Summary
Denne opsonophagocytic drab analysen bruges til at sammenligne evne til fagocyterende immunceller til at reagere på og dræbe bakterier baseret på forskellige behandlinger og/eller betingelser. Klassisk, fungerer dette assay som den gyldne standard for vurdering af effektor funktion af antistoffer, der er rejst mod en bakterie som opsonin.
Abstract
Et centralt aspekt af immunrespons på bakteriel kolonisering af værten er fagocytose. En opsonophagocytic drab assay (OPKA) er en eksperimentel procedure hvor fagocyterende celler er co kulturperler med bakteriel enheder. Immunceller vil phagocytosis og dræbe de bakterielle kulturer på en måde, komplement-afhængig. Effektiviteten af immun-medieret celle drab er afhængig af en række faktorer og kan bruges til at bestemme, hvordan forskellige bakterielle kulturer sammenligne med hensyn til modstand til celledød. På denne måde, kan effekten af potentielle immun-baserede therapeutics vurderes mod specifikke bakteriestammer og/eller serotyper. I denne protokol beskriver vi en forenklet OPKA, der udnytter grundlæggende dyrkningsbetingelserne og celle tælle Bestem bakteriel cellernes levedygtighed efter fælles kultur med behandling betingelser og HL-60 immunceller. Denne metode har udnyttet med held med en række forskellige pneumokok serotyper, kapsulær, og acapsular stammer og andre bakteriearter. Fordelene ved denne OPKA protokol er dets enkelhed, alsidighed (som denne analyse ikke er begrænset til antistof behandlinger som opsonins), og minimering af tid og reagenser til at vurdere grundlæggende eksperimentelle grupper.
Introduction
Opsonophagocytic dræbe assay (OPKA) er et kritisk værktøj for forbinder ændringer i bakteriel struktur eller funktion til efterfølgende ændringer i immunrespons og funktion. Som sådan, er det ofte brugt som en supplerende analyse til at bestemme immun-baserede effekten af antistof behandlinger, vaccine kandidater og enzym optimering. Mens in vivo assays er nødvendigt at fastlægge effektive clearance eller beskyttelse i en bakteriel infektion model, OPKA kan bruges til at vurdere immun bidrag til bakteriel celledød på det mest grundlæggende komponenter: bakterier, immunceller, og eksperimenterende behandlinger. Tidligere undersøgelser har vist, at OPKAs kan ændres og anvendes til en bred vifte af bakterier og serotyper, herunder Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Desuden, disse optimeret assays kan bruges til at vurdere forskellige eksperimentelle behandlinger, herunder et enzym evne til at gøre bakterien mere tilgængelige for komplement-medieret immun celler4 og antistof behandlinger til at forbedre opsonization5. Klassisk, OPKA assay held har været anvendt i grundforskning og klinisk forskning indstillinger som en stærk indikator for beskyttelse induceret af patogen-specifikke antistoffer6,7,8,9 .
Forskellige typer af immunceller kan anvendes til vurdering af opsonophagocytic drab. Et almindeligt anvendte fagocyterende befolkning er HL-60 menneskelige leukemic cellelinie. Denne cellelinje kan holdes som inaktiverede promyelocytes i kultur; de kan dog opdeles i forskellige aktiveret stater via forskellige stof behandlinger10,11. Behandling af HL60 med N, N-dimethylformamid adskiller linjen celle i aktiverede neutrofiler med stærk Fagocytisk aktivitet11. Mens HL-60 celler er blevet optimeret og anvendes ofte til disse fagocytose assays10, kan andre primære polymorfnukleære leukocytter bruges som eksperiment12immun arm.
Derudover disse assays kan være forenklet13 eller multipleksede14 at se på flere antibiotika-resistente stammer af bakterier til at blive testet. Metoden multipleksede er gjort mere realistisk gennem udvikling af software, der effektivt kan tælle bakteriel kolonidannende enheder (CFUs) pr. spot på en agar plade15. Her, beskriver vi en strømlinet metode ved hjælp af en bakteriel stamme, HL-60 celler, baby kanin supplement og blod agar plader. Med denne metode kan flere behandlinger vurderes hurtigt for at løse specifikke forskningsspørgsmål om hvordan den medfødte immun reaktion på bakteriel infektion kan moduleres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur, differentiering og validering af HL-60 celler
- Forberede HL-60 celle Kulturmedier består af 500 mL RPMI med L-glutamin og 50 mL varme-inaktiverede føtal bovint serum. Må ikke tilsættes antibiotika, da dette kan påvirke differentiering af HL-60 celler.
- For formering/vedligeholdelse af HL-60 celler, kultur 5 x 106 celler i 10 mL af HL-60 celle kultur medier i 75 cm2 udluftet kolber på 37 ° C og 5% CO2. Passage celler hver 3−4 dage for at opretholde optimale celle koncentrationer.
Bemærk: Celle koncentration bør ikke overstige 5 x 106/mL. - Generere arbejder bestande af HL-60 celler ved aliquoting ca 1 x 106 celler/mL i HL60 medier med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) i 1 mL kryogene rør.
Bemærk: Der arbejder bestande kan opbevares ved-80 ° C. Master bestanden bør opbevares ved-120 ° C. - Differentiere HL-60 celler af dyrkningsbaserede 1.5 x 107 celler i 15 mL HL-60 celle kultur medier med 0,6% N, N-dimethylformamid (DMF) ved 37 ° C og 5% CO2 i sterile filter-udjævnede 75 cm2 flasker i 3 dage før OPKA.
- Validere at HL-60 celler har været succesfuldt differentieret og er egnet til brug i OPKA assay ved at teste levedygtighed og celle celleoverflademarkører efter etablerede flow flowcytometri protokoller16,17, 18,19. Efter differentiering, høste HL-60 celler og plet ca 1 x 104 celler med fluorescently-konjugerede antistoffer/pletter for CD71, CD35, annexin V og propidium Iodid.
Bemærk: Differentierede celler bør være ≥65% levedygtige, ≥55% CD35+, og ≤20% CD71+ som bestemmes gennem etableret validering protokoller14 (figur 1).
2. forberedelse af OPKA buffere og reagenser
- Forberede 50 mL sterilt opsonization buffer B (OBB) ved at blande 42,5 mL sterilt 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med Ca2 +/Mg2 +5 mL af varme-inaktiverede føtal bovint serum og 2,5 mL af 0,1% sterilt gelatine. Opbevares ved 4 ° C.
- Få baby kanin supplement og opbevares ved-80 ° C.
- Opnå eller forberede bakteriekulturen plader (dvs. 15 x 100 mm2 5% får blod agar plader).
3. forberedelse af bakteriel Stock prøver
- Opnå en bestand af bakteriel stammen eller stammerne skal testes.
Bemærk: For denne protokol, serotype 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generøst leveret af Dr. Moon Nahm) bruges. - Vokse bakteriel stammen i en passende bouillon (dvs., Todd-Hewitt bouillon + 0,5% gærekstrakt for denne WU2 stamme) til ca 2−4 timer ved 37 ° C.
Bemærk: Den optiske tæthed på 600 nm (OD600) af kulturen bør være mellem 0,6 og 0,8. - Pellet bakterier ved centrifugering ved 6.000 x g i 2 min og resuspend celler i 10−30 mL 15% glycerol i passende bouillon. Alikvot bakteriekulturen (500 µL pr. alikvot) i sterile 1,5 mL centrifugeglas, og opbevares ved-80 ° C.
- Tø et hætteglas med bakteriel lager i et 37 ° C vandbad. Pellet de bakterieceller og resuspend i 500 µL af OBB under sterile forhold.
- Forberede forskellige fortyndinger af bakteriel bestanden i OBB (dvs. 10 µL af ingen fortynding, 10 µL af 1:10, 10 µL af 1: 100, osv.). Udføre OPKA assay (afsnit 4-6, herunder HL-60/supplement Co kultur), som beskrevet nedenfor ved hjælp af forskellige fortyndinger af ubehandlet bakteriel bestanden. Kultur plader natten over ved 30 ° C (CO2).
Bemærk: Temperatur 30 ° C er specifikke for WU2 at forhindre overvækst; andre stammer/serotyper kan vokse optimalt ved 37 ° C. - Kolonierne for hver fortynding af ubehandlet bakteriel stock Co kulturperler med HL-60 celler og supplement. Afgøre, hvilke fortynding af bakterier giver det optimale antal tællelig kolonier (ca 80−120 CFUs for ubehandlet bakterier Co kulturperler med HL-60 celler). Bemærk Denne fortynding for fremtidige OPKAs involverer bakteriel bestand.
4. Bakteriers behandling og kultur
- Tø en tube af bakteriel lager parat i trin 3.3. Pellet bakterier (6.000 x g i 2 min.) og resuspend celle pellet i OBB på optimal fortynding som fastsat i trin 3.6.
- Tilsæt 10 µL af resuspenderede bakteriel fortynding pr. brønd i en runde-bunden 96-brønd celle kultur plade.
- Tilsæt 20 µL af passende antistof eller stofmisbrug behandling til hver eksperimentelle brønd i to eksemplarer.
Bemærk: I denne protokol, en serotype-specifikke antistof genereret i mus er tilføjet som behandling X og en glycosid hydrolase enzym kendt at forringe serotype 3 polysaccharid kapsel er tilføjet som behandling Y (figur 2)4,20. For kontrolhullerne, brug 1 x PBS eller OBB, afhængigt af den buffer, der bruges til behandling brønde. - Ryst prøve plade på ca 90 rpm i 1 time ved stuetemperatur. Justere disse betingelser, afhængigt af den optimale temperatur eller ryster betingelser af de behandlinger, der testes.
5. HL-60 Co bakteriekulturen
- Forbered HL-60 celler ved høst HL-60 differentierede celler, der er behandlet med DMF tre dage før (Se trin 1.4) i 15 mL konisk rør. Sammenpresse cellerne (500 x g, 3 min), supernatanten fjernes, og vask med mindst 10 mL 1 x PBS.
- Pellet vasket cellerne (500 x g, 3 min), supernatanten fjernes, og resuspend celler i OBB (start med 1 mL OBB og justere for en endelig koncentration på 1 x 107/mL efter celle tælle).
- Tilføje baby kanin supplement (steril, ufortyndet baby kaninserum, alder 3−4 uger) i en 1:5 endelige rumfang.
Bemærk: Den endelige koncentration af HL-60-supplement blandingen bør være 1 x 107/mL. Hvis test supplement afhængighed, en anden løsning, der indeholder aktive HL-60 celler med varme-inaktiverede supplement kan anvendes (supplement kan blive inaktiveret ved inkubering i et vandbad på > 55 ° C i mindst 30 min). - Efter 1 time bakteriekulturen er komplet (trin 4.4), opdele hver prøve (dvs. 10 µL af hver 30 µL prøve godt ind i to nye brønde) i dublerede brønde for to grupper (dvs. Brug kun 20 µL af de oprindelige 30 µL Co kultur for at tage højde for pipettering fejl) : ét sæt vil være co kulturperler med HL-60-supplement og en vil indeholde bakterier kun. Tilsæt 50 µL af HL-60-supplement blandingen (fra trin 5.3) til hver eksperimentelle sæt af brønde (delegerede + HL-60); tilføje 50 µL af OBB alene brønde bakterier kun (delegeret -HL-60).
Bemærk: I dette eksempel bruges ca 800 bakteriel CFUs for den oprindelige fælles kultur med 5 x 105/50 µL HL-60 celler. Hvis denne mangfoldighed af infektion er for højt eller for lavt, som det fremgår af sidste koloni tal, justere den indledende bakterielle fortynding i stedet for HL-60 celletal. - Ryste den 96-brønd plade ved 37 ° C i 1 time (CO2).
6. prøve Plating og natten inkubation
- Fortynd hver godt 1:5 med OBB, således at hver prøve har et rumfang på mindst 50 µL.
- Tilsæt 50 µL af hver prøve direkte på et afgrænset område af en bakteriekultur plade, sikre tilstrækkelig afstand mellem prøver. 15 x 100 mm2 runde agar plader, afpipetteres ca 4 prøver på en tallerken.
- Cover og lad prøver at tørre i ca. 15 min. ved stuetemperatur.
- Invertere plader og kultur natten over ved 30 ° C (CO2). Alternativt, kultur plader i anaerobe krukker til at teste, om iltfattige forhold påvirker den bakterievækst eller til kontrol for morfologi.
- Kolonierne i hver udpeget eksempelområde efter natten kultur. Analysere data ved at sammenligne antallet af levende celler i hvert sæt til den tilsvarende kontrol og/eller prøver, der ikke modtager HL-60 cellekultur Co (vejledende af 100% celle overlevelse, 0% celle drab).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validering af HL-60 differentiering bør udføres før du starter OPKA. Dette kan opnås ved hjælp af flowcytometri til at bestemme den ekstracellulære udtryk for CD11b, CD35, CD71 og annexin V (figur 1). Propidium Iodid kan også bruges som levedygtighed markør. Efter behandling med DMF for 3 dage, forhøjes udtryk for CD35 (≥55% af alle celler) og udtryk for CD71 bør være faldet (≤20% af alle celler). Procentdelen af annexin V + og propidium Iodid (PI +) celler sammen bør være < 35% at sikre tilstrækkelig cellernes levedygtighed. Hvis disse procentsatser ikke opfylder mindstekravene, justeres dyrkningsbetingelserne som beskrevet i diskussionen.
Antallet af CFUs fremstillet af skridt 6,5 kan bruges til at sammenligne den bakterielle celle overlevelse af forskellige grupper i forhold til den ubehandlede kontrolgruppe (100% celle overlevelse) som vist i figur 2. For eksempel, bør de gennemsnitlige tæller fremstillet af brønde, der modtog ingen behandling, men blev co kulturperler med HL-60 være relativt tæt på antallet til de celler, der modtog ingen behandling og ingen fælles kultur af HL-60, hvilket ville være et tegn på 100% celle overlevelse, eller 0 % celledød. Med en effektiv behandling bør antallet af kolonier flere forskellige mellem HL-60 Co kultur og ingen HL-60 celler (figur 2 og figur 3). Større forskelle mellem HL-60 og ingen HL-60 sæt er vejledende for mere effektiv fagocytose. Behandlingen kan dog rent faktisk at forbedre bakteriel cellevækst i sættet, der ikke er co kulturperler med HL-60 celler. Denne forskel i behandlede og ubehandlede prøver skal bemærkes. Hvis den bakterielle fortynding ikke er optimeret (trin 3.6) eller koloni væksten ikke er omhyggeligt overholdt efter plating (skridt 6,5 eller se diskussion), overvækst af kolonierne kan forhindre korrekt optælling af kolonier (figur 4).
Figur 1 : Validering af HL-60 Celledifferentiering via flowcytometri. Differentierede HL-60 celler blev høstet, vasket og genopslemmes i 1 x 105 celler/mL PBS. Celler blev derefter aliquoted til 12 brønde (100 µL/brønd) i en 96-brønd plade. Celler blev derefter farves med fluorescently konjugerede anti-CD35, anti-CD71, annexin V og propidium Iodid. Unstained celler eller celler farves med fluorescently konjugeret isotype antistoffer blev brugt som kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Behandling Y forbedrer HL-60-medieret celle drab af bakterier. S. pneumoniae prøver blev behandlet med behandling X (antistof) eller behandling Y (enzym). OPKA blev udført efter protokol og bakteriel CFUs blev talt i to eksemplarer. Prøver, der ikke blev behandlet med HL-60 celler blev brugt som en kontrol (100% celle overlevelse). Vist er den gennemsnitlige procentdel af bakteriel CFUs i HL-60 behandlede grupper i forhold til de tilsvarende ikke-HL-60-behandlede grupper. Søjler repræsenterer standardfejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Bakteriel CFUs efter OPKA og overnight kultur. Bakteriel prøver blev behandlet og co kulturperler uden (A) eller (B) HL-60 celler i 1 timer ved 37 ° C. Prøver var fortyndes efter protokol og belagt på blod agar plader natten over ved 30 ° C (CO2). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Bakteriel CFU overvækst. Bakteriel prøver blev behandlet og OPKA blev udført. Prøverne blev fortyndet og belagt på blod agar plader natten over ved 37 ° C (CO2). Præcis vurdering af kolonien tal ikke kan bestemmes som overvækst af kolonier er vist. Da 37 ° C (CO2) førte til bakteriel overvækst, inkubation temperatur for fremtidige plader blev sænket til 30 ° C (CO2) at opretholde countability af kolonierne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OPKAs tjener væsentlige roller i vurderingen af antistof medieret immunrespons induceret af vaccinationer6,8. Den centrale betydning af denne forenklede OPKA er tilpasningsevne i betingelserne, der skal testes (dvs. antistoffer, enzym behandlinger, osv.). I denne forstand, mens dette assay kan bruges til at teste bidrag af opsonins (dvs. antistoffer) i fagocytose, kan det også bruges til at vurdere måder at overvinde virulens faktorer (dvs. kapsulær polysakkarider), som normalt hæmmer fagocyterende veje. Minimere antallet af trin, der typisk bruges i en multiplex OPKA potentielt minimerer mulighederne for tekniske fejl, der kan påvirke de eksperimentelle resultater og reducerer mængden af fejlfinding og optimering for at opnå brugbare data. Da denne protokol er velegnet til variationer til behandling betingelser, det giver mulighed for en stor alsidighed.
Før etablering af assay gennem kultur af HL-60 og etablering af bakteriel bestande er vigtigt at forhindre uvedkommende optimering trin, når du udfører OPKA. Tid skal være dedikeret til at gøre sikker på, at alle reagenser og celletyper er klar og funktionel før forsøget udføres. Disse skridt omfatter formerings HL-60 cellelinie i kultur (omkring to uger), validerer, at bestemte koncentrationer af DMF effektivt differentiere HL-60 celler (omkring en uge), og etablering af uforurenede og optimeret bakteriel lager fortyndinger (omkring to uger).
Nogle trin i denne protokol er kritisk for opnåelse af tællelig kolonier og tilstrækkelige data. Denne protokol bruger HL-60 celler som fagocytter på grund af lethed, hvormed ved hjælp af en human cellelinie, der kan opretholdes i kultur og differentieret med relativt få skridt. Humant perifert blod mononukleære celler (PBMC) kan også bruges; at opnå disse celler og optimere betingelserne for deres anvendelse kan dog være mere udfordrende. HL-60 celler skal differentieres for at fungere som fagocytter mod bakterier. For at kontrollere differentiering efter 3 dages behandling med DMF, bør flowcytometri bruges til at teste for udtryk for CD11b og CD35 på et flertal af cellerne, før nogen OPKA er forsøgt, som beskrevet i trin 1,5. Cellernes levedygtighed bør også kontrolleres (helst med annexin V og propidium Iodid farvning). Hvis et stort antal celler er døde, apoptotiske, eller udifferentieret som observeret med flowcytometri, 3 dages differentiering med 0,6% DMF i RPMI medier kan ændres (0,4% −0. 8% DMF, 2−6 dag kultur tid) indtil celle levedygtighed og differentiering markører er forbedret. Denne differentiering bør være den første optimering af OPKA som HL-60 funktion er afgørende for effektiv bakteriel drab. Vi anbefaler validering HL-60 differentiering før hver OPKA eksperiment.
Antallet af bakteriel CFUs (trin 3.6) i første omgang hældes 96-brønd plade (trin 4.2) er også kritisk: udlevering for mange celler vil gøre optælling vanskeligt og unøjagtige (skridt 6,5) og kan nedsætte celledød observeret fra HL-60 Co kultur, hvorimod udlevering for få celler kan øge mængden af afvigelse mellem dubletter og kan ikke vise nogen tællelig kolonier efter HL-60 fælles kultur. Optimering af lager fortynding er derfor kritisk, og skal afprøves med fuld protokollen, herunder HL-60/supplement Co kultur.
Betydningen af supplement kan også blive testet med denne protokol ved at medtage to sæt af prøver: ene med aktiv baby kanin supplement og en med varme-inaktiverede supplement. HL-60 celler bør være co kulturperler med begge sæt, men nogle bakterier, der kun skal stadig medtages som en 100% celle overlevelse baseline.
For nogle bakteriel serotyper, kan morfologi af kolonierne gøre celle optælling eller synlighed problematisk. Mucoid serotyperne såsom type 3 Streptococcus pneumoniae, for eksempel kan, nemt vokse hen over og reducere CFU tæller. Dette kan vise sig især problematisk, når afprøvning af behandlinger, der påvirker kapslen, som overvækst ville være forhindret i den behandlede gruppe, men større antal mindre kolonier ville blive talt. For at forhindre denne uoverensstemmelse, er kontrol af cellevækst kritisk. Dyrkning af forgyldt kolonier ved 30 ° C natten vil sandsynligvis give mulighed for bedre overvågning af bakterievækst og pladerne kan fjernes, når alle kolonier nå kan skelnes, tællelig størrelser. Derudover kan forskellige agar plader anvendes til at forbedre synligheden af enkelte kolonier. På denne måde er denne protokol fordelagtig som små ændringer til at optimere forhold kan således bruges til at redegøre for en række af bakteriestammer eller forskellige behandlingsmuligheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) for hans uvurderlige hjælp i etablering af OPKA assays i vores laboratorium. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter af sundhed Grant 1R01AI123383-01A1 til FYA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
