Summary
Questo test di uccisione anticorpli viene utilizzato per confrontare la capacità delle cellule fagocitiche immuni di rispondere e uccidere i batteri basati su diversi trattamenti e/o condizioni. Classicamente, questo test serve come il gold standard per valutare le funzioni effettrici degli anticorpi alzati contro un batterio come opsonina.
Abstract
Un aspetto chiave della risposta immunitaria a colonizzazione batterica dell'host è la fagocitosi. Un'analisi di uccisione di anticorpli (OPKA) è una procedura sperimentale in cui le cellule fagocitiche sono co-coltivate con unità batterica. Le cellule immunitarie verranno fagocitare e uccidere le colture batteriche in modo complemento-dipendente. L'efficienza dell'uccisione delle cellule immuno-mediata è dipendente da una serie di fattori e può essere utilizzato per determinare batterica come le diverse culture confrontare per quanto riguarda la resistenza alla morte cellulare. In questo modo, può essere valutata l'efficacia di potenziali terapie basate su immunitario contro ceppi batterici specifici e/o sierotipi. In questo protocollo, descriviamo un OPKA semplificata che utilizza condizioni di cultura di base e delle cellule di conteggio per determinare la vitalità cellulare batterica dopo co-coltura con condizioni di trattamento e le cellule immunitarie di HL-60. Questo metodo è stato utilizzato con successo con un numero di diversi sierotipi pneumococcici, capsulari e ceppi di acapsular e altre specie batteriche. I vantaggi di questo protocollo OPKA sono la sua semplicità, versatilità (come questo test non è limitato ai trattamenti di anticorpo come opsonine) e la minimizzazione del tempo e reagenti per valutare gruppi sperimentali di base.
Introduction
L'anticorpli uccidendo assay (OPKA) sono uno strumento critico per il collegamento di alterazioni nella struttura batterica o funzione alle successive modifiche nella risposta immunitaria e la funzione. Come tale, esso è frequente come analisi complementare per determinare il sistema immunitario l'efficacia di trattamenti anticorpali, vaccini candidati, ottimizzazione degli enzimi, ecc. Saggi in vivo sono necessari per determinare l'effettiva liquidazione o protezione in un modello di infezione batterica, il OPKA può essere utilizzato per valutare il contributo immune alla morte delle cellule batteriche componenti di base al massimo: batteri, cellule immunitarie e sperimentale trattamenti. Gli studi precedenti hanno dimostrato che la OPKAs può essere modificato e utilizzato per una varietà di batteri e sierotipi, tra cui1di Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Inoltre, queste analisi ottimizzate possono essere utilizzate per valutare i diversi trattamenti sperimentali, tra cui la possibilità di un enzima per rendere più accessibile ai trattamenti di4 e l'anticorpo di complemento-mediata di cellule immuni per migliorare il batterio opsonizzazione5. Classicamente, analisi di OPKA è stato utilizzato con successo nella ricerca clinica e di base impostazioni come un indicatore potente per la protezione indotta da anticorpi patogeni specifici6,7,8,9 .
Diversi tipi di cellule del sistema immunitario possono essere utilizzati per la valutazione dell'uccisione di anticorpli. Una popolazione fagocitica comunemente usato è la linea di cellule leucemiche umane HL-60. Questa linea cellulare può essere mantenuta come inattivato promielociti nella cultura; Tuttavia, possono essere differenziati in vari stati attivati via droga diversi trattamenti10,11. Trattamento di HL60 con N, N-dimetilformammide differenzia la linea cellulare in neutrofili attivati con forte attività fagocitica11. Mentre le cellule HL-60 sono state ottimizzate e sono frequentemente utilizzate per questi test di fagocitosi10, altri leucociti polimorfonucleari primari è utilizzabile come il braccio immune dell' esperimento12.
Inoltre, queste analisi possono essere semplificata13 o multiplex14 a guardare più ceppi resistenti agli antibiotici dei batteri da testare. Il metodo multiplex è stato reso più fattibile attraverso lo sviluppo di software che può contare in modo efficiente Colonia batterica formando unità (CFUs) al posto su una piastra di agar15. Qui, descriviamo un metodo semplificato utilizzando un ceppo batterico, cellule HL-60, complemento di coniglio bambino e piastre di agar sangue. Con questo metodo, i trattamenti multipli possono essere valutati rapidamente per affrontare questioni di ricerche specifiche su come può essere modulata la risposta immunitaria innata alle infezioni batteriche.
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Protocol
1. la cultura, la differenziazione e la convalida delle cellule HL-60
- Preparare terreni di coltura delle cellule HL-60 composto da 500 mL RPMI con L-Glutammina e 50ml inattivati siero bovino fetale. Non aggiungere antibiotici come questo può influenzare la differenziazione delle cellule HL-60.
- Per propagazione/manutenzione delle cellule HL-60, 5 x 106 cellule in 10 mL di terreni di coltura delle cellule HL-60 75 cm2 sfiato matracci a 37 ° C e 5% CO2. Passaggio cellule ogni 3 − 4 giorni per mantenere le concentrazioni di cellulare ottimale.
Nota: Concentrazione delle cellule non deve superare 5 x 106/ml. - Generare lavoro scorte delle cellule HL-60 aliquotare circa 1 x 106 cellule/mL in terreni di coltura HL60 con 10% di dimetilsolfossido (DMSO) in 1 mL provette criogeniche.
Nota: Scorte di lavoro possono essere conservate a-80 ° C. Lo stock master deve essere conservato a-120 ° C. - Differenziare cellule HL-60 di coltura 1.5 x 107 cellule in 15 mL di terreno di coltura delle cellule HL-60 con 0,6% N, N-dimetilformammide (DMF) a 37 ° C e 5% di CO2 in boccette2 75cm con tappo filtro sterile per 3 giorni prima del OPKA.
- Verificare che le cellule HL-60 sono state differenziate con successo e sono idonee all'uso nell'analisi della OPKA di test di vitalità e gli indicatori di superficie delle cellule secondo stabilito flusso cytometry protocolli16,17, 18,19. Dopo la differenziazione, raccogliere le cellule HL-60 e macchia circa 1 x 104 cellule con anticorpi/macchie coniugato fluorescente per CD71, CD35, Annessina V e ioduro di propidio.
Nota: Le cellule differenziate dovrebbero essere ≥ 65% vitali, ≥ 55% CD35+e ≤ 20% CD71 stabilito+ come determinato tramite convalida protocolli14 (Figura 1).
2. preparazione del buffer OPKA e reagenti
- Preparare 50 mL di tampone sterile opsonizzazione B (OBB) mescolando 42,5 mL di 1x sterile tampone fosfato salino (PBS) con Ca2 +/Mg2 +, 5 mL di siero bovino fetale inattivati e 2,5 mL di 0,1% gelatina sterile. Conservare a 4 ° C.
- Ottenere il coniglio del bambino complemento e conservare a-80 ° C.
- Ottenere o preparare piastre di coltura batterica (cioè, piastre di agar sangue di montone al 5% 15 x 100 mm2 ).
3. preparazione dei campioni Stock batterici
- Ottenere uno stock di ceppo batterico da testare.
Nota: Per questo protocollo, sierotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente fornito da dottor Moon Nahm) viene utilizzato. - Crescere il ceppo batterico in un brodo appropriato (cioè, Todd-Hewitt brodo + 0,5% di Estratto di lievito per questo ceppo WU2) per circa 2−4 h a 37 ° C.
Nota: La densità ottica a 600 nm (OD600) della cultura deve essere compreso tra 0,6 e 0,8. - A pellet i batteri mediante centrifugazione a 6.000 x g per 2 min e risospendere le cellule in 10−30 mL di glicerolo al 15% nel brodo appropriato. Aliquotare la coltura batterica (500 µ l in ogni aliquota) in provette sterili da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.
- Disgelo fuori un flaconcino di stock batterici in bagnomaria a 37 ° C. Agglomerare le cellule batteriche e risospendere in 500 µ l di OBB in condizioni sterili.
- Preparare diluizioni differenti dello stock batterici in OBB (vale a dire, 10 µ l di Nessuna diluizione, 10 µ l di 01:10, 10 µ l di 1: 100, ecc.). Eseguire l'analisi OPKA (sezioni 4 – 6, tra cui co-cultura HL-60/complemento) come descritto di seguito utilizzando varie diluizioni dello stock batterica non trattata. Coltura le piastre durante la notte a 30 ° C (senza CO2).
Nota: La temperatura di 30 ° C è specifica per WU2 prevenire la crescita eccessiva; altri ceppi/sierotipi possono crescere in modo ottimale a 37 ° C. - Contare le colonie per ciascuna diluizione delle azione batterica non trattata co-coltivate con complemento e cellule HL-60. Determinare quale diluizione di batteri produce il numero ottimale di colonie numerabili (circa 80−120 CFUs per batteri non trattati co-coltivati con cellule HL-60). Nota questa diluizione per futuri OPKAs che coinvolgono questo stock batterico.
4. cultura e trattamento batterico
- Scongelare una provetta di brodo batterico preparata al punto 3.3. A pellet batteri (6.000 x g per 2 min) e risospendere il pellet cellulare in OBB a una diluizione ottimale come determinato al punto 3.6.
- Pipettare 10 µ l di sedimento diluizione batterica per pozzetto in una piastra di coltura di cella di 96 pozzetti di turno-inferiore.
- Aggiungere 20 µ l di trattamento appropriato dell'anticorpo o droga ad ogni pozzetto sperimentale in duplice copia.
Nota: In questo protocollo, un sierotipo specifico anticorpo generato nei topi è aggiunto come trattamento X e un enzima di idrolasi del glicoside conosciuto a degradare la capsula del polisaccaride 3 sierotipo è aggiunto come trattamento Y (Figura 2)4,20. Per pozzetti di controllo, utilizzare 1X PBS o OBB, a seconda del buffer utilizzato per pozzi di trattamento. - Agitare la piastra campione a circa 90 rpm per 1 h a temperatura ambiente. Regolare queste Condizioni a seconda della temperatura ottima o agitazione di trattamenti in fase di test.
5. HL-60 Co-coltura batterica
- Preparare le cellule HL-60 raccogliendo le cellule HL-60 differenziati che sono trattate con DMF tre giorni prima (Vedi punto 1.4) in provette coniche da 15 mL. Appallottolare le celle (500 x g, 3 min), scartare il surnatante e lavare almeno 10 ml di PBS 1X.
- Agglomerare le cellule lavate (500 x g, 3 min), scartare il surnatante e risospendere le cellule in OBB (iniziare con 1 mL OBB e regolare per una concentrazione finale di 1 x 107/ml dopo il conteggio delle cellule).
- Aggiungere complemento di coniglio bambino (siero di coniglio bambino sterile, non diluito, età 3 − 4 settimane) in un volume finale di 1:5.
Nota: La concentrazione finale della miscela HL-60-complemento dovrebbe essere 1 x 107/ml. Se il test dipendenza di complemento, una seconda soluzione contenente cellule HL-60 attive con complemento inattivati al calore può essere utilizzata (complemento può essere inattivato incubando in un bagno di acqua a > 55 ° C per almeno 30 min). - Dopo coltura batterica 1h è completa (punto 4.4), dividere ogni campione (vale a dire, 10 µ l di ogni 30 µ l di campione fino a due nuovi pozzi) in pozzetti duplicati per i due gruppi (cioè, uso solo 20 µ l della co-cultura 30 µ l originale per tenere conto per pipettaggio errore) : un set verranno co-coltivato con HL-60-complemento e uno includerà solo i batteri. Aggiungere 50 µ l della miscela HL-60-complemento (dal punto 5.3) per ogni gruppo sperimentale di pozzi (delegati + HL-60); aggiungere 50 µ l di OBB da solo ai pozzetti di batteri solo (delegati -HL-60).
Nota: In questo esempio, vengono utilizzati circa 800 CFUs batterica per la co-coltura con cellule HL-60 5 x 10550 µ l. Se questa molteplicità di infezione è troppo alto o troppo basso, come indicato da un numero finale di Colonia, regolare la diluizione batterica iniziale in contrasto con il conteggio delle cellule HL-60. - Agitare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C per 1 h (non di CO2).
6. campione placcatura e incubazione Overnight
- Diluire ciascun pozzetto 1:5 con OBB, in modo che ogni campione ha un volume di almeno 50 µ l.
- Pipettare 50 µ l di ciascun campione direttamente su un'area di una piastra di coltura batterica, garantendo un'adeguata spaziatura tra campioni. Per 15 x 100 millimetri rotonda2 piastre di agar, campioni di dispensare circa 4 su un piatto.
- Coprire e lasciar campioni ad asciugare per circa 15 min a temperatura ambiente.
- Capovolgere le piastre e coltura durante la notte a 30 ° C (senza CO2). In alternativa, piastre in vasetti anaerobiche per verificare se le condizioni anossiche influenzano la crescita batterica o a controllo per morfologia della coltura.
- Dopo una notte cultura, contare le colonie in ogni area campione designato. Analizzare dati confrontando il numero di cellule vive in ogni set di controllo corrispondente e/o campioni che non ricevono co-coltura delle cellule HL-60 (indicativo di sopravvivenza delle cellule di 100%, 0% delle cellule di uccisione).
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Representative Results
Convalida di differenziazione di HL-60 deve essere eseguita prima di iniziare la OPKA. Questa operazione può essere eseguita mediante citometria a flusso per determinare l'espressione extracellulare di CD11b, CD35, CD71 e Annessina V (Figura 1). Ioduro di propidio può essere utilizzato anche come un indicatore di redditività. Dopo essere stati trattati con DMF per 3 giorni, dovrebbe essere aumentata espressione di CD35 (≥ 55% di tutte le cellule) e deve essere diminuita espressione di CD71 (≤ 20% di tutte le cellule). La percentuale di annessina V + e propidio ioduro (PI +) cellule insieme dovrebbe essere < 35% per garantire sufficiente vitalità cellulare. Se queste percentuali non soddisfano i requisiti minimi, le condizioni di coltura devono essere regolate come descritto nella discussione.
Il numero di CFUs ottenuto dal passaggio 6.5 consente di confrontare la sopravvivenza della cellula batterica dei gruppi differenti rispetto al gruppo di controllo non trattato (100% sopravvivenza), come mostrato nella Figura 2. Ad esempio, i conteggi medio ottenuti da pozzi che non ha ricevuto trattamento ma erano co-coltivate con HL-60 dovrebbero essere relativamente vicini nel numero di cellule che hanno ricevuto alcun trattamento e non co-coltura di HL-60, che sarebbe indicativo di sopravvivenza 100% delle cellule, o 0 % morte delle cellule. Con un trattamento efficace, il numero di colonie dovrebbe essere più diverso tra co-cultura HL-60 e nessun cellule HL-60 (Figura 2 e Figura 3). Più grandi differenze tra HL-60 e nessun set di HL-60 sono indicative della fagocitosi più efficiente. Tuttavia, il trattamento può realmente migliorare la crescita delle cellule batteriche nel set che non è co-coltivate con cellule HL-60. Dovrebbe essere notata questa differenza nei campioni trattati e non trattati. Se la diluizione batterica non è ottimizzato (punto 3.6) o la crescita di Colonia non è attentamente osservata dopo il placcaggio (passo 6.5 o Vedi discussione), può impedire la crescita eccessiva delle colonie accurato conteggio delle colonie (Figura 4).
Figura 1 : Convalida di differenziazione delle cellule HL-60 tramite flusso cytometry. Differenziato cellule HL-60 sono stati raccolti, lavate e risospesi in 1 x 105 cellule/mL di PBS. Le cellule sono state poi aliquotate in 12 pozzetti (100 µ l/pozzetto) in una piastra a 96 pozzetti. Le cellule poi sono state macchiate con fluorescente coniugati anti-CD35, anti-CD71, Annessina V e ioduro di propidio. Le celle non macchiate o macchiate con gli anticorpi dell'isotipo fluorescente coniugati sono stati utilizzati come controlli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Trattamento Y migliora l'uccisione di HL-60-mediata delle cellule dei batteri. Campioni di S. pneumoniae sono stati trattati con trattamento X (anticorpo) o trattamento Y (enzima). OPKA è stato effettuato secondo il protocollo e CFUs batterica sono stati contati in duplice copia. Campioni che non sono stati trattati con cellule HL-60 sono stati utilizzati come controllo (100% sopravvivenza delle cellule). Sono indicate le percentuali medie di CFUs batterica nei gruppi HL-60 trattate rispetto ai corrispondenti gruppi non-HL-60-trattati. Barre rappresentano errore standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : CFUs batterica dopo OPKA e cultura durante la notte. Batterici campioni sono stati trattati e co-coltivati senza (A) o con le cellule HL-60 (B) per 1 h a 37 ° C. I campioni sono stati diluiti secondo il protocollo e placcati su agar sangue piastre durante la notte a 30 ° C (senza CO2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Crescita eccessiva batterica CFU. Batterici campioni sono stati trattati e OPKA è stato effettuato. I campioni sono stati diluiti e placcati su agar sangue piastre durante la notte a 37 ° C (senza CO2). Valutazione accurata dei numeri di Colonia non può essere determinato come crescita eccessiva delle colonie è mostrato. Come 37 ° C (senza CO2) ha condotto alla crescita eccessiva batterica, la temperatura di incubazione per piastre di futuri è stato abbassato a 30 ° C (senza CO2) per mantenere numerabilità delle colonie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
OPKAs servire ruoli essenziali nella valutazione risposte immunitarie anticorpo mediata indotte dalla vaccinazione6,8. Il significato principale di questo OPKA semplificata è l'adattabilità nelle condizioni per essere testati (cioè, anticorpi, enzimi trattamenti, ecc.). In questo senso, mentre questo test può essere utilizzato per verificare il contributo di opsonine (cioè anticorpi) nella fagocitosi, può anche essere utilizzato per valutare il modo di superare i fattori di virulenza (cioè, polisaccaridi capsulari) che normalmente inibiscono vie fagocitiche. Riducendo al minimo il numero di passi che vengono in genere utilizzati in un multiplex OPKA potenzialmente riduce al minimo le possibilità di errori tecnici che possono influenzare i risultati sperimentali e riduce la quantità di risoluzione dei problemi e ottimizzazione per l'ottenimento di dati utilizzabili. Come questo protocollo è adatta per le variazioni alle condizioni di trattamento, permette una grande quantità di versatilità.
Pre-stabilire il dosaggio attraverso la cultura di HL-60 e costituzione di scorte batteriche è importante per prevenire le fasi di ottimizzazione estranei quando si esegue il OPKA. Tempo deve essere dedicato a assicurandosi che tutti i reagenti e i tipi delle cellule sono pronti e funzionale prima dell'esperimento viene eseguita. Tali passaggi includono la linea cellulare HL-60 nella cultura (circa due settimane), la convalida che concentrazioni specifiche di DMF differenziano efficacemente le cellule HL-60 (circa una settimana) e che istituisce stock batterici contaminanti e ottimizzato di moltiplicazione diluizioni (circa due settimane).
Alcuni passaggi del presente protocollo sono fondamentali per l'ottenimento di colonie numerabili e dati adeguati. Questo protocollo utilizza cellule HL-60 come fagociti a causa della facilità di utilizzo di una linea cellulare umana che possa essere mantenuta in coltura e differenziata con relativamente pochi passi. Cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMC) possono anche essere utilizzate; Tuttavia, ottenere queste cellule e ottimizzando le condizioni per il loro uso può essere più difficile. Le cellule HL-60 devono essere differenziate al fine di funzionare come fagociti contro i batteri. Per verificare la differenziazione dopo il trattamento di 3 giorni con DMF, citometria a flusso dovrebbe essere utilizzato per verificare l'espressione di CD11b e CD35 su una maggioranza delle cellule prima che venga tentata ogni OPKA, come illustrato nel passaggio 1.5. Vitalità cellulare dovrebbe anche essere verificata (preferibilmente con Annessina V e ioduro di propidio). Se un numero elevato di celle è morto, apoptotico, o indifferenziato come osservato con citometria a flusso, la differenziazione di 3 giorni con 0,6% DMF nei media RPMI può essere modificato (0,4% − 0.8 % DMF, tempo della coltura di 2−6 giorno) fino a quando gli indicatori di redditività e la differenziazione delle cellule sono migliorata. Questa differenziazione dovrebbe essere la prima ottimizzazione della OPKA come funzione di HL-60 è critica per uccisione batterica efficace. Si consiglia di convalidare la differenziazione di HL-60 prima di ogni esperimento OPKA.
Anche il numero di CFUs batterica (punto 3.6) inizialmente erogato nella piastra 96 pozzetti (passo 4.2) è critico: erogazione troppe cellule renderà difficile e imprecisa di conteggio (passo 6.5) e può diminuire la morte delle cellule osservata da HL-60 co-cultura, considerando che erogazione troppo poche cellule può aumentare la quantità di deviazione tra duplicati e potrebbe non mostrare alcun colonie numerabili dopo co-coltura di HL-60. Ottimizzando la diluizione stock, è molto importante e deve essere testato con il protocollo completo, compreso HL-60/complemento co-cultura.
L'importanza del complemento può essere testata anche con questo protocollo includendo due serie di campioni: uno con complemento di coniglio bambino attivo e uno con complemento inattivati al calore. Le cellule HL-60 dovrebbero essere co-coltivate con entrambi i set, anche se un insieme solo batteri ancora dovrebbe essere incluso come una previsione di sopravvivenza del 100% delle cellule.
Per alcuni sierotipi batterici, la morfologia delle colonie renda conta cellulare o visibilità problematico. Mucoide sierotipi come tipo 3 Streptococcus pneumoniae, per esempio, può facilmente invadere e ridurre i conteggi CFU. Ciò può rivelarsi particolarmente problematico quando test trattamenti che interessano la capsula, come crescita eccessiva sarebbe impedito nel gruppo curato, ma sarà contata una maggior numero di colonie di minori dimensioni. Per evitare questa discrepanza, controllo della crescita delle cellule è fondamentale. Coltura le colonie placcate a 30 ° C durante la notte probabilmente permetterà per migliore controllo della crescita batterica e le piastre possono essere rimossi quando tutte le colonie raggiungono dimensioni distinguibili, numerabile. Inoltre, piastre di agar diversi possono essere utilizzati per migliorare la visibilità di diverse colonie. In questo modo, il presente protocollo è vantaggioso come piccole modifiche per ottimizzare le condizioni così può essere utilizzate per rappresentare un certo numero di ceppi batterici o varie opzioni di trattamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il dottor Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) per la sua preziosa assistenza nella creazione di saggi OPKA nel nostro laboratorio. Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute Grant 1R01AI123383-01A1 a FYA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
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