Summary
هذا الإنزيم قتل أوبسونوفاجوسيتيك يستخدم لمقارنة قدرة الخلايا المناعية متجولة التجاوب وتقتل البكتيريا التي تستند إلى معالجات مختلفة و/أو شروط. كلاسيكي، هذا التحليل بمثابة المعيار الذهبي لتقييم الوظائف المستجيب للأجسام المضادة التي أثيرت ضد بكتيريا طاهية.
Abstract
أحد جوانب رئيسية للاستجابة المناعية للاستعمار الجرثومي للمضيف هو البلعمه. مقايسة قتل أوبسونوفاجوسيتيك (أوبكا) هو إجراء تجريبية التي خلايا متجولة مثقف يشترك مع وحدات البكتيرية. وسوف phagocytose الخلايا المناعية وقتل الثقافات البكتيرية بطريقة تعتمد على تكملة. كفاءة قتل الخلايا المناعية بوساطة يعتمد على عدد من العوامل، ويمكن استخدامها لتحديد البكتيريا المختلفة كيفية مقارنة الثقافات فيما يتعلق بالمقاومة لموت الخلايا. وبهذه الطريقة، يمكن تقييم فعالية العلاجات المحتملة المستندة إلى المناعة ضد السلالات البكتيرية محددة و/أو اللقاح. في هذا البروتوكول، يصف لنا أوبكا مبسطة التي تستخدم شروط الثقافة الأساسية وخلية العد لتحديد صلاحية الخلايا البكتيرية بعد ثقافة المشارك مع ظروف العلاج و HL-60 الخلايا المناعية. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح مع عدد من اللقاح المكوّرات الرئوية مختلفة، الحافظة وسلالات أكابسولار، وغيرها من الأنواع البكتيرية. مزايا هذا البروتوكول أوبكا هي بساطته، براعة (كما لا يقتصر هذا الفحص على العلاجات جسم أوبسونينس)، والتقليل إلى أدنى حد من الوقت والمواد الكاشفة لتقييم المجموعات التجريبية الأساسية.
Introduction
أوبسونوفاجوسيتيك مما أسفر عن مصرع الإنزيم (أوبكا) أداة حاسمة لربط التعديلات في هيكل البكتيرية أو دالة للتغيرات اللاحقة في الاستجابة المناعية والدالة. على هذا النحو، فإنه كثيرا ما يستخدم كتحليل تكميلي لتحديد فعالية العلاجات جسم، المرشحين اللقاح، إنزيم الأمثل، إلخ المستندة إلى جهاز المناعة. حين المجراة في فحوصات ضرورية لتحديد فعالية التخليص أو الحماية في نموذج عدوى بكتيرية، أوبكا يمكن أن تستخدم لتقييم مساهمة محصنة إلى موت الخلايا البكتيرية المكونات الأساسية في معظم: البكتيريا والخلايا المناعية، والتجريبية العلاجات. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن أوبكاس يمكن تعديلها واستخدامها لمجموعة متنوعة من البكتيريا واللقاح، بما في ذلك العقدية الرئوية1،2من المكوّرات العنقودية الذهبية، الزائفة الزّنجاريّة3. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الاختبارات الأمثل لتقييم علاجات تجريبية مختلفة، بما في ذلك قدرة إنزيم جعل البكتيريا أكثر يسرا لتكملة بوساطة الخلايا المناعية4 وجسم علاجات لتحسين أوبسونيزاتيون5. كلاسيكي، الإنزيم أوبكا وقد استخدمت بنجاح في مجال البحوث الأساسية والسريرية الناجمة عن الإعدادات كمؤشر قوي لحماية الأجسام المضادة الخاصة بالعوامل الممرضة6،،من78،9 .
يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا المناعية للتقييم لقتل أوبسونوفاجوسيتيك. أحد السكان متجولة استخداماً هو خط الخلية ليوكيميك البشرية HL-60. يمكن الاحتفاظ بهذا الخط خلية بروميلوسيتيس المعطل في الثقافة؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون متباينة في مختلف الدول المنشط عن طريق المخدرات مختلف العلاجات10،11. علاج HL60 مع N، N-ديميثيلفورماميدي يميز خط الخلية في العَدلات مفعّلة مع النشاط متجولة قوية11. حين يكون قد تم تحسين HL-60 الخلايا وتستخدم بشكل متكرر لهذه الاختبارات البلعمه10، يمكن استخدام أخرى الكريات البيض النوى الأولية كذراع محصنة من التجربة12.
بالإضافة إلى ذلك، هذه فحوصات يمكن أن تكون مبسطة13 أو14 إلقاء نظرة على السلالات المقاومة للمضادات الحيوية متعددة من البكتيريا لاختبار متعدد. الأسلوب متعدد أحرز أكثر جدوى من خلال تطوير البرمجيات التي يمكن عد كفاءة مستعمرة بكتيرية تشكيل وحدات (كفوس) كل بقعة على لوحة أجار15. وهنا يصف لنا طريقة مبسطة باستخدام سلالة بكتيرية واحدة HL-60 الخلايا، وتكملة الأرنب الرضيع ولوحات أجار الدم. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تقييم علاجات متعددة بسرعة لمعالجة مسائل بحثية محددة حول كيف يمكن أن يكون التضمين الاستجابة المناعية الفطرية للعدوى البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الثقافة، والتمايز، والتحقق من صحة الخلايا HL-60
- إعداد HL-60 الخلايا ثقافة وسائل الإعلام مؤلفة من 500 مل ربمي مع الجلوتامين لام و 50 مل إبطال الحرارة الجنيني البقري المصل. لا تقم بإضافة المضادات الحيوية كما قد يؤثر هذا على التفريق بين الخلايا HL-60.
- لنشر وصيانة HL-60 الخلايا، تنفيس الثقافة 5 × 106 خلايا في 10 مل HL-60 الخلايا وسائط الثقافة في 75 سم2 قوارير في 37 درجة مئوية و 5% CO2. مرور الخلايا كل أيام 3−4 للحفاظ على تركيزات الخلية أمثل.
ملاحظة: تركيز خلية ينبغي أن لا تتجاوز 5 × 106/mL. - توليد الأرصدة العامل HL-60 الخلايا عن طريق اليقوتينج حوالي 1 × 106 خلايا/مل في وسائط الثقافة HL60 مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في أنابيب التبريد 1 مل.
ملاحظة: قد يتم تخزين مخزونات العامل في-80 درجة مئوية. يجب أن يتم تخزين المخزون الرئيسي في-120 درجة مئوية. - تمييز HL-60 الخلايا عن طريق تثقيف 1.5 × 107 خلايا في 15 مل HL-60 الخلايا ثقافة وسائل الإعلام مع 0.6% N، N-dimethylformamide (DMF) في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في قوارير معقمة توج تصفية 75 سم2 لمدة 3 أيام قبل أوبكا.
- التحقق من صحة أن HL-60 الخلايا المتمايزة قد تم بنجاح، وهي مناسبة للاستخدام في التحليل أوبكا باختبار صلاحية وعلامات سطح الخلية وفقا للمنشأة التدفق الخلوي البروتوكولات16،17، 18،19. بعد التمايز، حصاد HL-60 الخلايا ووصمة عار حوالي 1 × 104 خلايا مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي/البقع ل CD71، CD35، أنيكسين الخامس، ويوديد propidium.
ملاحظة: ينبغي أن تكون الخلايا المتمايزة % إيه سيكس فايف % قابلة للحياة، إيه فايف فايف CD35+، ودي تو زيرو % CD71+ كما هو محدد من خلال إنشاء بروتوكولات المصادقة14 (الشكل 1).
2-إعداد الكواشف ومخازن أوبكا
- إعداد 50 مل opsonization العقيمة المخزن المؤقت ب (أوب) عن طريق خلط 42.5 مل معقمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) مع Ca2 +/Mg2 +, 5 مل من المصل البقري الجنين الحرارة معطل، و 2.5 مل من 0.1% الجيلاتين العقيمة. مخزن في 4 درجات مئوية.
- الحصول على طفل أرنب مكملاً وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- الحصول على أو إعداد لوحات ثقافة البكتيرية (أي 15 × 100 مم2 5% الأغنام أجار الدم اللوحات).
3-إعداد نماذج المخزون البكتيرية
- الحصول على مخزون من strain(s) الجرثومي لفحصها.
ملاحظة: لهذا البروتوكول، النمط المصلي المسيطر يستخدم 3 العقدية الرئوية (WU2، قدمت بسخاء بالدكتور القمر Nahm). - تنمو السلالة البكتيرية في مرق مناسب (أي، تود هيويت مرق + مستخرج الخميرة 0.5% لهذه السلالة WU2) لما يقرب من 2−4 ح في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) للثقافة ينبغي أن يكون بين 0.6 و 0.8. - بيليه البكتيريا بالطرد المركزي في 6,000 س ز 2 دقيقة وريسوسبيند الخلايا في 10−30 مل من والغليسيرول 15% في المرق المناسب. قاسمة ثقافة البكتيرية (500 ميليلتر الواحدة قاسمة) إلى أنابيب الطرد المركزي معقم 1.5 مل ومخزن في-80 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد بقنينة واحدة من الأسهم البكتيرية في حمام مائي 37 درجة مئوية. بيليه الخلايا البكتيرية وريسوسبيند في 500 ميليلتر من أوب تحت ظروف معقمة.
- إعداد تخفيف مختلفة من الأسهم البكتيرية في أوب (أي 10 ميليلتر من لا تمييع، 10 ميليلتر من 01:10، 10 ميليلتر من 1: 100، إلخ.). إجراء المقايسة أوبكا (المادتان 4-6، بما في ذلك ثقافة المشارك HL-60/تكملة) كما هو موضح أدناه باستخدام تخفيف مختلف الأسهم البكتيرية غير المعالجة. الثقافة لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية (لا CO2).
ملاحظة: درجة حرارة 30 درجة مئوية محددة ل WU2 لمنع فرط؛ سلالات أخرى/اللقاح قد ينمو على النحو الأمثل عند 37 درجة مئوية. - عد المستعمرات لتمييع كل الأسهم البكتيرية غير المعالجة مثقف يشترك مع HL-60 الخلايا وتكملة. تحديد أي تمييع للبكتيريا غلة العدد الأمثل للمستعمرات العد (حوالي 80−120 كفوس لعلاج البكتيريا المستزرعة يشترك مع HL-60 الخلايا). ملاحظة هذا تمييع للمستقبل أوبكاس التي تنطوي على هذا المخزون البكتيرية.
4-البكتيرية في المعاملة والثقافة
- ذوبان الجليد أنبوب واحد من الأسهم البكتيرية إعدادها في الخطوة 3، 3. بيليه البكتيريا (6,000 س ز 2 دقيقة) وريسوسبيند بيليه الخلية في أوب في تمييع الأمثل كما هي محددة في الخطوة 3، 6.
- "الماصة؛" 10 ميليلتر لتمييع البكتيرية حراكه كل بئر في لوحة ثقافة الجولة-أسفل خلية 96-جيدا.
- إضافة 20 ميليلتر لعلاج جسم أو العقاقير المناسبة لكل بئر تجريبية في مكررة.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، ويتم إضافة جسم النمط المصلي المسيطر على حدة التي تم إنشاؤها في الفئران كعلاج X ويضاف إنزيم هيدرولاز غليكوزيد المعروف أن تتحلل الكبسولة السكاريد 3 النمط المصلي المسيطر كعلاج Y (الشكل 2)4،20. لمراقبة الآبار، استخدم 1 x برنامج تلفزيوني أو OBB، اعتماداً على المخزن المؤقت المستخدم لمعالجة الآبار. - اهتزاز لوحة العينة حوالي 90 لفة في الدقيقة ح 1 في درجة حرارة الغرفة. ضبط هذه الشروط تبعاً لدرجة الحرارة المثلى أو ظروف تهتز من العلاجات يجري اختبارها.
5-HL-60 البكتيرية ثقافة المشارك
- إعداد HL-60 الخلايا بحصاد الخلايا HL-60 المتباينة التي تعامل مع DMF في الأيام الثلاثة السابقة (راجع الخطوة 1، 4) إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل. بيليه الخلايا (500 س ز، 3 دقيقة) وتجاهل المادة طافية، وتغسل مع مالا يقل عن 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني.
- بيليه الخلايا غسلها (500 س ز، 3 دقيقة) وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في أوب (ابدأ مع 1 مل أوب وضبط بتركيز 1 × 107/mL نهائي بعد عد الخلايا).
- إضافة تكملة أرنب الطفل (بيبي العقيمة، غير مخفف أرنب المصل، العمر 3−4 أسابيع) في وحدة تخزين نهائي 1:5.
ملاحظة: ينبغي أن يكون التركيز النهائي المخلوط HL-60-تكملة 1 × 107/mL. إذا كان اختبار تكملة التبعية، يمكن استخدام حل ثاني تتضمن النشطة HL-60 الخلايا مع تكملة إبطال الحرارة (قد يتم إلغاء تنشيط مكملاً بحضانة في حمام مائي في > 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل). - بعد ح 1 البكتيرية ثقافة كاملة (الخطوة 4، 4)، تقسيم كل عينة (أي، 10 ميليلتر من كل عينة 30 ميليلتر في آبار جديدة اثنين) إلى الآبار مكررة للفريقين (أي استخدام سوى 20 ميليلتر من ثقافة المشارك الأصلي 30 ميليلتر لحساب خطأ بيبيتينج) : مجموعة واحدة سيكون مثقف يشترك مع HL-60-تكملة وواحدة سوف تشمل البكتيريا فقط. إضافة 50 ميليلتر من خليط HL-60-تكملة (من الخطوة 5، 3) لكل مجموعة تجريبية من الآبار (تفويض + HL-60)؛ إضافة 50 ميليلتر من OBB وحدها إلى الآبار من البكتيريا فقط (تفويض-HL-60).
ملاحظة: على سبيل المثال، تستخدم حوالي 800 كفوس الجرثومي للثقافة المشتركة الأولى مع 5 × 10550 ميليلتر HL-60 الخلايا. إذا كان هذا التعدد للإصابة عالية جداً أو منخفضة جداً كما يتبين من الأرقام النهائية مستعمرة، ضبط تمييع البكتيرية الأولية بدلاً من عدد الخلايا HL-60. - اهتزاز لوحة 96-جيدا في 37 درجة مئوية ح 1 (لا CO2).
6-عينة من الطلاء والحضانة بين عشية وضحاها
- تمييع كل جيدا 1:5 مع أوب، حيث يكون لكل نموذج وحدة تخزين على الأقل 50 ميليلتر.
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من كل عينة مباشرة على منطقة معينة من لوحة الثقافة البكتيرية، ضمان تباعد ملائم بين العينات. 15 × 100 مم2 الجولة لوحات أجار، وعينات بيبيت حوالي 4 على لوح واحد.
- تغطية وتسمح العينات لتجف لمدة 15 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
- عكس لوحات والثقافة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية (لا CO2). وبدلاً من ذلك، ثقافة لوحات في الجرار اللاهوائية لاختبار ما إذا كانت ظروف وصول تؤثر على النمو البكتيري أو لعنصر التحكم للتشكل.
- بعد الثقافة بين عشية وضحاها، عد المستعمرات في كل منطقة عينة المعينة. تحليل البيانات من خلال مقارنة عدد الخلايا الحية في كل مجموعة عنصر التحكم المطابق و/أو العينات التي لا تتلقى HL-60 خلية ثقافة المشارك (قتل الخلية تشير إلى بقاء الخلية 100%، 0%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وينبغي أن يكون إجراء التحقق من صحة التمايز HL-60 قبل البدء في أوبكا. هذا أن يمكن إنجاز باستخدام التدفق الخلوي لتحديد التعبير خارج الخلية CD11b، CD35، CD71، والخامس أنيكسين (الشكل 1). يمكن أيضا استخدام يوديد Propidium كعلامة سلامة. بعد أن تلقي علاجاً مع DMF لمدة 3 أيام، وينبغي زيادة التعبير عن CD35 (إيه فايف فايف في المائة من كافة الخلايا) وينبغي أن تراجع التعبير عن CD71 (دي تو زيرو في المائة من كافة الخلايا). ينبغي أن تكون النسبة المئوية ل annexin V + و propidium يوديد (PI +) الخلايا معا < 35% لضمان كاف الخلية البقاء. إذا كانت هذه النسب لا تفي بالحد الأدنى من المتطلبات، ينبغي تعديل شروط الثقافة كما هو موضح في المناقشة.
يمكن استخدام عدد كفوس التي تم الحصول عليها من الخطوة 6.5 مقارنة بقاء الخلية البكتيرية من مجموعات مختلفة مقارنة بمجموعة التحكم غير المعالجة (بقاء الخلية 100 ٪) كما هو مبين في الشكل 2. على سبيل المثال، ينبغي أن يكون متوسط التهم التي تم الحصول عليها من الآبار التي تلقي أي علاج ولكن قد شارك مثقف مع HL-60 قريبة نسبيا في عدد الخلايا التي تلقي أي علاج ولا ثقافة المشارك HL-60، والذي سوف يكون دليلاً على بقاء الخلية 100%، أو 0 % موت الخلية. مع علاج فعال، ينبغي أن يكون عدد المستعمرات أكثر مختلفة بين ثقافة المشارك HL-60 ولا HL-60 الخلايا (الشكل 2 و الشكل 3). الاختلافات الكبيرة بين HL-60 ولا توجد مجموعات HL-60 إرشادية البلعمه أكثر كفاءة. ومع ذلك، قد فعلا تحسين المعاملة نمو الخلايا البكتيرية في المجموعة غير المستزرعة يشترك مع HL-60 الخلايا. وينبغي ملاحظة هذا الاختلاف في العينات المعالجة وغير المعالجة. إذا لم يكن تمييع البكتيرية الأمثل (الخطوة 3، 6) أو نمو مستعمرة لا يحترم بدقة بعد الطلاء (الخطوة 6.5 أو انظر المناقشة)، وقد منع فرط المستعمرات عد دقيق للمستعمرات (الشكل 4).
الشكل 1 : التحقق من صحة التمايز HL-60 الخلايا عن طريق التدفق الخلوي- كانت تحصد متمايزة HL-60 الخلايا وغسلها وحراكه في 1 × 105 خلايا/مل برنامج تلفزيوني. وكانت الزنزانات ثم الكوتيد في الآبار 12 (100 ميليلتر في البئر) في لوحة 96-جيدا. ثم أن الخلايا كانت ملطخة المضادة مترافق فلوريسسينتلي-CD35، CD71 المضادة والخامس أنيكسين ويوديد propidium. واستخدمت أونستينيد الخلايا أو الخلايا الملون مع الأجسام المضادة مترافق فلوريسسينتلي ايستب كعناصر تحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : علاج Y يحسن قتل الخلية HL-60-بوساطة البكتيريا. عينات الرئوية س. تعامل مع العلاج X (الأجسام المضادة) أو العلاج Y (إنزيم). وأجرى أوبكا وفقا للبروتوكول واحصى كفوس البكتيرية في التكرارات. واستخدمت عينات لم يعاملوا HL-60 الخلايا كعنصر تحكم (بقاء الخلية 100%). يظهر هي متوسط النسب المئوية كفوس البكتيرية في مجموعات HL-60 معاملة مقارنة بالمجموعات غير HL-60-المعالجة بالمطابقة. تمثل أشرطة الخطأ القياسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : كفوس البكتيرية بعد أوبكا والثقافة بين عشية وضحاها. كانت تعامل العينات البكتيرية وشارك مثقف دون (أ) أو (ب) HL-60 الخلايا ح 1 في 37 درجة مئوية. كانت عينات المخفف وفقا للبروتوكول ومطلي على أجار الدم لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية (لا CO2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : فرط زيمبابوي البكتيرية. تعامل العينات البكتيرية وأجرى أوبكا. كانت عينات المخفف ومطلي على أجار الدم لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية (لا CO2). لا يمكن تحديد تقييم دقيق لأرقام مستعمرة كما هو مبين في فرط مستعمرات. 37 درجة مئوية (لا CO2) أدت إلى فرط البكتيرية، درجة حرارة الحضانة للمستقبل لوحات خفضت إلى 30 درجة مئوية (لا CO2) للحفاظ على كونتابيليتي المستعمرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أوبكاس تخدم أدوار أساسية في تقييم الاستجابات المناعية الأجسام المضادة بوساطة الناجمة عن التطعيم6،8. المغزى الرئيسي لهذه أوبكا مبسطة هو قدرة على التكيف في الظروف لفحصها (أي الأجسام المضادة، والعلاجات إنزيم، إلخ.). وبهذا المعني، بينما يمكن استخدام هذا التحليل لاختبار مساهمة أوبسونينس (أي الأضداد) في البلعمه، يمكن أيضا استخدامه لتقييم السبل للتغلب على عوامل الفوعة (أي السكريات الحافظة) التي تمنع عادة مسارات متجولة. تقليل عدد الخطوات التي تستخدم عادة في أوبكا متعدد يحتمل أن يقلل فرص الأخطاء التقنية التي يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية، ويقلل من مقدار استكشاف الأخطاء وإصلاحها والأمثل للحصول على بيانات قابلة للاستخدام. كما يناسب هذا البروتوكول للاختلافات لظروف العلاج، فإنه يسمح لقدر كبير من التنوع.
قبل إنشاء التحليل من خلال ثقافة HL-60 وإنشاء مخزون البكتيرية من المهم منع خطوات التحسين دخيلة عند أداء أوبكا. يجب تخصيص الوقت للتأكد من أن جميع المواد الكاشفة وأنواع الخلايا على استعداد ويتم تنفيذ الوظيفية قبل التجربة. وتشمل هذه الخطوات نشر خط الخلية HL-60 في الثقافة (حوالي أسبوعين)، التحقق من صحة أن تركيزات محددة من DMF تفرق فعالية HL-60 الخلايا (حوالي أسبوع واحد)، وإنشاء مخزون البكتيرية خالية من الملوثات والأمثل تخفيف (حوالي أسبوعين).
بعض الخطوات لهذا البروتوكول حاسمة بالنسبة للحصول على مستعمرات معدود وبيانات كافية. هذا البروتوكول يستخدم HL-60 الخلايا البالعات نظراً لسهولة استخدام خط خلية بشرية التي يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة ومتباينة مع خطوات قليلة نسبيا. كما يمكن استخدام خلايا الدم الطرفية البشرية وحيدات النوى (ببمكس)؛ ومع ذلك، الحصول على هذه الخلايا والشروط لاستخدامها على النحو الأمثل قد يكون أكثر صعوبة. يجب أن يكون ميزت HL-60 الخلايا كي تعمل البالعات ضد البكتيريا. للتحقق من التمايز بعد العلاج 3 أيام مع DMF، ينبغي استخدام التدفق الخلوي لاختبار للتعبير عن CD11b و CD35 على معظم الخلايا قبل محاولة أي أوبكا، كما نوقش في الخطوة 1، 5. يجب أيضا التحقق من صلاحية خلية (يفضل أن يكون ذلك مع أنيكسين الخامس وتلطيخ يوديد propidium). إذا مات، بعدد كبير من الخلايا أبوبتوتيك، أو متمايز كما لاحظ مع التدفق الخلوي، التفريق بين 3 أيام مع 0.6% يمكن تعديل DMF في وسائل الإعلام ربمي (0.4% −0. 8% DMF، 2−6 اليوم ثقافة الوقت) حتى علامات البقاء وتمايز الخلية تحسين. ينبغي أن يكون هذا التمايز التحسين الأول أوبكا HL-60 وظيفة أمر حاسم لقتل البكتيريا الفعالة. نوصي بالتحقق من صحة التمايز HL-60 قبل كل تجربة أوبكا.
عدد كفوس البكتيرية (الخطوة 3، 6) الاستغناء عن في البداية إلى لوحة 96-جيدا (الخطوة 4.2) أمر بالغ الأهمية أيضا: الاستغناء عن عدد كبير من الخلايا سوف تجعل العد صعبة وغير دقيقة (الخطوة 6، 5) وقد ينخفض موت الخلية ولاحظ من ثقافة المشارك HL-60، بينما الاستغناء عن عدد قليل جداً من الخلايا قد يزيد مقدار الانحراف بين التكرارات، وقد لا تظهر أي مستعمرات معدود بعد ثقافة المشارك HL-60. الاستفادة المثلى من إضعاف الأسهم ولذلك حرج، ويجب اختبار مع بروتوكول كامل، بما في ذلك ثقافة المشارك HL-60/تكملة.
كما يمكن اختبار أهمية تكملة مع هذا البروتوكول بما في ذلك مجموعتين من العينات: واحد مع واحد مع تكملة إبطال الحرارة وتكملة أرنب الطفل النشط. ينبغي أن يكون HL-60 الخلايا المستزرعة يشترك مع كلتا المجموعتين، على الرغم من أن مجموعة البكتيريا فقط لا يزال ينبغي إدراجها كخط أساس بقاء خلية 100%.
لبعض الأنماط البكتيرية، مورفولوجية المستعمرات قد جعل خلية العد أو بروز إشكالية. مخاطي اللقاح مثل نوع 3 العقدية الرئوية، وعلى سبيل المثال، يمكن بسهولة كسا والحد من التهم زيمبابوي. قد يكون هذا مشكلة خاصة عند اختبار العلاجات التي تؤثر على الكبسولة، كما سيتم منع فرط في المجموعة المعالجة ولكن سوف تحسب عدد أكبر من المستعمرات الأصغر حجماً. لمنع هذا التعارض، السيطرة على نمو الخلايا أمر بالغ الأهمية. استزراع المستعمرات مطلي عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها المحتمل أن تسمح بتحسين رصد النمو البكتيري ويمكن إزالة اللوحات عندما تصل جميع المستعمرات إلى أحجام مميزة، والعد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام لوحات أجار مختلفة تحسين الرؤية للمستعمرات الفردية. وبهذه الطريقة، هذا البروتوكول مفيد كما التغييرات الصغيرة لتحسين الظروف وبالتالي يمكن أن تستخدم لحساب عدد من السلالات البكتيرية أو خيارات العلاج المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور القمر Nahm (جامعة ألاباما في برمنغهام) له مساعدة لا تقدر بثمن في إنشاء أوبكا فحوصات في المختبر. وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة منحة" 1R01AI123383-01A1 إلى فيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
