur 4 og tabel 2).

sgRNA integreret positive enkelt klon-induceret Indel mutationer bestemmes af PCR-baseret genotypebestemmelse og nukleasen fordøjelsen baseret på nukleasen assay (figur 5). Nukleasen fordøjelsen assay er udført for at identificere Indel mutationer opstod i CBS7/9 grænse i repræsentant HOXA9-reduceret, HOXA9 -uændret, og HOXA9 -steg kloner. Resultaterne viste, at CBS7/9 mutation er blevet fundet i 4 ud af de 6 HOXA9-reduceret kloner: kloner #5, 6, 28 og 121, men ikke i kloner #15 og #31 (figur 5). Dog klon #15 indeholdt sgRNA målretning HOTTIP lncRNA site, , mens klon #31 indeholdt flere sgRNAs rettet mod HOAIRM1 lncRNA, HOTAIR lncRNA og HOXD9/10 CTCF bindingssted (tal 4B, 5 og tabel 2).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk diagram viser CTCF bindingssteder og lncRNAs i fire HOX gen loci. Hver målretning DNA element indeholder 5-10 forskellige sgRNAs. CTCF ChIP-seq datasæt blev hentet fra GEO (GSM1335528) og visualiseret med integreret genomisk Viewer (IGV). SgRNA målretning CTCF websteder i HOX loci var mærket med orange saks. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Skematisk diagram, der repræsenterer del af integration sgRNA vektor sekvens og PCR-amplifikation primere. PCR-amplifikation primere var designet efter den tomme sekvens på sgRNA lentiviral vektor. Den forreste primer (P1) blev fremhævet i gult, den omvendte primer (P2) var fremhævet med rødt, og sgRNA var fremhævet med grønt på sgRNA lentiviral vektor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 : Skematisk diagram repræsenterer arbejdsproces for sgRNAs Biblioteksdesign, konstruktion og verifikation. Denne arbejdsproces er som følger. Først, sgRNA biblioteket blev designet og klonet i en lentiviral CRISPR vektor, og derefter lentivirus var pakket med de sgRNA bibliotek lentiviral vektor, psPAX2 og pMD2.G-vektorer i HEK293T celler. Næste, MOLM13 celler var smittet med en lav MOI (0,3) virus og disse celler undergik puromycin udvalg. Derefter, den enkelt klon var seedet i en 96-brønd plade. Endelig, sgRNA enkelt kloner integreret i en genom blev identificeret ved et-trins RT-qPCR, Sanger sekvens og Indel mutation påvisning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 : Poolet CRISPR-Cas9 KO bibliotek screening identificeret med et-trins RT-qPCR og Sanger sekvens. (A) en skridt RT-droplet digital PCR screening af HOXA9 udtryk i enkelt kloner inficeret med lentivirus, der indeholder sgRNA-biblioteket. Screening af 528 sgRNA bibliotek inficeret kloner til HOXA9 udtryk niveauer er vist (528 prikker). Ti af 528 kloner udstillet mere end 50% reduktion i HOXA9 niveauer (lilla pile). Den røde linje angiver grænsen for en 2-fold fald ændring ved at sammenligne med kontrol celler; den blå linje angiver grænsen for en ændring af 2-fold stigning. (B) seks kloner #5, 6, 28, 121, 207 og 420 blev rettet af CBS7/9 bestemte sgRNA gennem Sanger sekvens (grønne pile). (C) RT-ddqPCR analyse af HOXA9 niveauer i WT MOLM13 og 21 kloner indeholdende enkelt målrettet sgRNA. HOXA9 udtryk data blev inddelt i fem grupper i overensstemmelse med kategorierne af sgRNA sekvenser: HOXA7/9 CTCF site, ikke-menneskelige mål, andre CTCF steder i HOX loci, HOX forbundet lncRNAs, og andre menneskelige mål. Dette tal er blevet ændret fra Luo et al.12. For statistik, var denne data repræsenteret som den gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg med Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Indel mutationer af integrerede sgRNAs positive klon bekræftet PCR-baserede genotypebestemmelse og nukleasen assay. (A)  Genomisk DNA blev isoleret fra de repræsentative CRISPR-Cas9 KO bibliotek screenet kloner, udstillet reduceret, uændret eller øget HOXA9 udtryk niveauer. Heterozygous sletning af CTCF stedet ligger mellem HOXA7 og HOXA9 gener (CBS7/9 grænse) blev identificeret af PCR-baseret genotypebestemmelse. HOXA9-faldt kloner #5, 6, 28 og 121 udstillet sletning i CBS7/9 grænse placering (sorte pile). (B) The Indel mutationer i webstedet CBS7/9 blev analyseret af nukleasen fordøjelsen analysen fra de repræsentative kloner, udstillet reduceret (rød linje), uændret (blå linje), eller øget (lilla linje) HOXA9 udtryk niveauer. HOXA9-faldt kloner #5, 6, 28 og 121 udstillet mutationer i CBS7/9 grænse placering (orange pil). Dette tal er blevet ændret fra Luo et al.12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Tabel 1: sgRNAs pool bibliotek målretning oplysninger. Disse data er fra Luo et al.12. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Sanger sekventering resultaterne af sgRNAs præsenteres i den valgte HOXA9 -faldet, HOXA9 -uændret, og HOXA9 -øget kloner. HOXA9-nedsat, uændret og øget kloner er fremhævet i rød, blå og lilla, separat. Disse data er fra Luo et al.12. Venligst klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protein-kodning gen relateret sgRNA biblioteker har været anvendt i en funktionel screening system til identifikation af gener og regulering af specifikke cellulære funktioner gennem sgRNA berigelse24,25,26 -netværk ,27,28. Flere ikke-kodende region relateret sgRNA biblioteker blev også vist i gen-specifikke funktionelle skærme til distale og proksimale regulering elementer, herunder BCL11A, Tdgf1a og resistens over for lægemidler regulering gener28, 29,30. Disse sgRNA biblioteker var alle genereret af en detaljeret Bioinformatik design, oligonukleotid syntese og sub kloning oligonukleotid svømmebassin i vektorer. Hele genom-dækkende screening tilgang er meget kraftfuld og nyttige men kræver beregningsmæssige ekspertise til genome-wide sgRNA konstruktion og konsekvent finansiering for dyre syntese; Det er således stadig udfordrende for de fleste laboratorier. Men vores loci-specifikke sgRNA bibliotek screening tilgang er både praktisk og effektivt at identificere de specifikke DNA element som det CTCF bindingssted involveret i kromatin organisation og transkriptionel regulering (figur 1 og figur 2). Ved at målrette CTCF grænser, anvendte vi en et-trins RT-PCR til at vurdere sgRNA målrettet kloner ud udtryk fra en bestemt markørgen, HOXA9. Derudover vi udført Sanger rækkefølge for at bekræfte disse positive integreret sgRNAs kloner (figur 2 og figur 4). For at bekræfte funktionelt disse positive sgRNAs målrettet kloner, gennemførte vi en PCR-baserede genotypebestemmelse og mutation påvisning assay for at afgøre, om sgRNA inducerer målet site Indsæt eller sletning mutationer (figur 5). Dette giver os en lovende metode til at målrette specifikke ikke-kodende DNA elementer og evaluere deres biologiske funktion i pattedyrsceller.

I vores protokol, vi nævnte, at en bestemt oligonukleotid design vil sikre mere effektiv sub kloning i lentiCRIPSRV2 vektorer og mere pålideligt generere en nøjagtig sgRNA bibliotek (trin 1 – 2). For at opnå høj titer sgRNA bibliotek lentivirus, bør lentiviral supernatanten være koncentreret 50-fold bruge koncentrator efter protokol (trin 3), og gemt i et-80 ° C fryser i flere delprøver (trin 3.1-3.5). En yderligere bekymring er at finde den optimale MOI værdien for transduktion. Hvis MOI er for lavt, vil antallet af inficerede celler falde og føre til sgRNA screening fiasko. Hvis MOI er for høj, det vil integrere mere end én sgRNA i en enkelt celle, og det vil forstyrre sgRNA biblioteket screening gennem et-trins RT-PCR og Indel mutation påvisning. Derfor, før screening, at finde den optimale MOI for hver gruppe af celler gennem titrering af den lentiviral bibliotek er et vigtigt skridt. Titrering af det lentiviral bibliotek i MOLM13 leukæmiceller og evaluering af MOI vil blive gennemført i protokol (trin 5.1 – 5.10). Desuden kan en grundig lysing af celler til reverse transkription sikre, vellykket one-step RT-PCR. Dette kan gøres ved at øge inkubationstiden for lysis på alle temperatur stadier i protokol (skridt 7,5-7.6). Derfor, for at øge den effektive for screening af poolede CRISPR-Cas9 KO bibliotek, grundig celle lysis og reverse transkription spille en kritisk rolle i fastlæggelsen af et-trins RT-qPCR (trin 7.1 – 7.14). Derudover kan øger kvaliteten af PCR produkter sikre vellykkede indel mutation påvisning, fordi lav kvalitet PCR produkter vil påvirke heteroduplex/homoduplex generation processen (trin 9.1 –.6).

Derudover kan metoden bruges til at identificere CTCF rolle i HOX RIBOREGULATION i tidlige embryonale udvikling og visse leukæmi med afvigende HOX gen signatur. For eksempel, HOX gener spiller en kritisk rolle under fosterudviklingen og alle fire klynger af HOX gens er tidsmæssigt og rumligt begrænsede i deres udtryk mønstre i fosterudviklingen. Derudover er NPM1 mutationer blandt de mest almindelige genetiske abnormitet i AML og tegner sig for 30% af AML patienter med normal cytogenetisk karyotype31. Denne delmængde af AML udstiller en afvigende HOXA og HOXB gene signatur, som bliver en dominerende mekanisme leukemic transformation17. Det er afgørende at belyse hvordan HOX genet er reguleret i normal udvikling og dysregulated under årsager. Vi og andre har vist, at CTCF spiller en væsentlig rolle i kromatin organisation og gen transskription i HOX loci9,12. Således giver HOX loci fokuseret sgRNA bibliotek screening en bekvem måde at vikle den specifikke funktion af CTCF bindingssted HOX RIBOREGULATION under udvikling og hæmatopoietisk maligniteter. En begrænsning af tilgangen er dog svært at finde en nyttig markør for høj overførselshastighed næste generation sequencing. En af de fremtidige forskningsmål vil være at finde en yderst selektiv markør og foretage genome-wide næste generation sequencing for at se den markør effekter. Derfor, ved hjælp af en bestemt fluorescerende markør-tagged gen som tracking reporter vil blive et afgørende redskab i fremtiden forskningsplaner.

Smagsforstærkere spille en lang række kritiske roller i reguleringen af promotor funktion og gen udtryk. Men det kan også aktivere promotor aktivitet fra lang afstand på en uafhængig måde, placering og orientering, og smagsforstærkere regulere ofte genekspression i en trans orientering. Således, det er udfordrende for at lokalisere enhancer(s) for specifikke gener, især i den post-genom æra. Traditionelle reporter assays og korrelationsmaalinger funktionelle analyser (fx, kromatin immunoprecipitation og DNaseI overfølsomme assays) har været brugt til at undersøge enhancer funktion32,33. På samme måde, små skaleret locus-fokuserede screeninger blev også anvendt til at udforske aktiviteterne i distale og proksimale regulerende elementer for specifikke gener34. For nylig, samlet sgRNA-KO bibliotek strategi, der er rettet mod ikke-kodende regulerende elementer i HOX gen loci held identificeret en CTCF bindingssted beliggende mellem HOXA7 og HOXA9 gener, samt en HOTTIP lncRNA Det er kritisk for at kontrollere posterior HOXA kromatin domæne organisation, der driver ektopisk HOXA genekspression i akut myeloid leukæmi (AML)12. Disse undersøgelser viste, at samles sgRNA-KO bibliotek screening er også en kraftfuld genetik tilgang til at identificere og evaluere biologiske funktion af ikke-kodende elementer i vores genom på stedet.

CTCF, spiller som en kromatin isolator protein, en vigtig rolle i genom organisation ved at definere kromatin kvarterer for bestemte gen expression mønstre i specifikke celle type11,35. Ændring af topologisk tilknyttede domænestruktur (TAD) ændrer forstærker/promotor interaktioner, hvilket resulterer i en syge stat5,11. CTCF er meget bevaret i metazoan og er beriget på TAD grænser. Det er imidlertid uklart, hvorvidt og hvordan CTCF bidrager til at opretholde kromatin grænse struktur og TAD dannelse. Selvom poolet CTCF sgRNA-knockout bibliotek screening var fokuseret på de fire HOX loci, det viste sig at være en kraftfuld metode til at identificere og dissekere CTCF grænser og definere TAD domæne samt forstærker/promotor interaktion og transskription inden for TAD domæne12. Desuden, kan denne metode anvendes effektivt til at identificere de lncRNA elementer og transkriptionsfaktorer, der mægle kromatin kropsbygning og tilgængelighed aktivitet i HOX loci. Vi forsøger også at udforske CRISPR/sgRNA bibliotek indeholdende genome-wide CTCF websteder via næste generation sequencing identifikation ifølge CTCF ChIP-FF. og ChIA-PET data forskning fremover. Således, denne strategi kan udvides til en hel kromosom eller endda den samlede genom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingen interessekonflikter, der er relateret til denne betænkning.

Acknowledgments

Forfatterne også takke Nicholas Cesari redigeringsværktøjer håndskriftet. Arbejdet blev støttet af tilskud fra National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Proteinase K Thermo Fisher Scientific 25530049
Puromycin Thermo Fisher Scientific A1113802
Stbl3 cells  Life Technologies  C737303
HEK293T ATCC CRL-3216
MOLM-13 DSMZ ACC 554
lentiCRISPRv2 Addgene 52961
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
pGEM®-T Easy Vector Systems  Promega A137A
T4 ligase  New England Biolabs  M0202S
QIAquick Gel Extract kit QIAGEN 28706
QIAuick PCR purification kit QIAGEN 28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit Bio-Rad Laboratories 1725095
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific  11965084
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 11875093
Fetal bovine serum (FBS)  Thermo Fisher Scientific 10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine  Life Technologies  10378016
Lenti-X Concentrator  Clontech 631232
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Genessee Scientific  25-507
TAE buffer  Thermo Fisher Scientific  FERB49
Surveyor® Mutation Detection Kits Integrated DNA Technologies 706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc System Bio-Rad 170-8126
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000138
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Fisher Scientific 88870002
TSX Series Ultra-Low Freezers Thermo Fisher Scientific TSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series Thermo Fisher Scientific 75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths Thermo Fisher Scientific FSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems Thermo Fisher Scientific 13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
MiniAmp™ Thermal Cycler Applied Biosystems technology A37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply Thermo Fisher Scientific 7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fisher Scientific 09-528-178
VWR® Tube Rotator and Rotisseries VWR International 10136-084
VWR® Incubating Mini Shaker VWR International 12620-942
Analytical Balance MS104TS/00 METTLER TOLEDO 30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer DeNovix Inc. DS-11 FX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Tags

Genetik sag 145 CRISPR/Cas9 sgRNA bibliotek screening CTCF grænse HOX loci one-step RT-qPCR Indel mutation påvisning akut Myeloid leukæmi
<em>HOX</em> Loci fokus CRISPR/sgRNA bibliotek Screening at identificere kritiske CTCF grænser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D.,… More

Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D., Brewer, E., Dovat, S., Qiu, Y., Huang, S. HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries. J. Vis. Exp. (145), e59382, doi:10.3791/59382 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter