Summary
Ce test de mise à mort d’opsonophagocytic est utilisé pour comparer la capacité des cellules immunitaires phagocytaires de répondre à et de tuer les bactéries issus des différents traitements et/ou des conditions. Classiquement, ce test sert de l’étalon-or pour évaluer les fonctions effectrices des anticorps contre une bactérie comme opsonine.
Abstract
Un aspect clé de la réponse immunitaire à une colonisation bactérienne de l’hôte est la phagocytose. Un test de mise à mort d’opsonophagocytic (OPKA) est une procédure expérimentale dans laquelle les cellules phagocytaires sont conjointement cultivés avec unités bactériennes. Les cellules immunitaires vont phagocyter et tuer les cultures bactériennes d’une manière dépendante du complément. L’efficacité de l’assassinat de cellule immunitaire dépend de plusieurs facteurs et peut être utilisée pour déterminer comment les différentes bactéries comparer les cultures en ce qui concerne la résistance à la mort cellulaire. De cette façon, l’efficacité du potentiel immunitaire base thérapeutique peut être évaluée contre les souches bactériennes spécifiques et/ou des sérotypes. Dans ce protocole, nous décrivons une OPKA simplifiée qui utilise des conditions de culture de base et de la cellule de comptage pour déterminer la viabilité cellulaire bactérienne après co-culture avec des conditions de traitement et HL-60 cellules immunitaires. Cette méthode a été utilisée avec succès avec un certain nombre de différents sérotypes pneumococciques, capsulaires et capsulée souches et d’autres espèces bactériennes. Les avantages du présent protocole OPKA sont sa simplicité, polyvalence (comme ce test n’est pas limité aux traitements d’anticorps comme opsonines) et la minimisation du temps et de réactifs pour évaluer les groupes expérimentaux de base.
Introduction
L’opsonophagocytic tuant assay (OPKA) est un outil essentiel permettant de relier des altérations de la structure bactérienne ou une fonction aux modifications ultérieures dans la réponse immunitaire et la fonction. À ce titre, il sert souvent une analyse complémentaire afin de déterminer l’efficacité immunitaire basé sur des traitements d’anticorps, vaccins expérimentaux, optimisation de l’enzyme, etc.. Alors que les essais in vivo sont nécessaires pour déterminer la clairance apparente ou protection dans un modèle d’infection bactérienne, le OPKA peut être utilisé pour évaluer la contribution immunisée à la mort de la cellule bactérienne composants à la base : les bactéries, les cellules immunitaires et expérimentale traitements. Des études antérieures ont montré que OPKAs peuvent être modifiées et utilisés pour une variété de bactéries et sérotypes, dont Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus,2,3de la Pseudomonas aeruginosa. En outre, ces dosages optimisés peuvent servir à évaluer différents traitements expérimentaux, y compris la capacité d’une enzyme pour faciliter l’accès aux cellules immunitaires médiée par le complément4 anticorps traitements et pour améliorer la bactérie opsonisation5. Classiquement, le dosage OPKA a été utilisée avec succès dans la recherche fondamentale et clinique paramètres comme un puissant indicateur de protection induite par des anticorps spécifiques6,7,8,9 .
Différents types de cellules immunitaires peuvent servir pour l’évaluation de l’assassinat d’opsonophagocytic. Une population phagocytaire couramment utilisée est la ligne de cellules leucémiques humaines HL-60. Cette lignée cellulaire peut être gardée comme promyélocytes inactivé en culture ; Toutefois, ils peuvent être différenciés dans divers États activés par l’intermédiaire de différents médicaments traitements10,11. Traitement des HL60 avec N, N-diméthylformamide différencie de la lignée cellulaire en neutrophiles activés avec forte activité phagocytaire11. Tandis que les cellules HL-60 ont été optimisés et sont fréquemment utilisés pour ces essais de phagocytose10, autres leucocytes polymorphonucléaires primaires peuvent être utilisés comme le bras immunitaire de l' expérience12.
En outre, ces tests peuvent être simplifiées13 ou multiplexés14 à regarder de nombreuses souches résistantes aux antibiotiques des bactéries à tester. La méthode multiplexée ont été réalisée en plus faisable grâce à l’élaboration d’un logiciel qui peut compter efficacement la colonie bactérienne formant des unités (UFC) par endroit sur une plaque de gélose15. Nous décrivons ici une méthode simplifiée utilisant une souche bactérienne, les cellules HL-60, complément de bébé lapin et géloses au sang. Avec cette méthode, plusieurs traitements peuvent être évalués rapidement pour répondre à des questions de recherche spécifiques sur la façon dont la réponse immunitaire innée à l’infection bactérienne peut être modulée.
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Protocol
1. culture, différenciation et la Validation des cellules HL-60
- Préparation des milieux de culture de cellules HL-60 composée de 500 mL RPMI avec la L-glutamine et 50 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal. N’ajoutez pas d’antibiotiques car cela peut affecter la différenciation des cellules HL-60.
- Pour propagation/maintenance des cellules HL-60, la culture 5 x 106 cellules dans 10 mL de milieux de culture cellulaire HL-60 à 75 cm2 ventilés flacons à 37 ° C et 5 % de CO2. Le passage des cellules tous les jours 3−4 pour maintenir la concentration cellulaire optimal.
Remarque : La concentration cellulaire ne devrait pas dépasser 5 x 106/ml. - Produire des stocks de travail des cellules HL-60 par aliquotage environ 1 x 106 cellules/mL dans les milieux de culture HL60 avec 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) dans des tubes cryogéniques de 1 mL.
Remarque : Les stocks de travail peuvent être conservés à-80 ° C. Le stock principal doit être conservé à-120 ° C. - Différencier les cellules HL-60 par culture 1,5 x 107 cellules dans 15 mL de milieux de culture cellulaire HL-60 avec 0,6 % N, N-diméthylformamide (DMF) à 37 ° C et 5 % de CO2 dans des flacons stériles diablotin filtre 75 cm2 pendant 3 jours avant OPKA.
- Valider que les cellules HL-60 ont été différenciés avec succès et sont appropriés pour une utilisation dans l’essai OPKA par des tests de viabilité et marqueurs de surface cellulaire selon débit établi cytometry protocoles16,17, 18,19. Après différenciation, récolter les cellules HL-60 et tache environ 1 x 104 cellules avec anticorps/taches conjugué fluorescent pour CD71, CD35, annexin V et l’iodure de propidium.
Remarque : Les cellules différenciées devraient être ≥65 viable, ≥55 % CD35+et ≤ 20 % CD71+ tel que déterminé par mis en place de protocoles de validation14 (Figure 1).
2. Elaboration d’OPKA tampons et réactifs
- Préparer 50 mL de tampon stérile opsonisation B (OBB) en mélangeant 42,5 mL stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca2 +/Mg2 +5 mL de sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur et 2,5 mL de 0,1 % de gélatine stérile. Conserver à 4 ° C.
- Obtenir le lapin bébé complément et conserver à-80 ° C.
- Obtenir ou préparer des plats de culture bactérienne (c.-à-d., 15 x 100 mm2 5 % brebis géloses au sang).
3. préparation des échantillons de Stock bactériennes
- Obtenir un stock de la souche bactérienne (s) à tester.
Remarque : Pour ce protocole, sérotype 3 Streptococcus pneumoniae (automatismes WU2, généreusement fournis par Dr Moon Nahm) est utilisé. - Cultiver la souche bactérienne dans un bouillon approprié (bouillon de Todd-Hewitt + 0,5 % d’extrait de levure pour cette souche automatismes WU2) pour environ 2−4 h à 37 ° C.
Remarque : La densité optique à 600 nm (OD600) de la culture doit être comprise entre 0,6 et 0,8. - Les bactéries de granule par centrifugation à 6 000 x g pendant 2 min et remettre en suspension les cellules de 10−30 mL de 15 % de glycérol dans le bouillon approprié. Aliquote la culture bactérienne (500 µL par aliquote) dans des tubes à centrifuger stérile de 1,5 mL et conserver à-80 ° C.
- Dégeler un flacon de stock bactérienne dans un bain-marie à 37 ° C. Les cellules bactériennes de granule et remettre en suspension dans 500 µL de OBB dans des conditions stériles.
- Préparer des dilutions différentes du stock bactérienne dans OBB (10 µL d’aucune dilution, 10 µL de 01:10, 10 µL de 1/100, etc..). Effectuez le test OPKA (art. 4-6, y compris co-culture HL-60/complément) tel que décrit ci-dessous à l’aide de diverses dilutions du stock bactérienne non traitée. Culture les plaques pendant la nuit à 30 ° C (pas de CO2).
Remarque : La température de 30 ° C est spécifique pour les automatismes WU2 empêcher la prolifération ; autres souches/sérotypes peuvent croître optimale à 37 ° C. - Compter les colonies pour chaque dilution du stock de bactérienne non traitée conjointement mis en culture avec complément et cellules HL-60. Déterminer quelle dilution des bactéries donne le nombre optimal de colonies dénombrables (environ 80−120 UFC pour les bactéries non traitées conjointement mis en culture avec cellules HL-60). Notez cette dilution pour les futurs OPKAs impliquant ce stock bactérien.
4. culture et traitement contre les bactéries
- Décongeler un tube de stock bactérienne préparée à l’étape 3.3. Bactéries (6 000 x g pendant 2 min) de granule et resuspendre le culot dans OBB à une dilution optimale tel que déterminé à l’étape 3.6.
- Distribuer 10 µL de suspension bactérienne dilution / puits dans une plaque de culture de cellules de 96 puits fond rond.
- Ajouter 20 µL du traitement approprié d’anticorps ou de la drogue dans chaque puits expérimental en double exemplaire.
Remarque : Dans le présent protocole, un anticorps spécifique au sérotype généré chez la souris est ajouté comme traitement X et une enzyme de glycoside hydrolase connue pour dégrader la capsule de polysaccharide 3 sérotypes est ajoutée comme traitement Y (Figure 2)4,20. Pour les puits de contrôle, utiliser 1 x PBS ou OBB, fonction de la mémoire tampon utilisée pour les puits de traitement. - Secouez la plaque d’échantillon à environ 90 tr/min pendant 1 h à température ambiante. Réglez ces conditions selon la température optimale ou agitation des traitements à l’essai.
5. HL-60 co-culture bactérienne
- Préparer les cellules HL-60 en récoltant les cellules HL-60 différenciés qui sont traités avec DMF trois jours avant (voir l’étape 1.4) dans des tubes coniques 15 mL. Les cellules (500 x g, 3 min) à pellets, éliminer le surnageant et laver au moins 10 ml de PBS 1 x.
- Les cellules lavées (500 x g, 3 min) à pellets, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules OBB (commencer avec 1 mL OBB et ajuster pour une concentration finale de 1 x 107/ml après comptage de cellules).
- Ajouter bébé lapin complément (sérum de lapin bébé stérile, non dilué, âge 3−4 semaines) à un volume final de 1:5.
Remarque : La concentration finale du mélange HL-60-complément devrait être de 1 x 107/ml. Si test complément dépendance, on peut utiliser une seconde solution contenant des cellules actives de HL-60 avec complément inactivés par la chaleur (complément peut-être être inactivée par incubation dans un bain-marie à > 55 ° C pendant au moins 30 min). - Après que 1 h culture bactérienne est complet (étape 4.4), diviser chaque échantillon (p. ex., 10 µL de chaque échantillon de 30 µL dans deux nouveaux puits) en puits dédoublés pour deux groupes (c.-à-d. utilisation seulement 20 µL de la co-culture 30 µL original pour tenir compte de l’erreur de pipettage) : un ensemble seront conjointement cultivé avec HL-60-complément et on comprendra seulement les bactéries. Ajouter 50 µL du mélange HL-60-complément (de l’étape 5.3) à chaque jeu expérimental de puits (délégué + HL-60) ; ajouter 50 µL de OBB seul dans les puits de bactéries seulement (déléguée -HL-60).
Remarque : Pour cet exemple, environ 800 CFU bactériennes est utilisés pour la co-culture initiale avec cellules HL-60 de 5 x 10550 µL. Si cette multiplicité d’infection est trop élevée ou trop basse, comme indiqué par le nombre de colonies final, ajuster la dilution initiale bactérienne plutôt que le nombre de cellules HL-60. - Secouer la plaque à 96 puits à 37 ° C pendant 1 h (pas de CO2).
6. l’échantillon électrodéposition et Incubation durant la nuit
- Diluer chaque puits 1:5 avec OBB, afin que chaque échantillon a un volume d’au moins 50 µL.
- Distribuer 50 µL de chaque échantillon directement sur une zone désignée d’une plaque de culture bactérienne, assurer un espacement adéquat entre les échantillons. Pour 15 x 100 mm2 ronds plats d’agar, échantillons de pipette environ 4 sur une plaque.
- Couvrir et laisser sécher pendant environ 15 min à température ambiante, les échantillons.
- Inverser les plaques et la culture du jour au lendemain à 30 ° C (pas de CO2). Alternativement, la culture des plaques dans des bocaux anaérobies pour vérifier si des conditions anoxiques affectent la croissance bactérienne ou de contrôle pour la morphologie.
- Après une culture, compter les colonies dans chaque zone désignée. Analyser des données en comparant le nombre de cellules vivantes dans chaque série pour le contrôle correspondant et/ou des échantillons qui ne reçoivent pas de co-culture de cellules HL-60 (l’indicatif de la survie des cellules de 100 %, 0 % de cellules mise à mort).
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Representative Results
Validation de la différenciation de la HL-60 doit être exécutée avant de commencer le OPKA. Ceci peut être accompli à l’aide de cytométrie de flux pour déterminer l’expression extracellulaire de CD11b, CD35, CD71 et l’annexin V (Figure 1). L’iodure de Propidium peut aussi servir comme un marqueur de viabilité. Après avoir été traités avec DMF pendant 3 jours, l’expression du CD35 devrait être augmentée (≥55 % de toutes les cellules) et expression du CD71 devrait être diminuée (≤ 20 % de toutes les cellules). Le pourcentage de l’annexin V + et cellules (PI +) l’iodure de propidium ensemble doit être < 35 % pour assurer suffisamment de viabilité cellulaire. Si ces pourcentages ne satisfont pas aux exigences minimales, les conditions de culture doivent être ajustées comme décrit dans l’explication.
Le nombre d’UFC obtenu à l’étape 6.5 permet de comparer la survie de la cellule bactérienne des différents groupes comparée au groupe témoin non traité (100 % la survie des cellules), comme illustré à la Figure 2. Par exemple, les comtes moyens obtenus à partir de puits qui a reçu aucun traitement, mais ont été conjointement cultivés avec HL-60 doivent être relativement proches en nombre vers les cellules qui ont reçu aucun traitement et aucune culture mixte de HL-60, qui serait révélateur de la survie des cellules de 100 % ou 0 % la mort cellulaire. Avec un traitement efficace, le nombre de colonies devrait être plus différent entre la co-culture HL-60 et aucune cellule HL-60 (Figure 2 et Figure 3). Grandes différences entre HL-60 et aucun ensemble de HL-60 sont révélateurs de la phagocytose plus efficace. Toutefois, le traitement peut réellement améliorer la croissance des cellules bactériennes dans le jeu qui n’est pas co cultivée avec cellules HL-60. A noter cette différence dans les échantillons traités et non traités. Si la dilution bactérienne n’est pas optimisé (étape 3.6) ou la croissance de la colonie n’est pas soigneusement observée après ensemencement (étape 6.5 ou voir Discussion), prolifération des colonies peut empêcher un comptage précis des colonies (Figure 4).
Figure 1 : Validation de la différenciation cellulaire par cytométrie en flux HL-60. Les cellules différenciées de HL-60 ont été récoltés, lavés et resuspendues dans 1 x 105 cellules/mL de PBS. Les cellules sont ensuite aliquotés dans 12 puits (100 µL/puits) dans une plaque à 96 puits. Les cellules ont été colorées puis avec fluorescent conjugués anti-CD35, anti-CD71, annexin V et l’iodure de propidium. Cellules incolores ou cellules colorées avec les anticorps fluorescent conjugués isotype ont été utilisés comme témoins. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Traitement Y améliore l’assassinat de HL-60-cellulaire de bactéries. S. pneumoniae échantillons ont été traités avec le traitement X (anticorps) ou traitement Y (enzyme). OPKA a été réalisée selon le protocole et CFU bactériennes ont été comptés en double exemplaire. Les échantillons qui n’étaient pas traités avec cellules HL-60 ont été utilisés comme contrôle (100 % la survie des cellules). Les pourcentages moyens d’UFC bactérienne dans les groupes de HL-60 traités par rapport aux groupes non-HL-60-traitées correspondants est indiqué. Barres représentent les écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : UFC bactérienne après OPKA et de la culture au jour le jour. Échantillons bactériens ont été traités et co cultivés sans (A) ou (B) HL-60 cellules pendant 1 h à 37 ° C. Des échantillons ont été dilués selon le protocole et cultivées sur gélose au sang de plaques pour la nuit à 30 ° C (pas de CO2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Surcroissance bactérienne CFU. Échantillons bactériens ont été traités et OPKA a été réalisée. Des échantillons ont été dilués et cultivées sur gélose au sang de plaques pour la nuit à 37 ° C (pas de CO2). Une évaluation précise du nombre de colonies ne peut être déterminée comme en témoigne la prolifération de colonies. 37 ° C (pas de CO2) conduit à la pullulation microbienne, la température d’incubation pour les futures plaques a été abaissé à 30 ° C (pas de CO2) pour maintenir la Dénombrabilité des colonies. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
OPKAs servir un rôle essentiel dans l’évaluation de médiation immunitaire d’anticorps induits par les vaccins6,8. La signification fondamentale de ce OPKA simplifiée est la capacité d’adaptation dans les conditions à tester (anticorps, traitements enzymatiques, etc..). En ce sens, bien que ce test peut être utilisé pour tester la contribution des opsonines (c.-à-d., anticorps) dans la phagocytose, également utilisable pour évaluer les moyens de surmonter les facteurs de virulence (c.-à-d., les polysaccharides capsulaires) qui inhibent normalement voies phagocytaires. Réduire au minimum le nombre d’étapes qui sont généralement utilisés dans un multiplex OPKA potentiellement minimise les risques d’erreurs techniques qui peuvent influer sur les résultats expérimentaux et réduit la quantité de dépannage et l’optimisation pour l’obtention de données utilisables. Comme ce protocole est adapté pour les modifications des conditions de traitement, il permet une grande polyvalence.
Pré établir le dosage par culture de HL-60 et de la création de stocks bactériennes est important afin d’éviter les étapes d’optimisation superflues lors de l’exécution de la OPKA. Temps doit être consacré pour vous assurer que tous les réactifs et types de cellules sont prêts et fonctionnel avant l’expérience est effectué. Ces étapes comprennent la lignée de cellules HL-60 dans la culture (environ deux semaines), valider que les concentrations spécifiques du DMF différencient efficacement les cellules HL-60 (environ une semaine) et l’établissement stock bactérienne sans contaminant et optimisée de multiplication dilutions (environ deux semaines).
A quelques pas de ce protocole sont essentiels pour l’obtention de colonies dénombrables et données adéquates. Ce protocole utilise des cellules HL-60 comme les phagocytes en raison de la facilité d’utilisation d’une lignée cellulaire humaine qui peut être maintenue en culture et différenciée avec relativement peu d’étapes. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) peuvent aussi être utilisés ; Toutefois, l’obtention de ces cellules et optimiser les conditions de leur utilisation peuvent être plus difficile. Les cellules HL-60 doivent être différenciées afin de fonctionner comme les phagocytes contre les bactéries. Pour vérifier la différenciation après le traitement de 3 jours avec DMF, cytométrie en flux devrait servir à tester pour l’expression de CD11b et CD35 sur la majorité des cellules avant tout OPKA est tentée, tel que discuté à l’étape 1.5. Viabilité cellulaire doit également être vérifiée (si possible avec l’annexine V et l’iodure de propidium). Si un grand nombre de cellules est mort, apoptotiques, ou indifférenciées tel qu’observé par cytométrie en flux, la différenciation de 3 jours avec 0,6 % DMF en milieu RPMI peut être modifié (0,4 % −0. 8 % DMF, temps de culture 2−6 jour) jusqu'à ce que les marqueurs de viabilité et de la différenciation des cellules sont points à améliorer. Cette différenciation doit être la première optimisation de la OPKA comme fonction de HL-60 est critique pour meurtre bactérienne efficace. Il est recommandé de valider la différenciation avant chaque expérience OPKA HL-60.
Le nombre d’UFC bactérienne (étape 3.6) initialement distribué dans la plaque à 96 puits (étape 4.2) est également essentiel : trop de cellules de distribution rendra difficile et imprécise de comptage (étape 6.5) et peut diminuer la mort cellulaire observée à partir de co-culture HL-60, alors que trop peu de cellules de distribution peut augmenter le montant de l’écart entre les doublons et peut ne pas montrer n’importe quel comptables colonies après la co-culture HL-60. Optimisant la dilution stock est donc essentielle et doit être testé avec le protocole complet, y compris la co-culture HL-60/complément.
L’importance du complément peut-être également être testé avec ce protocole en incluant deux séries d’échantillons : un complément lapin bébé actif et l’autre avec complément inactivés par la chaleur. HL-60 cellules doivent être co cultivés avec les deux ensembles, si un ensemble de bactéries seule serait toujours inclus comme une base de survie cellulaire de 100 %.
Pour certains sérotypes bactériens, la morphologie des colonies peut rendre cellule de comptage ou de visibilité problématique. Mucoïde sérotypes tels que type 3 Streptococcus pneumoniae, par exemple, peut facilement proliférer et réduire le nombre d’UFC. Cela peut s’avérer particulièrement problématique lors de l’essai de traitements qui influent sur la capsule, comme surcroissance pourrait être évitée dans le groupe traité mais en plus grand nombre de petites colonies serait compté. Pour éviter cette contradiction, contrôle de la croissance cellulaire est critique. Cultivant les colonies plaqués à 30 ° C pendant la nuit permettra probablement pour un contrôle amélioré de la croissance bactérienne et les plaques peuvent être enlevées lorsque toutes les colonies atteignent des tailles distinctes, calculable. En outre, différentes géloses peuvent servir à améliorer la visibilité des colonies individuelles. De cette façon, ce protocole est avantageux que de petits changements à optimiser les conditions peut donc être utilisés pour expliquer un certain nombre de souches bactériennes ou des diverses options de traitement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions m. Moon Nahm (Université de l’Alabama, Birmingham) pour son aide précieuse dans l’établissement de tests OPKA dans notre laboratoire. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé Grant 1R01AI123383-01 a 1 à FYA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
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