Denne opsonophagocytic drepe analysen brukes til å sammenligne evne til phagocytic immunceller svare og drepe bakterier basert på ulike behandlinger og/eller betingelser. Klassisk, fungerer denne analysen som gullstandarden for vurdering funksjoner effektor av antistoffer reist mot en bakterie som opsonin.
En viktig del av immunforsvaret til bakteriell kolonisering av verten er fagocytose. Opsonophagocytic drepe analysen (OPKA) er en eksperimentell prosedyre der phagocytic cellene er co kulturperler med bakteriell enheter. Immunceller vil phagocytose og dreper bakteriekulturer i en komplement-avhengige måte. Effektiviteten av immun-mediert celle drapet er avhengig av flere faktorer og kan brukes til å bestemme hvordan ulike bakteriell kulturer sammenligne med hensyn til motstand mot celledød. På denne måten kan effekten av potensielle immun-baserte therapeutics vurderes mot spesifikke bakteriell stammer og/eller serotyper. I denne protokollen beskriver vi en forenklet OPKA som benytter grunnleggende oppdrettsforholdene og celle teller for å fastslå bakteriell celle levedyktighet etter co kultur med behandling betingelser og HL-60 immunceller. Denne metoden har blitt vellykket utnyttet med en rekke forskjellige pneumokokk serotyper, capsular og acapsular stammer, og andre bakterie-art. Fordelene med denne OPKA protokollen er dens enkelhet, allsidighet (som denne analysen ikke er begrenset til antistoff behandlinger som opsonins), og minimering av tid og reagenser å vurdere eksperimentelle standardgrupper.
Opsonophagocytic drepe analysen (OPKA) er et kritisk verktøy for å koble endringer i bakteriell strukturen eller funksjon til etterfølgende endringer i immunforsvaret og funksjon. Som sådan, er det ofte brukt som en komplementær analysen for å bestemme immun-baserte effekten av antistoff behandlinger, vaksine kandidater, enzym optimalisering, etc. Mens i vivo analyser er nødvendig for å bestemme effektiv klarering eller beskyttelse i en bakteriell infeksjon modell, OPKA kan brukes til å vurdere immun bidrag til bakteriell celledød på de grunnleggende komponentene: bakterier, immunceller, og eksperimentelle behandlinger. Tidligere studier har vist at OPKAs kan endres og brukes til en rekke bakterier og serotyper, inkludert Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Videre kan disse optimalisert analyser brukes til å vurdere ulike eksperimentelle behandlinger, inkludert muligheten for et enzym å gjøre bakterien mer tilgjengelig for komplement-mediert immunceller4 og antistoff behandlinger for å forbedre opsonization5. Tradisjonelt OPKA analysen har blitt brukt i grunnleggende og klinisk forskning som en mektig indikator for beskyttelse indusert av patogen-spesifikke antistoffer6,7,8,9 .
Ulike immunceller kan brukes for vurdering av opsonophagocytic drap. En brukte phagocytic befolkningen er HL-60 human leukemic celle linjen. Denne cellen linjen kan holdes som deaktivert promyelocytes i kultur; Imidlertid kan de differensieres i ulike aktivert stater via ulike behandlinger10,11. Behandling av HL60 n, N-vannistedenfor skiller celle linjen i aktivert nøytrofile med sterke phagocytic aktivitet11. Mens HL-60 celler er optimalisert og brukes ofte for disse fagocytose analyser10, kan andre primære polymorfonukleære leukocytter brukes som immun armen av eksperimentet12.
I tillegg disse analyser kan være forenklet13 eller multiplekset14 å se på flere antibiotika-resistente stammer av bakterier skal testes. Metoden multiplex er gjort mer mulig gjennom utvikling av programvare som kan effektivt telle bakterie kolonien danner enheter (CFUs) per plass på en agar plate15. Her beskriver vi en strømlinjeformet metode som bruker en bakteriell stamme, HL-60 celler, baby kaninen supplement og blod agar plater. Med denne metoden kan flere behandlinger vurderes raskt for å løse spesifikke problemstillinger på hvordan medfødte immunforsvaret til bakteriell infeksjon kan være modulert.
OPKAs tjene viktige roller i å vurdere antistoff mediert immunreaksjoner indusert av vaksiner6,8. Viktigste betydningen av dette forenklet OPKA er tilpasningsevne i forhold til testes (dvs. antistoffer, enzym behandlinger, etc.). I denne forstand, mens denne analysen kan brukes til å teste bidrag av opsonins (dvs. antistoffer) i fagocytose, kan det også brukes til å vurdere måter å overvinne virulens faktorer (dvs. capsular polysakkarider) som normalt hemme…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) for hans uvurderlig hjelp i å etablere OPKA analyser i vårt laboratorium. Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse Grant 1R01AI123383-01A1 til FYA.
Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
glycerol | Sigma | G9012-1L | |
HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
propidium iodide | Sigma | P4864 | |
RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |