Summary
Este ensayo de matanza opsonofagocítico se utiliza para comparar la capacidad de las células inmunitarias fagocíticas y matar bacterias basadas en diferentes tratamientos o condiciones. Clásicamente, este ensayo sirve como el estándar de oro para la evaluación de funciones efectoras de los anticuerpos contra una bacteria como opsoninas.
Abstract
Un aspecto clave de la respuesta inmune a la colonización bacteriana de la hostia es la fagocitosis. Un ensayo de matanza opsonofagocítico (OPKA) es un procedimiento experimental en el que las células fagocíticas son cultivadas conjuntamente con unidades bacterianas. Las células inmunes a fagocitar y matar los cultivos bacterianos en una forma dependiente de complemento. La eficacia de la muerte de la célula inmunitaria depende de varios factores y puede utilizarse para determinar bacterias diferentes culturas Comparar con respecto a la resistencia a la muerte celular. De esta manera, la eficacia de la terapéutica de base inmunitaria potencial puede ser evaluada contra cepas bacterianas específicas o serotipos. En este protocolo, describimos un OPKA simplificada que utiliza condiciones de cultivo básico y cuenta determinar la viabilidad de la célula bacteriana después de co-cultivo con condiciones de tratamiento y HL-60 células inmunes de la célula. Este método ha sido utilizado con éxito con un número de diferentes serotipos de neumococos, capsulares y cepas de acapsular y otras especies bacterianas. Las ventajas de este protocolo OPKA son su simplicidad, versatilidad (como este ensayo no se limita a los tratamientos de anticuerpo como opsoninas) y reducción al mínimo de tiempo y reactivos para evaluar grupos experimentales básicos.
Introduction
Opsonofagocítico matando a ensayo (OPKA) es una herramienta crítica para vincular alteraciones en la estructura bacteriana o función con cambios posteriores en la respuesta inmune y la función. Como tal, con frecuencia se utiliza como una prueba complementaria para determinar base inmunitaria la eficacia de los tratamientos de anticuerpo, candidatos vacunales, optimización de la enzima, etcetera. Mientras los ensayos in vivo son necesarios para determinar el margen de altura eficaz o la protección de un modelo de infección bacteriana, la OPKA puede utilizarse para evaluar contribución inmune a la muerte de la célula bacteriana más básicos componentes: bacterias, células inmunes y experimental tratamientos. Estudios anteriores han demostrado que OPKAs pueden ser modificados y utilizados para una variedad de bacterias y serotipos, incluyendo Streptococcus pneumoniae1,2de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa3. Además, estos ensayos optimizados pueden utilizarse para evaluar distintos tratamientos experimentales, incluyendo la capacidad de una enzima para que la bacteria sea más accesible a los tratamientos4 y anticuerpo complemento-mediada de las células inmunes para mejorar opsonización5. Clásico, ensayo OPKA se ha utilizado con éxito en investigación básica y clínica ajustes como un indicador de gran alcance para la protección inducida por anticuerpos patógenos específicos6,7,8,9 .
Diferentes tipos de células inmunes pueden usarse para evaluación de opsonofagocítico matar. Una población fagocítica comúnmente utilizada es la línea de células leucémicas humanas HL-60. Esta línea celular se puede mantener como promyelocytes inactivada en la cultura; sin embargo, puede ser distinguidos en varios Estados activados a través de diferentes drogas tratamientos10,11. Tratamiento de HL60 con N, N-dimetilformamida distingue la línea celular en neutrófilos activados con fuerte actividad fagocítica11. Mientras que las células HL-60 se han optimizado y se utilizan con frecuencia para estos ensayos de fagocitosis10, pueden utilizarse otros leucocitos polimorfonucleares primarios como el brazo inmune del experimento12.
Además, estos ensayos pueden ser simplificado13 o multiplexado14 mirar varias cepas resistentes a los antibióticos de la bacteria a probar. El método de multiplexado se ha hecho más factible a través del desarrollo de software que puede contar eficientemente Colonia bacteriana formando unidades (UFC) por spot en una placa de agar15. Aquí, describimos un método racionalizado usando una cepa bacteriana, las células HL-60, complemento de conejo bebé y placas de agar sangre. Con este método, varios tratamientos pueden ser evaluados rápidamente para hacer frente a preguntas de investigación específicas sobre cómo se pueden modular la respuesta inmune innata a la infección bacteriana.
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Protocol
1. la cultura, la diferenciación y la validación de las células HL-60
- Preparar medios de cultivo de células HL-60 compuesto por 500 mL RPMI con L-glutamina y 50 mL inactivadas por calor suero bovino fetal. No agregue antibióticos ya que esto puede afectar la diferenciación de las células HL-60.
- Para la propagación y mantenimiento de las células HL-60, cultura 5 x 106 células en 10 mL de medio de cultivo celular HL-60 75 cm2 ventilación frascos a 37 º C y 5% CO2. Pasaje las células cada 3−4 dias a mantener concentraciones óptimas de la célula.
Nota: La concentración celular no debe exceder 5 x 106/ml. - Generar acciones de trabajo de las células HL-60 tomar aproximadamente 1 x 106 células/mL en medios de cultivo HL60 con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en los tubos criogénicos de 1 mL.
Nota: Las acciones de trabajo pueden ser almacenadas a-80 ° C. La principal acción debe ser almacenada a-120 ° C. - Diferenciar células HL-60 por cultivo 1,5 x 107 células en 15 mL de medio de cultivo celular HL-60 con 0,6% N, N-dimetilformamida (DMF) a 37 ° C y 5% de CO2 en frascos de tapón filtro estéril 75 cm2 durante 3 días antes de la OPKA.
- Validar que las células HL-60 han sido distinguidas con éxito y son apropiadas para su uso en el ensayo OPKA mediante ensayos de viabilidad y marcadores de superficie celular según establecido flujo cytometry protocolos16,17, 18,19. Después de la diferenciación, cosechar células HL-60 y mancha de aproximadamente 1 x 104 células con fluorescencia conjugado anticuerpos/manchas CD71, CD35, anexina V y yoduro de propidio.
Nota: Las células diferenciadas deben ser ≥65% viables, ≥55% CD35+y ≤20% CD71+ determinado a través de establecer protocolos de validación14 (figura 1).
2. preparación de OPKA Buffers y reactivos
- Preparar 50 mL de buffer estéril opsonización B (OBB) mezclando 42,5 mL de estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Ca2 +/Mg2 +5 mL de suero bovino fetal inactivado con calor y 2,5 mL de 0.1% gelatina estéril. Almacenar a 4 ° C.
- Obtener conejo bebé complemento y almacenar a-80 ° C.
- Obtener o preparar platos para cultivo bacteriano (es decir, placas de agar sangre de oveja al de 5% 15 x 100 mm2 ).
3. preparación de muestras de acción bacterianas
- Obtener un stock de las cepas bacterianas positivo para ser probado.
Nota: De este protocolo, serotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente proporcionada por el Dr. Moon Nahm) se utiliza. - Crecer la cepa bacteriana en un caldo apropiado (es decir, caldo Todd-Hewitt + 0,5% extracto de levadura para esta cepa WU2) para aproximadamente 2−4 h a 37 ° C.
Nota: La densidad óptica a 600 nm (OD600) de la cultura debe ser entre 0.6 y 0.8. - De la pelotilla de las bacterias por centrifugación a 6.000 x g durante 2 min y resuspender las células en 10−30 mL de glicerol al 15% en el caldo apropiado. Alícuota del cultivo bacteriano (alícuota de 500 μl) en tubos de centrífuga estériles de 1.5 mL y conservar a-80 ° C.
- Descongelar un vial de acción bacteriana en baño de agua de 37 ° C. Las células bacterianas de la pelotilla y resuspender en 500 μl de OBB en condiciones estériles.
- Preparar diluciones diferentes de la población bacteriana en OBB (es decir, 10 μl de ninguna dilución, 10 μl de 1:10, 10 μl de 1: 100, etcetera). Realizar el ensayo OPKA (secciones 4-6, incluyendo co-cultivo HL-60/complemento) como se describe a continuación utilizando varias diluciones de la acción bacteriana no tratada. La cultura las placas durante la noche a 30 ° C (sin CO2).
Nota: La temperatura de 30 ° C es específica para WU2 evitar crecimiento excesivo; otras cepas/serotipos pueden crecer óptimamente a 37 ° C. - Contar las colonias para cada dilución de la acción bacteriana no tratada cultivada conjuntamente con complemento y células HL-60. Determinar qué dilución de las bacterias produce el número óptimo de colonias contables (aproximadamente 80−120 unidades formadoras de colonias de bacterias cultivadas conjuntamente con las células HL-60). Tenga en cuenta esta dilución para futuras OPKAs que implica esta acción bacteriana.
4. cultura y el tratamiento bacteriana
- Descongelar un tubo de caldo bacteriano preparado en el paso 3.3. Pellet de bacterias (6.000 x g durante 2 min) y resuspender el precipitado de células en OBB en una disolución óptima determinada en el paso 3.6.
- Pipetear 10 μl de la dilución bacteriana resuspendida por pozo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo redondo.
- Añadir 20 μl del anticuerpo o drogas el tratamiento apropiado a cada pozo experimental por duplicado.
Nota: En este protocolo, se agrega un anticuerpo serotipo-específicos generado en ratones como tratamiento X y una enzima hidrolasa de glucósido conocida para degradar la cápsula de polisacárido 3 serotipo se agrega como tratamiento Y (figura 2)4,20. Para los pozos de control, use 1 x PBS o OBB, dependiendo el buffer utilizado para los pozos de tratamiento. - Agitar la placa de la muestra a aproximadamente 90 rpm durante 1 h a temperatura ambiente. Ajustar estas condiciones dependiendo de la temperatura óptima o agitación de los tratamientos de prueba.
5. HL-60 la cultura bacteriana Co
- Recolección de las células HL-60 diferenciados que son tratadas con DMF tres días antes (ver paso 1.4) en tubos cónicos de 15 mL para preparar células HL-60. Sedimenten las células (x 500 g, 3 min), deseche el sobrenadante y lavar con menos de 10 mL de PBS 1 x.
- Sedimenten las células lavadas (500 x g, 3 min), eliminar el sobrenadante y resuspender las células en OBB (comenzar con 1 mL OBB y ajustar para una concentración final de 1 x 107/ml después de la célula que cuenta).
- Agregar complemento de conejo bebé (de suero de conejo estéril, sin diluir bebé, semanas de edad 3−4) en un volumen final de 1:5.
Nota: La concentración final de la mezcla de HL-60-complemento debe ser de 1 x 107/ml. Si pruebas de dependencia de complemento, puede utilizarse una segunda solución que contiene activadas células HL-60 con complemento inactivadas por calor (complemento puede ser inactivado por incubar en un baño de agua a > 55 ° C durante al menos 30 minutos). - Después de 1 h la cultura bacteriana es completa (paso 4.4), dividen cada muestra (es decir, 10 μl de cada 30 μl de la muestra en dos nuevos pozos) en los pocillos duplicados para los dos grupos (es decir, uso solo 20 μl de la original cultura Co 30 μL para tener en cuenta para el error de pipeteo) : un sistema será Co cultivado con HL-60-complemento y uno incluirá sólo las bacterias. Añadir 50 μl de la mezcla de la HL-60-complemento (de paso 5.3) para cada sistema experimental de pozos (delegado + HL-60); Añadir 50 μl de OBB solo a los pozos de las bacterias sólo (delegado -HL-60).
Nota: Para este ejemplo, se utiliza aproximadamente 800 UFC bacterianas para la inicial co-cultivo con células HL-60 de 5 x 10550 μl. Si esta multiplicidad de la infección es demasiado alta o demasiado baja según lo indicado por los números finales de la Colonia, ajustar la dilución bacteriana inicial en comparación con el recuento de células HL-60. - Agitar la placa de 96 pozos a 37 ° C durante 1 hora (sin CO2).
6. placas y la incubación de la muestra
- Diluir cada bien 1:5 con OBB, para que cada muestra tiene un volumen de 50 μl.
- Pipetee 50 μl de cada muestra directamente en un área designada de una placa de cultivo bacteriano, garantizar el espacio adecuado entre las muestras. De 15 x 100 mm2 alrededor de las placas de agar, muestras de pipeta aproximadamente 4 en un plato.
- Cubra y deje las muestras a secar durante unos 15 minutos a temperatura ambiente.
- Invertir las placas y la cultura durante la noche a 30 ° C (sin CO2). Por otra parte, la cultura placas en jarras anaeróbicas para comprobar las condiciones anóxicas afectan el crecimiento bacteriano o control para morfología.
- Después de la cultura durante la noche, contar las colonias en cada área designada de la muestra. Analizar los datos comparando el número de células vivas en cada sistema para el control correspondiente o muestras que no reciben cultura Co de células HL-60 (indicativo de supervivencia de la célula de 100%, 0% matanza de la célula).
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Representative Results
Validación de la diferenciación de la HL-60 se debe realizar antes de comenzar la OPKA. Esto puede lograrse mediante citometría de flujo para determinar la expresión extracelular de CD11b, CD35, CD71 y anexina V (figura 1). Yoduro de propidio también puede utilizarse como un marcador de viabilidad. Después de ser tratado con DMF durante 3 días, se debe aumentar la expresión de CD35 (≥55% de todas las células) y disminución de expresión de CD71 (≤20% de todas las células). El porcentaje de propidio yoduro (PI +) las células juntas y anexina V + debe ser < 35% para asegurar la suficiente viabilidad celular. Si estos porcentajes no cumplen los requisitos mínimos, las condiciones de cultivo deben ajustarse como se describe en la discusión.
El número de UFC de paso 6.5 puede utilizarse para comparar la supervivencia de la célula bacteriana de los diferentes grupos en comparación con el grupo de control no tratados (100% de supervivencia de la célula) como se muestra en la figura 2. Por ejemplo, las cuentas promedio obtenidas de pozos que no recibieron tratamiento, pero fueron cultivadas conjuntamente con HL-60 deben ser relativamente cercanas en número a las células que recibieron ningún tratamiento y sin co-cultivo de HL-60, que sería indicativo de supervivencia celular 100% o 0 % la muerte celular. Con un tratamiento eficaz, el número de colonias debe ser más diferente entre cultura Co HL-60 y no células HL-60 (figura 2 y figura 3). Diferencias más grandes entre HL-60 y no conjuntos de HL-60 son indicativas de la fagocitosis más eficiente. Sin embargo, el tratamiento puede mejorar realmente crecimiento celular bacteriano en el conjunto que no es co cultivado con células HL-60. Cabe señalar esta diferencia en las muestras tratadas y sin tratadas. Si la dilución bacteriana no está optimizado (paso 3.6) o el crecimiento de colonias no se observa con cuidado después de galjanoplastia (paso 6.5 o ver discusión), puede prevenir el crecimiento excesivo de las colonias cuenta exacta de las colonias (figura 4).
Figura 1 : Validación de diferenciación de las células HL-60 mediante citometría de flujo. Diferenciadas las células HL-60 se cosecha, lavadas y resuspendió en 1 x 105 células/mL PBS. Las células fueron entonces alícuotas en 12 pocillos (100 μL/pocillo) en una placa de 96 pocillos. Las células luego se tiñeron con fluorescente conjugado anti-CD35, anti-CD71, anexina V y yoduro de propidio. Como controles se utilizaron células sin manchas o células teñidas con anticuerpos de isotipo conjugado fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Muerte celular mediada por el HL-60 de bacterias el tratamiento Y mejora. Muestras de S. pneumoniae fueron tratadas con tratamiento X (anticuerpo) o tratamiento Y (enzima). OPKA fue realizada según el protocolo y unidades formadoras de colonias bacterianas fueron contados por duplicado. Las muestras que no fueron tratadas con células HL-60 se utilizaron como control (100% de supervivencia de la célula). Se muestran los porcentajes promedio de unidades formadoras de colonias bacterianas en los grupos de HL-60 tratados en comparación con los grupos correspondientes Sin HL-60-tratamiento. Las barras representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Unidades formadoras de colonias bacterianas después de OPKA y cultura durante la noche. Muestras bacterianas fueron tratadas y co cultivadas sin (A) o con las células HL-60 (B) por 1 h a 37 ° C. Se diluye según el protocolo y plateado en agar de sangre placas noche a 30 ° C (sin CO2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Crecimiento excesivo de bacterias UFC. Muestras bacterianas fueron tratadas y OPKA fue realizada. Las muestras fueron diluidas y plateadas en agar de sangre placas durante la noche a 37 ° C (sin CO2). Evaluación precisa de los números de la Colonia no se puede determinar como se muestra el sobrecrecimiento de las colonias. Como 37 ° C (sin CO2) condujo a sobrecrecimiento bacteriano, la temperatura de incubación para placas de futuro se redujo a 30 ° C (sin CO2) para mantener countability de las colonias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
OPKAs servir a funciones esenciales en la determinación de anticuerpo mediado inmune respuestas inducidas por vacunas6,8. La importancia principal de este OPKA simplificada es la adaptabilidad en las condiciones de prueba (es decir, anticuerpos, enzima tratamientos, etcetera.). En este sentido, mientras que este ensayo puede utilizarse para probar la contribución de opsoninas (es decir, anticuerpos) fagocitosis, puede también ser utilizado para evaluar formas de superar los factores de virulencia (por ejemplo, polisacáridos capsulares) que normalmente inhiben vías fagocíticas. Minimizar el número de pasos que se suelen utilizar en un multiplexado OPKA potencialmente minimiza la probabilidad de errores técnicos que pueden afectar los resultados experimentales y reduce la cantidad de solución de problemas y optimización para la obtención de datos útiles. Como este protocolo es adecuado para las variaciones a las condiciones de tratamiento, permite una gran versatilidad.
Establecer previamente el análisis a través de la cultura de la HL-60 y el establecimiento de las poblaciones bacterianas es importante para evitar pasos de optimización extraños al realizar la OPKA. Tiempo debe estar dedicado a asegurarse de que todos los reactivos y los tipos de células están listos y funcionales antes del experimento se lleva a cabo. Estos pasos incluyen la propagación de la línea de celular de HL-60 en la cultura (unas dos semanas), validando que las concentraciones específicas de DMF diferencian eficazmente las células HL-60 (cerca de una semana) y el establecimiento de acciones bacterianas optimizada y libre de contaminantes diluciones (dos semanas).
Algunos pasos de este protocolo son críticos para la obtención de colonias contables y datos adecuados. Este protocolo utiliza células HL-60 como fagocitos debido a la facilidad de uso de una línea de células humanas que se mantienen en cultivo y distinguida con relativamente pocos pasos. También pueden utilizarse las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs); sin embargo, obtención de estas células y la optimización de las condiciones para su uso pueden ser más difícil. Las células HL-60 se deben distinguir para poder funcionar como fagocitos contra las bacterias. Para comprobar la diferenciación después del tratamiento de 3 días con DMF, citometría de flujo debe utilizarse para comprobar la expresión de CD11b y CD35 en la mayoría de las células antes de intenta cualquier OPKA, como se explica en el paso 1.5. Viabilidad celular también debe ser verificada (preferiblemente con anexina V y tinción de yoduro de propidio). Si un gran número de las células está muerto, apoptóticos, o indiferenciado como observado con citometría de flujo, la diferenciación de 3 días con 0.6% DMF en medios RPMI puede modificarse (0.4% −0. 8% DMF, 2−6 día cultura tiempo) hasta que son marcadores de viabilidad y diferenciación de la célula mejorado. Esta diferenciación debe ser la primera optimización de la OPKA HL-60 función es crítica para la matanza bacteriana eficaz. Se recomienda validar la diferenciación antes de cada experimento OPKA HL-60.
El número de bacterias UFC (paso 3.6) inicialmente se distribuye en la placa de 96 pocillos (paso 4.2) es también crítico: demasiadas células de dispensación hará conteo difícil e inexacto (paso 6.5) y puede disminuir la muerte celular observada de co-cultivo HL-60, mientras que suministro demasiado pocas células puede aumentar la cantidad de desviación entre duplicados y puede mostrar cualquier colonias contables después de co-cultivo HL-60. Optimización de la dilución de stock por lo tanto es fundamental y se debe probar con el protocolo completo, incluyendo cultura Co HL-60/complemento.
La importancia del complemento también se puede probar con este protocolo mediante la inclusión de dos conjuntos de muestras: con complemento de conejo bebé activo y con complemento inactivadas por calor. Células HL-60 deben ser cultivadas conjuntamente con ambos juegos, aunque todavía se debe incluir como base de supervivencia de 100% de la célula un conjunto sólo bacterias.
Para algunos serotipos bacterianos, la morfología de las colonias puede hacer conteo celular o visibilidad problemático. Mucoide serotipos como tipo 3 Streptococcus pneumoniae, por ejemplo, fácilmente puede cubran y reducir el conteo de UFC. Esto puede resultar especialmente problemático al probar tratamientos que afectan la cápsula, como crecimiento excesivo se le impidió en el grupo tratado pero contar mayor número de colonias más pequeñas. Para evitar esta discrepancia, control del crecimiento celular es fundamental. Cultivo las colonias plateadas a 30 ° C durante la noche probablemente permitirá mejor control del crecimiento bacteriano y las placas pueden eliminarse cuando todas las colonias alcanzan tamaños distinguibles, contables. Además, las placas de agar diferentes pueden utilizarse para mejorar la visibilidad de colonias individuales. De esta manera, este protocolo es ventajoso como pequeños cambios para optimizar las condiciones por lo tanto puede ser utilizados para tener en cuenta una serie de cepas bacterianas o varias opciones de tratamiento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos su inestimable colaboración en el establecimiento de ensayos OPKA en nuestro laboratorio Dr. Moon Nahm (Universidad de Alabama Birmingham). Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud beca 1R01AI123383-01A1 a FYA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
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